CN104086676B

CN104086676B - 一种环糊精酯化衍生物、制备方法及其应用

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Publication number: CN104086676B
Application number: CN201410346398.4A
Authority: CN
Inventors: 卢宇; 王德云; 赵晓娟; 潘华荣; 侯继波; 胡元亮
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2014-07-18
Publication date: 2017-01-25
Anticipated expiration: 2034-07-18
Also published as: CN104086676A

Abstract

本发明提供一种环糊精酯化衍生物、制备方法及其应用，属于水包油佐剂技术领域。所述环糊精酯化衍生物，是由环糊精经月桂酰氯酯化和硫酸酯化后得到。本发明还提供所述环糊精酯化衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）环糊精与酰氯进行酯化反应；（2）步骤（1）反应后得到的混合物与氯磺酸进行酯化反应；（3）取步骤（2）反应后得到的混合物，调节pH至6.8‑7.2，除去溶剂，取沉淀溶解、透析、干燥后得到环糊精酯化衍生物。本发明还提供一种水包油型佐剂及兽用疫苗。采用该环糊精酯化衍生物制备的水包油型佐剂，具有良好的热稳定性和离心稳定性，能显著增提高抗原免疫活性。本发明环糊精酯化衍生物的制备方法，该方法简单，硫酸根的取代度低，月桂酰基的取代度高，收率高。

Description

一种环糊精酯化衍生物、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于水包油佐剂技术领域，具体涉及一种环糊精酯化衍生物、制备方法及其应用。

背景技术

目前油乳剂疫苗有三种剂型：油包水(W/O)型、水包油包水(W/O/W)型和水包油(O/W)型。W/O剂型免疫活性最强，但毒副反应大、注射困难；W/O/W免疫活性也较强，但热稳定性差、保存期短；O/W剂型毒副作用小、使用方便、热稳定性好，但是免疫活性较弱。MF59是首个实现商品化应用的O/W剂型佐剂，用其制备的人用流感疫苗在欧洲和美国获得上市。该佐剂的油为角鲨烯，具有安全、毒副作用极小等优点，表面活性剂为吐温和司本系列产品。但是，该佐剂的免疫活性相对较弱，仅能协助诱导微弱的免疫应答，尚不能满足养兽用疫苗的质量要求。另外，角鲨烯(或其类似物角鲨烷)的价格昂贵，也很难在兽用疫苗产品中广泛应用。法国SEPPIC公司用白油替代角鲨烯，用吐温和司本系列产品作为表面活性剂开发了一种O/W佐剂(ISA15A VG)，免疫活性也较弱。

发明内容

本发明的目的是提供一种环糊精酯化衍生物，采用该环糊精酯化衍生物制备的水包油型佐剂，具有良好的热稳定性和离心稳定性，能显著增提高抗原免疫活性。

本发明的另一目的是提供环糊精酯化衍生物的制备方法，该方法简单，硫酸根的取代度低，月桂酰基的取代度高，收率高。

本发明的再一目的是提供水包油型佐剂，稳定性好，能显著增提高抗原免疫活性。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种环糊精酯化衍生物，是由环糊精经月桂酰氯酯化和硫酸酯化后得到。

在本发明中，所述环糊精酯化衍生物中硫酸根的取代度为1.2-1.5，月桂酰基的取代度为1.3-1.7；所述环糊精为β环糊精。

本发明还提供所述环糊精酯化衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)环糊精与酰氯进行酯化反应；(2)步骤(1)反应后得到的混合物与氯磺酸进行酯化反应；(3)取步骤(2)反应后得到的混合物，调节pH至6.8-7.2，除去溶剂，取沉淀溶解、透析、干燥后得到环糊精酯化衍生物。

在本发明中，步骤(1)所述环糊精与酰氯进行酯化反应的方法为：在溶剂中，月桂酰氯与环糊精在55～80℃条件下进行酯化反应，所述溶剂为二甲基甲酰胺与吡啶的混合物。

在本发明中，步骤(2)的具体方法为：在步骤(1)反应后得到的混合物中加入氯磺酸，在55～80℃下反应。

在本发明中，月桂酰氯与环糊精的摩尔比为(1～4):1；氯磺酸与环糊精的摩尔比为(0.5～2.0):1。优选的技术方案中，所述的月桂酰氯与环糊精的摩尔比为(3.2-3.8):1，氯磺酸与环糊精的摩尔比为(0.8-1.2):1；步骤(1)和(2)的反应温度为55-65℃。

本发明还提供一种水包油型佐剂，包括所述环糊精酯化衍生物。

优选的技术方案中，所述水包油型佐剂，其特征在于由如下成分组成：

本发明还提供一种兽用疫苗，包括抗原和所述水包油型佐剂；所述疫苗为猪圆环病毒疫苗。

本发明环糊精酯化衍生物，硫酸根的取代度低，月桂酰基的取代度高，同时具有亲水和亲油基团，具备双亲功能。采用该环糊精酯化衍生物制备的水包油型佐剂，具有良好的热稳定性和离心稳定性，能显著增提高抗原免疫活性。

本发明采用月桂酰氯对环糊精进行酯化反应，然后采用硫酸酯化法(用氯磺酸进行磺化)，制备了环糊精酯化衍生物。本发明方法简单，收率高。

本发明水包油型佐剂，热稳定性和离心稳定性均合格，能显著提高抗原免疫活性。以猪圆环病毒2型(PCV-2)为模式抗原，通过体内免疫试验测评，该佐剂的免疫增强活性显著优于进口产品ISA15A VG。本发明提供的水包油型佐剂成功地解决了常规O/W剂型佐剂免疫活性较弱、不能满足兽用疫苗质量要求的难题，可以用于PCV-2等兽用疫苗的生产。

附图说明

图1是环糊精的标准曲线图；

图2是硫酸钠的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受这些实施例子的限制。

实施例1制备环糊精酯化衍生物

(1)材料与仪器

试验药物：环糊精(分子量1135，β型，上海楷洋生物技术有限公司，批号T0008)、N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、硫酸、盐酸、氯磺酸、氨水(分析纯，南京化学试剂有限公司)；月桂酰氯(aladdin industrial corporation，批号F1228036)；铬酸钾、氯化钠、无水硫酸钠(西陇化工股份有限公司)。

主要仪器设备：DZF-6051真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；SHI-82A恒温水浴振荡器(常州国华电器有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-Ⅲ循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；KH-500DE数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器厂)；754紫外分光光度计(上海菁华科技有限公司)；LGJ-18冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)。

(2)糖含量、硫酸根取代度、月桂酰基取代度的测定方法

将待测样品放入真空干燥箱中50℃干燥至恒重(6h以上)，测定游离脂肪酸的比例、SO₄ ²⁺质量和糖的质量。

游离脂肪酸比例的测定：干燥后样品(Ag)溶于4.0mol/L的HCl水溶液中，用等体积的氯仿进行抽提、萃取，过滤后，取沉淀干燥，干燥后的沉淀质量为Bg。游离脂肪酸的比例(g/Kg)＝(A－B)÷A×1000。

SO₄ ²⁺的质量：用超声酸性铬酸钡分光光度法法测定样品中SO₄ ²⁺的质量。以无水硫酸钠为标准品，用分光光度计测定不同浓度硫酸钠溶液在375nm处的吸光度值(A375值)，得到硫酸钠浓度与A375的标准曲线和线性方程(图2)。取干燥后样品(Ag)溶于4.0mol/L的HCl水溶液中，100℃作用6h，测定A375。根据硫酸钠浓度与A375的线性方程，计算出SO₄ ²⁺的质量(Cg)。

样品中糖的质量测定：用苯酚硫酸法测定样品中糖的质量。以环糊精为标准品，用分光光度计测定不同浓度环糊精在490nm处的吸光度值(A490值)，绘制环糊精浓度与A490的标准曲线和线性方程。取一定质量(Ag)的样品溶于4.0mol/L的HCl溶液中，100℃作用6h，测定A490，根据线性方程计算样品中糖的质量(Dg)。

硫酸根取代度(Sulphate/monosaccharide)＝C÷D×162÷96。

月桂酰基取代度(Lipid/monosaccharide)＝(A－C－D－B)÷D×162÷200。

(3)环糊精酯化衍生物的制备

1)无水二甲基甲酰胺与无水吡啶按照体积比4:1混合，得到二甲基甲酰胺与吡啶混合液；

2)首先对环糊精进行真空干燥预处理，然后取400mg溶于10mL二甲基甲酰胺和吡啶混合液中，得到环糊精溶液；取0.8ml、1.6ml和2.4ml月桂酰氯分别溶于2mL二甲基甲酰胺和吡啶混合液，得到不同月桂酰氯溶液；取0.9ml、1.8ml和3.6ml氯磺酸分别溶于二甲基甲酰胺和吡啶混合液，得到不同浓度氯磺酸溶液，氯磺酸与二甲基甲酰胺和吡啶混合液的体积比为1:2。

3)再按表1正交试验设计中月桂酰氯与环糊精的摩尔比，将月桂酰氯溶液与环糊精溶液混合，按表1调整各试验反应温度，进行酯化反应，反应时间为条件6h。

4)然后按表1设定的氯磺酸与环糊精摩尔比，取不同浓度的氯磺酸溶液加入步骤3)反应后混合物中，按表1调整各试验反应温度，酯化反应6h，冷却至室温；

5)用NaOH溶液调节步骤4)反应后混合物的pH至7.0±0.2，通过减压蒸馏法(60℃)去除溶剂，将沉淀用蒸馏水重悬，至流动的水中透析(4℃，7天)除去杂质，真空冷冻干燥获得环糊精酯化衍生物。

表1是3因素3水平正交试验表(L₉(3⁴)正交表)

表中：按照各反应中加入400μmol环糊精来计算对应摩尔比所需试剂的量；“()”内体积表示：在反应体系中加入了400mg(400μmol)环糊精时，为了调整月桂酰氯或氯磺酸与环糊精摩尔比需要加入的月桂酰氯或氯磺酸体积。

根据硫酸根取代度和月桂酰基取代度计算各因素的极差值R和r，评价3种因素的影响，再用方差分析探讨各因素不同水平对硫酸根取代度和月桂酰基取代度的影响。

(4)结果与分析

1)糖浓度标准曲线的绘制：以环糊精标准溶液浓度为横坐标(X)，吸光值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，分别得到环糊精标准曲线Y＝15.191X+0.0056，R²＝0.9995。标准曲线见图1。

2)硫酸根含量的标准曲线的绘制：以硫酸钠对照品溶液浓度为横坐标(X)，吸光值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到标准曲线Y＝35.22X－0.1804，R²＝0.9993。标准曲线见图2。

3)环糊精正交试验结果如表2所示，在70℃、月桂酰氯与环糊精摩尔比3.6、氯磺酸与环糊精摩尔比2.0的条件下的硫酸根取代度最大，达1.85，以硫酸根取代度为指标的极差R可以看出，各因素对硫酸根取代度的影响排序为B＞A＞C，氯磺酸与环糊精摩尔对硫酸根取代度的影响最大；在60℃、月桂酰氯与环糊精摩尔比3.6、氯磺酸与环糊精摩尔比1.0的条件下的月桂酰基取代度最大，达1.7，以月桂酰基取代度为指标的极差r值可见，各因素对月桂酰基取代度的影响排序为B＞A＞C，氯磺酸与糖分子比对月桂酰基取代度的影响最大。

表2环糊精的L₉(3⁴)正交试验结果

4)以硫酸根取代度为指标的方差分析结果如表3所示，可见月桂酰氯与环糊精摩尔比、氯磺酸与环糊精摩尔比和温度的F值分别为0.156、2.584和0.26，均小于F临界值5.14，说明各因素不同水平对硫酸根取代度的影响无显著差异。

表3以硫酸根取代度为指标的方差分析

因素	偏差平方和	自由度	F值	F临界值
					月桂酰氯与环糊精摩尔比	0.024	2	0.156	5.14
氯磺酸与环糊精摩尔比	0.398	2	2.584	5.14
					温度	0.04	2	0.26	5.14
误差	0.46	6

5)各因素与月桂酰基取代度的关系：以月桂酰基取代度为指标的方差分析结果如表4所示，可见月桂酰氯与环糊精摩尔比、氯磺酸与环糊精摩尔比和温度的F值分别为0.787、2.167和0.037，均小于F临界值5.14，说明各因素不同水平对月桂酰基取代度的影响无显著差异。

表4以月桂酰基取代度为指标的方差分析

因素	偏差平方和	自由度	F值	F临界值
					月桂酰氯与环糊精摩尔比	0.106	2	0.787	5.14
氯磺酸与环糊精摩尔比	0.293	2	2.176	5.14
					温度	0.005	2	0.037	5.14
误差	0.4	6

由以上结果可知，在制备条件为：月桂酰氯与环糊精的摩尔比为3.6，氯磺酸与环糊精的摩尔比为1.0和反应温度为60℃下，环糊精酯化衍生物硫酸根取代度较低、月桂酰基取代度较高。

实施例2环糊精酯化衍生物制备O/W乳液

(1)制备方法

取实施例1中月桂酰基取代度较高的6个环糊精酯化衍生物(SLP)，即试验号2、4、5、6、7、8制备的环糊精酯化衍生物，分别制备成相应的水包油型乳液A-SLP2、A-SLP4、A-SLP5、A-SLP6、A-SLP7和A-SLP8。

水包油型乳液制备方法：取环糊精酯化衍生物1.0g，溶于2.0g的吐温-80，乳化制备成SLP的吐温-80溶液；将SLP的吐温-80溶液缓慢加入到80ml的注射用水中，制成透明或者微乳白色的水相溶液；在水相溶液中加入8.0g白油，用注射用水补齐至终体积100ml，得到油水混合物；将油水混合物采用高压均质机乳化。均质完成后，滤器过滤灭菌，得到水包油型乳液。

(2)水包油型乳液物理性状的比较

检测6种制备的水包油型乳液及对照ISA15A VG的物理性状，比较稳定性和黏度。具体结果见表5。

表5显示6种乳液和ISA15A VG的物理性状

通过表5可以看出，采用本发明的6个环糊精酯化衍生物都能制备出相对稳定的O/W乳液，其中以A-SLP8最好，稳定性可达24个月，比对照品稳定。

实施例3环糊精酯化衍生物制备的O/W佐剂对小鼠免疫活性的研究

(1)配苗方法：PCV-2(猪圆环病毒2型)抗原液(ZJ/C株，灭活前病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml)分别与实施例2中的水包油型乳液A-SLP8和ISA15A VG按体积比1:1混合，制备出试验疫苗和对照疫苗1；将PCV-2抗原液与白油按体积比1:2.5混合均匀，制备出对照疫苗2，4℃保存备用。

(2)主要试剂：猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒(武汉科前动物生物制品有限责任公司。

(3)主要仪器：AH100D高压均质机(ATS工业***有限公司)；SatFax-2100型酶联免疫检测仪(美国西蒙公司)。

(4)动物分组及处理：将5周龄Balb/c雌性小鼠(购自扬州大学动物医学中心)40只随机分成4个组，每组10只。第1组小鼠皮下注射试验疫苗，0.2mL/只；第2组小鼠皮下注射对照疫苗1，0.2mL/只；第3组小鼠皮下注射对照疫苗2，0.2mL/只；第4组小鼠注射PBS缓冲液(pH为7.2,0.05mM)，0.2mL/只。于免疫后第7天(D₇)、14天(D₁₄)、21天(D₂₁)、28天(D₂₈)、35天(D₃₅)天进行眼眶静脉采血，分别采用猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒测定血清猪圆环病毒2型特异性IgG水平、IgG1抗体亚类和IgG2a抗体亚类的浓度。各组数据以(表示平均值，SE表示离散度)表示。应用SPSS20.0软件进行统计处理，分析比较各试验组之间差异显著性。

(5)结果

1)PCV-2特异性IgG水平测定：

对上述试验动物在免疫后的第7天(D₇)、14天(D₁₄)、21天(D₂₁)、28天(D₂₈)、35天(D35)各组随机抽取5只，眼眶静脉采血，将血样置于37℃温箱中温育2h，离心分离血清，于-20℃保存。PCV-2特异性IgG水平的测定按照ELISA试剂盒的说明书进行。

PCV-2特异性IgG的OD值动态变化：血清释100倍后采用ELISA试剂盒检测得到OD值，OD值的动态变化如下表6所示。免疫后五个采血时间点，第1组试验动物的PCV-2特异性IgG的OD值均显著高于第2组(P<0.05)，低于第3组。表明本发明制备的O/W佐剂优于进口同剂型制品，略差于W/O剂型，但能显著促进小鼠特异性抗体的产生。采用水包油型乳液A-SLP2、A-SLP4、A-SLP5、A-SLP6和A-SLP7(实施例2制备)按照试验疫苗的制备方法，制成相应的猪圆环病毒2型疫苗，免疫后，实验动物的PCV-2特异性IgG水平，优于对照疫苗1免疫后特异性IgG水平，略差于对照疫苗2免疫后特异性IgG水平，但能显著促进小鼠特异性抗体的产生。

表6OD值的动态变化(n＝5)

Groups

注射疫苗

D₇

D₁₄

D₂₁

D₂₈

D₃₅

第1组

试验疫苗

0.328±0.078^a

0.362±0.040^b

0.374±0.003^b

0.499±0.012^b

0.42±0.009^b

第2组

对照疫苗1

0.159±0.011^b

0.277±0.030^bc

0.305±0.023^c

0.230±0.024^d

0.295±0.019^c

第3组

对照疫苗2

0.309±0.066^a

0.500±0.039^a

0.480±0.012^a

0.833±0.052^a

0.589±0.038^a

第4组

PBS缓冲液

0.154±0.011^b

0.246±0.029^c

0.274±0.020^c

0.218±0.023^d

0.274±0.014^c

注：同列不含相同字母标准者差异显著(p<0.05)，下表同。

2)抗体亚类IgG1和IgG2a浓度的测定

对上述试验动物在免疫后的第7天(D₇)、14天(D₁₄)、21天(D₂₁)、28天(D₂₈)、35天(D₃₅)各组随机抽取5只，眼眶静脉采血，将血样置于37℃温箱中温育2h，离心分离血清，于-20℃保存。血清IgG1和IgG2a浓度的测定按照ELISA试剂盒的说明书进行。

IgG1和IgG2a浓度的动态变化如表7、8所示。在免疫后14天-35天里，第1组试验动物的IgG1和IgG2a浓度均显著高于第2组(P<0.05)，与第3组相当，差异不显著(P>0.05)。表明本发明制备的O/W佐剂在促进IgG1和IgG2a分泌方面优于进口同剂型制品，与W/O剂型相当。采用水包油型乳液A-SLP2、A-SLP4、A-SLP5、A-SLP6和A-SLP7(实施例2制备)按照试验疫苗的制备方法，制成相应的猪圆环病毒2型疫苗，免疫后，实验动物的IgG1和IgG2浓度，优于对照疫苗1免疫后IgG1和IgG2浓度，与对照疫苗2免疫后IgG1和IgG2浓度，说明本发明环糊精酯化衍生物能够显著促进小鼠特异性抗体的产生。

表7IgG1浓度的动态变化(μg·mL^-1)(n＝5)

Groups

注射疫苗

D₇

D₁₄

D₂₁

D₂₈

D₃₅

第1组

试验疫苗

353.11±11.92^a

369.02±18.61^a

327.73±13.78^a

275.45±5.61^a

223.56±6.70^a

第2组

对照疫苗1

320.17±3.94^b

315.61±5.66^b

291.62±11.24^a

223.94±2.48^b

208.41±2.62^ab

第3组

对照疫苗2

331.98±1.02^ab

329.58±1.27^b

317.51±1.97^a

234.03±2.03^b

224.32±3.99^a

第4组

PBS缓冲液

314.95±3.03^b

308.03±7.23^b

282.78±12.92^a

217.50±1.97^b

205.11±3.28^b

表8IgG2a浓度的动态变化(μg·mL^-1)(n＝5)

Groups

注射疫苗

D₇

D₁₄

D₂₁

D₂₈

D₃₅

第1组

试验疫苗

50.68±0.94^a

75.69±1.62^a

92.75±1.47^a

95.99±6.79^a

105.78±1.36^a

第2组

对照疫苗1

42.02±0.18^c

49.74±1.16^b

75.93±1.87b^c

81.64±0.94^b

96.53±0.48^ab

第3组

对照疫苗2

51.66±1.24^b

59.82±0.84^a

92.59±1.63^a

99.23±4.59^a

104.01±2.93^a

第4组

PBS缓冲液

39.59±0.60^c

47.53±1.08^b

71.14±4.08^c

79.01±1.63^b

91.47±1.74^b

实施例4环糊精酯化衍生物制备的O/W佐剂对猪免疫活性的研究

(1)材料与仪器

实施例3制备的试验疫苗，PCV-2商品疫苗(ZJ/C株，天津瑞普生物科技有限公司)；猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒(武汉科前动物生物制品有限责任公司)；

主要仪器：AH100D高压均质机(ATS工业***有限公司)；SatFax-2100型酶联免疫检测仪(美国西蒙公司)。

(2)动物分组及处理：

将15头30日龄的PCV-2阴性健康仔猪随机分成3个组，每组5头。第1组颈部皮下注射试验疫苗，2.0mL/头；第2组颈部皮下注射PCV-2商品疫苗，2.0mL/头；第3组，颈部皮下注射PBS缓冲液(pH7.2,0.05mM)，2.0mL/头。于免疫后28天颈静脉采血，采用ELISA法检测血清猪圆环病毒2型特异性IgG水平。各组数据以表示。应用SPSS20.0软件进行统计处理，分析比较各试验组之间差异显著性。

(3)猪圆环病毒2型特异性IgG检测结果

对上述试验猪在免疫后的第28天，颈静脉采血，将血样置于37℃温箱中温育2h，离心分离血清，于-20℃保存。猪圆环病毒2型特异性IgG水平的检测按照ELISA试剂盒的说明书进行。

血清释400倍后ELISA试剂盒检测的OD值如表9所示。免疫后28天，第1组的抗体水平与第2组相当，差异不显著(P>0.05)，说明用本发明制备O/W佐剂的疫苗能够满足兽用疫苗的商业开发需求。

表9血清释400倍后ELISA试剂盒检测的OD值(n＝5)

Groups	疫苗	D28
			第1组	试验疫苗	0.84±0.26^a
第2组	PCV-2商品疫苗	0.82±0.21^a
			第3组	PBS缓冲液	0.06±0.16^b

Claims

1.一种用于猪圆环病毒疫苗的水包油型佐剂，包括环糊精酯化衍生物，所述环糊精酯化衍生物是由环糊精经月桂酰氯酯化和硫酸酯化后得到；所述环糊精酯化衍生物中硫酸根的取代度为1.32，月桂酰基的取代度为1.7；所述环糊精为β环糊精。

2.根据权利要求1所述水包油型佐剂，其特征在于由如下成分组成：

3.根据权利要求2所述水包油型佐剂，其特征在于采用如下方法制备环糊精酯化衍生物：(1)环糊精与酰氯进行酯化反应；(2)步骤(1)反应后得到的混合物与氯磺酸进行酯化反应；(3)取步骤(2)反应后得到的混合物，调节pH至6.8-7.2，除去溶剂，取沉淀溶解、透析、干燥后得到环糊精酯化衍生物；步骤(1)所述环糊精与酰氯进行酯化反应的方法为：在溶剂中，月桂酰氯与环糊精在55～80℃条件下进行酯化反应，所述溶剂为二甲基甲酰胺与吡啶的混合物；步骤(2)的具体方法为：在步骤(1)反应后得到的混合物中加入氯磺酸，在55～80℃下反应。

4.根据权利要求3所述水包油型佐剂，其特征在于所述的月桂酰氯与环糊精的摩尔比为(3.2-3.8):1，氯磺酸与环糊精的摩尔比为(0.8-1.2):1；步骤(1)和(2)的反应温度为55-65℃。

5.一种兽用疫苗，包括抗原和权利要求1-3之一所述水包油型佐剂；所述疫苗为猪圆环病毒疫苗。