CN104066440B - 白介素-22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途 - Google Patents

白介素-22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了白介素‑22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途。具体地，本发明公开了白介素‑22或白介素‑22二聚体的如下用途：(1)在动物缺血性神经损伤后，保护神经元，从而使损伤的神经功能得到恢复；(2)能够显著抑制黑质多巴胺能神经元的丢失，提高多巴胺能神经元的功能，减少海玛区神经元细胞的凋亡，从而治疗神经退行性疾病。

Description

白介素-22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途
技术领域
本发明涉及生物和医药技术领域。具体地，本发明涉及白介素-22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途。
背景技术
白介素-22(Interleukin-22，IL-22)是一种T细胞分泌的糖蛋白，又名白介素10诱导的T细胞因子(IL-10-related T cell-derived inducible factor，IL-TIF)。白介素22mRNA的表达最初证明在小鼠的IL-9刺激后的T细胞株和IL-9刺激的肥大细胞株(mast cells)，以及concanavalinA激活后的脾细胞。人白介素22mRNA的表达主要在外周自分离的T细胞并通过抗CD-3的抗体或ConA刺激。白介素22mRNA在激活后的NK细胞也有表达。活化的T细胞主要是CD4+，特别是由CD28通路的Th1细胞。
白介素-22前体由179个氨基酸残基组成(成熟肽为146个氨基酸残基)，Dumoutier等最先报道了克隆小鼠和人的白介素-22基因(Dumoutier等，JI，164:1814-1819，2000)。此外，Dumoutier还取得了IL-22的专利(US6,359,117和6,274,710)。Gurney也取得了IL-22在治疗人胰腺病变方面的应用专利(US6,551,799)。
白介素-22主要在胸腺、大脑、活化的T细胞和肥大细胞、lectin刺激后的脾细胞(Duroutier JI2002)、白介素-2/白介素-12刺激后的NK细胞(Wolk，K JI2002)，以及LPS刺激后的多个器官和组织中表达(Dumoutier PNAS paper)，包括肠道、肝、胃、肾、肺、心脏、胸腺、脾都可测到IL-22的表达升高。
IL-22通过结合IL-22RI受体和IL-10R2受体，发挥生物学功能。IL-22R1是IL-22特异的受体，它表达在皮肤，肾，消化***(胰腺、小肠、肝、大肠、结肠)以及呼吸***(肺、支气管)。已公开的研究表明白介素22是一个免疫调节剂。在专利申请白介素-22的医药用途中，已报道IL-22对降低血清甘油三酯，肥胖的医疗用途(见WO2006/073508，CN200510023103.0)。然而，目前并未发现白介素-22可以在治疗神经损伤疾病或神经退行性疾病中可发挥积极的作用。
神经退行性疾病(neurodegenerative disease)是大脑和脊髓的神经元细胞渐进性变性、死亡的状态，是一种慢性、进行性神经***疾病，主要包括阿尔茨海默氏病(Alzhemier’s disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington disease)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis)，脊髓肌萎缩病(spinal muscular atrophy)、脊髓小脑共济失调(spinal cerebellar ataxias)等，其共同特征是发生神经元的退行性病变和凋亡，导致病人行为异常和功能障碍，引起过早死亡的神经性疾病。神经退行性疾病的发病机制尚不清楚，至今还没有有效的方法和药物来防治，现有治疗方法包括，通过服用或静脉注射补充人大脑神经递质治疗PD，如左旋多巴，但是，左旋多巴并不能有效的控制PD的自然病变过程，不能影响多巴胺能神经元的变性速度，长期使用还具有多种不良反应，如开关现象和运动障碍，其治疗作用也只能维持两年左右，长期使用还可损害神经元，加速神经元的凋亡；针对AD脑内乙酰胆碱不足，用胆碱酯酶抑制剂提高其浓度，该方法只是对症治疗，不能控制疾病的发展。
综上，本领域迫切需要开发有效的治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病的药物和方法。
发明内容
本发明的目的就是一种有效的治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病的药物及其用途，即白介素-22(Interleukin-22，即IL-22)在治疗和预防哺乳动物神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种白介素-22或其二聚体或多聚体的用途，它用于制备治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病的药物。
在另一优选例中，所述的神经损伤疾病选自：中风、脊柱损伤和伴有血脑屏障损伤的神经***疾病；
所述神经退行性疾病选自：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化病、脊髓肌萎缩病、原发性侧索硬化病、或脊髓小脑共济失调。
在另一优选例中，所述白介素-22包括：人白介素-22或哺乳动物(如鼠、兔、牛、或羊)的白介素-22。
在另一优选例中，所述白介素-22包括：重组的白介素-22、或天然的白介素-22。
在另一优选例中，所述的白介素-22的二聚体是式I所示的白介素-22的二聚体：
M1-L-M2 式I
式中，
M1是白介素-22的第一单体；
M2是白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
在另一优选例中，所述的IL-22二聚体的血清半衰期是所述第一单体和/或第二单体的血清半衰期的3倍以上、5倍以上或10倍以上。
在另一优选例中，所述的接头元件L选自下组：
(i)3-50个氨基酸的短肽；
(ii)式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z- 式II
式中，
Y为载体蛋白；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
“-”为化学键或共价键。
在另一优选例中，所述的第一单体和第二单体是相同的。
在另一优选例中，所述的第一单体和第二单体是不同的。
在另一优选例中，所述的生物活性是选自下组的一种或多种活性：
(a)在体外激活神经元细胞STAT3；
(b)在体内脑缺血性损伤后，能保护神经元，减少脑梗死体积；
(c)在体外激活多巴胺能神经元细胞STAT3或海马神经元细胞STAT3；
(d)在体内能显著抑制PD模型动物黑质多巴胺能神经元的丢失；
(e)在体内能显著减少AD模型动物海马区神经元细胞的凋亡。
在另一优选例中，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。
在另一优选例中，所述的载体蛋白是二个IgG的Fc片段之间通过二硫键连接而形成。在另一优选例中，所述二硫键的数量为2-4个。
在另一优选例中，所述的“-”是肽键。
在另一优选例中，所述二聚体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:2-5所示的单体所构成的二聚体。
在本发明的第二方面，提供了式I所示的白介素-22的二聚体：
M1-L-M2 式I
式中，
M1是白介素-22的第一单体；
M2是白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
在本发明的第三方面，提供了一种可用于治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病的药物组合物，它含有药学上可接受的载体以及式I所示的白介素-22的二聚体，
M1-L-M2 式I
式中，
M1是白介素-22的第一单体；
M2是白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
在另一优选例中，所述二聚体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:3或5所示的单体所构成的二聚体。
在另一优选例中，所述IL-22的二聚体采用以下步骤制备：
(a)采用包含编码IL-22-Fc复合物的DNA序列的表达载体转化哺乳动物细胞。
(b)培养所述哺乳动物细胞，和
(c)分离纯化所述IL-22二聚体。
本发明使用IL-22二聚体分子，一方面在动物体内缺血性神经损伤后，可以保护神经元，从而使损伤的神经功能得到恢复，能够有效地治疗神经损伤疾病；另一方面能够显著抑制PD模型动物黑质多巴胺能神经元的丢失，提高多巴胺能神经元的功能。此外，IL-22二聚体分子能够显著改善AD模型大鼠学习记忆能力，保护神经元，减少海马区神经元细胞的凋亡，减轻痴呆的症状。本发明的二聚体IL-22的血清半衰期延长，有效阻止神经元的丢失，从而能够更有效地治疗神经退行性疾病。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明一种IL-22二聚体的示意图。其中，“-”表示连接肽，IL-22椭圆形表示IL-22单体。
该IL-22二聚体的一种序列如SEQ ID NO:1所示，其中第1-146位为IL-22，第147-162位为连接肽，第163-308位为另一IL-22。
图2A和2B显示了本发明IL-22二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，IL-22椭圆形表示IL-22单体，标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且IL-22位于载体蛋白的N-末端。
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ IDNO:2所示，其中第1-146位为IL-22，第147-162位为连接肽，第163-385位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ IDNO:3所示，其中第1-146位为IL-22，第147-152位为连接肽，第153-375位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
图3A和3B显示了本发明IL-22二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，IL-22椭圆形表示IL-22单体，标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且IL-22位于载体蛋白的C-末端。
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ IDNO:4所示，其中第1-223位为人IgG2的Fc片段，第224-239位为连接肽，第240-385位为IL-22。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ IDNO:5所示，其中第1-223位为人IgG2的Fc片段，第224-229位为连接肽，第230-375位为IL-22。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
图4显示了IL-22和IL-22二聚体(IL-22-Fc)对激活神经元细胞STAT3的影响。结果显示，IL-22和IL-22二聚体均具有激活神经元细胞STAT3的生物活性，而且，IL-22二聚体比IL-22具有更显著的生物活性。
图5显示了本发明的IL-22二聚体在局灶性脑缺血动物模型(Focal cerebralischemia)中的治疗作用。重组人IL-22二聚体可以显著地减少脑梗死体积。
图6显示了本发明的IL-22二聚体在局灶性脑缺血动物模型(Focal cerebralischemia)中的治疗作用。重组人IL-22二聚体可以显著地改善造模动物的神经功能。
图7显示了本发明的IL-22二聚体、IL-22单体的体外活性分析结果。
图8A显示了小鼠黑质致密部TH阳性神经元免疫组化染色图片。
图8B显示了小鼠黑质致密部TH阳性细胞计数分析结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现：白介素-22或白介素-22二聚体在神经损伤疾病或神经退行性疾病中表现出明显的治疗效果。此外，与IL-22单体相比，本发明的IL-22二聚体能够延长体内半衰期，改善药物的动力学，减少注射频率，并且具有显著增强的体内生物活性。对神经元细胞STAT3的激活作用实验表明，相对于IL-22单体，IL-22二聚体在IL-22摩尔终浓度相当于IL-22单体的终浓度的1/10时，可以使神经元p-STAT3的信号水平上升更明显，因此二聚体有更明显的神经保护作用，能够更有效地治疗神经损伤疾病；还可有效地阻止神经元的丢失，从而能够更有效地治疗神经退行性疾病。在此基础上完成了本发明。
术语
术语“氨基酸序列基本相同”是指序列相同或由一个或多个氨基酸改变(缺失、增加、取代)引起的不同，但这种改变基本上不降低其生物学活性，即可以通过结合IL-22靶细胞受体而发生生物学功能。任何符合“基本相同”要求的白介素-22均包括在本发明内，无论它是糖基化的(即来源于天然的或来源于真核生物表达***的)或是非糖基化的(即来源于原核生物表达***或化学合成的)。
术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质(predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的白介素-22。
术语“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。
术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的白介素-22的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随白介素-22的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。
白介素22及其制备
如本发明所用，“白介素-22”或“IL-22”是指一种蛋白质，该蛋白质(a)具有与Dumoutier等人在US359,117中描述的人/鼠白介素-22基本相同的氨基酸序列和(b)具有与天然白介素-22相同的生物学活性。本发明的白介素-22包括，但不限于：人白介素-22、重组人白介素、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。在本发明中，术语“IL-22”可包括单体、二聚体或多聚体形式的IL-22。
“白介素-22”还包括PEG化的IL-22以及共价修饰的IL-22蛋白质。例如，可用各种活化的分子量为5,000～100,000的聚乙二醇(PEG)修饰以使IL-22高分子化，延长其半衰期。具体操作可参见Greenwald等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1994，4，2465；Caliceti等，IL Farmaco，1993，48，919；Zalipsky and Lee，《聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用》，J.M.Harris编，Plenum Press，N.Y.，1992。优选使用多臂树杈型活性PEG(CNZL02101672.0、WO9932139、PCT/US95/0755、PCT/US94/13013、US4,640,835、US4,496,689、US4,301,144、US4,670,417、US4,791,192、US4,179,337)。
本发明的白介素-22可用基因重组技术克隆表达的。表达的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或者高等真核生物细胞。适用的原核宿主细胞包括，但不限于：G+或G-菌，如大肠杆菌E.coli.，能够通过公共途径得到的E.coli.菌株包括：K12MM294(ATCC31,446)、X1776(ATCC31,537)、W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)等。其他可用的原核细胞包括但不限于：欧式杆菌(Erwinia)、克雷伯杆菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)等。E.coli.W3110因其常被用作重组DNA产品的发酵宿主而被推荐为优选。
除了原核细胞，真核细胞如丝状真菌(filamentous fungi)或酵母菌(yeast)等同样适用于表达或者克隆本发明的白介素-22。酿酒酵母菌(Saccharomyces)就是一种常用的低等真核宿主微生物，其他宿主如非洲粟酒裂殖酵母菌；克鲁维酵母菌；巴氏毕赤酵母菌等。甲基营养酵母菌(Methylotropic yeasts)同样可用于表达本发明的白介素-22，包括但不限于各种能够在甲醇中生长的酵母菌如汉逊酵母菌(Hansenula)，念珠菌(Candida)，克勒克酵母菌(kloeckera)，毕赤酵母菌(Pichia)，酿酒酵母菌(Saccharomyces)等。
用于表达糖基化的本发明的白介素-22的宿主细胞可来源于多细胞有机体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9，植物细胞。适用的哺乳动物宿主细胞的例子包括中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，COS细胞。特别是，经SV40转化的猴肾CV1细胞株(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞株293等。本领域的普通技术人员应知如何选择合适的宿主细胞。
上述宿主细胞经白介素-22表达载体或克隆载体转染或者转化后可在传统的营养基(nutrient media)中培养，所述营养基经修饰后适于诱导启动子(promoter)、选择性转化体(selecting transformant)或者扩增白介素-22编码基因序列。培养条件如培养基、温度、pH等的选择对本领域的普通技术人员来说则是应知的。如何使细胞培养繁殖力最大化的一般原则、方案以及操作技术可参见Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach，M.Butler,ed.(IRLPress，1991)和Sambrook等，supra。
本领域的普通技术人员应熟知真核细胞转染和原核细胞转化的方法，例如CaCl2法、磷酸钙沉淀法、脂质体媒介法或电穿孔法。根据使用的宿主细胞的不同，本领域的普通技术人员可选择相应的标准转化技术，例如CaCl2法(Sambrook等，supra.)或电穿孔法通常用于原核细胞；对于没有细胞壁的哺乳动物细胞，则可以使用磷酸钙沉淀法。
编码本发明的白介素-22的核苷酸序列(即cDNA或基因组DNA)可被***一可复制载体(replicable vector)进行基因克隆(DNA扩增)或者表达。各种载体如质粒、粘粒(cosmid，装配型质粒)、病毒颗粒或噬菌体等均可通过公共途径获得。运用本领域的公知技术，可将本发明的白介素-22的编码核苷酸序列按常规步骤***可复制载体上适宜的限制性核酸内切酶位点。
本发明的白介素-22不但可以通过基因重组直接表达，也可以通过与异种多肽形成融和多肽的方式生产，后者可以是一段位于成熟蛋白质或多肽N端的信号序列，也可以是位于成熟蛋白质或多肽N端的具有特异性切割位点的其他多肽片段。通常情况下，这段信号序列是上述可复制载体的一部分，或者它也可以是***可复制载体的本发明的白介素-22编码核苷酸序列的一部分。
表达载体和克隆载体均含有一段核苷酸序列，该序列使载体能够在一个或多个相应的宿主细胞内复制。与各种细菌、酵母或病毒宿主细胞对应的核苷酸序列为本领域普通技术人员所公知。例如，质粒pBR322的复制起点适用于大多数G-细菌，2.mu.质粒复制起点适用于酵母细胞，而各种病毒复制起点(SV40，多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)则适用于哺乳动物细胞内的克隆载体。
表达载体和克隆载体通常含有一段选择基因，又名“选择标记”。典型的选择基因编码产生的蛋白质(a)对某些抗生素或毒素如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤，四环素等具有抗性；(b)能弥补营养缺陷型缺乏(auxotrophic deficiencies)(c)补充复合型培养基不能提供的关键营养物质如杆菌宿主细胞需要的D-丙氨酸消旋酶的编码基因。
适用于哺乳动物宿主细胞的选择基因应该可以将有能力吸纳本发明的白介素-22编码基因的宿主细胞区分出来，如DHFR或胸(腺嘧啶核)苷激酶。适用的以野生型DHFR为选择基因的宿主细胞是无DHFR活性的CHO细胞株，该细胞株的制备及繁殖方法可参见Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4216(1980)。适用于酵母细胞的选择基因是在酵母质粒Yrp7中表达的trpl基因(Stinchcomb等，Nature，282:39(1979)；Kingsman等，Gene，7:141(1979)；Tschemper等，Gene，10:157(1980))。trpl基因可用于筛选不能在色氨酸中生长的酵母菌突变株如ATCCNo.44047或PEP4-1(Jones，Genetics，85:12(1977))。
表达载体和克隆载体通常含有一个可人工操纵地连接到本发明的白介素-22编码核苷酸序列上的启动子，以指导mRNA的合成。与各种宿主细胞对应的启动子为本领域普通技术人员所公知。适用于原核宿主细胞的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子***等。细菌宿主细胞启动子同样包含一段可人工操纵地连接到本发明的白介素-22编码基因序列的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
通过在可复制载体中***增强子可增强本发明的白介素-22的编码核苷酸序列在高等真核生物表达体系中的转录。增强子是一种DNA分子的顺式作用元件，通常为10到300个bp，通过作用于启动子而增强DNA分子的转录。
真核宿主细胞(酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞、人类细胞，或者来源于其他多细胞有机体的有核细胞)中的表达载体同样含有中止转录和稳定mRNA所需的核苷酸序列。此类序列通常取自真核或者病毒DNA或cDNA非翻译区的5’端，有时也可取自3’端。所述“非翻译区”包含的核苷酸片段可转录产生位于本发明的白介素-22mRNA非翻译区的聚腺苷酰化片段。
其他可在重组脊椎动物培养体系中用于合成本发明的白介素-22的方法、载体和宿主细胞可参见Gething等，Nature，293:620-625(1981)；Mantei等，Nature，281:40-46(1979)；EP117,060；以及EP117,058。
IL-22二聚体
本发明的IL-22二聚体的结构如式I所示。代表性的结构如图1-3中所示。其中，载体蛋白包括(但并不限于)是指人IgG(1,2,3,4)的Fc片段、或人白蛋白(albumin)。
IL-22位于可用载体蛋白的C-末端，也可用位于载体蛋白的N-末端。
如本文所用，术语“连接肽”(linker)指位于IL-22单体和IL-22单体之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度没有特别限制。连接肽的长度通常为5-50个氨基酸。通常，连接肽不影响或不显著影响IL-22单体和IL-22单体形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例子包括(但并不限于)：
较佳地，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)疏水性氨基酸Gly和Pro构成的3-16个氨基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro；
(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常为5-20个，较佳地10-20个氨基酸；
(c)来自于IL-22单体之外的蛋白的氨基酸序列，例如来自于IgG或白蛋白的氨基酸序列；
(d)由(a)、(b)和(c)组合形成的氨基酸序列。
优选的连接肽包括：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1中第147-162位)和ASTKGP(SEQ ID NO:3中第147-152位)。
此外，在融合蛋白的N端或C末端还可添加其他不影响IL-22单体活性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点(Glu-Lys-Arg)，或可促进融合蛋白的活性。
二聚体的制备方法
编码本发明IL-22二聚体或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得IL-22第一单体和/或IL-22第二单体的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
为了提高宿主细胞的表达量，可以对IL-22二聚体编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在本发明中，可以采用酵母细胞或哺乳动物细胞偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对IL-22二聚体基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。
药物组合物和施用方法
由于本发明IL-22二聚体可产生更强的受体激活信号并具有优异的血清半衰期，因此本发明IL-22二聚体以及含有本发明IL-22二聚体为主要活性成分的药物组合物可用于治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病。其中，所述的神经损伤疾病包括：中风、脊柱损伤和伴有血脑屏障损伤的神经***疾病；所述神经退行性疾病选自：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化病、脊髓肌萎缩病、原发性侧索硬化病、或脊髓小脑共济失调。
本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的本发明IL-22或其二聚体及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.001-1000mg的IL-22或其二聚体/剂，较佳地0.05-300mg的IL-22或其二聚体/剂，更佳地，含有0.5-200mg的IL-22或其二聚体/剂。
本发明的化合物及其药理上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明IL-22或其二聚体或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。化合物的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。
“药理上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
施用本发明IL-22或其二聚体时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和***胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明IL-22或其二聚体的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明IL-22或其二聚体可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
含有本发明的白介素-22或其二聚体的微胶囊可用于本发明的白介素-22的缓释给药。重组蛋白的微囊缓释给药技术已成功应用于重组人生长激素(rhGH)、重组人干扰素(rhIFN)、白介素-2和MNrgp120(Johnson等，Nat.Med.，2:795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther27:1221-1223(1993)；WO97/03692，WO96/40072，WO96/07399；US5654010。
本发明的白介素-22或其二聚体的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物(PLGA)制备。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可被人体很快清除。而且，该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同，从几个月延长到几年(Lewis，“Controlled release of bioactive agents formlactide/glycolide polymer,”in:M.Chasin and R.Langer(Eds.)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York，1990)，pp.1-41))。
本发明的药物组合物的剂量和浓度范围可因实际使用情况的不同而变化。本领域的普通技术人员应知如何根据实际需求去选择合适的剂量和给药途径。对于不同种系，例如人和鼠之间药物剂量范围的调整原则，可参见Mordenti,J.andChappell,W.“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”InToxicokinetics and New Drug Development，Yacobi等；Pergamon Press，New York1989，pp.42-96。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明IL-22或其二聚体适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01～300mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于：
1.IL-22或其二聚体在体外能激活神经细胞STAT3。
2.IL-22二聚体在动物模型已证实可有效治疗神经损伤疾病。
3.IL-22二聚体能够延长体内半衰期，改善药物的动力学，减少注射频率；能显著增强体内生物活性。
4.IL-22或IL-22二聚体在显著抑制PD模型动物黑质多巴胺能神经元的丢失，激发多巴胺能神经元的功能。
5.IL-22或IL-22二聚体显著抑制海马区神经元细胞的凋亡，改善AD模型动物的学习记忆能力。
6.IL-22或IL-22二聚体在神经退行性疾病中具有显著的神经保护作用，有效治疗神经退行性疾病。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
用常规方法制备和纯化，获得结构如图1-图3所示的IL-22二聚体(序列为SEQID NO:1，或单体序列如SEQ ID NO:2-5所示)。例如，由IL-22-Fc复合物制备IL-22二聚体，具体制备方法如下：
a.IL-22二聚体表达细胞株的构建
采用全基因合成IL-22-Fc复合物的cDNA序列(如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示，其中SEQ ID NO.:6编码SEQ ID NO.:2所示的单体，SEQ ID NO.:7编码SEQID NO.:3所示的单体)，将人IL-22单体的基因与IgG2的Fc基因片段连接，5’端引入EcoRI位点，以及哺乳动物细胞表达所需要的元件如Kozak序列和信号肽序列，3’端引入XbaI位点，克隆到市售的pUC19质粒，命名为pIL-22-Fc，转化常规的E.coli TG1。用EcoRI和XbaI酶切pUC19质粒，回收约1300bp的IL-22-Fc片段，与经EcoRI和XbaI酶切后的pcDNA3(Invitrogen)表达质粒相连接，构建表达质粒pEX-IL-22-Fc。表达质粒pEX-IL-22-Fc通过线性化转染CHO细胞，表达IL-22二聚体，ELISA法检测表达量，筛选出蛋白产量较高的细胞株，并制备细胞库。
b.IL-22二聚体的分离纯化
将重组CHO细胞用常规方法进行培养从而表达重组蛋白。培养结束后，收集细胞上清(含有IL-22复合物、IL-22二聚体、IL-22多聚体及代谢物)，细胞上清收集后经过滤、多级凝胶层析纯化，例如，rProtein A Sepharose FF(GE Healthcare，货号：17-1279-04)捕获，用20-50mM柠檬酸缓冲液，0.1-2M NaCl，pH3.5-3.8的缓冲液洗脱，得到纯度>90％的IL-22二聚体，接下来采用PPA复合介质的凝胶层析(PALL Life Sciences货号：k364-01)，用20-50mM NaAc/HAC，pH3.0-5.0的缓冲液洗脱，洗脱液经低pH灭活病毒，Nano20膜除病毒过滤等，最终获得IL-22二聚体。
分离纯化得到的IL-22二聚体的纯度>95％(采用反向HPLC分析)。电泳显示，纯化后IL-22二聚体(由二个SEQ ID NO.:2所示单体构成)分子量为52±10KD(采用还原型SDS-PAGE分析)，与预测值相符。紫外吸收光谱为280nm。IL-22二聚体在体外能刺激Colo205细胞产生IL-10(ED50为10-1000ng/mL)。
实施例2IL-22二聚体体内半衰期
大鼠皮下单次注射IL-22二聚体(由二个序列如SEQ ID NO:2所示的IL-22-Fc单体构成)100μg/kg，药代动力学参数如下表1所示(n＝6)。而单体IL-22(重组人白介素22)在大鼠的半衰期约1.3小时。
表1
实施例3IL-22或IL-22二聚体对神经元细胞STAT3的激活作用
取孕17天SD大鼠的胎鼠的全脑放入预冷的D-Hanks液中，在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。剪碎脑组织成1mm3大小，加入10mL0.125％胰酶，并放入37℃孵箱内消化15min，随后吸出组织转移到装有预冷的DMEM+10％FBS的离心管内终止消化，用移液枪吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。
用无血清神经元基础培养基neurobasal(invitrogen，货号：21103049)+无血清添加剂B27(invitrogen，货号：17504044)培养8天，每2天换液一次。
培养至第八天，分别用不同浓度IL-22二聚体(由二个序列如SEQ ID NO:2所示的IL-22-Fc单体构成)和IL-22(IL-22二聚体的终浓度：0.3μg/mL；IL-22的终浓度：1.2μg/mL)处理神经元15分钟。将含药物的培养基上清完全吸出，细胞用PBS洗两遍，按照细胞裂解液使用说明步骤裂解细胞。用细胞裂解液(Cell SignalingTechnology，货号：9803；主要成分：20mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1mM EGTA，1％Triton，2.5mM sodium pyrophosphate，1mMbeta-glycerophosphate，1mM Na3VO4，1μg/ml leupeptin，1mM PMSF)冰上裂解细胞20分钟，用细胞刮子刮取细胞。收集细胞裂解液，12000rpm，4℃离心10分钟。
吸取上清，测定蛋白浓度。另取100μl的上清用STAT3[pY705]ELISA试剂盒(invitrogen，货号：KH00481)检测STAT磷酸化水平变化。
结果如图4所示：与空白对照组相比，IL-22、IL-22二聚体均能激活神经元细胞信号转导及转录活化因子3(STAT3)的生物活性。其中，IL-22单体(终浓度为1.2μg/mL)可使神经元p-STAT3的信号水平上升5.4倍，而IL-22二聚体，其终浓度仅为0.3μg/mL，相当于IL-22单体的终浓度的1/10，而且可以使神经元p-STAT3的信号水平上升7.8倍，可见，IL-22二聚体对神经元细胞STAT3的激活作用显著优于IL-22单体。
实施例4IL-22二聚体在局灶性脑缺血动物模型(Focal cerebral ischemia)中的治疗作用
雄性SD大鼠，体重为250～300g。动物分成3组:模型组(MCAO+溶剂，n＝12)，IL-22二聚体组(MCAO+IL-22-D100μg/kg，IL-22-D由二个序列如SEQ ID NO:2所示的IL-22-Fc单体构成)，假手术组(手术+溶剂，n＝12)。
麻醉后，大鼠的右颈总动脉(CCA)、右颈内动脉(ICA)、右颈外动脉(ECA)通过颈部手术暴露在外。一种头部硅胶包裹的线栓通过大鼠颈外动脉***颈总动脉再回拨至颈内动脉进行阻塞，***长度大约18.5±0.5mm。***后感觉略微受阻，表明已到达中动脉处，能够阻塞中动脉的血流供应。阻塞60min后，线栓被拔出约10mm左右进行再灌注。IL-22二聚体组分别于再灌注0.5h和48h时，皮下注射IL-22二聚体100μg/kg，假手术组和模型组皮下注射相同体积的溶剂。整个手术过程中，动物体温被保持在36.5℃。假手术组只切开颈部皮肤分离颈部动脉，不***线栓。21天后动物被安乐处死取出大脑。
用2mm的冠状切片模具将大脑切成6片，放在2％TTC溶液中，37℃避光温孵20-30min，最后固定在10％***溶液中。固定后将这些脑切片用数码相机拍照，白色未染上的部分为梗死区。然后计算其体积百分比％＝(对侧脑半球面积-同侧脑半球未梗死部位面积)/对侧脑半球面积*100％。梗死面积的测量用Photoshop7.0软件完成。
神经学症状的临床评价
神经功能学分数在手术的0天，1天，2天，3天或者第0、1、2、3、7、14、21天被评价，其分数分级标准为：0-无神经功能性损伤；1-左前肢不能伸展；2-不连续地向左边转圈；3-连续的向左边转圈；4-向左侧倾倒；5-神经意识丧失，不能自发行走。
结果如图5-6所示，模型组梗死体积为54.7％。与模型组比较，注射IL-22二聚体后显示出了显著的治疗效果(P<0.01)，其梗死体积为33.8％，相对于模型组，IL-22二聚体组的梗死体积减少了20.9％。在术后第三天，IL-22二聚体组与模型组相比，神经功能评分有显著性差异(P<0.05)，提示IL-22二聚体可以保护神经的坏死，促进神经功能的恢复。
实施例5IL-22二聚体在食蟹猴体内的药代动力学
成年健康猕猴，8只，雌雄各半，体重3-5公斤，按动物体重随机分成2组，分别为IL-22二聚体30、100μg/kg给药组，其中给药组各组4只/组，雌雄各半。分别皮下注射给予相应剂量的IL-22二聚体(由二个序列如SEQ ID NO.:2所示的IL-22-Fc单体构成)，给药体积0.2ml/kg体重，单次给药，于给药前、给药后0.5、1、2、4、8、16、24、48、72、96、120、144、168小时下肢隐静脉取血0.6ml，室温静置30min后，分离血清，采用ELISA试剂盒(Biolegend，货号：434507)检测血清中的IL-22二聚体浓度，检测结果采用非房室模型分析药代动力学参数，结果如下表2所示。IL-22在食蟹猴体内的半衰期(t1/2z)约为2hr。
表2药代动力学参数(均值±SD，n＝4)
实施例6IL-22二聚体、IL-22的体外活性分析
本实施例利用某些细胞在受到IL-22刺激时，会产生IL-10，通过检测相应的OD值，从而测定IL-22的活性。方法如下：
Colo205细胞(ATCC号CCL-222，人结肠癌细胞)培养于RPMI164010％FBS培养基中，细胞生长至对数期时，弃上清，加入PBS洗去残留培养基，加入2～5mL0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，加入培养基吹打均匀，1500rpm离心5min，收集细胞，然后用基础培养基配制成5.0×105Cell/ml的细胞悬液，于96孔板各孔分别添加100μL/孔，于37℃、5％CO2培养箱中过夜。次日，取出CO2培养箱中的96孔板，于4℃条件下，800rpm离心5分钟，从各孔抽出细胞上清液90μL，并补入90μL0.1％BSA/RPMI1640，加入IL-22二聚体(由二个SEQ ID NO.:2所示单体构成)至终浓度1.4、4.1、12.3、37.0、111.1、333.3、1000、3000ng/mL，加入IL-22至终浓度0.01、0.04、0.12、0.37、1.1、3.3、10、30ng/mL，于37℃，5％CO2培养箱中培养20hr，收集细胞上清液，采用IL-22ELISA试剂盒(R&D，货号S1000B)检测OD值。
结果如图7所示，IL-22二聚体的半数有效浓度(ED50)值为229ng/mL(2675pM)，IL-22的ED50为0.54ng/mL(32.4pM)。
以上结果显示，虽然体外实验中IL-22活性略优于IL-22二聚体的活性，而IL-22二聚体在体内的药代动力学参数和有效活性远远优于IL-22，可见评价IL-22二聚体的生物活性宜采用体内实验模型。
实施例3和6的结果提示，IL-22单体或二聚体形式对不同细胞的作用存在很大差异。对神经细胞而言，IL-22二聚体对神经细胞的激活作用明显优于IL-22单体的作用，对人结肠癌类细胞(如Colo205细胞)而言，IL-22单体的活性略优于较IL-22二聚体的活性。
因此，实施例3的体外测定方法更适合用于测定二聚体IL-22的活性(尤其是针对神经细胞的保护作用)，也更适合反映二聚体IL-22在体内的活性。
实施例7IL-22或IL-22二聚体对MPP+诱导的PC12细胞神经毒性的保护作用
PC12细胞是一种大鼠嗜铬细胞瘤细胞系，体外培养能合成、代谢、传递多巴胺，可作为体外模型筛选具有活性的化合物。
实验将PC12细胞按40000个/孔种于96孔板，培养基成分：DMEM，10％马血清+5％FCS，1％青霉素-链霉素。MPP+(Sigma)加入至30～3000μm终浓度，分别加入IL-22至终浓度为0.04ng/mL、0.4ng/mL、4ng/mL、40ng/mL IL-22二聚体(由两个选自序列如SEQ ID NO:2-5所示的IL-22-Fc单体构成)至终浓度为0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL。培养24hr后，采用荧光细胞存活分析(Fluorimetric cellviability assay)。
结果显示，MPP+处理后，PC12细胞的存活率随着MPP+浓度的增加而降低，IL-22和IL-22二聚体对PC12细胞均显示出显著的保护作用。
实施例8IL-22或IL-22二聚体对MPTP诱导的动物帕金森氏病(PD)模型的治疗作用
1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)，可以特异性的损伤多巴胺能神经元，使黑质多巴胺能神经元大量丢失，出现类似帕金森氏病的症状。
实验选取C57/BL6J小鼠，雄性，～28g，12-14周，动物饲养于室温24±2℃的环境中，维持光-暗12小时循环交替，给以充足的饲料，自由饮水。
50只小鼠随机分成5组，每组10只，分别为溶剂对照组、MPTP模型组、MPTP+IL-2240μg/kg组、MPTP+IL-22-D40μg/kg组、MPTP+IL-22-D100μg/kg组，其中IL-22-D为由二个序列如SEQ ID NO:2-5所示的IL-22-Fc单体构成的IL-22二聚体。
MPTP以30mg/kg的剂量腹腔注射，连续给予5天，恢复一天后(从第7天起)MPTP+IL-2240μg/kg组按IL-2240μg/kg皮下注射给药，每天给药IL-22，每天一次，连续7天，即从第7～13天；MPTP+IL-22-D40μg/kg组按40μg/kg皮下注射给药，于第7、9、11天分别给药IL-22-D一次；MPTP+IL-22-D100μg/kg组按100μg/kg皮下注射给药，于第7、9、11天分别给药IL-22-D一次；溶剂对照组皮下注射给予等体积的生理盐水。
第14天对动物进行以下评价。
a.PD小鼠的行为学评价
在本实验于MPTP末次给药后第10天进行行为学检测。方法：爬杆法(pole test)用于检测PD中典型行为学症状—运动徐缓(Matsuura等，1997；Araki等，2001；Kato等，2004)。
将小鼠头向上轻柔的放在粗糙的杆顶(直径8mm，高55cm)。小鼠从头向上调整至头完全向下的时间记录为T-turn(time to turn)，小鼠从向下运动至四肢全部到达杆底的时间记录为T-LA(locomotion activity time)，超过30s按照30s记录。每只小鼠重复检测5次取平均值。
结果显示，IL-22和IL-22二聚体均能显著改善MPTP诱导的小鼠行为学异常。
b.检测纹状体内多巴胺的浓度
方法：小鼠断头处死，将纹状体取出称重后装在1.5ml的离心管中，并立即置于碎冰中。样本每10mg加入300μl冰水浴中的样品处理液(0.2M高氯酸、0.2mM焦亚硫酸钠、0.01％EDTA-2Na，同时含有0.3μM DHBA作为内标)。以上混合液使用超声仪超声粉碎，随后将其在4℃下10,000g离心20min。取其上清液并用0.22μM水相滤膜过滤，采用高效液相色谱法检测纹状体多巴胺的浓度。
结果显示，IL-22和IL-22二聚体能显著抑制MPTP诱导的小鼠纹状体多巴胺浓度的降低。
c.黑质内多巴胺能神经元的情况观察
方法：10％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛灌流后取脑。4％多聚甲醛后固定24h，再将样本转入10％，20％，30％的蔗糖溶液中梯度脱水至样本沉底，在-20℃冰冻切片机中做中脑与纹状体部位冠状切片，小鼠脑切片厚度为15μm。TH为多巴胺能能神经元的特异性标记。一抗为单克隆小鼠抗TH(1:1000，CHEMICON)，与纹状体和中脑部位的脑片4℃共同孵育过夜，PBS洗三遍后用生物素化二抗，室温孵育1h。SABC复合物室温孵育1h。DAB显色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。黑质TH阳性细胞计数，纹状体TH阳性染色光密度扫描。
结果显示，IL-22和IL-22二聚体可以明显抑制MPTP诱导的多巴胺能神经元的大量丢失。
实施例9IL-22或IL-22二聚体对海马神经元细胞STAT3的激活作用
取孕17天SD大鼠的胎鼠的全脑放入预冷的D-Hanks液中，在解剖显微镜下取海马。剪碎成1mm3大小，加入10mL0.125％胰酶，并放入37℃孵箱内消化15min，随后吸出组织转移到装有预冷的DMEM+10％FBS的离心管内终止消化，用移液枪吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。
用无血清神经元基础培养基(neurobasal，购自invitrogen，货号：21103049)+无血清添加剂B27(invitrogen，货号：17504044)培养8天，每2天换液一次。
培养至第八天，分别用不同浓度IL-22二聚体(由两个选自序列如SEQ IDNO:2-5所示的IL-22-Fc单体构成)和IL-22(IL-22二聚体的终浓度：1、10、100ng/mL；IL-22单体的终浓度：0.4、4、40ng/mL)处理神经元15分钟。将培养基完全吸出，细胞用PBS洗两遍，按照细胞裂解液使用说明步骤裂解细胞。用细胞裂解液(Cell Signaling Technology，货号：9803；主要成分：20mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1mM EGTA，1％Triton，2.5mM焦磷酸钠，1mMβ-甘油磷酸盐，1mM Na3VO4，1μg/ml亮抑酶肽，1mM PMSF)冰上裂解细胞20分钟，用细胞刮子刮取细胞。收集细胞裂解液，12000rpm，4℃离心10分钟。吸取上清，测定蛋白浓度。另取100μl的上清用STAT3[pY705]ELISA试剂盒(invitrogen，货号：KH00481)检测STAT磷酸化水平变化。
结果显示，IL-22二聚体(IL-22-D)与IL-22单体均能激活海马神经元STAT3的生物学活性。
实施例10IL-22或IL-22二聚体对Aβ诱导的PC12细胞凋亡的保护作用
PC12细胞用神经生长因子(NGF)诱导后可长出突起，具有神经细胞特性，Aβ(β淀粉样蛋白)诱导PC12细胞凋亡可作为体外模拟埃尔茨海默(AD)模型。
将PC12细胞培养于基础培养基(DMEM，10％FCS，1％青霉素-链霉素)，胰酶消化，重悬于含NGF50ng/mL的培养基中，细胞浓度调整为2X104cells/孔加入96孔板，于37℃，5％CO2培养箱中培养24hr。加入Aβ至终浓度1-100μmol/L，分别用不同浓度的IL-22单体和IL-22-D(IL-22-D由二个选自序列如SEQ ID NO:2-5所示的IL-22-Fc单体构成)处理，IL-22单体的终浓度分别为0.4、4、40ng/mL，IL-22-D的终浓度分别为1、10、100ng/mL，模型孔加入等体积的PBS，阴性对照孔不加Aβ，继续培养24hr。Hochest染色观察细胞形态学，或MTT法检测PC12细胞的增殖。
与阴性对照孔相比，模型孔的PC12细胞细胞核荧光染色明显不均匀，可见到细胞凋亡引起的致密浓染的高荧光细胞核，IL-22单体和IL-22二聚体处理的PC12细胞细胞核荧光染色均匀，未见到明显的致密浓染的高荧光细胞核。IL-22和IL-22二聚体均能抑制NGF分化后Aβ诱导所致的PC12细胞的凋亡，保护神经细胞。
实施例11IL-22或IL-22二聚体对MPTP诱导的PD动物模型的治疗作用
1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)，可以特异性的损伤多巴胺能神经元，使黑质多巴胺能神经元大量丢失，从而出现类似帕金森氏病(PD)的症状。酪氨酸羟化酶(TH)是多巴胺能神经元的特异性标记，可以用于定量检测黑质多巴胺能神经元的数量。
因IL-22单体与IL-22-D的分子量之比为约1:5,且一个IL-22-D含2个IL-22单体，故为了比较试验结果，本试验中选用等摩尔用量(按IL-22单体计)，即IL-22用量为40μg/kg，而IL-22-D用量为100μg/kg。
实验选取雄性C57/BL6J小鼠，22～30g，12-14周，随机分成4组，分别为：
MPTP+IL-2240μg/kg组：以30mg/kg的剂量腹腔注射MPTP，连续给予5天，动物恢复一天后(即从第7天起)按40μg/kg皮下注射给予IL-22(重组人白介素22)，连续给药7天；
MPTP+IL-22-D100μg/kg组：以30mg/kg的剂量腹腔注射MPTP，连续给予5天，动物恢复一天后(即从第7天起)按100μg/kg皮下注射给予IL-22-D，分别于第7、9、11天分别给药一次；
MPTP模型组：以30mg/kg的剂量腹腔注射MPTP，连续给予5天，动物恢复一天后，从第7天起给予等体积的溶剂(0.5％鼠血清/PBS)；
正常对照组：给予等体积的生理盐水，连续给予5天，动物恢复一天后，从第7天起给予等体积的溶剂(0.5％鼠血清/PBS)。
所述IL-22二聚体(IL-22-D)由二个序列如SEQ ID NO:2所示的IL-22-Fc构成。IL-22-D也可以由二个选自序列如SEQ ID NO:3-5所示的IL-22-Fc单体构成。
第14天处死动物，检测黑质内多巴胺能神经元的情况。
黑质内多巴胺能神经元的情况观察
方法：10％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛灌流后取脑。4％多聚甲醛后固定24h，再将样本转入10％，20％，30％的蔗糖溶液中梯度脱水至样本沉底，在－20℃冰冻切片机中做中脑部位冠状切片，小鼠脑切片厚度为20μm，TH免疫组化分析。一抗为单克隆小鼠抗TH抗体(1:1000，Sigma)，与中脑部位的脑片4℃共同孵育过夜，PBS洗三遍后用生物素化二抗(羊抗鼠)，室温孵育1h。SABC复合物室温孵育1h。DAB显色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。进行黑质致密部TH阳性细胞计数分析。
结果如图8A、图8B所示：
图8A显示了小鼠黑质致密部TH阳性神经元免疫组化染色图片。小鼠连续5天注射MPTP后，黑质致密部TH阳性神经元大量丢失，在施用IL-22或者IL-22二聚体后，明显恢复了TH阳性神经元数量。
图8B显示了小鼠黑质致密部TH阳性细胞计数分析结果。与正常对照组相比，MPTP模型组中，黑质致密部TH阳性神经元的数量显著减少，大约为正常对照组的51％，说明MPTP导致黑质内多巴胺能神经元的大量丢失。MPTP+IL-2240μg/kg组中，黑质内TH阳性多巴胺神经元大约为正常对照组的80％，MPTP+IL-22-D100μg/kg组中，黑质内TH阳性多巴胺神经元大约为正常对照组的86％。
可见，IL-22、IL-22二聚体对MPTP诱导的多巴胺能神经元的大量丢失有保护作用(IL-22二聚体的保护作用更为显著)，从而对MPTP诱导的帕金森疾病模型小鼠脑多巴胺神经元的退行性病变具有治疗作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种白介素-22或其二聚体的用途，其特征在于，用于制备治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病的药物，其中,
所述的白介素-22的二聚体是式I所示的白介素-22的二聚体，
M1-L-M2 式I
式中，
M1是白介素-22的第一单体；
M2是白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上；
其中，所述的接头元件L是式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z- 式II
式中，
Y为载体蛋白；且所述载体蛋白是二个IgG的Fc片段之间通过二硫键连接而形成；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
“-”为化学键或共价键；
并且所述的神经损伤疾病为中风；而所述神经退行性疾病为帕金森氏病；
其中所述的白介素-22的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第1-146位所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，用于制备治疗神经退行性疾病的药物，并且所述神经退行性疾病为帕金森氏病。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的第一单体和第二单体是相同的。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的生物活性是选自下组的一种或多种活性：
(a)在体外激活神经元细胞STAT3；
(b)在体内脑缺血性损伤后，能保护神经元，减少脑梗死体积；
(c)在体外激活多巴胺能神经元细胞STAT3或海马神经元细胞STAT3；
(d)在体内能显著抑制PD模型动物黑质多巴胺能神经元的丢失；
(e)在体内能显著减少AD模型动物海马区神经元细胞的凋亡。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述二聚体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:2-5所示的单体所构成的二聚体。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述二硫键的数量为2-4个。
7.一种可用于治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病的药物组合物，其特征在于，所述的神经损伤疾病为中风；而所述神经退行性疾病为帕金森氏病；
并且所述药物含有药学上可接受的载体以及式I所示的白介素-22的二聚体，
M1-L-M2 式I
式中，
M1是白介素-22的第一单体；
M2是白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上
所述的接头元件L是式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z- 式II
式中，
Y为载体蛋白；且所述载体蛋白是二个IgG的Fc片段之间通过二硫键连接而形成；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
“-”为化学键或共价键；
其中所述的白介素-22的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第1-146位所示。
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