CN104059159B - 纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药活性成分提取生产工艺领域，具体涉及一种响应面分析优化纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖方法及最佳提取工艺条件。本发明采用纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖，用纤维素酶法热水浸提、灭活酶、浓缩、醇沉、脱蛋白、醇沉、脱色素、醇沉、提取率测定等步骤，即按照1：8～12料液比和添加2％左右的纤维素酶热水浸提两次，80％醇沉三次，三氯乙酸脱蛋白两次，活性炭吸附脱色两次。本发明由响应面三维图获得白花蛇舌草多糖最佳提取工艺条件为：PH7左右、温度55℃、纤维素酶用量2％，在此条件下白花蛇舌草多糖提取率为9.83％。
Description
技术领域
本发明属于中药活性成分提取生产工艺领域，具体涉及一种用响应面分析优化纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖方法及最佳提取工艺条件。
背景技术
多糖又称为多聚糖，是由醛糖或酮糖等单糖通过苷链聚合在一起的一类天然高分子化合物，其分子量一般为数万甚至达数百万，广泛存在于动物细胞膜，植物和微生物细胞壁中，到目前为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中被提取出来，其中从中药材中获得的水溶性多糖最为重要。研究表明：中药多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、保肝等多种功能，其中中药多糖的免疫调节活性及抗肿瘤作用倍受关注，是中药多糖研究的中心课题。目前，多糖提取的主要方法有热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法、超声波提取法和微波提取法等，这些方法都存在一定的不足，如提取率较低、纯度不高，或者提取温度太高破坏多糖活性，或者会引起多糖分子的降解等。目前，多糖提取工艺多为均匀设计和正交设计，这些设计是采用固定其他因素，改变一个因素的单因素考察法确定工艺条件，不能考察因素之间的相互作用，同时也很难考察多个响应值与因素之间的交互作用关系，因此精确度不高。近年来，国内已开始将生物酶应用于中药活性成分的提取，多糖存在于植物的细胞壁中，纤维素酶可使纤维素、半纤维素等物质降解，裂解植物的细胞壁，从而增大细胞内有效成分向提取介质的扩散而提高多糖得率。响应面分析是一种最优化方法，它是将体系的响应作为一个或多个因素的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件，可以准确找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值，是理想的方法。响应面分析法克服了正交试验设计只能处理离散的水平值，无法找出整个区域上的最佳组合和响应值的最优值的缺陷，用该法研究提取工艺参数，求得的回归方程精确度高。白花蛇舌草是茜草科(Rubiaceae)耳草属植物白花蛇舌草(HerbaHedyotis.)的干燥全草，白花蛇舌草多糖是其重要的活性成分，具有抗菌消炎、抗肿瘤和提高机体免疫功能等作用。为提高白花蛇舌草多糖的提取率，并准确地找出工艺条件的最佳组合，本发明提供了响应面分析优化纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺，以酶解与热水浸提相结合的方法提取白花蛇舌草多糖，工艺简便、省时，提取率高；提取工艺采用响应面分析设计，所得最佳工艺参数可靠、精确，为白花蛇舌草多糖的规模生产和应用提供了一种实用的方法，对于白花蛇舌草的综合开发利用及提高其经济价值具有实际意义。
发明内容
本发明采用纤维素酶法对白花蛇舌草多糖进行提取，并采用响应面设计确定最佳工艺条件，最大限度的去除蛋白质、色素等杂质，制备出含量相对稳定的白花蛇舌草多糖。
本发明所用的方法为采用纤维素酶法从白花蛇舌草提取白花蛇舌草多糖的工艺方法。
本发明采用纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺方法为：将干燥的白花蛇舌草进行粉碎，加入纤维素酶进行浸提，酶灭活、浓缩、醇浓、脱蛋白、脱色素步骤，具体要求为，按照白花蛇舌草与水重量比1：8～12料液比配制进行浸提，在上述料液中加入1.5～2.5％的纤维素酶，用热水浸提两次，灭活酶、80％醇沉三次，三氯乙酸脱蛋白两次，活性炭吸附脱色两次，苯酚-硫酸法测定多糖含量和提取率。工艺分为：添加纤维素酶热水浸提、灭活酶、浓缩、醇沉、脱蛋白、醇沉、脱色素、醇沉等步骤，具体按如下步骤进行：
(1)添加纤维素酶热水浸提：两次浸提，将白花蛇舌草粉碎过40目筛。称取白花蛇舌草粉末，按重量比1：8～12的料液比加入水，混合均匀；用磷酸缓冲液调节pH为7左右，添加1.5～2.5％的纤维素酶，混匀，55℃水浴搅拌浸提60分钟；90℃灭活酶10分钟，抽滤得滤液；将滤渣按重量比1：8～12的料液比加入水，混合均匀，用磷酸缓冲液调节pH为7左右，添加1.5～2.5％的纤维素酶，混匀，55℃水浴搅拌浸提60分钟；90℃灭活酶10分钟，抽滤得滤液；合并两次滤液。
(2)浓缩：将滤液真空旋转减压浓缩至浓度为含生药0.5～1克/毫升左右，放至室温；
(3)第一次醇沉：浓缩液中加入95％乙醇至醇浓度为80％，边加边搅拌，密封盖严，静置24～48小时；抽滤，得白花蛇舌草粗多糖；
(4)脱蛋白：将白花蛇舌草粗多糖加适量水溶解，白花蛇舌草粗多糖与水比例w:v为1:1～1.5kg/L，加等体积5％的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000rmp离心5分钟，取上清液；再重复以上操作进行第二次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；
(5)第二次醇沉：脱蛋白多糖液中加入95％乙醇至醇浓度为80％，边加边搅拌，密封盖严，静置24～48小时；抽滤，无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得脱蛋白多糖；
(6)脱色素：将以上所得多糖用适量水溶解，白花蛇舌草粗多糖与水比例w:v为1:1～1.5kg/L，加入重量1％的活性炭，混匀，加热至80℃搅拌30分钟，过滤，取滤液。滤液再按照以上重复操作一次，得脱色素多糖溶液；
(7)第三次醇沉：将以上制得的脱色素多糖液加入95％乙醇至醇浓度为80％，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得精制多糖。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并计算多糖得率。
本发明应用了响应面分析优化设计的方法对多糖的提取工艺进行了优化设计。
(1)各单因素对白花蛇舌草多糖提取率的影响
1)纤维素酶用量对多糖提取率的影响：纤维素酶用量对多糖提取率的影响见表1。从表1可以看出，随着纤维素酶用量的增加，多糖的提取率也随之增大，当纤维素酶用量达2％时，继续增加纤维素酶用量，多糖提取率基本不再增加。
表1纤维素酶用量对多糖含量和多糖提取率的影响
| 纤维素酶用量(％) | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 |
| 多糖含量(g) | 0.614 | 0.702 | 1.024 | 1.782 | 1.740 |
| 多糖提取率(％) | 3.07 | 3.51 | 5.12 | 8.91 | 8.70 |
2)提取温度对多糖提取率的影响：提取温度对多糖提取率的影响见表2。从表2可看出，在30-50℃范围内随着提取温度的升高提取率也随之上升，50℃左右时达到最高点，之后随着温度上升，提取率反而下降，这说明纤维素酶的最适温度在50℃附近。
表2提取温度对多糖含量和提取率的影响
| 提取温度(℃) | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 |
| 多糖含量(g) | 1.016 | 1.224 | 1.150 | 0.782 | 0.794 |
| 多糖提取率(％) | 5.08 | 6.12 | 5.75 | 3.91 | 3.97 |
3)提取时间对多糖提取率的影响：提取温度对多糖提取率的影响见表3。从表3可看出，随着提取时间的增加，多糖提取率无明显变化。
表3提取时间对多糖含量与多糖提取率的影响
| 提取时间(min) | 30 | 60 | 90 | 120 | 150 |
| 多糖含量(％) | 0.802 | 0.862 | 0.894 | 1.006 | 1.076 |
| 多糖提取率(％) | 4.01 | 4.31 | 4.47 | 5.03 | 5.38 |
4)提取pH对多糖提取率的影响：提取pH对多糖提取率的影响见表4。从表4可看出，在pH3-7范围内，随着PH增大白花蛇舌草多糖的提取率也随之增加，到达PH7后，提取率下降，说明纤维素酶的最适PH是7左右。
表4提取PH对多糖含量与多糖提取率的影响
| pH | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 多糖含量(g) | 0.302 | 0.512 | 0.866 | 1.016 | 1.134 | 0.844 |
| 多糖提取率(％) | 1.51 | 2.56 | 4.33 | 5.08 | 5.67 | 4.22 |
(2)用响应面分析优化设计提取方案
根据响应面设计的要求，统计模型发现3个影响因素—提取pH、温度、纤维素酶用量对多糖提取率和含量有显著影响。因此在单因素的基础上进行三因素三水平的响应面设计分析。试验因素及水平如下表5。
表5纤维素酶响应面优化提取还花蛇舌草的因素与水平
| 水平 | 提取温度(℃) | pH值 | 纤维素酶用量(％) |
| －1 | 40 | 3 | 0.5 |
| 0 | 50 | 7 | 2 |
| 1 | 80 | 8 | 2.5 |
(3)纤维素酶响应面提取白花蛇舌草多糖试验结果及显著性分析
根据响应面设计的design-expert软件，得到响应面优化纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖试验结果和回归方程见表6。
表6响应面优化纤维素酶提取白花蛇舌草多糖试验结果
(4)纤维素酶响应面优化提取白花蛇舌草多糖模型显著性分析
纤维素酶响应面优化提取白花蛇舌草多糖模型显著性分析结果见表7。
表7纤维素酶响应面优化提取白花蛇舌草多糖模型显著性分析
| 来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | p值 |
| 模型 | 133.02 | 9 | 14.78 | 49.72 | <0.0001 |
| A-提取温度 | 0.21 | 1 | 0.21 | 0.72 | 0.4245 |
| B-ph | 9.71 | 1 | 9.71 | 32.66 | 0.0007 |
| C-酶用量 | 23.45 | 1 | 23.45 | 78.89 | <0.0001 |
| Ab | 1.11 | 1 | 1.11 | 3.74 | 0.0945 |
| Ac | 0.97 | 1 | 0.97 | 3.27 | 0.1136 |
| Bc | 0.28 | 1 | 0.28 | 0.94 | 0.3656 |
| A2 | 29.61 | 1 | 29.61 | 99.61 | <0.0001 |
| B2 | 7.71 | 1 | 7.71 | 25.95 | 0.0014 |
| C2 | 1.24 | 1 | 1.24 | 4.17 | 0.0804 |
| 残差 | 2.08 | 7 | 0.30 | ||
| 失拟 | 2.04 | 3 | 0.68 | 60.21 | 0.0009 |
| 误差 | 0.045 | 4 | 0.011 | ||
| 总异变 | 135.10 | 16 |
由响应面分析结果得知，白花蛇舌草多糖提取率预试验结果表明提取pH值、提取温度和纤维素酶用量对多糖提取率都有显著影响，其中纤维素酶用量与pH的影响最突出，提取温度影响相对次之。由响应面三维图得白花蛇舌草多糖提取的最佳工艺条件为：pH7左右.、提取温度55℃、纤维素酶用量2％，在此条件下白花蛇舌草多糖提取率为9.83％。
本发明的有益效果是：酶法是一种温和的方法，不会破坏多糖的结构，可提高多糖的得率，并且可以大规模用于工业化生产，是获得生物活性多糖的高效方法。采用响应面分析法优化得到的提取条件参数准确可靠，具有指导规模生产价值，应用与生产具有一定的市场前景和相应的社会效益、经济效益。
具体实施方式
实施例1(1)热水浸提取白花蛇舌草进行粉碎，过40目筛，称取白花蛇舌草粉末，按8～12的比例与水混合均匀；用磷酸缓冲液调节pH为7左右，在料液中添加1.5～2.5％的纤维素酶，混匀，55℃水浴搅拌浸提60分钟；
(2)灭活酶：对提取后的溶液在90℃灭活酶10分钟，抽滤得滤液；
(3)对滤渣再添加纤维素酶热水进行第二次浸提：将第一次提取所得的滤渣，按重量比1：8～12的比例与水混合均匀；用磷酸缓冲液调节pH为7左右，添加1.5～2.5％的纤维素酶，混匀，55℃水浴搅拌浸提60分钟；
(4)灭活酶：对第二次的滤液进行90℃灭活酶10分钟，抽滤得滤液；合并两次滤液。
(5)浓缩：将滤液真空旋转减压浓缩至相当于生药0.5～1克/毫升，放至室温；
(6)第一次醇沉：以上制备的浓缩液中加入95％乙醇至醇浓度为80％，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，真空干燥，得白花蛇舌草粗多糖；
(7)第一次脱蛋白：将以上所制得的白花蛇舌草粗多糖加适量超纯水溶解，w:v为1:1～1.5kg/L，加等体积5％的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000rmp离心5分钟，取上清液；
(8)第二次脱蛋白：将上清液再加等体积5％的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000rmp离心5分钟，取上清液，得脱蛋白多糖溶液；
(9)第二次醇沉：以上脱蛋白多糖溶液中加入95％乙醇至醇浓度为80％，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，用无水乙醇洗涤2～3次，真空干燥，得脱蛋白多糖；
(10)第一次脱色素：将以上制得的脱蛋白多糖加适量超纯水溶解，w:v为1:1～1.5kg/L，加入1％活性炭，搅匀，加热至80℃搅拌30分钟，过滤，取滤液；
(11)第二次脱色素：将以上所得滤液再加入1％活性炭搅匀，加热至80℃搅拌30分钟，过滤，取滤液；
(12)第三次醇沉：将以上制得的脱色素多糖液加入95％乙醇至醇浓度为80％，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，用无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得白花蛇舌草精制多糖。
(13)多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并计算多糖得率。
本发明按照响应面图像分析所得的最佳提取条件：提取温度55℃、提取PH7、料液中加入纤维素酶用量为2％，进行3次提取，结果见表8，白花蛇舌草多糖提取率分别为：8.81％、8.92％和8.94％，与模型预测差异较小，说明该模型能够很好地反映出白花蛇舌草多糖提取的优化条件。
表8纤维素酶响应面优化提取白花蛇舌草多糖具体实施结果
| 具体测定次数 | 第一次 | 第二次 | 第三次5 --> |
| 多糖含量(g) | 1.76 | 1.78 | 1.79 |
| 多糖提取率(％) | 8.81 | 8.92 | 8.95 |
实施例2(1)热水浸提取白花蛇舌草进行粉碎，过40目筛，称取白花蛇舌草粉末20克，加水至200毫升，混合均匀；用磷酸缓冲液调节pH为7左右，在料液中添加2％的纤维素酶，混匀，55℃水浴搅拌浸提60分钟；对滤渣进行第二次浸提，加水至200毫升，混合均匀，用磷酸缓冲液调节pH为7左右，添加2％的纤维素酶，混匀，55℃水浴搅拌浸提60分钟，抽滤得滤液，合并两次滤液，灭活酶，对滤液进行90℃灭活酶10分钟。
(2)浓缩：将滤液真空旋转减压浓缩至30～40毫升，放至室温；
(3)第一次醇沉：以上制备的浓缩液中加入95％乙醇至醇浓度为80％，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，真空干燥，得白花蛇舌草粗多糖；
(4)第一次脱蛋白：将以上所制得的白花蛇舌草粗多糖加20～30毫升超纯水溶解，加等体积5％的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000rmp离心5分钟，取上清液；
(5)第二次脱蛋白：将上清液再加等体积5％的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000rmp离心5分钟，取上清液，得脱蛋白多糖溶液；
(6)第二次醇沉：以上脱蛋白多糖溶液中加入95％乙醇至醇浓度为80％，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时，抽滤，用无水乙醇8～20毫升洗涤2～3次，脱蛋白多糖与无水乙醇w:v为1:3～5kg/L，真空干燥，得脱蛋白多糖；
(7)第一次脱色素：将以上制得的脱蛋白多糖加20～30毫升超纯水溶解，加入重量1％活性炭，搅匀，加热至80℃搅拌30分钟，过滤，取滤液；
(8)第二次脱色素：将以上所得滤液再加入重量1％活性炭搅匀，加热至80℃搅拌30分钟，过滤，取滤液；
(9)第三次醇沉：将以上制得的脱色素多糖液加入95％乙醇至醇浓度为80％，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，用无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得白花蛇舌草精制多糖1.76～1.79克。
Claims (2)
1.一种纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺方法，其特征在于：按照白花蛇舌草与水重量比1：8~12的料液比配制提取液，在提取液中添加纤维素酶热水浸提，80%醇沉，脱蛋白，脱色素，最后精制而成；
具体按如下步骤进行：
（1）热水浸提：将白花蛇舌草进行粉碎，过40目筛，按1：8～12重量比的料液比加入水配制成白花蛇舌草提取液；用磷酸缓冲液调节pH为7，加入1.5～2.5%的纤维素酶，混匀，55°C水浴搅拌加热提取60分钟，抽滤得滤液；将滤渣按1：8～12重量比的料液比加入水，用磷酸缓冲液调节pH为7，再加入1.5～2.5%的纤维素酶，混匀，55°C水浴搅拌加热提取60分钟再提取一次，抽滤得滤液，合并两次滤液，对滤液进行90°C灭活酶10分钟；
（2）浓缩：将滤液真空旋转减压浓缩至浓度为含生药0.5～1克/毫升，放至室温；
（3）第一次醇沉：在浓缩液中加入95%乙醇至醇浓度为80%，边加边搅拌，密封盖严，静置24～48小时；抽滤，得白花蛇舌草粗多糖；
（4）脱蛋白：将白花蛇舌草粗多糖加适量水溶解，加等体积5%的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000rmp离心5分钟，取上清液，再重复以上操作进行第二次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；
（5）第二次醇沉：在脱蛋白后的白花蛇舌草多糖液中加入95%乙醇至醇浓度为80%，边加边搅拌，密封盖严，静置24～48小时；抽滤，用无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得白花蛇舌草多糖；
（6）脱色素：将白花蛇舌草多糖用适量水溶解，加入重量1％的活性炭，混匀，加热至80℃温度搅拌30分钟，过滤，收取滤液；将滤液加入重量1％的活性炭，混匀，加热至80℃温度搅拌30分钟，过滤，得脱色素白花蛇舌草多糖溶液；
（7）第三次醇沉：将脱色素白花蛇舌草多糖液加入95%乙醇至醇浓度为80%，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，用无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得精制白花蛇舌草多糖。
2.根据权利要求1所述的纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺方法，其特征在于：（1）取白花蛇舌草进行粉碎，过40目筛，称取白花蛇舌草粉末20克，加水至200毫升，混合均匀；用磷酸缓冲液调节pH为7，在料液中添加2%的纤维素酶，混匀，55°C水浴搅拌浸提60分钟；对滤渣进行第二次热水浸提，加水至200毫升，混合均匀，用磷酸缓冲液调节pH为7，添加2%的纤维素酶，混匀，55°C水浴搅拌浸提60分钟，抽滤得滤液，合并二次滤液进行90°C灭活酶10分钟；
（2）浓缩：将滤液真空旋转减压浓缩至30～40毫升，放至室温；
（3）第一次醇沉：以上制备的浓缩液中加入95%乙醇至醇浓度为80%，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，真空干燥，得白花蛇舌草粗多糖；
（4）第一次脱蛋白：将以上所制得的白花蛇舌草粗多糖加20～30毫升超纯水溶解，加等体积5%的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000rmp离心5分钟，取上清液；
（5）第二次脱蛋白：将上清液再加等体积5%的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000rmp离心5分钟，取上清液，得脱蛋白多糖溶液；
（6）第二次醇沉：以上脱蛋白多糖溶液中加入95%乙醇至醇浓度为80%，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；进行抽滤，用无水乙醇洗涤2～3次，脱蛋白多糖与无水乙醇w:v为1:3～5kg/L，真空干燥，得脱蛋白多糖；
（7）第一次脱色素：将以上制得的脱蛋白多糖加20～30毫升超纯水溶解，按照1％重量加入活性炭，搅匀，加热至80℃搅拌30分钟，过滤，取滤液；
（8）第二次脱色素：将以上所得滤液再按照1％浓度加入活性炭搅匀，加热至80℃搅拌30分钟，过滤，取滤液；
（9）第三次醇沉：将以上制得的脱色素多糖液加入95%乙醇至醇浓度为80%，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得白花蛇舌草精制多糖1.76～1.79克。
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- 2014-06-17 CN CN201410269480.1A patent/CN104059159B/zh active Active
Patent Citations (3)
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