CN103820561B - 一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏pcr扩增检测体系及应用 - Google Patents

一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏pcr扩增检测体系及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种柑橘黄龙病亚洲种PCR检测，尤其涉及一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR检测体系及应用，属于分子生物领域。本发明提供的一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系，包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系，所述第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系最终体积均为10～20μL，其中均包括DNA模板1.0μL、2×Taq？PCR？Master？Mix5μL、引物0.5μL，余量为灭菌双蒸水；其中第二轮PCR扩增体系的DNA模板由第一轮PCR扩增产物经稀释10～20倍体积后制得。本发明第一轮及第二轮PCR扩增反应体系小，第一轮PCR产物稀释倍数小，检测所需试剂也少，相应的费用少。

Description

一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系及应用
技术领域
本发明涉及一种柑橘黄龙病亚洲种PCR检测，尤其涉及一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR检测体系及应用，属于分子生物领域。
背景技术
目前，巢氏PCR（Nested-PCR）是柑橘黄龙病的比较常用的一种检测方法，具有比常规PCR灵敏度更高、特异性更强的优点。巢式PCR反应利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增反应，在第一轮扩增中，外套引物用以产生扩增产物，扩增所得产物在内嵌引物的存在下进行第二轮扩增。
巢式PCR反应虽然增加了扩增反应的复杂性但降低了扩增多个靶位点的可能性、增加了检测的特异性，但是柑橘黄龙病亚洲种病原PCR检测反应体系所需的各种试剂价格昂贵，需要承担的费用较大，因此尽量采用小体系。以第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板时，其中又可分为两种途径：
（1）把第一轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶放-20℃过夜，12000rpm离心10min，取上清液做模板回收或直接把胶片割胶直接纯化再进行第二轮PCR。此种方法要用大量的切胶，胶切碎了再加入TE，反复冻融离心取上清，回收率很低，过程中损失很多DNA；或者需要另行准备柱子等设备以及其他试剂，步骤繁琐、费工费时。
（2）把第一轮PCR产物稀释后作为第二轮PCR的模板，在引物、ddH2O、2×TaqPCRMasterMix（不含染料）用量固定的前提下，第一轮PCR产物的稀释倍数就成为整个巢氏PCR最终效果的决定性因素。目前，稀释体积倍数常为50～10000倍。最常用的稀释体积倍数为50倍、100倍、1000倍、10000倍。为防止在第二轮PCR过程中RNA干扰，以达到更佳效果，一般使用RNase-freewater或者0.1%DEPC来进行稀释，而这两种试剂价格却不菲。RNase-freewater价格为48元/100ml（北京康为世纪生物科技有限公司），0.1%DEPC工作液价格为100元/100ml（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。因此，在运用巢氏PCR技术检测柑橘黄龙病的过程中，虽然高稀释倍数容易实现最终的检测结果，但是稀释倍数越高，所需要的RNase-freewater或者0.1%DEPC的工作液就越多，也就意味着更多的能耗。如果能够把第一轮PCR产物稀释倍数大幅度降低且最终能够满足巢氏PCR技术要求，那么不仅节省了试剂剂量，还能达到节约能耗的目的，因为在制作DEPC等试剂的过程中，一般都会用到高温（120℃）高压灭菌处理后才能使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系及应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系，包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系，所述第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系最终体积均为10～20μL，其中均包括DNA模板1.0μL、2×TaqPCRMasterMix5μL、引物0.5μL，余量为灭菌双蒸水；其中第二轮PCR扩增体系的DNA模板由第一轮PCR扩增产物稀释10～20倍体积后制得。
优选的是：所述第一轮PCR扩增体系的DNA模板浓度为2.75ng/μl。
优选的是：所述的2×TaqPCRMasterMix不含染料，其中包括浓度均为0.4mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP；浓度为4mmol/L的Mgcl2；总浓度为0.05U/μL的Taq酶和PfuDNA聚合酶。
优选的是：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物浓度均为5μmol/L，体积比为1:1。
利用上述的柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系进行PCR扩增反应，该扩增反应包括第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增的DNA模板是将第一轮PCR扩增产物稀释而得，第一轮PCR扩增反应条件为94℃预变性4min，94℃变性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min；第二轮PCR扩增反应条件为94℃预变性4min，94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min。
本发明有益效果：
(1)第一轮及第二轮PCR扩增反应体系为10～20μL，反应体系较小，检测所需试剂量也少，相应的费用少。
(2)将第一轮PCR产物稀释10～20倍体积后作为第二轮PCR的模板，稀释倍数较小，检测所需试剂也少，相应的费用少。
(3)本发明使用试剂量少，还能减轻实验废弃物对环境的污染。
(4)本发明使用试剂量少，使大规模检测柑橘黄龙病亚洲种大规模检测应用成为可能，为柑橘黄龙病的综合防治提供坚实的技术支持，推动柑橘产业健康发展，其所引发的社会效益规模是不可估量的。
附图说明
图1为7个砂糖橘叶片样品经第一轮PCR扩增反应所得产物经过10倍、20倍、100倍体积稀释得到的三种浓度DNA模板进行三次重复第二轮PCR扩增反应结果；
M泳道代表DNAmarkerDM2000；
泳道1-7分别代表样品AT5-2、AT5-4、AT5-49、AT5-55、AT5-71、AT5-84、AT5-141；A、B、C分别代表样品10倍、20倍、100倍的稀释液；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代表三次重复试验。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、实验材料
1、植物材料
7个砂糖橘疑似黄龙病叶片材料，全部采自广西，分别编号为AT5-2、AT5-4、AT5-49、AT5-55、AT5-71、AT5-84、AT5-141，其中，AT5-2、AT5-4采自武鸣县，AT5-49、AT5-55采自岑溪县，AT5-71采自防城港市，AT5-84采自隆安县，AT5-141采自西林县。
2、引物
根据柑橘黄龙病亚洲种（CandidantusLiberibacterasiaticus）的16SrDNA序列，设计引物fd1/fd2（SEQIDNO:1/SEQIDNO:2）、OI1/OI2（SEQIDNO:3/SEQIDNO:4），目的核酸片段长度是1160bp，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列如下:
fd1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；
fd2：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′。
OI1：5′-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3′；
OI2：5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′。
3、基因组DNA提取试剂盒
快捷型植物基因组DNA提取套装***，试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，套装包括FP1和FP2两种缓冲液。
4、2×TaqPCRMasterMix（不含染料），购自康为世纪生物科技（北京）有限公司(版本号：01182013；目录号：CW0716)。
5、RNaseA（10mg/ml）、异丙醇、乙醇、缓冲液TE、灭菌双蒸水（ddH2O）、RNase-freewater（购于北京康为世纪生物科技有限公司）等试剂。
二、实验方法
1、ＤＮＡ样品提取
（1）分别剪取7个砂糖橘疑似黄龙病叶片中脉，每份约100g，用液氮研磨至粉末状，放置-20℃保存待用。
（2）取100mg步骤（1）制得的产品，加入400μL缓冲液FP1和6μL的RNaseA（10mg/mL），涡旋振荡1min后，室温放置10min，期间轻柔地翻转EP管2～3次。
（3）加入130μL缓冲液FP2，涡旋振荡1min使其充分混匀。
（4）12000r/min离心5min，转移上清液至新的EP管中。
（5）将上清液再次离心5min，12000r/min，转移上清液至新的EP管中。
（6）向上清液中加入预冷的0.7倍体积的异丙醇，轻柔地翻转EP管使其混匀，静置片刻，12000r/min离心2min，弃上清。
（7）沉淀加入700μL乙醇，涡旋振荡5s，12000r/min离心2min，弃上清。
（8）重复第7步。
（9）开盖倒置，室温5～10min，彻底晾干残余的乙醇。
（10）加入适量的洗脱缓冲液TE，颠倒混匀，制成浓度为275ng/μl的DNA提取液，置于-20℃保存待用。
2、PCR扩增反应体系及条件
利用柑橘黄龙病亚洲种(CandidantusLiberibacterasiaticus)的16SrDNA引物fd1/fd2，OI1/OI2对7份DNA样品进行PCR扩增检测。第一轮PCR扩增体系：即1.0μlDNA模板（将DNA提取液稀释100倍体积，制得浓度为2.75ng/μl的DNA模板），5μl2×TaqPCRMasterMix，0.5μlfd1/fd2引物，加ddH2O补至10μl，所述的2×TaqPCRMasterMix不含染料，其中dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为0.4mmol/L；Mgcl2浓度为4mmol/L；Taq酶和PfuDNA聚合酶总浓度为0.05U/μL，所述所述引物fd1、引物fd2浓度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。第一轮PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存产物。第二轮PCR扩增体系：分别取第一轮PCR产物1.0μl稀释10×、20×、100×体积，再各自从中取1.0μl作为模板，5μl2×TaqPCRMasterMix，0.5μlOI1/OI2引物，加ddH2O补至10μl，所述引物OI1、引物OI2浓度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。分别三次重复进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存产物。
3、脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物
取3μl6×Loadingbuffer与第二轮PCR产物6.0μLDNA样品混合均匀后上样，用1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：1×TAE电泳缓冲液，电压150V，15min，电泳结束后，在FIREREADERXSD-56-26.M凝胶成像***下观察拍照。
三、实验结果
图1中电泳结果显示，第一轮PCR扩增反应产物经过稀释10、20、100倍体积后得到的ＤＮＡ模板均能扩增出目的基因。
实施例2
分别将实施例1制得的7份DNA提取液稀释100倍体积后制得浓度为2.75ng/μl的DNA模板备用。
利用柑橘黄龙病亚洲种(CandidantusLiberibacterasiaticus)的16SrDNA引物fd1/fd2，OI1/OI2对7份DNA样品进行PCR扩增检测。第一轮PCR扩增体系：即1.0μlDNA模板（浓度为2.75ng/μl），5μl2×TaqPCRMasterMix，0.5μlfd1/fd2引物，加ddH2O补至15μl，所述的2×TaqPCRMasterMix不含染料，其中dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为0.4mmol/L；Mgcl2浓度为4mmol/L；Taq酶和PfuDNA聚合酶总浓度为0.05U/μL，所述所述引物fd1、引物fd2浓度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。第一轮PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存产物。第二轮PCR扩增体系：分别取第一轮PCR产物1.0μl用RNase-freewater稀释15倍体积，再各自从中取1.0μl作为模板，5μl2×TaqPCRMasterMix，0.5μlOI1/OI2引物，加ddH2O补至15μl，所述引物OI1、引物OI2浓度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。分别三次重复进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存产物。
采用与实施例1相同的脂糖凝胶电泳条件进行PCR扩增产物检测。
实施例3
分别将实施例1制得的7份DNA提取液稀释100倍体积后制得浓度为2.75ng/μl的DNA模板备用。
利用柑橘黄龙病亚洲种(CandidantusLiberibacterasiaticus)的16SrDNA引物fd1/fd2，OI1/OI2对7份DNA样品进行PCR扩增检测。第一轮PCR扩增体系：即1.0μlDNA模板（浓度为2.75ng/μl），5μl2×TaqPCRMasterMix，0.5μlfd1/fd2引物，加ddH2O补至20μl，所述的2×TaqPCRMasterMix不含染料，其中dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为0.4mmol/L；Mgcl2浓度为4mmol/L；Taq酶和PfuDNA聚合酶总浓度为0.05U/μL，所述所述引物fd1、引物fd2浓度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。第一轮PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存产物。第二轮PCR扩增体系：分别取第一轮PCR产物1.0μl稀释20体积，再各自从中取1.0μl作为模板，5μl2×TaqPCRMasterMix，0.5μlOI1/OI2引物，加ddH2O补至20μl，所述引物OI1、引物OI2浓度均为5μmol/L，体积均为0.25μl。分别三次重复进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min，4℃保存产物。
采用与实施例1相同的脂糖凝胶电泳条件进行PCR扩增产物检测。

Claims (2)

1.一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系，包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系，其特征在于：所述第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系最终体积均为10～20μL，其中均包括DNA模板1.0μL、2×TaqPCRMasterMix5μL、引物0.5μL，余量为灭菌双蒸水；其中第二轮PCR扩增体系的DNA模板由第一轮PCR扩增产物稀释10～20倍体积后制得；
所述第一轮PCR扩增体系的DNA模板浓度2.75ng/μL；
所述的2×TaqPCRMasterMix，其是由dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Mgcl2、Taq酶和PfuDNA聚合酶组成；其中包括浓度均为0.4mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP；浓度为4mmol/L的Mgcl2；总浓度为0.05U/μL的Taq酶和PfuDNA聚合酶；
所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物为fd1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；fd2：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′；所述下游引物为OI1：5′-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3′；OI2：5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′；所述上游引物和下游引物浓度均为5μmol/L，体积比为1:1。
2.利用权利要求1所述的柑橘黄龙病亚洲种巢氏PCR扩增检测体系进行PCR扩增反应，其特征在于：该扩增反应包括第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增的DNA模板是将第一轮PCR扩增产物稀释而得，第一轮PCR扩增反应条件为94℃预变性4min，94℃变性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min；第二轮PCR扩增反应条件为94℃预变性4min，94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，72℃最后延伸7min。
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EP3643788A4 (en) * 2017-06-20 2021-01-06 MGI Tech Co., Ltd. PAIR OF PRIMERS FOR PCR AND RELATED APPLICATION
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