CN104072766B - 一种用于负载药物和基因的载体、药物-基因载体***及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于负载药物和基因的载体，由阳离子聚合物与酸酐反应得到，所述阳离子聚合物具有式I或式II所示结构。该载体可用于负载抗肿瘤药物和基因物质，得到药物‑基因载体***。本发明提供的药物‑基因载体***能够通过直接肺部给药的方式，用于肺部肿瘤的治疗，对药物和基因物质具有较高的利用率，从而使得对肺部肿瘤的治疗具有较好的效果。实验结果表明，本发明所提供的药物‑基因载体***对B16F10(高转移黑色素瘤)细胞在酸性条件下细胞毒性远远大于正常pH值＝7.4中的细胞毒性，且具有理想转染效率和沉默效率；将本发明提供的药物‑基因载体***经肺部直接给药治疗鼠黑色素瘤肺转移癌，具有良好的抑制肿瘤生长的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物载体技术领域，尤其涉及一种用于负载药物和基因的载体、药物载体***及其制备方法。
背景技术
近年来，癌症已经成为威胁人类健康的最大问题之一，因此癌症治疗备受研究者关注。除手术治疗、放射治疗外，化学治疗是癌症治疗的主要手段之一。目前，临床上常用的广谱抗肿瘤药主要包括阿霉素、依柔比星、正定霉素、吡柔比星等。
随着DNA重组技术的成熟，基因治疗作用一种新的治疗手段，在临床上可以用来治疗多种疾病，其中癌症是主要应用领域。基因治疗是指通过一定方式将正常基因或者有治疗作用的基因导入靶细胞以纠正基因缺陷或发挥治疗作用。基因物质的导入需要借助一定的技术手法或载体将外源基因导入细胞，因此，需要开发安全、有效的载体***。
由于药物和基因共同治疗可以降低多耐药机制的产生和毒副作用，因此其越来越受到人们关注，但是由于基因治疗存在缺乏靶向性和可控性、安全性等问题，单对某个基因进行功能干涉难以达到理想的治疗效果。此外，药物和基因的传输是影响治疗效果的主要原因之一，这成为了限制药物-基因治疗发展的重要因素。
目前，为了便于药物和基因的传输，现有技术开发了多种药物和基因的共传递载体***，如阳离子脂质体、高分子阳离子载体等，但在肺部给药中应用案例不多，如Minko团队采用脂质体和纳米硅球将化疗药物和基因共同传递到肺部(Innovative strategy fortreatment of lung cancer:targeted nanotechnology-based inhalation co-deliveryof anticancer drugs and siRNA.Taratula,O.,Garbuzenko,O.B.,Chen,A.M.,Minko,T.,Journal of drug targeting2011,19,900-914；Nanostructured lipid carriers asmultifunctional nanomedicine platform for pulmonary co-delivery of anticancerdrugs and siRNA.Taratula O,Kuzmov A,Shah M,Garbuzenko OB,Minko T.J ControlRelease.2013,10；171(3):349-57)，但其使用的载体具有毒性大，难以降解，不适合肺部直接给药，也就影响了对肺部肿瘤的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于负载药物和基因的载体、药物-基因载体***及其制备方法，本发明提供的载体负载药物和基因后，能够直接通过肺部给药的途径用于肺部肿瘤的治疗。
本发明提供了一种用于负载药物和基因的载体，由阳离子聚合物与酸酐反应得到；
所述阳离子聚合物具有式I或式II所示结构：
式I中，a为聚合度，a≥1；
式II中，b和c为聚合度，b≥1，c≥1。
优选的，所述酸酐为顺式乌头酸酐、2,3-二甲基马来酸酐、环己烷-1,2-二羧酸酐或四氢邻苯二甲酸酐。
优选的，所述阳离子聚合物与酸酐的摩尔比为1:(1.5～50)。
优选的，所述阳离子聚合物的数均分子量为600Da～35000Da。
本发明提供了一种药物-基因载体***，包括载体和负载在所述载体上的抗肿瘤药物和基因物质；
所述载体为上述技术方案所述的用于负载药物和基因的载体；
所述抗肿瘤药物通过与所述载体中的酸酐反应，负载在所述载体上。
优选的，所述抗肿瘤药物为阿霉素或柔红霉素。
优选的，所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
本发明提供了上述技术方案所述的药物-基因载体***的制备方法，包括以下步骤：
将抗肿瘤药物与酸酐反应，得到酸酐键合药；
将所述酸酐键合药与阳离子聚合物反应，得到载体负载药物***；
将所述载体负载药物***与基因物质混合孵育，得到药物-基因载体***。
优选的，所述酸酐键合药与阳离子聚合物的摩尔比为(1.5～50):1；
所述基因物质与所述高分子键合药的质量比为1:(1～80)。
优选的，所述孵育的时间为10分钟～30分钟。
本发明提供了一种用于负载药物和基因的载体，由阳离子聚合物与酸酐反应得到，所述阳离子聚合物具有式I或式II所示结构。该载体可用于负载抗肿瘤药物和基因物质，得到药物-基因载体***。本发明提供的药物-基因载体***能够通过直接肺部给药的方式，用于肺部肿瘤的治疗，对药物和基因物质具有较高的利用率，从而使得对肺部肿瘤的治疗具有较好的效果。实验结果表明，本发明所提供的药物-基因载体***对B16F10(高转移黑色素瘤)细胞在酸性条件下细胞毒性远远大于正常pH值＝7.4中的细胞毒性，且具有理想转染效率和沉默效率；将本发明提供的药物-基因载体***经肺部直接给药治疗鼠黑色素瘤肺转移癌时，具有良好的抑制肿瘤生长的效果。
另外，本发明提供的药物-基因载体***具有pH值响应性，从而使得该药物-基因载体***具有智能型可控释放的特性：在中性或者偏碱性即正常细胞周围，可以有效地抑制载体***中抗肿瘤药物的断裂；而在偏酸性的肿瘤组织周围，抗肿瘤药物可快速断裂并释放，从而发挥药效。
具体实施方式
本发明提供了一种用于负载药物和基因的载体，由阳离子聚合物与酸酐反应得到；
所述阳离子聚合物具有式I或式II所示结构：
式I中，a为聚合度，a≥1；
式II中，b和c为聚合度，b≥1，c≥1。
本发明提供了一种用于负载药物和基因的载体，由阳离子聚合物与酸酐反应得到，所述阳离子聚合物具有式I或式II所示结构。该载体可用于负载抗肿瘤药物和基因物质，得到药物-基因载体***。本发明提供的药物-基因载体***能够通过直接肺部给药的方式，用于肺部肿瘤的治疗，对药物和基因物质具有较高的利用率，从而使得对肺部肿瘤的治疗具有较好的效果。
在本发明中，所述阳离子聚合物与酸酐反应，所述酸酐会与所述阳离子聚合物结构中的胺基反应，从而将酸酐键合在所述阳离子聚合物中，得到用于负载药物和基因的载体。
在本发明中，所述阳离子聚合物具有式I或式II所示结构：
式I中，a为聚合度，a≥1；
式II中，b和c为聚合度，b≥1，c≥1。
在本发明中，所述阳离子聚合物的数均分子量优选为600Da～35000Da，更优选为1000Da～30000Da。
本发明对所述阳离子聚合物的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的具有上述结构的阳离子聚合物即可，如可以采用上述结构的阳离子聚合物的市售商品。
在本发明中，所述酸酐优选为顺式乌头酸酐、2,3-二甲基马来酸酐、环己烷-1,2-二羧酸酐或四氢邻苯二甲酸酐。本发明对所述酸酐的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的上述酸酐即可，如可以采用上述种类酸酐的市售商品。
在本发明中，所述阳离子聚合物与所述酸酐的摩尔比优选为1:(1.5～50)，更优选为1:(3～40)，最优选为1:(5～30)。
在本发明中，所述阳离子聚合物与酸酐的反应优选在避光条件下进行；优选先将阳离子聚合物的盐酸盐溶解，得到阳离子聚合物盐酸盐溶液；将活化后的酸酐与阳离子聚合物盐酸盐溶液混合，避光反应，得到用于负载药物和基因的载体。在本发明中，所述阳离子聚合物的盐酸盐优选按照以下方法制备得到：
将阳离子聚合物溶于水中，得到阳离子聚合物水溶液；
调节阳离子聚合物水溶液的pH值至6.8～8.0，冻干后得到阳离子聚合物的盐酸盐。
在本发明中，调节pH值采用的pH值调节剂优选盐酸，本发明对所述盐酸的质量浓度没有特殊的限制，能够将阳离子聚合物水溶液的pH值调至6.8～8.0即可。在本发明中，所述阳离子聚合物水溶液的pH值更优选为7.0～7.8。
在本发明中，所述溶解阳离子聚合物盐酸盐的溶剂优选为DMSO、甲醇或二次水，更优选为DMSO或甲醇；所述阳离子聚合物盐酸盐溶液的质量浓度优选为20～40mg/mL，更优选为30mg/mL。在本发明中，所述活化酸酐的物质优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；本发明对活化的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的EDS和NHS对酸酐的活化的技术方案即可。
在本发明中，所述阳离子聚合物与酸酐反应的时间优选为12h～70h，更优选为24h～48h；所述阳离子聚合物与酸酐反应的温度优选为20℃～40℃，更优选在室温下进行，无需进行加热或降温。
本发明提供了一种药物-基因载体***，包括载体和负载在所述载体上的抗肿瘤药物和基因物质；
所述载体为上述技术方案所述的用于负载药物和基因的载体；
所述抗肿瘤药物通过与所述载体中的酸酐反应，负载在所述载体上。
在本发明中，所述抗肿瘤药物通过酸酐接枝在所述阳离子聚合物的伯胺基团上，可以降低阳离子聚合物的部分毒性，还能够复合带负电的基因物质，从而得到药物-基因载体***。
在本发明中，所述抗肿瘤药物优选为阿霉素或柔红霉素，更优选为阿霉素。在本发明中，所述阿霉素或柔红霉素结构中含有胺基，其能够与酸酐反应，从而通过酸酐键合在阳离子聚合物上，实现抗肿瘤药物的负载。
在本发明中，所述基因物质优选为质粒DNA或siRNA。
在本发明中，所述抗肿瘤药物与载体的摩尔比优选为(1.5～50):1，更优选为(3～40)，最优选为(5～30):1。
本发明还提供了上述技术方案所述药物-基因载体***的制备方法，包括以下步骤：
将抗肿瘤药物与酸酐反应，得到酸酐键合药；
将所述酸酐键合药与阳离子聚合物反应，得到载体负载药物***；
将所述载体负载药物***与基因物质混合孵育，得到药物-基因载体***。
本发明将抗肿瘤药物与酸酐反应，得到酸酐键合药。在本发明中，所述抗肿瘤药物优选为阿霉素或柔红霉素。本发明优选将抗肿瘤药物与酸酐溶解后，向其中加入三乙胺，避光反应，得到酸酐键合药。在本发明中，三乙胺能够中和抗肿瘤药物中的盐酸；所述三乙胺与所述抗肿瘤药物的摩尔比优选为(0.5～1):1，更优选为(0.6～0.8)：1。在本发明中，所述溶解抗肿瘤药物和酸酐的溶剂优选为无水DMF或DMSO，更优选为无水DMF。
在本发明中，所述抗肿瘤药物与酸酐的摩尔比优选为(0.5～3):1，更优选为1:1；所述抗肿瘤药物与所述溶剂的质量比优选为(0.1～1)：10，更优选为1:10。
在本发明中，所述抗肿瘤药物与酸酐反应的温度优选为20℃～40℃，更优选为25℃～35℃；具体的，将抗肿瘤药物与酸酐在室温下进行反应，无需加热或降温。
完成所述抗肿瘤药物和酸酐的反应后，本发明优选将得到的反应产物用乙酸乙酯溶解，再用饱和食盐水洗涤纯化，最后再无水硫酸盐中干燥，用冷肼抽干后得到酸酐键合药。本发明对所述乙酸乙酯的用量没有特殊的限制，能够将抗肿瘤药物和酸酐的反应产物充分溶解即可；所述饱和食盐水的pH值优选为1～4，更优选为2～3；所述无水硫酸盐优选为无水硫酸钠或无水硫酸镁。
得到酸酐键合药后，本发明将所述酸酐键合药与阳离子聚合物反应，得到载体负载药物***。本发明优选先将所述酸酐键合药进行活化；将活化后的酸酐键合药与阳离子聚合物进行反应。本发明对所述活化的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的活化酸酐的技术方案即可。本发明优选采用EDC和NHS对所述酸酐键合药进行活化。在本发明中，所述EDC、NHS和酸酐键合药的质量比优选为(1～2)：1，更优选为1.2:1；所述活化优选在避光的条件下进行；所述活化的时间优选为12h～48h，更优选为24h～36h。
本发明对所述酸酐键合药与阳离子聚合物的混合顺序没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的反应原料的混合顺序即可。本发明优选以阳离子聚合物盐酸盐为原料，将阳离子聚合物盐酸盐溶解，得到阳离子聚合物盐酸盐溶液；将活化后的酸酐键合药与所述阳离子聚合物盐酸盐溶液混合，避光反应，得到载体负载药物***。
在本发明中，所述阳离子聚合物盐酸盐的制备方法与上述技术方案所述的阳离子聚合物盐酸盐的制备方法一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述溶解阳离子聚合物盐酸盐的溶剂优选为DMSO、甲醇和二次水，更优选为DMSO或甲醇；所述阳离子聚合物盐酸盐溶液的质量浓度优选为20～40mg/mL，更优选为30mg/mL。在本发明中，所述酸酐键合药与所述阳离子聚合物的摩尔比优选为(1.5～50):1，更优选为(3～40):1，最优选为(5～30):1。在本发明中，所述酸酐键合药与所述阳离子聚合物反应的温度优选为20℃～40℃，更优选为25℃～35℃；具体的，本发明可以将酸酐键合药与阳离子聚合物在室温下反应，无需加热或降温；所述酸酐键合药与所述阳离子聚合物反应的时间优选为12h～70h，更优选为24h～48h。
酸酐键合药与阳离子聚合物反应完成后，本发明优选将得到的反应产物进行透析和冻干处理，得到载体负载药物***。本发明对所述透析和冻干处理的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的透析和冻干处理的技术方案即可；在本发明中，所述透析采用的透析袋的截留量优选为3000Da～7000Da，更优选为4000Da～6000Da。
得到载体负载药物***后，本发明将所述载体负载药物***与基因物质混合孵育，得到药物-基因载体***。本发明优选将所述载体负载药物***和基因物质在溶剂中进行孵育；为了提高孵育效果，本发明优选将基因物质和载体负载药物***分别溶解后，将得到的基因物质溶液和载体负载药物***溶液混合，进行孵育。
在本发明中，所述基因物质优选为质粒DNA或siRNA；所述基因物质与所述载体负载药物***的质量比优选为1:(1～80)，更优选为1:(2～20)，最优选为1:(5～15)。所述孵育采用的溶剂优选为水、PBS溶液或无血清培养基，更优选为水。本发明对所述水的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的基因孵育过程中采用的水即可。
在本发明中，所述孵育的温度优选为0℃～35℃，更优选为10℃～35℃；具体的，本发明可以将基因物质和载体负载药物***在室温下进行孵育，无需进行加热或降温；所述孵育的时间优选为10分钟～30分钟，更优选为15分钟～25分钟。
本发明测试了得到的药物-基因载体***的pH值响应性能，将药物-基因载体***在不同pH值条件下对B16F10黑色素瘤细胞进行细胞毒性试验，结果显示，本发明提供的药物-基因载体***在酸性条件下的细胞毒性远远大于正常pH值条件下的细胞毒性；
本发明还将得到的药物-基因载体***对B16F10黑色素瘤细胞进行转染效率和基因沉默效果测定，结果表明，其具有理想的转染效率和基因沉默效率；
本发明所提供的基因载体***用于体内实验时，经肺部直接给药治疗鼠黑色素瘤肺转移癌，具有良好的抑制肿瘤生长的效果。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的用于负载药物和基因的载体、药物-基因载体***及其制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将60mg乌头酸酐与200mg的DOX溶于20mL的DMF溶剂中，向其中加入58μL的三乙胺，常温下避光反应48小时，反应完成后，将得到的反应产物用500mL乙酸乙酯溶解，用pH值为3的饱和食盐水洗涤纯化，然后用pH为7的饱和食盐水洗涤至中性，将纯化产物在无水硫酸钠中干燥，用冷肼抽干得到酸酐键合药；
将得到的酸酐键合药取100mg，用10mL DMSO溶解，向其中加入19.73mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和32.74mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)避光活化24小时后，向其中加入3mL质量浓度为30mg/mL数均分子量为1800的聚乙烯亚胺盐酸盐的DMSO溶液，在30℃下反应48小时，反应结束后，将得到的反应液用7000Da的透析袋透析3天，换水6次，产物经冷冻干燥后，得到载体负载阿霉素***(PEI-酸酐-DOX)。
参见表1，表1为本发明实施例1～6采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例2
按照实施例1的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中溶解乌头酸酐和DOX的溶剂为DMSO，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为1800:14000。
参见表1，表1为本发明实施例1～6采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例3
按照实施例1的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，溶解酸酐键合药的溶剂为甲醇，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为1800:21000。
参见表1，表1为本发明实施例1～6采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例4
按照实施例1的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中的酸酐为环己烷-1,2-二羧酸酐，DOX的用量为200mg。
参见表1，表1为本发明实施例1～6采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例5
按照实施例4的技术方案制备得到的PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为1800:14000。
参见表1，表1为本发明实施例1～6采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例6
按照实施例4的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为1800:21000。
参见表1，表1为本发明实施例1～6采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
表1实施例1～6的不同原料比例及产物的颗粒大小和表面电位
实施例7
将60mg乌头酸酐与200mg的DOX溶于20mL的DMF溶剂中，向其中加入58μL的三乙胺，常温下避光反应48小时，反应完成后，将得到的反应产物用500mL乙酸乙酯溶解，用pH值为3的饱和食盐水洗涤纯化，然后用pH为7的饱和食盐水洗涤至中性，将纯化产物在无水硫酸钠中干燥，用冷肼抽干得到酸酐键合药；
将得到的酸酐键合药取100mg，用10mL DMSO溶解，向其中加入19.73mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和32.74mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)避光活化24小时后，向其中加入3mL质量浓度为30mg/mL数均分子量为600的聚乙烯亚胺盐酸盐的DMSO溶液，在30℃下反应48小时，反应结束后，将得到的反应液用7000Da的透析袋透析3天，换水6次，产物经冷冻干燥后，得到载体负载阿霉素***(PEI-酸酐-DOX)。
参见表2，表2为本发明实施例7～12采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例8
采用实施例7的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，溶解乌头酸酐和DOX的溶剂为DMSO，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为600:14000。
参见表2，表2为本发明实施例7～12采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例9
按照实施例7的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，溶解酸酐键合药的溶剂为甲醇，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为600:21000。
参见表2，表2为本发明实施例7～12采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例10
按照实施例7的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中的酸酐为环己烷-1,2-二羧酸酐，DOX的用量为200mg。
参见表2，表2为本发明实施例7～12采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例11
按照实施例10的技术方案制备得到的PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为600:14000。
参见表2，表2本发明实施例7～12采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例12
按照实施例10的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为600:21000。
参见表2，表2为本发明实施例7～12采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
表2本发明实施例7～12采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位
实施例13
将60mg乌头酸酐与200mg的DOX溶于20mL的DMF溶剂中，向其中加入58μL的三乙胺，常温下避光反应48小时，反应完成后，将得到的反应产物用500mL乙酸乙酯溶解，用pH值为3的饱和食盐水洗涤纯化，然后用pH为7的饱和食盐水洗涤至中性，将纯化产物在无水硫酸钠中干燥，用冷肼抽干得到酸酐键合药。
将得到的酸酐键合药取100mg，用10mL DMSO溶解，向其中加入19.73mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和32.74mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)避光活化24小时后，向其中加入3mL质量浓度为30mg/mL数均分子量为25000的聚乙烯亚胺盐酸盐的DMSO溶液，在30℃下反应48小时，反应结束后，将得到的反应液用7000Da的透析袋透析3天，换水6次，产物经冷冻干燥后，得到载体负载阿霉素***(PEI-酸酐-DOX)。
参见表3，表3为本发明实施例13～18采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例14
采用实施例13的技术方案，制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，溶解乌头酸酐和DOX的溶剂为DMSO，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为25000:14000。
参见表3，表3为本发明实施例13～18采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例15
按照实施例13的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，溶解酸酐键合药的溶剂为甲醇，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为25000:21000。
参见表3，表3为本发明实施例13～18采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例16
按照实施例13的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中的酸酐为环己烷-1,2-二羧酸酐，DOX的用量为200mg。
参见表3，表3为本发明实施例13～18采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例17
按照实施例16的技术方案制备得到的PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为25000:14000。
参见表3，表3本发明实施例13～18采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
实施例18
按照实施例16的技术方案制备得到PEI-酸酐-DOX，不同的是，本实施例中，DOX的用量为200mg，PEI和酸酐键合药的分子量之比为25000:21000。
参见表3，表3为本发明实施例13～18采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位。
表3本发明实施例13～18采用的原料比例及产物的颗粒大小和表面电位
实施例19～54
将实施例1～18制备得到的PEI-酸酐-DOX用二次水溶解，配制质量浓度为1mg/mL的水溶液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌待用；
将质粒pGL-3用二次无菌水溶解，配制成质量浓度为0.02mg/mL的水溶液；
将PEI-酸酐-DOX水溶液和质粒pGL-3水溶液混合，在室温下孵育30分钟，得到药物-基因载体***。
参见表4，表4为本发明实施例19～54和比较例1采用的原料、比例及药物-基因载体***的粒径和表面电位。
比较例1
将聚乙烯亚胺PEI25k溶于二次水中，配制成浓度为1mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液，用孔径为0.22μm的无菌微孔滤膜过滤；
将质粒pGL-3溶于无菌二次水中，配制成浓度为0.02mg/mL的水溶液；
去所述聚乙烯亚胺水溶液与质粒水溶液混合，使聚乙烯亚胺与治疗的质量比为5:1，混合孵育30分钟，得到药物-基因载体***。
参见表4，表4为本发明实施例19～54和比较例1采用的原料、比例及药物-基因载体***的粒径和表面电位。
表4发明实施例19～54和比较例1采用的原料、比例及药物-基因载体***的粒径和表面电位
实施例55～90
采用实施例19的技术方案制备得到药物-基因载体***，不同的是，实施例55～90采用的基因物质为RNA，具体的为将Luc siRNA用二次无菌水溶解配制成浓度为0.02mg/mL的水溶液；
将PEI-酸酐-DOX水溶液和RNA水溶液混合，在室温下孵育30分钟，得到药物-基因载体***。
参见表5，表5为本发明实施例55～90和比较例2～3采用的原料、比例及药物-基因载体***的粒径和表面电位。
比较例2
将聚乙烯亚胺PEI25k溶于二次水中，配制成浓度为1mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液，用孔径为0.22μm的无菌微孔滤膜过滤；
将Luc siRNA溶于无菌二次水中，配制成浓度为0.02mg/mL的水溶液；
取所述聚乙烯亚胺水溶液与质粒水溶液混合，使聚乙烯亚胺与质粒的质量比为5:1，混合孵育30分钟，得到基因载体***。
参见表5，表5为本发明实施例55～90和比较例2～3采用的原料、比例及药物-基因载体***的粒径和表面电位。
比较例3
将聚乙烯亚胺PEI25k溶于二次水中，配制成浓度为1mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液，用孔径为0.22μm的无菌微孔滤膜过滤；
将阴性对照Rev siRNA溶于无菌二次水中，配制成浓度为0.02mg/mL的水溶液；
将所述聚乙烯亚胺水溶液与质粒水溶液混合，使聚乙烯亚胺与质粒的质量比为5:1，混合孵育30分钟，得到基因载体***。
参见表5，表5为本发明实施例55～90和比较例2～3采用的原料、比例及药物-基因载体***的粒径和表面电位。
表5本发明实施例55～90和比较例2～3采用的原料、比例及药物-基因载体***的粒径和表面电位
实施例91
载DNA转染效率的测试方法
(1)B16F10细胞的培养
细胞培养条件为37℃、体积分数为5％的二氧化碳培养箱中，细胞置于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，隔天传代或换新鲜培养液。
(2)体外转染
细胞融合度为80～90％时，用胰蛋白酶消化，每孔2×104细胞密度种植于96孔培养板中，培养过夜。转染时，分别将实施例19～54和比较例1得到的药物-基因载体***的样品加入至96孔板中，培养48小时。
(3)体外转染效率的测定
将培养液弃掉，用PBS洗涤两次后，加入细胞裂解液于负80℃冰箱中反复冻融，吹打均匀后加入荧光素酶底物，用分光光度计测定转染效率。结果如表6所示，表6为本发明实施例19～54和比较例1得到的药物-基因载体***的转染效率测试结果。
表6本发明实施例19～54和比较例1得到的药物-基因载体***的转染效率测试结果
| 实施例 | 转染效率，RLU/mg Protein |
| 比较例1 | 1.21×106 |
| 19 | 1.08×105 |
| 20 | 2.30×105 |
| 21 | 3.12×105 |
| 22 | 2.14×105 |
| 23 | 1.04×106 |
| 24 | 2.31×106 |
| 25 | 4.21×105 |
| 26 | 5.41×105 |
| 27 | 6.23×105 |
| 28 | 2.31×106 |
| 29 | 1.23×106 |
| 30 | 4.10×106 |
| 31 | 2.31×106 |
| 32 | 2.14×106 |
| 33 | 5.24×105 |
| 34 | 4.56×105 |
| 35 | 1.36×106 |
| 36 | 1.89×106 |
| 37 | 2.14×106 |
| 38 | 2.17×106 |
| 39 | 2.47×105 |
| 40 | 2.71×106 |
| 41 | 3.21×106 |
| 42 | 5.14×105 |
| 43 | 1.45×106 |
| 44 | 2.37×106 |
| 45 | 5.61×106 |
| 46 | 4.56×106 |
| 47 | 3.47×106 |
| 48 | 4.67×106 |
| 49 | 4.52×106 |
| 50 | 3.24×106 |
| 51 | 5.78×106 |
| 52 | 4.35×106 |
| 53 | 3.57×106 |
| 54 | 2.69×106 |
实施例92
介导沉默荧光素酶的Luc siRNA和阴性对照Rev siRNA对恒定表达荧光素酶的Huh7细胞的体外转染
(1)Huh7细胞的培养
细胞培养条件为37℃，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中，细胞置于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，隔天传代或换新鲜培养液。
(2)体外转染
细胞融合度为80～90％时，用胰蛋白酶消化，每孔2×104细胞密度种植于96孔培养板中，培养过夜。转染时，将实施例55～90和比较例2～3得到的药物-基因载体***的样品加入至96孔板中，培养48小时。
(3)体外转染效率的测定
将培养液弃掉，用PBS洗涤两次后，加入细胞裂解液于-80℃冰箱中反复冻融，吹打均匀后加入荧光素酶底物，用分光光度计测定转染效率。结果如表7所示，表7为本发明实施例55～90和比较例2～3得到的药物-基因载体***的转染效率测试结果。
表7本发明实施例55～90和比较例2～3得到的药物-基因载体***的转染
效率测试结果
| 实施例 | 转染抑制效率(％) |
| 比较例2 | 42 |
| 比较例3 | 5 |
| 55 | 31 |
| 56 | 41 |
| 57 | 26 |
| 58 | 35 |
| 59 | 28 |
| 60 | 26 |
| 61 | 30 |
| 62 | 35 |
| 63 | 19 |
| 64 | 28 |
| 65 | 26 |
| 66 | 27 |
| 67 | 34 |
| 68 | 28 |
| 69 | 26 |
| 70 | 18 |
| 71 | 25 |
| 72 | 34 |
| 73 | 41 |
| 74 | 28 |
| 75 | 29 |
| 76 | 35 |
| 77 | 36 |
| 78 | 47 |
| 79 | 42 |
| 80 | 46 |
| 81 | 35 |
| 82 | 39 |
| 83 | 38 |
| 84 | 51 |
| 85 | 54 |
| 86 | 48 |
| 87 | 45 |
| 88 | 46 |
| 89 | 49 |
| 90 | 47 |
实施例93
药物-基因载体***经肺部给药在体内pDNA转染中的应用
(1)B16F10细胞的培养
细胞培养条件为37℃、体积分数为5％的二氧化碳培养箱中，细胞置于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，隔天传代或换新鲜培养液。
(2)肿瘤接种
选择重量为18～20g左右的C57雄性小鼠，当细胞融合度为80～90％时，用胰蛋白酶消化，用PBS洗两次并计数，通过尾静脉注射1×104/只。
(3)体内转染
从第七天开始，将药物-基因载体***葡萄糖溶液经肺部给药装置直接喷射至小鼠肺部，其中基因浓度0.1mg/mL。给药组别的药物分别为比较例1，实施例19、21、23、31、33、35、43、45和47制备得到药物-基因载体***。
(4)体内转染效率的测定
体内转染3天后，小鼠安乐死，取出肺部，PBS洗涤两次，加入裂解液裂解，匀浆，加入荧光素酶底物，用分光光度计测定转染效率。结果如表8所示，表8为本发明实施例19～54和比较例1制备得到的药物-基因载体***的体内转染效率测试结果。
表8本发明实施例19、21、23、31、33、35、43、45和47以及比较例
1制备得到的药物-基因载体***的体内转染效率测试结果
| 实施例 | 转染效率，RLU/mg Protein |
| 比较例1 | 1.5×107 |
| 19 | 2.9×106 |
| 21 | 7.9×106 |
| 23 | 9.6×106 |
| 31 | 3.8×107 |
| 33 | 1.9×107 |
| 35 | 2.8×107 |
| 43 | 8.2×106 |
| 45 | 3.1×107 |
| 47 | 3.9×106 |
实施例94
药物-基因载体***经肺部给药在体内Bcl2siRNA转染中的应用
(1)B16F10细胞的培养
细胞培养条件为37℃，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中，细胞置于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，隔天传代或换新鲜培养液。
(2)肿瘤接种
选择重量为18～20g左右的C57雄性小鼠，当细胞融合度为80～90％时，用胰蛋白酶消化，用PBS洗两次并计数，通过尾静脉注射1×104/只。
(3)体内转染
从第七天开始，药物-基因载体***的葡萄糖溶液经肺部给药装置直接喷射至肺部，其中基因Bcl2siRNA浓度为0.1mg/mL，每周治疗一次。给药组别的药物分别为比较例3，实施例55、57、59、67、71、79、81、83对应样品，另外设置单纯给药组和单纯给Bcl2siRNA组，对照组为5％的葡萄糖溶液。
(4)治疗效果的测定
治疗第28天后，小鼠安乐死，取出肺部并称重。结果如表9所示，表9为本发明实施例55、57、59、67、71、79、81、83、比较例3得到的药物-基因载体***以及对照物对小鼠治疗效果。
表9本发明实施例55、57、59、67、71、79、81、83、比较例3得到的
药物-基因载体***以及对照物对小鼠治疗效果
| 实施例 | 肺的重量(mg) |
| 5％葡萄糖 | 780 |
| Bcl2siRNA | 741 |
| 比较例3 | 752 |
| 55 | 310 |
| 57 | 401 |
| 59 | 286 |
| 67 | 257 |
| 69 | 239 |
| 71 | 258 |
| 79 | 247 |
| 81 | 256 |
| 83 | 301 |
由表9可以看出，本发明提供的药物-基因载体***经小鼠肺部直接给药，对肺癌具有较好的治疗效果。
由以上实施例可知，本发明提供了一种用于负载药物和基因的载体，由阳离子聚合物与酸酐反应得到，所述阳离子聚合物具有式I或式II所示结构。该载体可用于负载抗肿瘤药物和基因物质，得到药物-基因载体***。本发明提供的药物-基因载体***能够通过直接肺部给药的方式，用于肺部肿瘤的治疗，对药物和基因物质具有较高的利用率，从而使得对肺部肿瘤的治疗具有较好的效果。实验结果表明，本发明所提供的药物-基因载体***对B16F10(高转移黑色素瘤)细胞在酸性条件下细胞毒性远远大于正常pH值＝7.4中的细胞毒性，且具有理想转染效率和沉默效率；将本发明提供的药物-基因载体***经肺部直接给药治疗鼠黑色素瘤肺转移癌时，具有良好的抑制肿瘤生长的效果。
另外，本发明提供的药物-基因载体***具有pH值响应性，从而使得该药物-基因载体***具有智能型可控释放的特性：在中性或者偏碱性即正常细胞周围，可以有效地抑制载体***中抗肿瘤药物的断裂；而在偏酸性的肿瘤组织周围，抗肿瘤药物可快速断裂并释放，从而发挥药效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于负载药物和基因的载体，由阳离子聚合物与酸酐反应得到；
所述阳离子聚合物具有式I或式II所示结构：
式I中，a为聚合度，a≥1；
式II中，b和c为聚合度，b≥1，c≥1；
所述酸酐为顺式乌头酸酐、2,3-二甲基马来酸酐、环己烷-1,2-二羧酸酐或四氢邻苯二甲酸酐；
所述药物为阿霉素或柔红霉素。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述阳离子聚合物与酸酐的摩尔比为1:(1.5～50)。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述阳离子聚合物的数均分子量为600Da～35000Da。
4.一种药物-基因载体***，包括载体和负载在所述载体上的抗肿瘤药物和基因物质；
所述载体为权利要求1～3任意一项所述的用于负载药物和基因的载体；
所述抗肿瘤药物通过与所述载体中的酸酐反应，负载在所述载体上；
所述抗肿瘤药物为阿霉素或柔红霉素。
5.根据权利要求4所述的药物-基因载体***，其特征在于，所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
6.一种如权利要求4～5任意一项所述的药物-基因载体***的制备方法，包括以下步骤：
将抗肿瘤药物与酸酐反应，得到酸酐键合药；
将所述酸酐键合药与阳离子聚合物反应，得到载体负载药物***；
将所述载体负载药物***与基因物质混合孵育，得到药物-基因载体***。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酸酐键合药与阳离子聚合物的摩尔比为(1.5～50):1；
所述基因物质与所述载体负载药物***的质量比为1:(1～80)。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的时间为10分钟～30分钟。
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