KR20220010461A - 종양괴사인자-자극된 유전자 6을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

종양괴사인자-자극된 유전자 6을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20220010461A
KR20220010461A KR1020210093528A KR20210093528A KR20220010461A KR 20220010461 A KR20220010461 A KR 20220010461A KR 1020210093528 A KR1020210093528 A KR 1020210093528A KR 20210093528 A KR20210093528 A KR 20210093528A KR 20220010461 A KR20220010461 A KR 20220010461A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tsg
protein
composition
group
mesenchymal stem
Prior art date
Application number
KR1020210093528A
Other languages
English (en)
Inventor
유제영
남승우
김창영
김동훈
신정연
Original Assignee
주식회사 엘지화학
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엘지화학 filed Critical 주식회사 엘지화학
Publication of KR20220010461A publication Critical patent/KR20220010461A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/426—Immunomodulating agents, i.e. cytokines, interleukins, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/24—Materials or treatment for tissue regeneration for joint reconstruction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)

Abstract

본 출원은 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포의 연골 재생 용도 및/또는 골관절염 치료 용도에 관한 것이다. 본 출원은 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물 및 골관절염 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 출원이 제공하는 연골 재생용 조성물 및/또는 골관절염 치료용 약학적 조성물은 연골 세포의 콜라겐 발현을 증가시키고, 염증을 낮추며, 연골 구조를 복원할 수 있다.

Description

종양괴사인자-자극된 유전자 6을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating osteoarthritis comprising mesenchymal stem cell expressing tumor necrosis factor-inducible gene 6}
본 출원은 관절염의 치료를 위한 조성물 또는 이를 이용한 치료 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종양괴사인자-자극된 유전자 6(tumor necrosis factor-inducible gene 6; TSG-6)를 발현하는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)를 포함하는 골관절염의 치료용 약학 조성물 및/또는 이를 이용한 치료 방법에 관한 것이다.
골관절염(Osteoarthritis)은 퇴행성 관절염(Degenerative arthritis)으로도 알려져 있으며, 뼈의 끝부분에서 뼈를 보호하는 역할을 수행하는 연골이 닳아서 없어지면서 발생하는 관절 질환의 하나이다. 관절염의 가장 일반적인 유형으로, 특히 아침에 관절통, 부기, 뻣뻣함과 같은 증상을 보인다. 연골(Cartilage)은 전신의 두 개의 뼈를 서로 이어주는 관절 부위의 표면에 위치한 섬유성 결합 조직이며, 연골세포와 연골아세포로 구성된다. 연골의 핵심 구성 성분은 콜라겐으로 특히 콜라겐 II (2형 콜라겐, Type II collagen)으로 구성된다.
현재 골관절염에 대한 치료는 통증을 완화하면서 관절을 유연하게 유지하는 것에 초점을 두고 있으며, 약물과 운동, 물리치료 등이 일반적으로 사용되고, 관절이 심하게 손상된 경우에는 제한적으로 인공 관절 치환술과 같은 수술이 시행되기도 한다.
TSG-6은 LINK와 CUBE의 2개의 도메인으로 이루어지는 단백질로, TNF와 같은 염증 자극에 의해 유도되어, 섬유아세포, 결합 조직 세포와 같은 세포에서 주로 생산되는 것으로 알려져 있다.
TSG-6은 소염 작용을 하는 것으로 알려져 있으나, 관절강 내에 주사하는 경우 단시간 내에 관절강 외로 분산되는 것으로 알려져 있다. 2016년 보고에 의하면, 관절강 내 주사된 TSG-6의 반감기는 채 0.5 시간이 되지 않아(Kim D-K, et al., 2016, PLoS ONE 11(1)), TSG-6의 소염 작용에 불구하고 직접 주사시 지속적인 치료 효과를 기대하기 어려운 한계가 있다.
본 출원의 일 예는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포의 약학적 유효량을 연골 재생을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 연골 재생 방법을 제공한다.
다른 예는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포의 연골 재생에 사용하기 위한 용도 또는 연골 재생용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기와 같은 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포의 연골 재생 효과는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가에 의한 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 연골 재생용 약학적 조성물, 방법, 및/또는 용도의 적용 (투여) 대상은 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비가 낮은 (예를 들어, 정상인 대비 낮은) 환자 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가를 필요로 하는 환자일 수 있다. 또한, 상기 연골 재생 방법은, 투여하는 단계 이전에, 연골 재생을 필요로 하거나 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가를 필요로 하는 (예컨대, 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비가 정상인보다 낮은) 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 예는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 골관절염의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포의 약학적 유효량을 골관절염의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 골관절염의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포의 골관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 용도 또는 골관절염의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기와 같은 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포의 골관절염의 예방 및/또는 치료 효과는 연골 재생 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가에 의한 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 골관절염의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물, 방법, 및/또는 용도의 적용 (투여) 대상은 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비가 낮은 (예를 들어, 정상인 대비 낮은) 환자 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가를 필요로 하는 환자 및/또는 연골재생을 필요로 하는 환자일 수 있다. 또한, 상기 골관절염의 예방 및/또는 치료 방법은, 투여하는 단계 이전에, 골관절염의 예방 및/또는 치료를 필요로 하거나, 및/또는 연골 재생을 필요로 하거나, 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가를 필요로 하는 (예컨대, 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비가 정상인보다 낮은) 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 예는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가용 조성물을 제공한다.
다른 예는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포의 약학적 유효량을 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가 방법을 제공한다.
다른 예는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포의 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가에 사용하기 위한 용도 또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 출원은 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 재생용 조성물 및/또는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가용 조성물, 및/또는 이들을 이용한 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "TSG-6 단백질"은, 종양괴사인자(Tumor necrosis factor; TNF)-자극된 유전자 6(TNF-inducible gene 6) 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "중간엽 줄기세포"(mesenchymal stem cell, MSC)는 다양한 세포, 예컨대, 지방세포, 연골세포 또는 연골모세포, 뼈세포 또는 뼈모세포, 근육세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미할 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 상기의 전능성 또는 다능성을 유지하는 범위에서 그 유래가 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 중간엽 줄기세포는 혈액, 진피, 제대혈, 탯줄, 지방조직, 태반, 성체근육, 각막 기질(corneal stroma), 젖니의 치아 속질(dental pulp) 및/또는 골막 등과 같은 비골수 조직(non-marrow tissues), 또는 골수조직, 바람직하게는 비골수 조직으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 중간엽줄기세포는 "MSC"와 혼용될 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 포유동물에서 유래하는 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 말, 마우스, 래트 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 중간엽 줄기세포는 골관절염 환자 유래 또는 골관절염 환자가 아닌 공여자로부터 분리되는 것일 수 있다.
본 출원이 제공하는 연골 재생용 조성물 및/또는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가용 조성물, 및/또는 이들을 이용한 방법은 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함 또는 사용(투여)한다.
상기 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포는 TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 이들 모두를 포함하는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 본 출원에서 제공되는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포는 외래의 TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 이를 포함하는 재조합 벡터 (발현 벡터)를 포함함으로써 TSG-6 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하고, TNF-a 등과 같은 자극 인자에 의하여 TSG-6 단백질의 유전자 수준 및/또는 단백질 수준에서의 발현이 증가된 세포와 구별되는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 TSG-6 단백질을 항시 발현할 수 있도록 항시 발현 프로모터와 TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하도록 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 TSG-6 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 또는 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지는 유전자에 의해 암호화되는 단백질일 수 있다.
상기 TSG-6 단백질을 발현하는 (TSG-6 유전자의 발현 벡터가 도입된) 중간엽줄기세포에서의 TSG-6 유전자(예, mRNA) 및/또는 단백질의 발현 수준은, TSG-6 단백질 유전자의 발현 벡터가 도입되지 않은 동종 중간엽줄기세포 (예, 동종의 비변형 중간엽줄기세포, TNF-a 자극된 중간엽줄기세포 등) 대비, 약 2배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 50배 이상, 약 70배 이상, 약 100배 이상, 약 200배 이상, 또는 약 300배 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포에서의 TSG-6 단백질 발현량은, 약 10 내지 약 200 ng/10만개 세포/24시간(이하 단위 동일), 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 80, 약 10 내지 약 70, 약 10 내지 약 65, 약 30 내지 약 200, 약 30 내지 약 100, 약 30 내지 약 80, 약 30 내지 약 70, 약 30 내지 약 65, 약 50 내지 약 200, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 70, 또는 약 50 내지 약 65 ng/10만개 세포/24시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서, 용어 “약(about)”은 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하기 위한 표현으로, 기재된 수치 기준으로 약 10%, 약 8%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 또는 약 0.1% 증감된 범위를 포괄하는 의미일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다 (이하, 동일한 의미로 해석될 수 있다).
본 출원이 제공하는 연골 재생용 조성물 및/또는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서의 TSG-6 발현량은 약 10 내지 약 50,000 ng/mL/24시간(이하 단위 동일), 약 10 내지 약 30,000; 약 10 내지 약 10,000; 약 10 내지 약 5,000, 약 50 내지 약 50,000, 약 50 내지 약 30,000, 약 50 내지 약 10,000, 약 50 내지 약 5,000, 약 100 내지 약 50,000, 약 100 내지 약 30,000, 약 100 내지 약 10,000, 약 100 내지 약 5,000, 약 100 내지 약 5,000, 약 500 내지 약 50,000, 약 500 내지 약 30,000, 약 500 내지 약 10,000, 약 500 내지 약 5,000, 약 1,000 내지 약 50,000, 약 1,000 내지 약 30,000, 약 1,000 내지 약 10,000, 또는 약 1,000 내지 약 5,000 ng/mL/24시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원이 제공하는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포는 TSG-6 단백질을 지속적으로 발현하는 것일 수 있으며, 이에 따라 TSG-6의 관절강 내 짧은 반감기를 극복할 수 있어, 연골의 회복(재생) 및/또는 골관절염의 예방 또는 치료에 적합하다. 또한, 본 출원에서 제공되는 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포는 TNF-a, IL-1b 등과 같은 염증성 지표를 억제함으로써, 골관절염에서의 염증 및/또는 통증 완화 효과를 가지는 것에 더하여, 콜라겐 II 단백질 발현량 및/또는 분비량을 증가시키고 연골을 재생 및/또는 손상된 연골을 재건(회복)함으로써, 골관절염, 특히 퇴행성 골관절염의 보다 근본적인 치료가 가능하도록 한다.
본 출원이 제공하는 연골 재생용 조성물 및/또는 방법, 및/또는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및/또는 방법, 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가용 조성물 및/또는 방법 (이하, “본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법”으로 통칭함)은 연골 세포 및/또는 연골 조직에서의 콜라겐 II 단백질의 유전자 (mRNA) 수준 및/또는 단백질 수준에서의 발현량 및/또는 세포 외로의 분비량을 증가시킬 수 있다. 일 예에서, 본 출원이 제공하는 조성물을 투여한 연골 세포 및/또는 연골 조직 내의 콜라겐 II 단백질 발현량 및/또는 분비량은 미투여 대조군 및/또는 TNF-a 미처리 또는 TNF-a 처리(활성화)된 동종 중간엽줄기세포 처리군에 비해 증가될 수 있다 (예를 들어, 미투여 대조군 및/또는 TNF-a 미처리 또는 TNF-a 처리된 동종 세포 처리군의 콜라겐 II 단백질 발현량 (예컨대, mRNA 수준 및/또는 단백질 수준) 및/또는 분비량 (예컨대, 배지 내 콜라겐 II 단백질 농도) 대비 약 1.2배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.4배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.6배 이상, 약 1.7배 이상, 약 1.8배 이상, 또는 약 1.9배 이상 증가; 증가 정도의 상한값은 특별한 한정이 없으며, 예컨대 약 20배, 약 15배, 약 10배, 약 5배, 또는 약 2배일 수 있으나 이에 제한되지 않음).
본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법은 연골 두께를 유지 및/또는 회복할 수 있다. 일 예에서, 본 출원이 제공하는 약학적 조성물을 투여한 연골의 두께는 미투여 대조군 대비 약 1배 초과 약 10배 이하, 약 1배 초과 약 5배 이하, 약 1배 초과 약 3배 이하, 약 1배 초과 약 2배 이하, 약 1.3 내지 약 10배, 약 1.3 내지 약 5배, 약 1.3 내지 약 3배, 약 1.3 내지 약 2배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 5배, 약 1.5 내지 약 3배 또는 약 1.5 내지 약 2배 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 본 출원의 약학적 조성물을 투여한 OA 동물 모델의 연골 두께는 미투여 OA환자에 비해 연골 두께의 회복이 관찰되었으며, 동량의 TSG-6 미발현 MSC 투여군에 비해 약 1.5배 이상 높은 연골 두께를 보였다.
본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법은 연골 세포 및/또는 활막 세포의 세포 내 및/또는 연골 조직 및/또는 활막 조직 내 염증성 지표 발현량을 감소시킬 수 있다. 상기 염증성 지표의 발현량 감소는 본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법을 투여 또는 적용하지 않은 미투여 대조군 대비 감소한 것일 수 있다. 상기 염증성 지표 (예, 염증성 사이토카인)는 예를 들어, 전환성장인자-베타1 (TGF-b1; TGF-β1), 종양괴사인자-알파 (TNF-a; TNF-α), 인터페론-감마 (IFN-r; IFN-γ), 및 인터류킨-6 (IL-6)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상 또는 이들 모두일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 실시예에서, TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 투여한 경우, 활막 세포와 연골 세포에서 상기 염증성 지표의 발현량이 정상군 수준으로 감소하였다.
일 예에서, 본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법이 투여 또는 적용된 연골 부위(연골 세포 및/또는 연골 조직, 이하 동일)에서의 TGF-b1 발현량은 환자군에서의 TGF-b1 발현량에 비해 약 55% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 또는 약 30% 이하 수준일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 TGF-b1의 발현량은 TSG-6 발현량이 증가할수록 감소하는 것일 수 있다.
일 예에서, 본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법이 투여 또는 적용된 연골 부위에서의 TNF-a 발현량은 환자군에서의 TNF-a 발현량에 비해 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 또는 35% 이하 수준일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 TNF-a의 발현량은 TSG-6 발현량이 증가할수록 감소하는 것일 수 있다.
일 예에서, 본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법이 투여 또는 적용된 연골 부위에서의 IFN-r 발현량은 환자군에서의 IFN-r 발현량에 비해 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 또는 약 35% 이하 수준일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 IFN-r의 발현량은 TSG-6 발현량이 증가할수록 감소하는 것일 수 있다.
일 예에서, 본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법이 투여 또는 적용된 연골 부위에서의 IL-6 발현량은 환자군에서의 IL-6 발현량에 비해 약 60% 이하, 약 55% 이하, 또는 약 50% 이하 수준일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 IL-6의 발현량은 TSG-6 발현량이 증가할수록 감소하는 것일 수 있다.
일 예에서, 본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법이 투여 또는 적용된 활막 부위(활막 세포 및/또는 활막 조직, 이하 동일)에서의 TGF-b1 발현량은 환자군에서의 TGF-b1 발현량에 비해 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 또는 약 30% 이하 수준일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법이 투여 또는 적용된 활막 부위에서의 TNF-a 발현량은 환자군에서의 TNF-a 발현량에 비해 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 또는 약 25% 이하 수준일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법이 투여 또는 적용된 활막 부위에서의 IFN-r 발현량은 환자군에서의 IFN-r 발현량에 비해 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 또는 약 35% 이하 수준일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법이 투여 또는 적용된 활막 부위에서의 IL-6 발현량은 환자군에서의 IL-6 발현량에 비해 약 45% 이하, 약 40% 이하, 또는 약 35% 이하 수준일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법은 약학적으로 유효한 양의 TSG-6를 발현하는 중간엽 줄기세포를 단독으로 포함 또는 투여하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함 또는 투여할 수 있다. 상기 약학적으로 유효한 양은 연골 재생, 골관절염의 증상을 예방, 개선 및/또는 치료, 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 및/또는 분비 증가 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며, 중간엽 줄기세포의 총 TSG-6 발현량이 약 200 ng/24시간 이상, 약 500 ng/24시간 이상, 약 1,000 ng/24시간 이상, 약 10,000 ng/24시간 이상, 약 50,000ng/24시간 이상, 약 200 내지 약 100,000ng/24시간, 약 200 내지 약 50,0000ng/24시간, 약 200 내지 약 10,000ng/24시간, 약 200 내지 약 5,000ng/24시간, 약 200 내지 약 3000ng/24시간, 약 200 내지 약 2000ng/24시간, 약 500 내지 약 100,000ng/24시간, 약 500 내지 약 50,0000ng/24시간, 약 500 내지 10,000ng/24시간, 약 500 내지 약 5,000ng/24시간, 약 500 내지 약 3,000ng/24시간, 또는 약 500 내지 약 2,000ng/24시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 약학적으로 유효한 양의 중간엽 줄기세포는 약 10만 내지 약 2500만 개 세포/ml(cell/mL, 이하 단위 동일), 약 10만 내지 약 2000만, 약 10만 내지 약 1500만, 약 10만 내지 약 1000만, 약 10만 내지 약 500만, 약 50만 내지 약 2500만, 약 50만 내지 약 2000만, 약 50만 내지 약 1500만, 약 50만 내지 약 1000만, 약 50만 내지 약 500만, 약 100만 내지 약 2500만, 약 100만 내지 약 2000만, 약 100만 내지 약 1500만, 약 100만 내지 약 1000만, 또는 약 100만 내지 약 500만 개 세포/ml 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 제한 없이 포함한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 아르기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐피를리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원이 제공하는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 활성 성분의 신속, 지속, 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화할 수 있다. 상기 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 또는 멸균 분말의 형태일 수 있다. 일 구현예에서 상기 조성물은 주사용액으로 제형화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 출원이 제공하는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 골관절염 치료 목적에서 경구, 경피, 피하, 정맥, 또는 근육을 포함하는 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 예를 들어, 관절강 내 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물 및/또는 방법의 적용(투여) 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이들의 배양물일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 대상은 연골 재생, 및/또는 골관절염의 예방 및/또는 치료, 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 증가를 필요로 하는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이들의 배양물일 수 있다.
본 출원은 또한 중간엽 줄기세포에 TSG-6 유전자 및/또는 상기 TSG-6 유전자를 포함하는 벡터를 형질도입하는 단계를 포함하는, 연골 재생용 조성물 및/또는 골관절염 예방 및/또는 치료용 조성물 및/또는 콜라겐 II 단백질 발현 증가용 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 형질도입은 중간엽줄기세포의 형질도입 목적 범위에서 당업계에 알려진 형질도입방법을 자유롭게 선택하여 수행될 수 있다.
상기 TSG-6 유전자 및/또는 이를 포함하는 벡터는 상술한 바와 같다.
본 출원에서 제공되는 연골 재생용 조성물 및/또는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및/또는 방법은 연골 재생능 및/또는 항염효과가 우수하다.
본 출원에서 제공되는 조성물 및/또는 방법은 TSG-6 단백질의 짧은 관절강 내 반감기에 의한 지속성 문제를 극복할 수 있다.
또한, 본 출원에서 제공되는 조성물은 조성물 및/또는 방법은 콜라겐 II 단백질 발현량 증가효과가 우수하여, 연골 재생 및 이를 통한 골관절염의 예방 및/또는 치료에 보다 근본적이고 유리한 효과를 가진다.
도 1은 선별된 TSG-6 MSC 2종과 대조군(TSG-6 미도입군)에서의 TSG-6 발현량을 측정하기 위해 ELISA를 수행한 결과 그래프이다.
도 2a는 시험관 수준에서(in vitro) 연골 세포에 대한 콜라겐 발현량을 확인하기 위한 공동배양 실험 디자인의 개략도이다.
도 2b는 각 그룹에서 콜라겐 II(collagen II)와 대조군(GADPH)의 발현량을 확인한 Western blot 결과를 정량한 값 (Collagen II 단백질 발현량/GAPDH 발현량)을 보여주는 그래프이다.
도 3a는 골관절염 토끼 모델에서 각 그룹별 연골 조직 회복 정도를 사프라닌 O 염색을 통해 확인한 현미경 사진이다 (스케일 바: 160 um, -B- 중 화살표: Clones 표시).
도 3b는 골관절염 토끼 모델에서 각 그룹에 따른 연골 두께를 각각 대퇴골과 경골 방향에서 측정한 그래프와 통계적 유의도를 나타낸 결과이다. n.s.: 통계적으로 유의미하지 않음(not significant); *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; ****: P<0.0001 (이하 동일).
도 4a는 골관절염 토끼 모델의 연골에서 각 그룹에 따른 TGF-b1에 대한 IHC 염색 결과 사진이다.
도 4b는 골관절염 토끼 모델의 연골에서 각 그룹에 따른 TGF-b1의 면역활성(immunoreactivity) 측정 결과 그래프와 통계적 유의도를 나타낸 결과이다.
도 5a는 골관절염 토끼 모델의 연골에서 각 그룹에 따른 TNF-a에 대한 IHC 염색 결과 사진이다.
도 5b는 골관절염 토끼 모델의 연골에서 각 그룹에 따른 TNF-a의 면역활성(immunoreactivity) 측정 결과 그래프와 통계적 유의도를 나타낸 결과이다.
도 6a는 골관절염 토끼 모델의 연골에서 각 그룹에 따른 IFN-r에 대한 IHC 염색 결과 사진이다.
도 6b는 골관절염 토끼 모델의 연골에서 각 그룹에 따른 IFN-r의 면역활성(immunoreactivity) 측정 결과 그래프와 통계적 유의도를 나타낸 결과이다.
도 7a는 골관절염 토끼 모델의 연골에서 각 그룹에 따른 IL-6에 대한 IHC 염색 결과 사진이다.
도 7b는 골관절염 토끼 모델의 연골에서 각 그룹에 따른 IL-6의 면역활성(immunoreactivity) 측정 결과 그래프와 통계적 유의도를 나타낸 결과이다.
도 8a는 골관절염 토끼 모델의 활막에서 각 그룹에 대해 H&E 염색을 수행한 결과 사진이다.
도 8b는 골관절염 토끼 모델의 활막에서 각 그룹에 대해 H&E 염색 결과 활막 상피세포 두께 및 염증 세포의 수를 나타낸 그래프와 그 통계적 유의도를 나타낸 결과이다.
도 9a는 골관절염 토끼 모델의 활막에서 각 그룹에 대해 TGF-b1 및 TNF-a에 대한 IHC 염색 수행 결과 현미경 사진이다.
도 9b는 골관절염 토끼 모델의 활막에서 각 그룹에 대해 TGF-b1 및 TNF-a에 대한 면역활성을 측정한 결과 그래프 및 그 통계적 유의도를 나타낸 결과이다.
도 10a는 골관절염 토끼 모델의 활막에서 각 그룹에 대해 IFN-r 및 IL-6에 대한 IHC 염색 수행 결과 현미경 사진이다.
도 10b는 골관절염 토끼 모델의 활막에서 각 그룹에 대해 IFN-r 및 IL-6에 대한 면역활성을 측정한 결과 그래프 및 그 통계적 유의도를 나타낸 결과이다.
도 11a는 비변형(Naive) MSC와 TNF-a 처리된 MSC, 및 TSG-6 발현벡터 도입 MSC의 TSG-6 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 11b는 비변형 MSC와 TNF-a 처리된 MSC, 및 TSG-6 발현벡터 도입 MSC의 TSG-6 단백질 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 11c는 비변형 MSC와 TNF-a 처리된 MSC, 또는 TSG-6 발현벡터 도입 MSC와 공배양한 연골세포(Chondrocyte)의 Col II mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 출원의 권리범위가 제한되지 않는다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, "AC"는 articular surface lining cartilage의 약자이고, "OA"는 골관절염(osteoarthritis)의 약자이다.
실시예 1. TSG-6 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 제작
1-1. 렌티바이러스의 제조
TSG-6 cDNA 서열 (Genbank accession no. NM_007115; 서열번호 3)에 대해 코돈 최적화(optimization)를 수행한 후, SIRION-Biotech 사에 의뢰하여 상기 코돈 최적화를 마친 cDNA 서열(서열번호 4)을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다.
1-2. 중간엽줄기세포에 TSG-6 유전자 도입
중간엽 줄기세포(MSC)는 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포를 5%(v/v) CO2, 섭씨 37도의 조건에서 MSC 배양용 배지에서 배양하였다. 배양된 MSC 50,000 cells 또는 100,000 cells에 상기 TSG-6 cDNA가 도입된 렌티바이러스를 첨가하여 다시 5%(v/v) CO2, 섭씨 37도의 조건에서 24시간 배양하였다. TSG-6 유전자의 cDNA 서열이 도입된 MSC(TSG-6 MSC)는 ELISA로 선별하였다.
실시예 2. TSG-6 MSC에서의 TSG-6 단백질 분비량 확인
상기 실시예 1에서 제조된 TSG-6 MSC에서의 TSG-6 단백질 분비량 확인을 위해, ELISA를 수행하여 TSG-6 단백질 분비량을 확인하였다. 구체적으로 대조군으로는 TSG-6 cDNA를 포함하는 렌티바이러스를 감염시키지 않은 MSC를 사용하였으며, 각 MSC는 Serum-free 배지 및 5% CO2, 37°C 배양 조건에서 24시간 배양하여 24시간 동안 발현된 총 TSG-6 단백질의 양을 측정하였다.
도 1에 TSG-6 MSG 및 대조군에서의 TSG-6 발현량 측정 결과 그래프를 나타내었다. 측정 결과, TSG-6 도입된 중간엽 줄기세포는 TSG-6 단백질을 약 10 내지 100ng/10만 개 세포/24시간 분비하는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 연골-활막세포(Cartilage-synoviocyte) 공동 배양 모델에서 TSG-6 MSC의 관절염 치료 효과 확인
in vitro 수준에서 TSG-6 MSC의 관절염에 대한 치료 효과를 확인하기 위해, 연골-활막세포 공동 배양 조건에서 상기 실시예 1에서 제조된 TSG-6 MSC 추가 유무에 따른 콜라겐 II(Collagen II) 발현량을 확인하였다.
도 2a에 실험 디자인의 개략도를 나타내었다. 구체적으로, 연골 세포를 단독으로 U-bottom 96 well plate에 접종하여 연골분화배지에서 5%(v/v) CO2, 37°C 로 3주(21일)간 배양하여 연골 집합체(cartilage aggregate)를 형성하고, 이 연골 집합체를 활막세포와 5% CO2, 37oC에서 2일간 공동배양하였으며, 이 때에는 TNF-alpha(TNF-a) 10ng/ml과 인터류킨 1-베타(IL1b) 10ng/mL를 첨가하여 염증을 유발하였다.
공동배양(염증 유발) 2일 후 정제된 TSG-6 단백질을 200ng/mL 첨가하여 1일간 배양 후, 활막세포를 제거하고 정제된 TSG-6 단백질을 앞서 첨가한 농도와 동일하게 200ng/mL 첨가하여 다시 7일간 배양하였다. TSG-6 MSC의 관절염에 대한 치료 효과를 확인하기 위한 실험군은, 공동배양(염증 유발) 3일 후 활막세포를 제거하고 10ng/mL/24시간 수준의 TSG-6 단백질을 발현하도록 또는 30ng/mL/24시간 수준의 TSG-6 단백질을 발현하도록 TSG-6 MSC 양을 달리하여 다시 7일간 공동배양하였다.
정상군으로는 염증 비유도 그룹(No inflammation control, NIC), 음성대조군으로는 염증 유도 후 TSG-6 미첨가 그룹(Inflammation control, IC)을 사용하였다. 이후 Western blot을 이용해 각 그룹별 Collagen II 단백질의 발현량을 측정하였으며, 대조군으로는 GAPDH 단백질의 발현량을 확인하였다.
하기 표 1에 각 그룹을 정리하여 나타내었다.
번호 이름 염증 TSG-6 MSC 정제 TSG-6
1 NIC X X X
2 IC O X X
3 TSG6 200 O X TSG-6 농도 200ng/mL
4 MSC 10 O TSG-6 발현량 10ng/mL/24hr(5x104 TSG-6 transduced MSCs) X
5 MSC 30 O TSG-6 발현량 30ng/mL/24hr(1.5x105 TSG-6 transduced MSCs) X
도 2b에 각 그룹별 Western blot 결과를 정량한 값 (Collagen II 단백질 발현량/GAPDH 발현량)을 나타내었다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 염증이 유도된 연골 세포(2번 컬럼)에서는 콜라겐 II 단백질이 거의 생성되지 않았으나, TSG-6 단백질이 정제된 단백질 또는 TSG-6 MSC에서 발현되는 형태로 첨가된 경우 모두 콜라겐II 단백질의 발현량이 증가하였다. 또한, TSG-6 단백질이 정제된 단백질 형태로 첨가된 경우와 TSG-6 발현 벡터가 도입된 MSC 형태로 첨가된 경우 모두 TSG-6 단백질농도 의존적으로 콜라겐II 단백질의 발현량이 증가하였으나, 특히 TSG-6 단백질이 TSG-6 발현 벡터가 도입된 MSC 형태 (즉, TSG-6 단백질이 MSC에서 발현되는 형태)로 첨가된 경우, 정제된 TSG-6 단백질이 첨가된 경우보다 콜라겐II 단백질 발현량이 높았으며, 30ng/mL/24시간 수준의 TSG-6 단백질을 발현하는 TSG-6 MSC와 공동배양한 경우에는 NIC 군과 유사한 수준의 콜라겐 II 단백질 발현량을 보였다.
즉, TSG-6 단백질 농도 의존적으로 콜라겐 II 단백질의 발현량이 증가하였으며, 본 출원이 제공하는 TSG-6 단백질을 발현하는 TSG-6 MSC는 정제 TSG-6와 유사하거나 더 우수한 수준의 콜라겐 II 단백질 회복 효과가 있음을 확인하였다.
해당 결과를 통해 본 출원이 제공하는 TSG-6 MSC가 연골 재생 및/또는 회복 효과를 가짐을 확인할 수 있고, 이를 통하여 관절염의 치료에 유리하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4. 퇴행성 골관절염 토끼 모델에서 TSG-6 MSC의 치료 효과 확인
in vivo 수준에서 TSG-6 MSC의 치료 효과를 확인하기 위해, 퇴행성 골관절염 토끼 모델에서 실험을 수행하였다.
구체적으로, 퇴행성 골관절염 토끼 모델로 SPF New Zealand White계 토끼(Kangda) 암컷(약 10개월령)을 이용하였으며, TSG-6 MSC등의 투여시 체중은 3.9kg 수준이었다. 상기 토끼 모델은 총 6개 그룹으로 분류되었다. 하기 표 2에 각 그룹에 대한 간단한 설명을 표시하였다.
번호 이름 OA 설명
A Intact X 정상군
B OA O 음성 대조군 (부형제만 투여)
C TSG-6 I O TSG-6 MSC 6.9x105 cells 투여군 (TSG-6 농도 200ng/24h)
D TSG-6 II O TSG-6 MSC 6.9x106 cells 투여군 (TSG-6 농도 2000ng/24h)
E Naive I O TSG-6 비발현 MSC 6.9x105 cells 투여군
F Naive II O TSG-6 비발현 MSC 6.9x106 cells 투여군
상기 표 2에 표시된 6개 그룹 중 C 내지 F 그룹에 각각 해당 MSC를 주사를 이용해 주입하였다. 주입 이후 16주가 경과한 후에 각 토끼로부터 무릎 관절을 수거하여 연골 조직을 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색, IHC 염색 또는 사프라닌 O 염색 하여 현미경 관찰 및 각 면역 활성, 상피 두께 측정, 또는 염증 세포 수 분석을 수행하였다.
4-1. 연골 구조 지표 확인 (사프라닌 O 염색)
도 3a에 사프라닌 O 염색 결과 사진을, 도 3b에 각 그룹별 관절면 표면연골(articular surface lining cartilage; AC)의 두께를 각각 대퇴골(Femur)과 경골(Tibia)측에서 측정한 결과 그래프 및 통계적 유의도를 나타내었다.
하기 표 3에 측정된 AC 두께의 평균값을 각각 나타내었다. Femur는 대퇴골 측에서 측정한 AC 두께를, Tibia는 경골 측에서 측정한 AC 두께를 의미한다.
그룹 Femur(um) Tibia(um)
Intact 518.65 728.36
OA 218.19 114.10
TSG-6 I 345.64 417.73
TSG-6 II 481.00 480.91
Naive I 275.51 304.28
Naive II 331.45 328.84
관절염(OA) 군에서는 모두 정상군에 비해 연골 두께가 현저히 감소하였으며, TSG-6 I 및 TSG-6 II 그룹에서는 각각 연골 두께가 통계적으로 유의미하게 회복되었으며, 특히 TSG-6 단백질 농도가 증가할수록 연골 두께 증가폭이 더 커지는 경향을 보였다. 이러한 농도 의존성은 대퇴골 측 연골에서 더욱 두드러지게 나타났다. TSG-6 II 그룹에서는 특히 정상군과 유의미한 차이가 없을 정도로 (n.s.: not significant) 연골 구조의 개선이 확인되었다. 한편 Naive 군에서는 Naive I 및 Naive II군 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다.
4-2. 연골 IHC 염색을 통한 염증 지표 확인
상기 표 2의 각 그룹의 연골 조직에서 TGF-b1, TNF-a, IFN-r, 및 IL-6에 대해 각각 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining, IHC 염색)을 수행하여 각 염증 지표의 발현량을 각각 확인하였다.
도 4a 내지 4b는 TGF-b1, 도 5a 내지 5b는 TNF-a, 도 6a 내지 6b는 IFN-r, 도 7a 내지 7b는 IL-6에 대한 IHC 염색 결과와 대퇴골(Femur)과 경골(Tibia)측에서 측정한 각 지표의 면역활성(immunoreactivity)결과를, 하기 표 4에 각 면역활성 측정 수치를 나타내었다. 하기 표 4에서 각 염증 지표 발현량 수치 단위(%/mm2)는 생략되었다.
염증 지표 TGF-b1 TNF-a IFN-r IL-6
부위 대퇴골 경골 대퇴골 경골 대퇴골 경골 대퇴골 경골
Intact 9.82 8.61 2.72 4.82 13.73 10.03 26.22 24.10
OA 53.62 65.11 51.73 63.68 50.06 63.15 66.16 66.89
TSG-6 I 27.63 24.06 29.29 20.26 23.44 21.49 43.28 38.11
TSG-6 II 14.07 20.08 20.94 19.26 15.14 20.17 32.99 30.19
Naive I 34.88 32.47 35.13 29.68 28.04 32.16 44.92 42.94
Naive II 30.68 27.84 29.12 21.69 26.60 22.18 42.34 38.76
OA 군에서는 TGF-b1, TNF-a, IFN-r, 및 IL-6의 면역활성이 매우 높게 나타났으나, TSG-6 MSC 처리군에서는 모두 OA군에 비해 낮은 면역 활성을 보였다. 특히 TGF-b1, IFN-r, 및 IL-6는 정상군과 유사한 수준으로 (n.s.) 면역 활성이 감소하여, 본 출원이 제공하는 TSG-6 MSC가 우수한 항염 효과를 보임을 확인하였다. 또한 투여 용량에 관계 없이 유사한 염증 지표 수치를 보인 Naive 군에 비해 본 출원의 TSG-6 MSC 처리군은 처리 용량이 증가할수록 염증 지표의 면역 활성 수치가 모두 감소하여, 항염 활성이 우수함이 확인되었다.
4-3. 활막 H&E 염색을 통한 염증 지표 확인
상기 표 2의 각 그룹의 활막을 분리하여 H&E 염색을 수행하였으며, 그 결과를 도 8a 내지 8b에 나타내었다. 도 8a는 활막 상피 두께(Synovial membrane epithelial thickness)를, 도 8b는 단위면적당 염증세포의 수를 나타낸 그래프와 그 통계적 유의성을 나타낸 표이다. 하기 표 5에 활막에서 측정된 상피 두께와 염증 세포(IF cell)의 수를 각각 나타내었다.
그룹 활막 상피 두께(um) 염증세포 수(cells/mm2)
Intact 9.15 34.00
OA 35.43 171.00
TSG-6 I 16.51 62.75
TSG-6 II 11.00 54.29
Naive I 17.39 75.71
Naive II 19.33 69.00
도 8b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 활막 상피 두께는 TSG-6 II 군에서 Intact 군과 유사한 수준으로 감소하였으며, 염증세포의 수 또한 Intact 군과 유사한 수준으로 감소하였다.
4-4. 활막 IHC 염색을 통한 염증 지표 확인
상기 표 2의 각 그룹의 활막 조직에서 TGF-b1, TNF-a, IFN-r, 및 IL-6에 대해 각각 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining, IHC 염색)을 수행하여 각 염증 지표의 발현량을 각각 확인하였다.
도 9a에는 각 그룹별 TGF-b1과 TNF-a에 대한 IHC 염색 결과를, 도 9b에는 각 그룹별 TGF-b1과 TNF-a의 면역활성 측정 결과와 통계적 유의도를 나타내었으며, 도 10a에는 각 그룹별 IFN-r 및 IL-6에 대한 IHC 염색 결과를, 도 10b에는 각 그룹별 IFN-r 및 IL-6의 면역활성 측정 결과 그래프와 통계적 유의도를 나타내었다. 하기 표 6에 각 그룹별 염증 지표의 발현량 측정 결과를 나타내었다.
그룹 TGF-b1 TNF-a IFN-r IL-6
Intact 34.33 17.17 25.33 54.67
OA 297.67 203.67 279.00 285.00
TSG-6 I 122.75 77.50 117.75 127.00
TSG-6 II 87.14 68.71 94.00 93.43
Naive I 155.43 124.86 156.00 180.29
Naive II 146.00 97.75 146.00 141.50
활막 세포에 대한 IHC 염색 결과, OA 군에서는 각 염증성 지표가 Intact 군에 비해 크게 증가하였으나, TSG-6 MSC 투여군 (TSG-6 I, 및 TSG-6 II)에서는 모두 염증성 지표가 감소하였다. 특히 TSG-6 II군에서는 TGF-b1, IFN-r, 및 IL-6가 정상군과 유사한 수준으로 면역 활성이 감소하여 본 출원이 제공하는 TSG-6 MSC의 항염 활성이 우수함을 확인하였다.
실시예 5. TSG-6 유전자의 발현 벡터가 도입된 MSC와 TNF-a 처리된 MSC의 비교
5-1. TNF-a 처리된 MSC의 준비
제대혈 유래의 MSC를 TNF-α로 활성화시켰다. 간략히 설명하면, 재대혈 유래 MSC를 각 웰당 10%(v/v) FBS를 포함하는 Advanced MEM (Thermofisher, MA, US) 배지 2 ml를 포함하는 6-well 플레이트에 1×105 cells의 양으로 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 1%(v/v) FBS 및 10 ng/ml TNF-α (Peptrotech, NY, USA)를 포함하는 Advanced MEM 배지로 교체하고 24시간 배양하였다. 상기 세포를 1 mM EDTA (Gibco)와 함께 0.25%(w/v) 트립신을 37℃에서 2분간 처리하여 트립신화(trypsinization)시켰다. 회수된 세포를 아래 실시예에 사용하였다.
5-2. TSG-6 mRNA 수준의 비교 (Reverse transcription quantitative real-time PCR: RT-qPCR)
비변형 제대혈 유래 MSC (이하, ‘MSC’; 대조군), 실시예 1.2에서 준비된 TSG-6 발현벡터가 도입된 제대혈 유래 MSC (이하, ‘TSG-6 transduced MSC’; 시험군), 및 실시예 5-1에서 준비된 TNF-α로 활성화된 제대혈 유래의 MSC (이하, ‘TNF-α treated MSC’; 비교군)의 24시간 동안의 TSG-6 발현 수준 (mRNA 수준)을 RT-qPCR로 측정하였다. RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 사용하여 제조사의 사용설명에 따라서 상기 세포로부터 총 RNA를 추출하고, SuperScript™ Ⅲ First-Strand Synthesis System(Thermofisher)을 사용하여 cDNA를 합성한 후, Fast SYBR™ Green Master Mix(Thermofisher)를 사용하여 QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystem) 상에서 RT-qPCR을 수행하였다. 내재의 대조유전자로 GAPDH를 사용하였다. 사용된 프라이머를 아래의 표 7에 정리하였다.
Gene Forward sequence (5' to 3') 서열번호 Reverse sequence (5' to 3') 서열번호
TSG-6 TGGATGGCTAAGGGCAGAG 5 GCGTGTGGGTTGTAGCA 6
GAPDH GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 7 ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 8
상기 얻어진 결과를 relative Ct values(TSG-6/GAPDH)로 구하여 도 11a에 나타내었다. 상기의 상대적 발현 수준은 2ΔΔCt method를 사용하여 계산하였다. 도 11a에 나타난 바와 같이, TNF-α treated MSC(비교군)의 상대적 TSG-6 발현 수준 (mRNA 수준)은 대조군인 MSC과 큰 차이를 보이지 않은 반면 (대조군 대비 3.47배), TSG-6 transduced MSC (시험군)의 상대적 TSG-6 발현 수준 (mRNA 수준)은 대조군은 물론 비교군 대비 현저히 높게 나타났다 (대조군 대비 약 1248배, 비교군 대비 약 360배).
5-3. TSG-6 단백질 수준의 비교 (ELISA)
비변형 제대혈 유래 MSC (이하, ‘MSC’; 대조군), 실시예 1.2에서 준비된 TSG-6 발현벡터가 도입된 제대혈 유래 MSC (이하, ‘TSG-6 transduced MSC’; 시험군), 및 실시예 5-1에서 준비된 TNF-α로 활성화된 제대혈 유래의 MSC (이하, ‘TNF-α treated MSC’; 비교군)에서 24시간 동안 발현(배지에 분비)된 TSG-6 단백질 수준을 TSG-6 ELISA kit(Raybiotech, GA, US)를 이용하여 제조사 사용설명에 따라서 측정하였다.
상기 얻어진 결과(ng/105cells/24시간)를 도 11b에 나타내었다. 도 11b에 나타난 바와 같이, 대조군 MSC 및 비교군 TNF-α treated MSC은 TSG-6 단백질 분비량이 측정되지 않을 정도로 낮은 수준인 반면, TSG-6 transduced MSC는 대조군 MSC 및 비교군 TNF-α treated MSC 대비 현저히 높은 수준 (약 70ng/105cells/24시간)으로 TSG-6 단백질을 분비하였다.
5-4. 콜라겐 II mRNA 수준의 비교 (RT-qPCR)
비변형 제대혈 유래 MSC (이하, ‘MSC’; 대조군), TSG-6 발현벡터가 도입된 제대혈 유래 MSC (이하, ‘TSG-6 transduced MSC’; 시험군; 실시예 1.2 참조), 및 TNF-α로 활성화된 제대혈 유래의 MSC (이하, ‘TNF-α treated MSC’; 비교군; 실시예 5-1 참조)를 각각 준비하였다. 이와 같이 준비된 각각의 제대혈 유래의 MSC를 각 웰당 10%(v/v) FBS를 포함하는 Advanced MEM 배지 2 ml를 포함하는 6-well transwell (Corning, MA, US)에 1x105 cells의 양으로 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 1%(v/v) FBS 및 10 ng/ml TNF-a를 포함하는 Advanced MEM 배지로 교체하고 24시간 배양하여 활성화된 MSC를 유발하였다.
연골세포 (늑연골 유래; 실시예 3 참조)를 각 웰당 10%(v/v) FBS를 포함하는 Advanced MEM 배지 2ml를 포함하는 6-well 플레이트에 1x105 cells의 양으로 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 1%(v/v) FBS 및 75 ng/ml IL-1b (Peptrotech, NY, US)를 포함하는 Advanced MEM 배지로 교체하고 24시간 배양하여 염증 유발하였다. 위의 6-well transwell에서 활성화 시킨 MSC와 24시간 공동배양하였다. 연골세포를 1 mM EDTA(Gibco)와 함께 0.25%(w/v) 트립신을 37℃에서 2분간 처리하여 트립신화(trypsinization)시켰다. 회수한 세포를 하기의 콜라겐 II mRNA 수준의 비교 (RT-qPCR)에 사용하였다.
상기와 같이 비변형 제대혈 유래 MSC (MSC; 대조군), TSG-6 발현벡터가 도입된 제대혈 유래 MSC (TSG-6 transduced MSC; 시험군), 또는 TNF-α로 활성화된 제대혈 유래의 MSC (TNF-α treated MSC; 비교군)와 공배양된 연골세포에서의 24시간 동안의 콜라겐 II 발현량 (mRNA 수준)을 RT-qPCR 로 측정하였다. RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 사용하여 제조사의 사용설명에 따라서 상기 세포로부터 총 RNA를 추출하고, SuperScript™ Ⅲ First-Strand Synthesis System(Thermofisher)을 사용하여 cDNA를 합성한 후, Fast SYBR™ Green Master Mix(Thermofisher)를 사용하여 QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystem) 상에서 RT-qPCR을 수행하였다. 내재의 대조유전자로 GAPDH를 사용하였다. 사용된 프라이머를 상기 표 8에 정리하였다.
Gene Forward sequence (5' to 3') 서열번호 Reverse sequence (5' to 3') 서열번호
collagen II CTCAAGTCGCTGAACAACCA 9 GTCTCCGCTCTTCCACTCTG 10
GAPDH GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 7 ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 8
상기 얻어진 결과를 relative Ct values(Collagen II/GAPDH)로 구하여 도 11c에 나타내었다. 상기의 상대적 발현 수준은 2ΔΔCt method를 사용하여 계산하였다. 도 11c에 나타난 바와 같이, TNF-α treated MSC(비교군)의 상대적 콜라겐 II 발현 수준 (mRNA 수준)은 대조군인 MSC과 큰 차이를 보이지 않은 반면 (대조군 대비 1.03배), TSG-6 transduced MSC (시험군)의 상대적 콜라겐 II 발현 수준 (mRNA 수준)은 대조군은 물론 비교군 대비 현저히 높게 나타났다 (대조군 대비 약 1.93배, 비교군 대비 약 1.87배). 이러한 결과는 TSG-6 발현 벡터가 도입된 MSC는, 비변형 MSC는 물론이고 TNF-α로 활성화(자극)된 MSC과 비교하여, 연골세포에서의 콜라겐 II 발현 효과가 현저히 우수함이 확인되었고, 이러한 결과는 TSG-6 발현 벡터가 도입된 MSC의 우수한 연골재생 효과 및/또는 골관절염 치료 효과를 입증한다.
<110> LG CHEM, LTD. <120> Composition for preventing or treating osteoarthritis comprising mesenchymal stem cell expressing tumor necrosis factor-inducible gene 6 <130> DPP20212097KR <150> KR 10-2020-0089148 <151> 2020-07-17 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_TSG-6 amino acid sequence <400> 1 Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Asp Thr Gln 1 5 10 15 Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu 20 25 30 Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys 35 40 45 Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His 50 55 60 Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His 65 70 75 80 Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile 85 90 95 Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp 100 105 110 Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr 115 120 125 Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Gln 130 135 140 Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile 145 150 155 160 Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser 165 170 175 Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr 180 185 190 Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg 195 200 205 Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val 210 215 220 Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe 225 230 235 240 Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly 245 250 255 Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly 260 265 270 Arg Phe Ser His Leu 275 <210> 2 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_TSG-6 gene <400> 2 agtcacattt cagccactgc tctgagaatt tgtgagcagc ccctaacagg ctgttacttc 60 actacaactg acgatatgat catcttaatt tacttatttc tcttgctatg ggaagacact 120 caaggatggg gattcaagga tggaattttt cataactcca tatggcttga acgagcagcc 180 ggtgtgtacc acagagaagc acggtctggc aaatacaagc tcacctacgc agaagctaag 240 gcggtgtgtg aatttgaagg cggccatctc gcaacttaca agcagctaga ggcagccaga 300 aaaattggat ttcatgtctg tgctgctgga tggatggcta agggcagagt tggatacccc 360 attgtgaagc cagggcccaa ctgtggattt ggaaaaactg gcattattga ttatggaatc 420 cgtctcaata ggagtgaaag atgggatgcc tattgctaca acccacacgc aaaggagtgt 480 ggtggcgtct ttacagatcc aaagcaaatt tttaaatctc caggcttccc aaatgagtac 540 gaagataacc aaatctgcta ctggcacatt agactcaagt atggtcagcg tattcacctg 600 agttttttag attttgacct tgaagatgac ccaggttgct tggctgatta tgttgaaata 660 tatgacagtt acgatgatgt ccatggcttt gtgggaagat actgtggaga tgagcttcca 720 gatgacatca tcagtacagg aaatgtcatg accttgaagt ttctaagtga tgcttcagtg 780 acagctggag gtttccaaat caaatatgtt gcaatggatc ctgtatccaa atccagtcaa 840 ggaaaaaata caagtactac ttctactgga aataaaaact ttttagctgg aagatttagc 900 cacttataaa aaaaaaaaaa aggatgatca aaacacacag tgtttatgtt ggaatctttt 960 ggaactcctt tgatctcact gttattatta acatttattt attatttttc taaatgtgaa 1020 agcaatacat aatttaggga aaattggaaa atataggaaa ctttaaacga gaaaatgaaa 1080 cctctcataa tcccactgca tagaaataac aagcgttaac attttcatat ttttttcttt 1140 cagtcatttt tctatttgtg gtatatgtat atatgtacct atatgtattt gcatttgaaa 1200 ttttggaatc ctgctctatg tacagttttg tattatactt tttaaatctt gaactttata 1260 aacattttct gaaatcattg attattctac aaaaacatga ttttaaacag ctgtaaaata 1320 ttctatgata tgaatgtttt atgcattatt taagcctgtc tctattgttg gaatttcagg 1380 tcattttcat aaatattgtt gcaataaata tccttgaaca ca 1422 <210> 3 <211> 834 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_TSG-6 cDNA <400> 3 atgatcatct taatttactt atttctcttg ctatgggaag acactcaagg atggggattc 60 aaggatggaa tttttcataa ctccatatgg cttgaacgag cagccggtgt gtaccacaga 120 gaagcacggt ctggcaaata caagctcacc tacgcagaag ctaaggcggt gtgtgaattt 180 gaaggcggcc atctcgcaac ttacaagcag ctagaggcag ccagaaaaat tggatttcat 240 gtctgtgctg ctggatggat ggctaagggc agagttggat accccattgt gaagccaggg 300 cccaactgtg gatttggaaa aactggcatt attgattatg gaatccgtct caataggagt 360 gaaagatggg atgcctattg ctacaaccca cacgcaaagg agtgtggtgg cgtctttaca 420 gatccaaagc aaatttttaa atctccaggc ttcccaaatg agtacgaaga taaccaaatc 480 tgctactggc acattagact caagtatggt cagcgtattc acctgagttt tttagatttt 540 gaccttgaag atgacccagg ttgcttggct gattatgttg aaatatatga cagttacgat 600 gatgtccatg gctttgtggg aagatactgt ggagatgagc ttccagatga catcatcagt 660 acaggaaatg tcatgacctt gaagtttcta agtgatgctt cagtgacagc tggaggtttc 720 caaatcaaat atgttgcaat ggatcctgta tccaaatcca gtcaaggaaa aaatacaagt 780 actacttcta ctggaaataa aaacttttta gctggaagat ttagccactt ataa 834 <210> 4 <211> 834 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_TSG-6 cDNA_codon optimization <400> 4 atgattatcc tgatctacct gttcctgctg ctgtgggaag atacccaagg ctggggcttc 60 aaggacggca tcttccacaa cagcatctgg ctggaaagag ccgctggcgt ctaccacaga 120 gaagccagaa gcggcaagta caagctgacc tacgccgagg ccaaagccgt gtgcgaattt 180 gaaggcggac acctggccac ctacaagcag ctggaagccg ccagaaagat cggcttccat 240 gtgtgcgctg ccggctggat ggctaagggc agagtgggat accccatcgt gaagcccgga 300 cctaattgcg gctttggaaa gaccggcatc atcgactacg gcatccggct gaacagatcc 360 gagagatggg acgcctactg ctacaaccct cacgccaaag aatgtggcgg cgtgttcaca 420 gaccccaagc agatctttaa gagccctggc ttccccaacg agtacgagga caaccagatc 480 tgctactggc acatcagact gaagtacggc cagcggatcc acctgagctt tctggacttc 540 gacctggaag atgaccctgg ctgcctggcc gactacgtgg aaatctacga cagctacgac 600 gacgtgcacg gcttcgtggg cagatactgc ggagatgagc tgcccgacga catcatcagc 660 accggcaacg tgatgactct gaagttcctg agcgacgcct ctgtgacagc cggcggattc 720 cagatcaaat acgtggccat ggatcccgtg tccaagtcca gccagggcaa gaataccagc 780 accacctcta ccggcaacaa gaacttcctg gccggcagat tcagccacct gtaa 834 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_TSG-6 forward primer <400> 5 tggatggcta agggcagag 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_TSG-6 reverse primer <400> 6 gcgtgtgggt tgtagca 17 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_GAPDH forward primer <400> 7 gtctcctctg acttcaacag cg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_GAPDH reverse primer <400> 8 accaccctgt tgctgtagcc aa 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_collagen II forward primer <400> 9 ctcaagtcgc tgaacaacca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_collagen II reverse primer <400> 10 gtctccgctc ttccactctg 20

Claims (14)

  1. TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 재생용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포는,
    TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 재조합 중간엽줄기세포인, 연골 재생용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 다음의 특징을 가지는 것인, 연골 재생용 조성물:
    TSG-6 단백질의 발현량이 10 내지 200ng/10만 개 세포/24시간,
    TSG-6 단백질의 발현량이 10 내지 50,000ng/mL/24시간, 또는
    이들 모두.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물을 투여한 연골 세포 및 연골 조직으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 콜라겐 II 단백질 발현량이 미투여 대조군에 비해 증가되는 것인, 연골 재생용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물을 투여한 연골 세포, 연골 조직, 활막 세포 및 활막 조직으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 염증성 지표 발현량이 미투여 대조군에 비해 감소하며,
    상기 염증성 지표는 TGF-b1, TNF-a, IFN-r, 및 IL-6로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인, 연골 재생용 조성물.
  6. TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포는,
    TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 재조합 중간엽줄기세포인, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 다음의 특징을 가지는 것인, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    TSG-6 단백질의 발현량이 10 내지 200ng/10만 개 세포/24시간,
    TSG-6 단백질의 발현량이 10 내지 50,000ng/mL/24시간, 또는
    이들 모두.
  9. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 다음의 효과를 가지는 것인, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    연골 세포 및 연골 조직으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 콜라겐 II 단백질 발현량의 미투여 대조군 대비 증가,
    연골 세포, 연골 조직, 활막 세포 및 활막 조직으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상에서의 TGF-b1, TNF-a, IFN-r, 및 IL-6로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 염증성 지표 발현량의 미투여 대조군 대비 감소, 또는
    이들 모두.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 관절강 내 투여용인, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 주사제인, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 II 단백질 발현용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 TSG-6 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포는,
    TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 TSG-6 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 재조합 중간엽줄기세포인, 콜라겐 II 단백질 발현용 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 다음의 특징을 가지는 것인, 콜라겐 II 단백질 발현용 조성물:
    TSG-6 단백질의 발현량이 10 내지 200ng/10만 개 세포/24시간,
    TSG-6 단백질의 발현량이 10 내지 50,000ng/mL/24시간, 또는
    이들 모두.
KR1020210093528A 2020-07-17 2021-07-16 종양괴사인자-자극된 유전자 6을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 KR20220010461A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200089148 2020-07-17
KR20200089148 2020-07-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220010461A true KR20220010461A (ko) 2022-01-25

Family

ID=79554872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210093528A KR20220010461A (ko) 2020-07-17 2021-07-16 종양괴사인자-자극된 유전자 6을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230263835A1 (ko)
EP (1) EP4169518A4 (ko)
JP (1) JP2023533236A (ko)
KR (1) KR20220010461A (ko)
CN (1) CN115867297A (ko)
AU (1) AU2021309230A1 (ko)
BR (1) BR112023000860A2 (ko)
CA (1) CA3184920A1 (ko)
MX (1) MX2023000780A (ko)
TW (1) TWI818286B (ko)
WO (1) WO2022015106A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117771226A (zh) * 2023-12-28 2024-03-29 山东博森医学工程技术有限公司 一种加快骨关节炎损伤修复的促进剂

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9878003B2 (en) * 2006-03-06 2018-01-30 The University Of Manchester Method of treating bone disorders using TSG-6
EP3029061B1 (en) * 2008-06-18 2017-09-13 The Texas A&M University System Mesenchymal stem cells, compositions, and methods for treatment of cardiac tissue damage
WO2016018761A1 (en) * 2014-07-28 2016-02-04 The Texas A&M University System Mesenchymal stem cells expressing biomarkers that predict the effectiveness of the mesenchymal stem cells for treating diseases and disorders
AU2017388339B2 (en) * 2016-12-28 2024-02-29 Hiroshima University Repair agent for living tissue damage and method for producing said repair agent
CN108815509A (zh) * 2018-08-07 2018-11-16 天津昂赛细胞基因工程有限公司 包含可降解生物医用缓释材料的间充质干细胞替代制品及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021309230A9 (en) 2023-06-29
WO2022015106A1 (ko) 2022-01-20
MX2023000780A (es) 2023-02-14
EP4169518A1 (en) 2023-04-26
BR112023000860A2 (pt) 2023-03-07
JP2023533236A (ja) 2023-08-02
TW202216176A (zh) 2022-05-01
CN115867297A (zh) 2023-03-28
EP4169518A4 (en) 2024-01-03
CA3184920A1 (en) 2022-01-20
AU2021309230A1 (en) 2023-02-02
TWI818286B (zh) 2023-10-11
US20230263835A1 (en) 2023-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2016277608B2 (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage
JP6948250B2 (ja) Ｌａｒファミリーホスファターゼの活性を阻害する組成物及び方法
JP5918909B2 (ja) 標的化治療薬
KR101590834B1 (ko) 중간엽 줄기 세포 분화
CN1295482A (zh) 炎性介质拮抗剂
KR20160002681A (ko) 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용해성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(fgr3) 폴리펩티드
KR20220010461A (ko) 종양괴사인자-자극된 유전자 6을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물
EP1371377B1 (en) Compositions for gene therapy of rheumatoid arthritis including a gene encoding an anti-angiogenic protein or parts thereof
SK287523B6 (sk) Použitie CC chemokínového mutanta, farmaceutický prostriedok s obsahom chemokínového mutanta, skrátený a mutovaný humánny RANTES a spôsob jeho výroby
US5726148A (en) Method of treating metabolic bone diseases with an IL-1 receptor
US6815417B1 (en) Method for treating obesity and for inhibiting adipocyte activity
KR101615161B1 (ko) 신경질환의 예방 또는 치료를 위한 icam-1의 용도
KR102308099B1 (ko) Soluble CCR2 발현 유도된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물
US20220409698A1 (en) Composition for preventing or treating bone diseases comprising ccr2
KR20220066116A (ko) 재조합 인간 뉴레귤린 유도체 및 그의 용도
WO2008077938A1 (en) Modulators of talin/integrin association and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination