CN104098631A - 一种环烯醚萜苷化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环烯醚萜苷类化合物及其制备方法和应用。制法：(1)取热毒宁注射液用正丁醇萃取，得正丁醇萃取物；(2)正丁醇萃取物经HP-20大孔吸附树脂柱分离，乙醇-水梯度洗脱，得25～35％醇洗脱部位；(3)25～35％乙醇洗脱部位依次经硅胶柱色谱，ODS柱色谱，HW-40柱色谱分离，制备液相HPLC分离，得到本发明化合物。本发明所述化合物可用于治疗手足口病。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种从现有中成药制剂中提取的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和应用。
背景技术
热毒宁注射液(国药准字Z20050217)为江苏康缘药业股份有限公司自主研发的原中药二类新药，其处方为青蒿、金银花、栀子，辅料为聚山梨酯80。热毒宁注射液在外感风热所致感冒、流感、咳嗽、上呼吸道感染等疾病的临床治疗中应用广泛，其作用迅速、效果显著。
研究人员在热毒宁注射液中发现了新的化学成分，并且发现此化合物在各个批次的热毒宁注射液中均稳定存在。经查阅文献可知，这是首次在热毒宁注射液中发现并鉴定出的新的化学成分，并经过Scifinder scholar检索发现该化合物为新化合物。
发明内容
本发明从热毒宁注射液中制备提取出一种具有生物活性的环烯醚萜苷类苷化合物，并提供了其在制备治疗手足口病药物中的应用。
具体地说，本发明提供了一种环烯醚萜苷类化合物，其结构如式I所示：
本发明上述化合物命名为：6″-O-反式-阿魏酰基京尼平龙胆二糖苷(6″-O-trans-feruloylgenipin gentiobioside)。
本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取热毒宁注射液成品，用等体积的乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层；
(2)将步骤(1)所得正丁醇萃取物经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，乙醇-水梯度洗脱，得到水洗脱部位，25～35％乙醇洗脱部位，95％乙醇洗脱部位；
(3)将步骤(2)所得25～35％乙醇洗脱部位经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇比例为9∶1的馏分E，馏分E经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水比例为5∶5的馏分E-2，馏分E-2经HW-40柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水比例为4∶6的馏分E-2-2，馏分E-2-2经制备液相HPLC分离，得到本发明化合物。
上述制备方法中，步骤(3)所述制备液相色谱，以比例为4.3∶6.7的甲醇-水为流动相，检测波长为254与325nm，流速8mL/min，在制备液相上的保留时间为42.5min。
发明人通过理化性质和现代波谱学手段(UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR)对分离得到的化合物进行了结构鉴定，证实其为结构如式I所示的环烯醚萜苷化合物。
本发明的另一个目的在于提供一种式I所示化合物在制备治疗手足口病药物中的应用。发明人发现本发明化合物对手足口病EV71病毒有一定的抑制作用。
本发明的再一个目的在于提供一种药物组合物，包含上述式I所示化合物。
本发明还提供了一种治疗手足口病的药物组合物，含有治疗有效量的上述式I化合物以及一种或多种药学上可接受的载体。
附图说明
图1为本发明化合物的1H-NMR谱图；
图2为本发明化合物13C-NMR；
图3为本发明化合物的HMBC局部放大谱图；
图4为本发明化合物1H-1H COSY谱图局部放大图谱；
图5为本发明化合物的HMBC局部放大谱图；
图6为本发明化合物的HMBC局部放大谱图；
图7为本发明化合物的HSQC谱图；
图8为本发明化合物的主要HMBC与1H-1H COSY相关信息；
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1本发明化合物的制备
(1)取热毒宁注射液成品700g，用等体积的乙酸乙酯和正丁醇分别萃取三次，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层；
(2)将步骤(1)所得正丁醇萃取物经HP-20大孔吸附树脂分离，乙醇-水梯度洗脱，得到水洗脱部位，30％乙醇洗脱部位，95％乙醇洗脱部位；
(3)将步骤(2)所得30％乙醇洗脱部位经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇比例为9∶1的馏分E，馏分E经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水比例为5∶5的馏分E-2，馏分E-2经HW-40柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水比例为4∶6的馏分E-2-2，馏分E-2-2400mg，馏分E-2-2经制备液相HPLC分离，以比例为4.3∶6.7的甲醇-水为流动相，检测波长为254和325nm，流速8mL/min，制备液相的保留时间为42.5min，分离所得溶液干燥，得到本发明化合物13.4mg。
实施例2本发明化合物的结构鉴定
黄色无定型粉末，Molish反应阳性。ESI-MS(positive)给出m/z749[M+Na]+；ESI-MS(negative)给出m/z725[M-H]-，提示化合物分子量为726。HR-ESI-Q-TOF-MS给出m/z749.2369[M+Na]+(计算值为749.2374)，确定化合物分子式为C33H42O18，计算不饱和度为13。
本发明化合物的1H-NMR(600MHz，in CD3OD)图谱(见图1)，低场区显示一组反式烯氢信号[δ7.63(1H，d，J＝15.9Hz，H-3″′)，6.40(1H，d，J＝15.9Hz，H-2″′)]和相互偶合的芳香质子信号[δ7.20(1H，brs，H-9″′)，δ7.07(1H，brd，J＝7.2Hz，H-5″′)，6.80(1H，d，J＝7.8Hz，H-6″′)]提示结构中存在1，3，4三取代苯环。高场区δ3.88(3H，s，8″′-OCH3)处显示一个甲氧基信号，结合13C-NMR(150MHz，in CD3OD)(见图2)信号：127.6(C-4″′)，δ124.3(C-5″′)，116.5(C-6″′)，150.8(C-7″′)，149.4(C-8″′)，111.7(C-9″′)苯环上的6个碳信号。
在HMBC谱(见图3)上可以看到烯氢质子信号H-3″′(δ7.63)与C-4″′(δ127.6)，C-5″′(δ124.3)，9″′(δ111.7)和C-1″′(δ169.6)；H-2″′(δ6.43)与C-1″′(δ169.6)和C-4″′(δ127.6)远程相关，提示分子中含有一个阿魏酰基的结构单元。糖端基质子信号[δ4.71(1H，d，J＝7.8Hz，H-1′)和4.40(1H，d，J＝7.8Hz，H-1″)]，提示两个葡萄糖残基的构型均为β型。在HMBC谱中，相关峰H-6′(δ4.11，3.76)/C-1″(δ105.0)，H-1″(δ4.40)/C-6′(δ70.2)，提示2个葡萄糖基为1→6连接，形成一个龙胆二糖基。
除去2个葡糖糖残基，1个C6-C3的阿魏酰基片段，结构中还剩余10个碳信号，包括1个甲氧基(δ51.7)，1个亚甲基(δ61.5)，5个次甲基(δ153.4，129.0，98.8，46.9，36.8)，以及3个季碳信号(其中1个酯羰基碳信号)(δ169.6，144.8，112.3)。结合分子式和不饱和度，本发明化合物为环烯醚萜苷类成分。
在1H-1H COSY谱中(见图4)，H-1/H-9/H-5/H-6/H-7之间具有明显的相关信号，结合HSQC谱，推出骨架片段A：C1-C9-C5-C6-C7。
在HMBC谱中(见图5)，相关峰H-3/C-1，4，5，11与H-7/C-5，9，10，构建了该化合物的苷元：京尼平(结构片段B)。综合以上分析，本发明化合物为取代有阿魏酰基的环烯醚萜二糖苷。各结构片段的连接位点可以通过HMBC谱进行确定。
HMBC放大谱中(见图6)，H-1(δ5.13)/C-1′(δ100.6)和H-1′(δ4.71)/C-1(δ98.8)的远程相关峰，提示龙胆二糖基取代于苷元的C-1位；糖基H-6″(δ4.53，4.30)与羰基C-1″′(δ169.1)具有远程相关，提示芥子酰基连接在龙胆二糖基的C-6″位。
综合以上分析，将该化合物鉴定为6″-O-反式-阿魏酰基京尼平龙胆二糖苷。
综合HSQC(图7)和HMBC谱信息(图8)，对化合物2的全部碳信号和氢信号进行了归属(表1)。经过SciFinder Scholar网络检索，未发现相关报道，表明本发明化合物为一个新的环烯醚萜苷类化合物。
表1化合物的核磁数据(氘代甲醇，1H-NMR600MHz，13C-NMR150MHz)
实施例3本发明化合物体外抗手足口病EV71病毒药物检测
1.材料
1.1毒株手足口病EV71病毒，实验室传代保存。
1.2细胞模型猴肾细胞系Vero，实验室传代保存。培养条件：DMEM+10％胎牛血清，37℃，5％CO2。
2.原理和方法
2.1药物的细胞毒性检测
采用了(Invitrogen)试剂盒检测药物对细胞的毒性作用
实验原理：是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸光度变化和荧光信号。易溶于水，其氧化形式进入细胞后经线粒体酶还原产生可测量的荧光及颜色变化，用于细胞活性和细胞增殖的定量分析以及体外细胞毒性研究。这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和比色指示剂的能力，受损和无活性细胞具有较低的天然代谢活性，对应的信号较低。因此荧光信号强弱，可以反映细胞活性的高低。
方法步骤：Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。用细胞维持液(DMEM+5％血清)将药物从2倍起始浓度连续3倍梯度稀释6个梯度，每浓度梯度单孔检测。加药培养48h后，加入37℃孵育2h，荧光检测的还原情况，激发光57Onm，发射光595nm。
细胞活性(％)＝(样品孔-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100％
2.2药物对EV71病毒的抑制试验
含报告基因GFP的EV71感染Vero细胞后，感染细胞会表达绿色荧光蛋白，通过在荧光显微镜下观察表达GFP绿色荧光的细胞数目，就可以反映出EV71病毒的增殖情况。
方法步骤：
Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。药物从4倍最高测试浓度起连续3倍梯度稀释6个梯度；将稀释好的药物加入孔中，4h后加入病毒上清液进行感染，置于37℃细胞培养箱培养24h，在荧光显微镜下拍照，对荧光细胞进行计数。
实验设无药物对照孔(病毒感染后未加药物孔)，阳性药物对照孔(盐酸胍GuHCl)。
抑制率(％)＝(无药物对照孔-样品孔)/无药物对照孔×100％
3.结果
3.1药物样品对细胞的毒性检测及对EV71抑制活性检测
药物样品稀释所用溶剂，最高溶解浓度，最高测试浓度，CC50，EC50以及SI(选择指数)如表2所示。
表2实验结果
4.结论
本发明化合物表现出明显毒性，且在显微镜下观察到大部分细胞变圆并有裂解，在(100μM)时也有明显毒性，其SI值为10.7，显示其对手足口病EV71病毒有一定的抑制作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种环烯醚萜苷类化合物，其结构如式I所示：
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取热毒宁注射液成品，用等体积的乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层；
(2)将步骤(1)所得正丁醇萃取物经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，乙醇-水梯度洗脱，得到水洗脱部位，25～35％乙醇洗脱部位，95％乙醇洗脱部位；
(3)将步骤(2)所得25～35％乙醇洗脱部位经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇比例为9∶1的馏分E，馏分E经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水比例为5∶5的馏分E-2，馏分E-2经HW-40柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水比例为4∶6的馏分E-2-2，馏分E-2-2经制备液相HPLC分离，得到本发明化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述制备液相色谱，以比例为4.3∶6.7的甲醇-水为流动相，检测波长为254与325nm，流速8mL/min，在制备液相上的保留时间为42.5min。
4.权利要求1所述化合物在制备治疗手足口病药物中的应用。
5.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述化合物。
6.一种用于治疗手足口病药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的权利要求1所述化合物和药学上可接受的载体。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1637009A (zh) * | 2003-12-22 | 2005-07-13 | 罗何生 | 地黄总苷提取物的提取工艺 |
| CN1706860A (zh) * | 2005-05-24 | 2005-12-14 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种用栀子果实制备总环烯醚萜苷的方法 |
| CN1706859A (zh) * | 2005-05-24 | 2005-12-14 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种用栀子果实制备高纯度栀子苷的方法 |
| CN101704857A (zh) * | 2009-09-25 | 2010-05-12 | 中国中医科学院中药研究所 | 一种女贞子专属性成分特女贞苷的分离纯化工艺 |
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2013
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1637009A (zh) * | 2003-12-22 | 2005-07-13 | 罗何生 | 地黄总苷提取物的提取工艺 |
| CN1706860A (zh) * | 2005-05-24 | 2005-12-14 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种用栀子果实制备总环烯醚萜苷的方法 |
| CN1706859A (zh) * | 2005-05-24 | 2005-12-14 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种用栀子果实制备高纯度栀子苷的方法 |
| CN101704857A (zh) * | 2009-09-25 | 2010-05-12 | 中国中医科学院中药研究所 | 一种女贞子专属性成分特女贞苷的分离纯化工艺 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HAI-BO LI，等: "Iridoid and bis-iridoid glucosides from the fruit of Gardenia jasminoides", 《FITOTERAPIA》 * |
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