CN103709400A - 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物如式(I)所示。本发明在超支化的聚乙烯亚胺上接枝有疏水性的聚丙氨酸,减少了共聚物整体的电荷量,并有效降低了电荷密度,从而降低了共聚物的细胞毒性。所述的共聚物作为基因载体使用时,可以与基因物质紧密结合,转染效率高。本发明将超支化聚乙烯亚胺作为大分子引发剂引发L-丙氨酸N-羧酸酐开环聚合得到超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-丙氨酸接枝共聚物,其制备过程简便。
Description
技术领域
本发明涉及聚合物领域,特别涉及超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物及其制备方法。
背景技术
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。成功的基因治疗依赖于有效的基因载体,常见的载体分为病毒类载体和非病毒载体。病毒类载体包括逆转录病毒、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等。但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患,在基因治疗历史上首例患者死亡事件以及著名的法国“气泡婴儿”事件,在很大程度上都是由病毒类基因载体的不安全性造成的。非病毒载体多为高分子阳离子聚合物,因其安全、有效、无免疫原性等优点,已成为病毒类载体最有希望的替代者。阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)是非病毒类载体中受到关注最多的一个,它已经在体外和体内的转染实验中得到应用,但由于其毒性高、转染效率低、在体内运输过程的非特异性吸附以及没有靶向性的缺点,阻碍了它的进一步发展。
在众多已经报道的聚阳离子载体中,聚乙烯亚胺(PEI)由于其具有独特的“质子海绵效应”能够实现高效的基因传递而倍受关注[参见Boussif O,Zanta M.A,Behr J.P.et al.A Versatile Vector for Geneand Oligonucleotide Transfer into Cells in Culture and in Vivo–Polyethylenimine.PNAS,1995;92:7297-7301]。PEI的优点在于电荷密度集中,对基因物质有强的复合能力,在低质量(m/m)比即能获得最佳转染效率。
近来,研究者们围绕降低毒性和提高转染效率展开了一系列对PEI的改性工作。例如,人们将疏水链段胆固醇、聚己内酯、聚乳酸等接入PEI上得到两亲性的聚合物。在一定程度上降低的细胞毒性和转染效率。但这类聚合物制备方法相对复杂,并且转染效率也没有太大提高。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物及其制备方法,所述共聚物的细胞毒性低,对于基因物质的负载能力强,转染效率高。
本发明公开了一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物,如式(I)所示:
其中,n1,n2,n3,x和y均为聚合度,n1,n2,n3,x和y均大于或等于1;600≥x+y≥40;
150≥n1+n2+n3≥5。
本发明公开了一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物的制备方法,包括以下步骤:
将超支化聚乙烯亚胺、L-丙氨酸N-羧酸酐在有机溶剂中反应,得到式(I)所示的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物;
其中,n1,n2,n3,x和y均为聚合度,n1,n2,n3,x和y均大于或等于1;600≥x+y≥40;
150≥n1+n2+n3≥5。
优选的,所述超支化聚乙烯亚胺与L-丙氨酸N-羧酸酐的摩尔比为1:10~1:120。
优选的,所述有机溶剂为无水氯仿、二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺。
优选的,所述超支化聚乙烯亚胺的数均分子量为1800~25000。
优选的,所述超支化聚乙烯亚胺与有机溶剂的质量体积比为1g:(10~100)mL。
优选的,所述反应的温度为0~50℃,所述反应的时间为12~48小时。
本发明公开了上述技术方案所述的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物或上述技术方案所述方法制备的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物作为基因载体的应用。
与现有技术相比,本发明的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物如式(I)所示。本发明在超支化的聚乙烯亚胺上接枝有疏水性的聚丙氨酸,有效降低了电荷密度,从而降低了共聚物的细胞毒性。所述的共聚物作为基因载体使用时,可以与基因物质紧密结合,转染效率高。本发明将超支化聚乙烯亚胺作为大分子引发剂引发L-丙氨酸N-羧酸酐开环聚合得到超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-丙氨酸接枝共聚物,其制备过程简便。实验结果表明,在同等条件下,所述超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物对HeLa和293T细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为商业化PEI25K的20倍和7倍,在最佳转染比例范围内,细胞存活率在80%以上;其基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的Huh7以及CT26细胞的最高基因沉默效率均可达到90%以上。
附图说明
图1为实施例18制备的聚乙烯亚胺聚丙烯酸共聚物的细胞毒性测试图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例公开了一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物,如式(I)所示:
其中,n1,n2,n3,x和y均为聚合度,n1,n2,n3,x和y均大于或等于1;600≥x+y≥40,优选为500≥x+y≥100;
150≥n1+n2+n3≥5,优选为90≥n1+n2+n3≥30。所述超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物可以作为高效的两亲性聚阳离子基因载体使用。
本发明还提供了一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物的制备方法,包括以下步骤:
将超支化聚乙烯亚胺、L-丙氨酸N-羧酸酐在有机溶剂中反应,得到式(I)所示的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物;
其中聚合度n1,n2,n3,x,y均大于或等于1;600≥x+y≥40;
150≥n1+n2+n3≥5。
在本发明中,以超支化聚乙烯亚胺和L-丙氨酸N-羧酸酐为原料,经过超支化聚乙烯亚胺作为大分子引发剂引发L-丙氨酸N-羧酸酐发生开环聚合反应,得到式(I)所示的共聚物。所述超支化乙烯亚胺的数均分子量优选为1800~25000。所述超支化聚乙烯亚胺与L-丙氨酸N-羧酸酐的摩尔比优选为1:10~1:120,更优选为1:30~1:90。
所述机溶剂优选为无水氯仿、二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺。所述超支化聚乙烯亚胺与有机溶剂的质量体积比优选为1g:(10~100)mL。所述L-丙氨酸N-羧酸酐与有机溶剂的质量体积比优选为1g:(10~100)mL。所述反应的温度优选为0~50℃,更优选为20~30℃;所述反应的时间优选为12~48小时,更优选为20~40小时。
本发明还公开了上述技术方案所述的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物或上述技术方案所述方法制备的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物作为基因载体的应用。
本发明在超支化的聚乙烯亚胺上接枝有疏水性的聚丙氨酸,有效降低了电荷密度,从而降低了共聚物的细胞毒性。所述的共聚物作为基因载体使用时,可以与基因物质紧密结合,转染效率高。本发明将超支化聚乙烯亚胺作为大分子引发剂引发L-丙氨酸N-羧酸酐开环聚合得到超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-丙氨酸接枝共聚物,其制备过程简便。实验结果表明,在同等条件下,所述超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物对HeLa和293T细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为商业化PEI25K的20倍和7倍,在最佳转染比例范围内,细胞存活率在80%以上;其基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的Huh7以及CT26细胞的最高基因沉默效率均可达到90%以上。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明提供的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物及其制备方法进行说明,本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
以下实施例中,均以商业化生产的分子量为1800的纯聚乙烯亚胺(即为P1.8)和分子量为25000的纯聚乙烯亚胺(记为P25)为对照。
实施例1~12
在无水无氧条件下,按照丙氨酸N-羧酸酐(Ala-NCA)单体,与50ml无水氯仿投到干燥的反应器中,充入氮气保护,搅拌溶解;然后将数均分子量为1800的支化聚乙烯亚胺作为多胺引发剂溶解在50ml无水氯仿中,并加入反应器内。其中聚乙烯亚胺与Ala-NCA的摩尔比分别为1:10,1:20,1:30,1:40,1:50,1:60,1:70,1:80,1:90,1:,100,1:110和1:120。控温30℃搅拌反应20小时,反应完成后在***或正己烷中沉降,过滤,干燥滤饼,得到聚乙烯亚胺聚丙氨酸共聚物。
将得到的聚乙烯亚胺聚丙氨酸共聚物用水溶解后,用透析袋透析72小时,期间换水4-6次,冷冻干燥,得到聚乙烯亚胺-聚丙氨酸共聚物(PEI-PAla)。超支化聚乙烯亚胺(PEI)与丙氨酸N-羧酸酐(PEI-PAla)反应所投原料的质量比与产物分子量的对应关系列于表1。
表1实施例1~12原料的摩尔比与产物分子量的对应关系
实施例13~24
在无水无氧条件下,按照丙氨酸N-羧酸酐(Ala-NCA)单体,与50ml无水氯仿投到干燥的反应器中,充入氮气保护,搅拌溶解;然后将数均分子量为25000的支化聚乙烯亚胺作为多胺引发剂溶解在50ml无水氯仿中,并加入反应器内。其中聚乙烯亚胺与Ala-NCA的摩尔比分别为1:10,1:20,1:30,1:40,1:50,1:60,1:70,1:80,1:90,1:,100,1:110和1:120。控温40℃搅拌反应18小时,反应完成后在***或正己烷中沉降,过滤,干燥滤饼,得到聚乙烯亚胺聚丙氨酸共聚物。
将得到的聚乙烯亚胺聚丙氨酸共聚物用水溶解后,用透析袋透析72小时,期间换水4-6次,冷冻干燥,得到聚乙烯亚胺-聚丙氨酸共聚物(PEI-PAla)。超支化聚乙烯亚胺(PEI)与丙氨酸N-羧酸酐(PEI-PAla)反应所投原料的质量比与产物分子量的对应关系列于表2。
表2实施例13~24原料的摩尔比与产物分子量的对应关系
对实施例18制备的聚乙烯亚胺聚丙氨酸共聚物对HeLa细胞的细胞毒性测试通过采用噻唑蓝(MTT)比色法评价。
实验前24小时内,取对数生长期的HeLa细胞,胰酶消化后用DMEM稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后,每孔分别加入20μl含质量分数为0.5%MTT的PBS溶液。混合物在37℃继续作用4小时,加入200μl二甲基亚砜溶解MTT甲臢结晶10分钟。然后用酶标仪测试每孔的吸收,测试波长选用492nm。细胞存活率按下公式计算:
细胞存活率(%)=(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收,Acontrol是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收,每组实验重复三次,测试结果见图1。图1为实施例18制备的聚乙烯亚胺聚丙烯酸共聚物的细胞毒性测试图。图1中A为不同浓度的纯聚乙烯亚胺对于细胞存活率的影响;B为不同浓度的实施例18制备的聚乙烯亚胺聚丙烯酸共聚物对于细胞存活率的影响。由图1可知,本发明制备的实施例18制备的聚乙烯亚胺聚丙烯酸共聚物的细胞毒性很小。
实施例25
利用实施例1~24制备的聚乙烯亚胺-聚丙氨酸介导pGL3(荧光素酶质粒)对HeLa细胞的体外转染。
取人***细胞(HeLa细胞),在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
取出培养板,吸去培养液,PBS洗涤2次,加入裂解液裂解,然后加入荧光素底物,用光度计测定转染效率。表3给出了荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
表3聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导荧光素酶质粒的体外转染效率
实施例26
利用实施例1~24制备的聚乙烯亚胺-聚丙氨酸介导pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)对HeLa细胞的体外转染。
取人***细胞(HeLa细胞),在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
取出培养板,吸去培养液,PBS洗涤2次。绿色荧光蛋白(GFP)表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光,而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。表4给出了绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率。
表4聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
实施例27
利用实施例1~24制备的聚乙烯亚胺-聚丙氨酸介导pCMV-lacZ(β-半乳糖苷酶质粒)对HeLa细胞的体外转染。
取人***细胞(HeLa细胞),在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
细胞用0.01mol/L的PBS洗涤,用0.4%多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方为0.04%X-gal,5mmol/L亚铁***,5mmol/L高铁***和2mmol/LMgCl2),放置37℃,5%CO2孵育3h。阳性细胞呈深蓝色,计算阳性细胞的百分率。表5给出了β-半乳糖苷酶质粒的复合物的转染效率。
表5聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导β-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率
实施例28~30
利用聚乙烯亚胺-聚丙氨酸pGL3(荧光素酶质粒)、pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)、pCMV-lac Z(β-半乳糖苷酶质粒)对COS7细胞的体外转染.
(1)COS7细胞,在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
(2)体外转染
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板,吸去培养液,PBS洗涤2次,加入裂解液裂解,然后加入荧光素底物,用光度计测定转染效率。表6给出了荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
绿色荧光蛋白(GFP)表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光,而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。表7给出了绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率。
β-半乳糖苷酶染色
细胞用0.01mol/L的PBS洗涤,用0.4%多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方为0.04%X-gal,5mmol/L亚铁***,5mmol/L高铁***和2mmol/LMgCl2),放置37℃,5%CO2孵育3h。阳性细胞呈深蓝色,计算阳性细胞的百分率。表8给出了β-半乳糖苷酶质粒的复合物的转染效率。
表6聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导荧光素酶质粒的体外转染效率
表7聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
表8聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导β-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率
实施例31~33
利用聚乙烯亚胺-聚丙氨酸pGL3(荧光素酶质粒)、pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)、pCMV-lac Z(β-半乳糖苷酶质粒)对HEK-293细胞的体外转染。
(1)HEK-293细胞,在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
(2)体外转染
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板,吸去培养液,PBS洗涤2次,加入裂解液裂解,然后加入荧光素底物,用光度计测定转染效率。表9给出了荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
绿色荧光蛋白(GFP)表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光,而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。表10给出了绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率。
β-半乳糖苷酶染色
细胞用0.01mol/L的PBS洗涤,用0.4%多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方为0.04%X-gal,5mmol/L亚铁***,5mmol/L高铁***和2mmol/LMgCl2),放置37℃,5%CO2孵育3h。阳性细胞呈深蓝色,计算阳性细胞的百分率。表11给出了β-半乳糖苷酶质粒的复合物的转染效率。
表9聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导荧光素酶质粒的体外转染效率
表10聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
表11聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导β-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率
实施例34~36
利用聚乙烯亚胺-聚丙氨酸pGL3(荧光素酶质粒)、pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)、pCMV-lac Z(β-半乳糖苷酶质粒)对NIH-3T3细胞的体外转染。
(1)NIH-3T3细胞,在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
(2)体外转染
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板,吸去培养液,PBS洗涤2次,加入裂解液裂解,然后加入荧光素底物,用光度计测定转染效率。表12给出了荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
绿色荧光蛋白(GFP)表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光,而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。表13给出了绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率。
β-半乳糖苷酶染色
细胞用0.01mol/L的PBS洗涤,用0.4%多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方为0.04%X-gal,5mmol/L亚铁***,5mmol/L高铁***和2mmol/LMgCl2),放置37℃,5%CO2孵育3h。阳性细胞呈深蓝色,计算阳性细胞的百分率。表14给出了β-半乳糖苷酶质粒的复合物的转染效率。
表12聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导荧光素酶质粒的体外转染效率
表13聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
表14聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导β-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率
实施例37
利用聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体介导沉默荧光素酶的LucsiRNA在HeLa细胞系中的转染。
(1)取HeLa细胞,在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
(2)体外转染
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板,吸去培养液,PBS洗涤2次,加入裂解液裂解,然后加入荧光素底物,用光度计测定转染效率。表15给出了荧光素酶沉默效率。
表15聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导沉默荧光素酶的Luc siRNA体外转染效率
实施例38
利用聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体介导沉默荧光素酶的LucsiRNA在CT26细胞系中的转染。
(1)取CT26细胞,在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
(2)体外转染
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板,吸去培养液,PBS洗涤2次,加入裂解液裂解,然后加入荧光素底物,用光度计测定转染效率。表16给出了荧光素酶的沉默效率。
表16聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导沉默荧光素酶的LucsiRNA体外转染效率
实施例39
利用聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体介导沉默荧光素酶的LucsiRNA在Huh7细胞系中的转染。
(1)取Huh7细胞,在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
(2)体外转染
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板,吸去培养液,PBS洗涤2次,加入裂解液裂解,然后加入荧光素底物,用光度计测定转染效率。表17给出了荧光素酶沉默效率。
表17聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导沉默荧光素酶的Luc siRNA体外转染效率
实施例40
利用聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体介导沉默荧光素酶的LucsiRNA在CHO细胞系中的转染
CHO细胞的培养
(1)取CHO细胞,在含有10%小牛血清的培养液中连续培养(5%CO2、37℃孵箱)。
(2)体外转染
转染前24小时内,取对数生长期细胞,胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释,按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板,置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时,吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液,用磷酸盐缓冲液洗涤两次后,基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL,继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板,吸去培养液,PBS洗涤2次,加入裂解液裂解,然后加入荧光素底物,用光度计测定转染效率。表18给出了荧光素酶沉默效率。
表18聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导沉默荧光素酶的Luc siRNA,体外转染效率
实施例41
(1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞,在含有10%(质量/体积百分数)的牛血清的培养液中,在含5%(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养;
(2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠,肿瘤接种前,取对数生长期的CT26细胞,胰酶消化后用DMEM中和胰酶,1×103离心5min,PBS洗涤三次后,用PBS重悬细胞,按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下,10天后,瘤径长大至10mm时进行体内转染。
(3)体内转染
荧光素酶质粒的复合物在含有5%(质量/体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积0.5mL,尾静脉注射。
(4)体内转染效率的测定
体内转染48h后,处死小鼠,取出肿瘤,PBS洗涤2次,加入裂解液裂解,匀浆,然后加入荧光素底物,测定转染效率。表19给出了体内实验中载体与DNA的质量比以及荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
表19聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导荧光素酶质粒体内转染效率
实施例42
聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***在体内siRNA转染中的应用
(1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞,在含有10%(质量/体积百分数)的牛血清的培养液中,在含5%(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养;
(2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠,肿瘤接种前,取对数生长期的CT26细胞,胰酶消化后用DMEM中和胰酶,1×103转/min离心5min,PBS洗涤三次后,用PBS重悬细胞,按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下,8天后,瘤径长大至7mm时进行体内siRNA的转染。
(3)体内转染
基因物质选用沉默血管内皮生长因子的VEGFsiRNA,通过抑制VEGF的表达实现抑制肿瘤生长的目的,VEGFsiRNA的复合物颗粒在含有5%(质量/体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积50μL,尾静脉注射给药。VEGFsiRNA的复合物包括载体和siRNA。
(4)体内肿瘤生长的测定
从第一次给药开始测量瘤径大小,实验共14天。表20给出了体内实验VEGFsiRNA的复合物对肿瘤抑制14天后的瘤径。
表20聚乙烯亚胺-聚丙氨酸基因载体***介导VEGFsiRNA体内转染效率及瘤径大小
注:选用不含载体的VEGF siRNA以及只含有5%Glucose的空白体系做为对比。
比较例1
在50mL反应瓶里,加入2.0g重均分子量为25000的聚乙烯亚胺(PEI25k),0.5gN-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸,1.0g N,N-二环己基碳二酰亚胺,0.6g N-羟基琥珀酰亚胺,再加入10mL N,N二甲基甲酰胺溶解,室温下反应48h。反应结束后,过滤除去沉淀,清液倒入250mL***中沉淀,过滤后将滤饼用10mL N,N二甲基甲酰胺溶解,再倒入250mL***中,如此反复3次。最后将沉淀分离,真空干燥得到PEI25k-(Phe-Boc)10分别用氯化氢的四氢呋喃饱和溶液作为脱保护剂,得到产物聚乙烯亚胺-苯丙氨酸共聚物,记为P25Phe。
选择与实施例25~27及37相同的转染条件,使用商业用分子量为25000的聚乙烯亚胺和P25Phe介导荧光素酶,绿色荧光蛋白,介导β-半乳糖苷酶以及沉默荧光素酶的Luc siRNA质粒在HeLa细胞中的表达。结果参见表21~23。
表21聚乙烯亚胺-聚丙氨酸与聚乙烯亚胺-苯丙氨酸基因载体***介导荧光素酶质粒的体外转染效率对比
表22聚乙烯亚胺-聚丙氨酸与聚乙烯亚胺-苯丙氨酸基因载体***介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率对比
表23聚乙烯亚胺-聚丙氨酸与聚乙烯亚胺-苯丙氨酸基因载体***介导-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率对比
表24聚乙烯亚胺-聚丙氨酸与聚乙烯亚胺-苯丙氨酸基因载体***介导沉默荧光素酶的Luc siRNA体外转染效率对比
P25-Phe只有在介导绿色荧光蛋白质粒转染时与P25PAla-6有相当的效率,而在其它质粒介导方面其效率远低于P25PAla-6。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物,如式(I)所示:
其中,n1,n2,n3,x和y均为聚合度,n1,n2,n3,x和y均大于或等于1;600≥x+y≥40;
150≥n1+n2+n3≥5。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述超支化聚乙烯亚胺与L-丙氨酸N-羧酸酐的摩尔比为1:10~1:120。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂为无水氯仿、二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述超支化聚乙烯亚胺的数均分子量为1800~25000。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述超支化聚乙烯亚胺与有机溶剂的质量体积比为1g:(10~100)mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述反应的温度为0~50℃,所述反应的时间为12~48小时。
8.权利要求1所述的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物或权利要求2~7所述方法制备的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物作为基因载体的应用。
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