CN104098651B

CN104098651B - 具有抗肿瘤活性的PD-L1 IgV亲和肽及其应用

Info

Publication number: CN104098651B
Application number: CN201410303775.6A
Authority: CN
Inventors: 高艳锋; 刘蓓媛; 祁元明; 李国栋; 李雯雯; 陈鲤翔; 赵园园; 周秀曼
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2034-06-30
Also published as: CN104098651A

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1 IgV的亲和肽产品及其制备和应用。该亲和肽特异性结合于PD-L1 IgV区，其氨基酸序列为ANGSRLV，分子量为715.4。该亲和肽可通过Fomc固相多肽合成法人工合成制备，可在制备抗结肠癌（CT26）药物中作为主要活性成分发挥作用。本发明通过利用噬菌体展示肽库筛选技术，以PD-L1 IgV为靶点进行高通量的筛选，人工合成了具有抗肿瘤活性的亲和肽。发明人进一步证明了本发明所提供的亲和肽具有较好的抗肿瘤活性，能明显抑制小鼠体内肿瘤的增长，从而为基于PD-L1的药物研究和开发提供新的思路和理论基础。

Description

具有抗肿瘤活性的PD-L1 IgV亲和肽及其应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性多肽产品的筛选、制备及应用，更具体的，本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1IgV的亲和肽产品及其制备和应用。

背景技术

近年来，肿瘤的防控形势非常严峻。随着临床诊断、手术治疗、化疗和放疗等水平的提高，使得一部分病人能够得到早发现、早治疗，并且获得较好的预后，但是，寻找新的治疗手段和治疗药物一直是全球范围内的研究热点。与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，并且建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移。

在肿瘤免疫治疗过程中，负性共刺激分子主要介导免疫耐受和逃逸，而前人在肿瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因此，探讨通过抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的对肿瘤细胞的免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。

T细胞的激活需两个来自细胞外的信号刺激，即淋巴细胞活化的双信号作用。细胞活化的第一信号主要来自细胞抗原识别受体（TCR）与MHC分子抗原肽复合物的特异性结合，此过程为抗原识别。细胞活化的第二信号又称共刺激信号，是由抗原递呈细胞（APC）和细胞表面的粘附分子对提供。这些粘附分子被称为共刺激分子，是一类细胞膜表面分子，可为T、B细胞的活化提供辅助信号，从而调节细胞的增殖、活化及分化。根据产生的效应不同，可将共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子。正性共刺激分子包括CD28、ICOS、4-1BB等分子，而负性共刺激分子则包括CTLA-4、PD-1、TIM-3等分子。

PD-1/PD-L1作为B7/CD28家族成员，已被证实通过抑制T细胞的活化和增殖来负调控免疫应答，并在调节免疫耐受、肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。因而利用PD-L1的阻断剂作为肿瘤免疫治疗药物或佐剂具有很好的应用前景和安全性，而现有技术中，尚缺少较好的PD-L1的阻断剂产品。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有较好抗肿瘤活性的靶向PD-L1IgV的亲和肽产品，可以特异性利用PD-L1蛋白IgV区（PD-L1IgV）作为结合靶点，从而最终阻断PD-1/PD-L1的活化，解除对T细胞的活化和增殖的抑制作用，从而发挥抗肿瘤作用。

具体而言，本发明采用的技术方案如下：

一种具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽，特异性结合于PD-L1IgV区，其氨基酸序列为：Ala-Asn-Gly-Ser-Arg-Leu-Val,即A-N-G-S-R-L-V，分子量为715.4。

所述具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽，添加药学上可接受的载体或/和添加剂后，在制备抗结肠癌（CT26）药物中作为主要活性成分发挥作用。

所述具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽，通过Fomc固相多肽合成法人工合成制备。

在对靶点进行高通量筛选亲和肽过程中，发明人采用了库容量大、操作简便的噬菌体展示肽库技术进行了筛选。噬菌体展示肽库技术是将外源蛋白或多肽序列***在M13噬菌体衣壳蛋白pⅢ的N末端，通过蛋白的融合表达将***的随机多肽序列展示在噬菌体表面。由于展示多肽位于pⅢ的N末端，这些小肽通常能够保持较为独立的空间结构，从而能够模拟配体与特异性受体靶标相互作用。

本发明通过利用噬菌体展示肽库筛选技术，以PD-L1IgV为靶点进行高通量的筛选，人工合成了具有抗肿瘤活性的亲和肽。发明人进一步通过小鼠体内荷瘤实验，证明了本发明所提供的靶向PD-L1IgV亲和肽具有较好的抗肿瘤活性，能明显抑制小鼠体内肿瘤的增长，从而为基于PD-L1的药物研究和开发提供新的思路和理论基础。

附图说明

图1是ELISA鉴定亲和肽噬菌体单克隆与PD-L1的亲和力结果图；

图2是亲和肽的质谱鉴定图；

图3是亲和肽对荷CT26结肠癌小鼠体重变化的影响结果图；

图4是亲和肽对荷CT26结肠癌小鼠瘤体积变化的影响结果图；

图5是亲和肽对荷CT26结肠癌小鼠移植瘤的瘤重图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

本发明所提供的具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽，特异性结合于PD-L1IgV区，是利用噬菌体展示肽库技术筛选得到的，其氨基酸序列为：Ala-Asn-Gly-Ser-Arg-Leu-Val,即A-N-G-S-R-L-V，分子量为715.4。

由于单抗药物的成本高昂，且不能大规模生产，因此，我们选用由原核表达纯化的PD-L1IgV区蛋白作为靶点，通过噬菌体展示技术来筛选得到能与PD-L1IgV特异性结合的多肽，用以阻断PD-1/PD-L1信号通路。为便于本领域技术人员实施本发明，对其筛选过程简要说明如下：

筛选过程中所用培养基和主要溶液的配制说明如下：

LB液体培养基：称取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，加超纯水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后室温贮存备用。

LB固体培养基：1LLB液体培养基中加入15g琼脂粉，加热使琼脂粉充分溶解，搅拌均匀并分装为100mL/瓶，121℃灭菌20min，冷却至室温后贮存备用。

LB/IPTG/Xgal平板：将100mLLB固体培养基用微波炉加热溶解，冷却至60℃左右时，加入75μLIPTG/Xgal，小心混匀，避免产生气泡，倾倒入六孔板。平板于4℃冰箱避光贮存备用。IPTG/Xgal按以下配方制备：称取0.5gIPTG和0.2gXgal溶于5mLDMF（N，N-二甲基甲酰胺）中，混匀后分装为300μL小份，于-20℃避光贮存。

上层琼脂：称取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，MgCl₂·6H₂O1g，琼脂糖7g，加超纯水定容至1L，微波炉煮沸3次，使琼脂糖充分溶解，冷却至60℃左右，分装成60mL的小份，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后室温存放备用。

LB-Tet（四环素）平板：微波炉加热溶解100mLLB固体培养基，冷却至60℃左右时，加入100μLTet贮液，混匀后倾倒六平板，待冷却凝固后4℃避光贮存，一周内使用完。四环素（Tet）贮液按以下配方制备：称取200mg盐酸四环素，溶于10mL的无水乙醇中，分装为300μL小份，于-20℃避光贮存。

包被液-0.1MNaHCO₃缓冲液（pH8.6）：称取NaHCO₃0.84g用80mL三蒸水溶解后用NaOH调PH至8.6，定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后4℃存放备用。

封闭液-0.1MNaHCO₃（pH8.6）、5mg/mLBSA：称取NaHCO₃0.84g、BSA0.5g用80mL三蒸水溶解后用NaOH调pH至8.6，定容至100mL，过滤除菌，分装为5mL小份，4℃贮存备用。

洗脱液-0.2M甘氨酸-HCl缓冲液（pH2.2）、1mg/mLBSA：量取50mL0.2M甘氨酸溶液和44mL0.2MHCl溶液，加入200mgBSA，加水定容至200mL，过滤除菌，4℃备用。

中和液-1MTris-HCl缓冲液（pH9.1）：称取12.114gTris碱，适量超纯水溶解，HCl调pH至9.1，定容、过滤除菌，分装备用。

TBS缓冲液-50mMTris-HCL（PH7.5）、150mMNaCl：按以下步骤制备，第一步先称取6.055gTrisbase，用少量双蒸水（300~500ml）溶解，再用浓HCl将pH调至7.5，最后加双蒸水至1000ml，此步骤制备得Tris缓冲液（50mM，PH7.5）；第二步称取NaCl8.766g，先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入第一步所制备的Tris缓冲液（50mM，pH7.5）100ml，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀，高压灭菌即得。

洗涤液（TBST）：0.1%（v/v）Tween-20TBS，TBS即前述TBS缓冲液。

PEG/NaCl：称取PEG-800020g，NaCl14.61g，加超纯水定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温，4℃贮存备用。

TMB储存液：称取10mgTMB溶于1mLDMSO，4℃避光保存备用。

TMB底物缓冲液-磷酸-柠檬酸缓冲液（pH5.0）：按以下步骤制备：首先制备0.1M/L柠檬酸液，即称取柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）19.2g，加水至1000mL，为甲液；然后制备0.2M/L磷酸氢二钠液体，即称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）71.7g，加水至1000mL，为乙液；最后取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水定容至100mL，即为TMB底物缓冲液-磷酸-柠檬酸缓冲液（pH5.0）。

TMB底物显色液：取100μLTMB贮存液于溶于上述10mLTMB底物缓冲液-磷酸-柠檬酸缓冲液（pH5.0）中，再加入体积分数为30%H₂0₂10μL，混匀即可，需要注意的是TMB底物显色液需现配现用。

终止液：为浓度为2M/L的硫酸液。

筛选步骤：

（1）包被：将原核表达并纯化的PD-L1蛋白的IgV区，经过尿素浓度梯度复性后得到目的蛋白PD-L1IgV（溶于0.1MpH8.6的NaHCO₃溶液）。用目的蛋白包被96孔板，15μg/孔（150μL，100μg/mL），密闭湿盒4℃孵育过夜；

（2）封闭：弃去包被液，用枪头吸出剩余残液并迅速加满封闭液，密闭湿盒4℃孵育3h；

（3）洗涤：TBST洗涤6次，每次不少于2min，注意无菌操作，动作要快以免微孔板干燥；

（4）结合：快速加入预先用TBST稀释至滴度为2×10¹¹的文库的噬菌体100μL/孔，室温温和摇动1h；在这个过程中，与靶蛋白具有亲和力的噬菌体会结合在蛋白上；

（5）洗涤：TBST洗涤10次，洗去未结合的噬菌体；

（6）洗脱：每孔加入100μL洗脱液，室温温和摇动20min；

（7）中和：用移液枪小心吸出洗脱的噬菌体，转移至预先已加好15μL中和液的灭菌离心管中，温和吹打混匀；

（8）扩增：把第一轮筛选得到的噬菌体与大肠杆菌ER2738加入LB液体培养基（Tet⁺）中共同培养，进行扩增和纯化，得到次级肽库；

（9）滴度测定：分别对各轮筛选得到的噬菌体以及扩增后的次级肽库在LB/IPTG/Xgal平板上进行噬菌体滴度测定，并进行回收率计算，噬菌体回收率=[洗脱噬菌体数/投入噬菌体数]×100%；

（10）重复筛选：将扩增得到的噬菌体投入下一轮筛选，重复上述筛选过程。经5轮亲和筛选，即可使得含目的多肽的噬菌体得到高度富集；

（11）测序：挑取第五轮筛选后的滴度测定平板上的噬菌斑进行扩增，取200μL新鲜扩增的噬菌体贮存液送往金唯智测序公司进行全自动测序，测序引物为-96gⅢ测序引物：5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。

多肽序列分析：根据DNA测序结果推导其所编码的氨基酸序列，得到拮抗肽的氨基酸序列。

筛选结果：

（1）分别对各轮筛选得到的噬菌体洗脱液进行滴度测定，并计算投入噬菌体回收率，结果见下表。

（2）我们选择七肽库对PD-L1IgV蛋白进行筛选，结果见下表。第四轮共筛选测序18个噬菌体克隆，而其中11个都是P1肽序列，即本发明所请求保护的亲和肽，占到测序克隆的60%以上。

ELISA鉴定噬菌体单克隆与靶蛋白PD-L1IgV的亲和性

为了鉴定噬菌体单克隆与靶蛋白PD-L1IgV的亲和性，发明人做了进一步的ELISA鉴定实验，鉴定步骤简述如下：

1、包被：用浓度为100μg/mL的PD-L1IgV蛋白溶液（溶于0.1M的NaHCO₃、pH8.6）包被酶标板，100uL/孔。

阴性对照：每个待鉴定克隆均包被一个对应的包被液（0.1MNaHCO₃，pH8.6）孔作为阴性对照。

空白对照：设包被靶分子加野生型M13噬菌体单克隆样品为空白对照。

包被后设置两个复孔，密闭湿盒4℃孵育过夜。

2、封闭：弃去包被液，将酶标板倒置于灭菌的滤纸上拍甩以除去残液，并迅速加满封闭液。密闭湿盒4℃孵育3h。

3、洗涤：TBST洗涤6次，每次不少于2min。注意无菌操作，动作要快以免微孔板干燥。

4、加样：快速加入预先用TBST稀释至滴度为2×10⁷的P1噬菌体单克隆样品，100μL/孔，室温温和摇动2h。

5、洗涤：TBST洗涤6次，洗去未结合的噬菌体。

6、二抗：用封闭液1:4000（体积比）稀释HRP标记的抗-M13抗体。每孔100μL，室温震荡孵育1h。

7、洗涤：TBST洗涤6次。

8、显色：每孔100μLTMB底物显色液，室温避光30min左右。

9、终止：每孔50μL终止液终止显色反应。

10、读板：在450nm波长处测OD。以OD₄₅₀值高于阴性对照2.1倍以上者为阳性克隆，与PD-L1IgV有较好的亲和力。

鉴定结果：

如图1所示，ELISA实验检测到特异性的P1噬菌体单克隆与靶蛋白具有较好亲和力，其与靶分子的亲和力较阴性对照的比值大于2.1，说明含有P1七肽序列的噬菌体克隆就是筛选得到的阳性肽克隆，能够特异性的结合靶蛋白PD-L1IgV。

实施例2

所述具有抗肿瘤活性的PD-L1IgV的亲和肽采用Fomc固相多肽合成法进行合成，合成步骤简要描述如下：

合成过程中所用到的主要试剂有：

封头液：乙酸酐/吡啶溶液（1:1，v/v）；

茚检试剂：A.茚三酮/乙醇溶液(5%，w/v)

B.苯酚/乙醇(4:1，w/v)

C.***/吡啶(2%，v/v)

脱保护液：哌啶/DMF溶液(20%，v/v)；

切割试剂：按体积含量计，TFA（82.5%），H₂O（5%），苯酚（5%），苯甲硫醚（5%），乙二硫醇（2.5%）。

合成步骤简要描述如下：

（1）溶胀树脂、加第一个氨基酸

A．溶胀树脂：取0.3~0.5gRink树脂（与树脂相连的肽的C末端氨基酸为酰胺）置于洗干净且干燥的多肽合成仪内，加入适量的DMF，浸泡30min左右使树脂充分溶胀，真空泵抽出合成仪中的DMF。

B．洗涤：步骤如下，加入适量的DMF，震荡洗涤2min共2次；加入适量的MeOH，震荡洗涤2min共3次；加入适量的DCM，震荡洗涤2min共3次；加入适量的DMF，再震荡洗涤2min共2次。

C．加第一个氨基酸：通过公式计算应该加入的首个氨基酸、HoBt及DIC的量，计算公示如下：

氨基酸质量=树脂质量×2.5倍当量×带有保护基团的氨基酸的相对分子质量，

HOBT质量=树脂质量×2.5倍当量×HOBT的相对分子质量，

DIC用量=树脂质量×2.5倍当量×DIC的相对分子质量，

天平秤取Fmoc-氨基酸、HOBT于50mL烧杯，用少量的DMF溶解后加入合成仪中，再用移液枪吸取DIC加入合成仪，将合成仪置于摇床中，室温下反应3h，使氨基酸与树脂发生耦联反应。

Ｄ．洗涤：同步骤B。

E．测取代值：由于在290nm下，芴甲氧羰基有很强的紫外吸收，因此通过测定它的吸光值，用比色法可以来测定第一个氨基酸与树脂结合的情况。挑取步骤D中反应后树脂1~1.5mg，烘干，用电子分析天平准确称量树脂质量；然后将树脂装入5mL的离心管中，加入3mL的脱保护液震荡10min；随后转移进入比色皿中于290nm测定样品OD值；另一比色皿中加入3mL的脱保护液为空白对照，按公式计算取代值，计算公示如下：

取代值=样品OD值/1.65×树脂质量。

取代值在0.4~0.6时最佳，若取代值小于0.4，则表明氨基酸与树脂结合的量过少，应该重复上述过程加第一个氨基酸。

F．封头：向合成仪加入适量的封头液震摇20min共两次。

G．洗涤：同步骤B。

（2）加第二个氨基酸及后续肽链延伸

H.脱保护：合成仪中加入适量的脱保护液，摇床反应20min共2次。

I．洗涤：同步骤B。

J．茚检：挑取步骤I中的少量树脂放入茚检管，分别滴加茚检试剂A液1滴、B液2滴、C液1滴，盖好茚检管，沸水浴2min观察树脂颜色；若为蓝色（Pro、His、Ser脱保护后茚检颜色为红棕色），则脱保护正常；否则须重复脱保护过程。

K．加氨基酸：计算并将称量好的氨基酸以及HOBT用少量DMF溶解后加入多肽合成仪，再用移液枪加入DIC，置于摇床中，室温下反应2.5h。

L．洗涤：同步骤B。

M．茚检：过程同步骤J，若树脂为亮黄色，无蓝斑，则氨基酸缩合完全，可进行下一步反应。若为蓝色，则氨基酸缩合不完全，需重复进行此氨基酸的缩合反应，直至茚检树脂完全呈亮黄色。

N．重复步骤H-M至完成整条肽的缩合反应。

（3）多肽切割

O．脱保护：同步骤H。

P．茚检：同步骤J。

Q．洗涤：同步骤B。

R．切割：在通风橱中配置切割试剂并倒入合成仪，将搅拌器放入合成仪，开始切割反应，搅拌器缓慢搅拌切割2.5h左右。反应完毕后，用真空抽滤泵抽滤出切割试剂，再用DCM洗涤几遍搅拌桨和树脂，并将抽滤得到的切割液装入圆底烧瓶。

S．旋转蒸发：用旋转蒸发仪将切割液中的TFA去除，旋转蒸发仪温度调整为65℃，旋转蒸发10~20min。之后再加入冰***，继续旋转蒸发，10~20min，此步重复6次，由于多肽序列中含有精氨酸，需进行冰切，以去除侧链的保护集团。向瓶中加入5mLTFA，置于冰中，摇床上震摇30min。冰切完毕后，继续置于旋转蒸发仪中，旋转蒸发10~20min。

T．沉淀：旋转蒸发完毕后，将切割液倒入装有50mL冰***的烧杯中，冰浴静置30min，使多肽沉淀。

U．离心：吸管吸取烧杯底部***沉淀混合液，2000r/min，离心2min，弃上清收集沉淀，冰***重悬洗涤沉淀5次。

V．烘干：将收集的多肽沉淀于37℃烘箱烘干，电子分析天平称重，计算粗肽产率，将其密封保存于-20℃备用。

（4）RP-HPLC分析和制备纯化多肽

RP-HPLC分析中流动相溶液配制：

流动相A液（1‰TFA溶液）：移液管量取1mLTFA，加入超纯水定容至1000mL，超声波仪器超声除气去泡；

流动相B液（乙腈）：使用色谱纯级乙腈溶液作为流动相B液，注意用超声波仪器超声除气去泡。

多肽纯化制备采用梯度洗脱分离纯化：

W．提前开机30min预热，打开软件操作界面，参数设置：波长设置228nm，流速设置5mL/min；

X．平衡：平衡约30min；

Y．粗肽制备：称取粗肽约20mg，用含特定浓度乙腈的0.1%TFA水溶液（4mL）溶解，0.45μm微孔滤膜过滤后进样。收集主峰产物置于-80℃过夜冻存。

Z．冻干：将冻好的主峰产物样品置于冻干机中冻干24h，之后收集并称量精肽，-20℃密封保存备用。

（5）质谱鉴定

取少量精肽，通过电喷雾电离质谱分析鉴定多肽分子质量，亲和肽质谱鉴定结果如图2所示，鉴定结果符合预期。

实施例3

以实施例2制备的具有抗肿瘤活性的PD-L1IgV的亲和肽为例，发明人做了进一步的荷瘤小鼠体内实验，具体实验过程如下：

选择24只实验用Balb/c小鼠，将鼠源结肠癌（CT26）细胞用生理盐水（NS）将细胞浓度调整至5×10⁶个细胞/mL，常规消毒后将0.1mL细胞悬液（含5×10⁵个细胞）接种于每只Balb/c小鼠右前肢腋窝皮下，持续观察皮下瘤体生长情况。

将实施例2制备的亲和肽溶于生理盐水中，制成多肽药物，-20℃分装保存，备用。

接种鼠源结肠癌（CT26）细胞9天后，将小鼠按瘤体积分组，每组6只，分为阴性对照组（NS），阳性对照组（5-FU），高剂量组（2mg/kg）、中剂量组（1.0mg/kg）和低剂量组（0.5mg/kg）。

各组均采用瘤旁给药，每天给药一次，共给药7天，实验期间小鼠自由进食和饮水。每日测量小鼠体重及肿瘤的长（a）短（b）径，并按并按瘤体积=π/6×a×b²公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。7天后将小鼠处死取出肿瘤并称重。实验结果见图3—图5，图中用P1代替表示本发明所提供的亲和肽。

从图3可以看出药物组实验小鼠体重正常，阳性对照组因5-FU的毒副作用较大而出现消瘦情况。由此可见，亲和肽不仅有一定的抗肿瘤效果，而且没有明显的毒副作用。

从图4我们可以看出药物组实验小鼠肿瘤体积比阴性对照组小。且在一定浓度范围内，肽浓度越大，实验小鼠肿瘤体积越小。

从图5我们可以看出药物组实验小鼠肿瘤重比阴性对照组小。在一定浓度范围内，亲和肽浓度越大，实验小鼠瘤重越小。

SEQUENCELISTING

<110>郑州大学

<120>具有抗肿瘤活性的PD-L1IgV亲和肽及其应用

<130>none

<160>1

<170>PatentInversion3.4

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>亲和肽

<400>1

AlaAsnGlySerArgLeuVal

15

Claims

1.一种具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽，其特征在于，该亲和肽特异性结合于PD-L1IgV区，其氨基酸序列为：Ala-Asn-Gly-Ser-Arg-Leu-Val，即A-N-G-S-R-L-V，分子量为715.4Da。

2.权利要求1所述具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽在制备抗结肠癌药物的应用。

3.权利要求1所述具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽的制备方法，其特征在于，通过Fmoc固相多肽合成法制备。