CN104046604A - 采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法 - Google Patents

采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，调节喷雾干燥机进料温度和风速等运行参数，利用高温使乳酸菌细胞涨破释放胞内乳糖酶，同时添加保护剂保护乳糖酶活性，制备乳糖酶粉剂。所述保护剂为糊精、脱脂奶粉与糊精的混合物，酶活回收率可达到80％以上。本发明利用高温破坏细胞壁，避免了氯仿等化学试剂的使用，极大地降低了生产过程对环境的污染压力，同时也避免了乳糖酶产品中污染有机试剂的可能性。实现了乳糖酶的绿色生产。本发明将制备粗酶液和制备酶固体粉剂两个过程合并，极大地简化了生产工艺，提高了生产效率。本发明可以适用于任何细胞胞内酶的制备，包括细菌、真菌、动物细胞核植物细胞等。

Description

采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法
技术领域
本发明属于酶制剂制备技术领域，涉及一种采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法。 
背景技术
乳糖酶，即β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)，能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。乳糖是乳和乳制品中最主要的碳水化合物，但是许多人由于缺乏乳糖酶而无法消化乳糖，同时引起胃肠道不适，如腹泻、肠绞痛等，即表现为乳糖不耐症。亚洲人口中约有70％的人患有不同程度的乳糖不耐症。患有乳糖不耐症的儿童易表现为钙吸收不良，患有软骨病，体重低下，生长发育迟缓；老年人尤其是老年妇女易表现为骨质疏松症状。 
利用乳糖酶水解乳糖的能力，可以有效消除人体对乳糖的不耐受症状，即向乳制品中添加外源乳糖酶，制成低乳糖或无乳糖乳制品。中国食品添加剂委员会已于1998年将乳糖酶列为食品添加剂新品种。目前，市售乳糖酶制剂主要是通过酵母菌和霉菌发酵获得的，主要有口服片剂、固体粉剂和固定化酶三种类型，多为进口酶制剂，价格昂贵。利用酵母菌和霉菌发酵生产乳糖酶发酵周期长，酵母菌产生的乳糖酶为胞内酶，最适pH值中性，适于水解牛乳中的乳糖，但对热不稳定，易失去活性；霉菌产生的乳糖酶为胞外酶，便于提取，稳定性好，但最适pH值一般为2.5～5.4，多用于水解酸性乳清。许多细菌也能产生乳糖酶，来自细菌的乳糖酶为胞内酶，最适pH中性，酶活力高，但只有少数细菌可作为乳糖酶的安全来源。乳酸菌是应用最早、最广泛的一类细菌，并具有一定的益生功能，但关于乳酸菌发酵生产乳糖酶的报道很少，产量处于较低水平，未实现大规模工业化生产。 
目前，工业上生产乳糖酶制剂的方法主要有三种，酶的固定化、透性化细胞乳糖酶以及多步分离纯化制得乳糖酶制剂。这些方法操作复杂，成本高，酶活力损失严重。本发明的目的是提供一种制备乳酸杆菌乳糖酶的喷雾干燥方法，为工业化生产低乳糖乳制品提供一种高活力、廉价、安全的乳糖酶制剂。 
发明内容
本发明涉及一株产乳糖酶乳酸菌的分离鉴定与一种利用喷雾干燥技术制备乳糖酶的方法。本发明利用乳酸菌发酵生产乳糖酶，发酵结束后向发酵液中添加一定量保护剂进行喷雾干燥，即制得乳糖酶固体酶制剂。利用本发明制备乳糖酶制剂干燥过程迅速、干燥效率高、成本低、操作简单，目前国内尚未见到利用喷 雾干燥法制备乳糖酶制剂的报道。 
技术方案如下 
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种采用喷雾干燥法制备乳糖酶的方法，本发明利用乳酸菌发酵生产乳糖酶，发酵结束后向发酵液中添加一定量保护剂进行喷雾干燥，即制得乳糖酶固体酶制剂，利用本发明制备乳糖酶制剂干燥过程迅速、干燥效率高、成本低、操作简单，目前国内尚未见到利用喷雾干燥法制备乳糖酶制剂的报道。 
本发明实现目的的技术方案如下： 
一种采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，在产乳糖酶的乳酸菌发酵液中直接添加保护剂，加料至喷雾干燥机，通过调节喷雾干燥机运行参数，破碎乳酸菌细胞，释放胞内乳糖酶，喷雾得到乳糖酶固体粉剂，所述保护剂为糊精、脱脂奶粉与糊精的混合物，所述糊精加入量为：10％～20％，g/100mL，所述脱脂奶粉与糊精的混合物的加入量为15％～20％，g/100mL。 
而且，所述脱脂奶粉与糊精添加比例为脱脂奶粉：糊精＝3～7:1。 
而且，所述喷雾干燥机运行参数为进风温度和物料流速。 
而且，所述干燥后乳糖酶固体粉剂的乳糖酶酶活回收率超过80％。 
而且，所述喷雾干燥机进风温度为125℃～135℃。 
而且，所述喷雾干燥机内物料流速为400-800mL/h。 
本发明取得的优点和有益效果是： 
1、本发明采用喷雾干燥技术直接干燥乳酸杆菌乳糖酶发酵液，干燥过程迅速，干燥效率高，生产成本低，操作简单，适合工业化大规模生产。 
2、本发明采用脱脂奶粉和糊精共同作为干燥保护剂，干燥出来的酶制剂干燥状况良好、粉末均匀，减少了乳糖酶因高温而失去的酶活力，同时避免了酶制剂在旋风分离器中的黏壁现象，酶活回收率可达到80％以上，而且干燥的酶制剂具有较好的溶解性，更易于实际应用。 
3、本发明避免了使用化学试剂，极大地降低了对环境的污染压力，同时也避免了乳糖酶制剂中污染有机试剂的可能性，实现了乳糖酶的绿色生产。 
4、本发明利用高温破坏细胞壁，避免了氯仿等化学试剂的使用，极大地降低了生产过程对环境的污染压力，同时也避免了乳糖酶产品中污染有机试剂的可能性。实现了乳糖酶的绿色生产。本发明将制备粗酶液和制备酶固体粉剂两个过程合并，极大地简化了生产工艺，提高了生产效率。本发明可以适用于任何细胞胞内酶的制备，包括细菌、真菌、动物细胞核植物细胞等。 
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。 
本发明使用的菌种购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种具体信息如下：株乳酸杆菌名称为罗伊氏乳杆菌MF2-2，分类名称为Lactobacillus reuteri，保藏编号为：CICC10855，保藏日期：2014年3月21日，北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，保藏单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心 
上述微生物是本发明在实施过程中的一个具体事例，本发明还可以采用其他产乳糖酶的微生物实现，本申请不做特殊限制。 
所用试剂： 
Z-buffer缓冲液(1L)：NaH2PO4·H2O5.64g、Na2HPO4·7H2O16.68g、KCl0.745g、MgSO40.246g、β-巯基乙醇2.7mL(使用前加入)，pH7.0； 
4mg/mLONPG(邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷)； 
1mol/LNa2CO3。 
所使用的仪器主要包括：恒温培养箱，水浴锅，SP-1500实验型喷雾干燥机(上海顺仪科技有限公司)； 
所用培养基： 
种子培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏8g/L、酵母浸粉4g/L、乳糖20g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸三铵2g/L、MgSO40.2g/L、磷酸二氢钾2g/L、MnSO40.05g/L，Tween-80 1mL，pH6.4，1×105Pa、115℃，灭菌25min； 
发酵培养基：乳清粉12.5g/L、酵母浸粉4.5g/L、(NH4)H2PO42.5g/L、乙酸钠5g/L、MgSO40.2g/L、MnSO40.05g/L、吐温-80 1mL，pH6.4，1×105Pa、115℃，灭菌25min。 
实验方法： 
1、罗伊氏乳杆菌MF2-2活化后，以1％的接种量接种至种子培养基中，35℃静置培养，一级种子培养12h，二级种子培养10h，然后转接至发酵培养基。 
2、乳糖酶活力的测定：取1mL发酵液至试管中，加入3mL Z-buffer缓冲液，混匀后加入80μL氯仿、80μL甲苯或氯仿和10％SDS各80μL，充分振荡，加入800μL浓度为4mg/mL的ONPG(邻硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷)，放入37℃水浴锅中开始计时，溶液变成黄色时，加入1mL1mol/LNa2CO3终止反应，12000r/min离心3min，取上清液测定OD420。 
3、中性乳糖酶活力单位(Neutral Lactase Activity Unit,NLU)，其定义为：以1μmol/min的速率释放ONP的酶量。计算公式：NLU/g＝(OD420×f×V)/(4.5254×t×m)。其中：f：测定OD420时的稀释倍数；V：反应体积mL；4.5254：在420nm处1μmol/mL的ONP的吸光度，即ONP标准曲线的斜率；t：反应时间min；m：1mL培养液中菌体干重：0.002g。 
4、喷雾干燥技术制备乳糖酶粉剂：向发酵液中加入10％～20％(g/100mL)糊精，或同时加入脱脂奶粉和糊精，添加比例为3:1～7:1，共添加15％～20％ (g/100mL)。调整喷雾干燥机的运行参数，如设置进风温度为125℃～135℃，物料流速为400mL/h，在此条件下进行喷雾干燥。 
实施例1 
采用化学法破壁处理发酵液，步骤和说明如下： 
采用不同的细胞破碎方式处理罗伊氏乳杆菌发酵液，测定其乳糖酶活力，结果见表1。化学方法破碎细胞的效率明显高于物理方法，其中只加入氯仿细胞破碎效果最好，酶活力最高，可达到768.7NLU/g。物理方法破碎细胞后测得的酶活力较低，说明细胞破碎不充分，乳糖酶不能全部释放。以氯仿破壁后粗酶活力为100％，计算其它方法的破壁效率，结果如表1。高压细胞破碎方法效率最差，只有4.2％。结果显示，现有方法无法用于乳糖酶的制备。 
表1细胞破碎方式对乳糖酶活力的影响 
破碎乳酸菌细胞壁后，粗酶溶液需要进一步处理制成粉剂，才能够有利于长期保存和应用。制成粉剂的方法有多种，主要包括喷雾干燥法和冷冻干燥法。但是，由于喷雾干燥机禁止使用有机溶剂，氯仿和甲苯为有机溶剂，因此不能用于胞内乳糖酶粉剂的制备。冷冻干燥法耗能较大，同样禁止使用有机溶剂，因此也不能用于胞内乳糖酶粉剂的制备。 
选择物理方法处理发酵液，细胞破壁效率普遍偏低，造成成本过高，显然不适于工业化大规模生产。 
实施例2 
一种采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，步骤如下： 
向发酵液中直接添加保护剂，如糊精和脱脂奶粉，可以单独加，可以混合加。设置喷雾干燥机运行参数，如进风温度和物料流速。不同喷雾干燥设备(实验室)功率等不同，酶活回收效率不同。如SP-1500实验型喷雾干燥机(上海顺仪科技有限公司)，设置进风为125℃左右，物料流速为400mL/h左右，向发酵液中同 时添加脱脂奶粉和糊精，比例为7:1，共添加15％，酶活回收率超过80％。 
本方法通过瞬时提高温度，使乳酸菌细胞涨破，破坏力乳酸菌细胞的外部结构，使细胞内的乳糖酶释放，在发酵液中添加必要保护剂，使释放的乳糖酶在极短的时间内得到保护，保护了乳糖酶的活力。避免了使用化学试剂，极大地降低了对环境的污染压力，同时也避免了乳糖酶制剂中污染有机试剂的可能性。实现了乳糖酶的绿色生产。 
本发明可以适用于任何生物细胞胞内酶的制备，包括细菌、真菌、动物细胞核植物细胞等。本发明将破坏细胞结构释放胞内酶和制备固体酶制剂两个过程，在同一时间完成，极大地简化了生产工艺，提高了生产效率，避免了使用有机试剂，属于绿色环保的新型方法。 
本发明采用脱脂奶粉和糊精共同作为干燥保护剂，干燥出来的酶制剂干燥状况良好、粉末均匀，减少了乳糖酶因高温而失去的酶活力，同时避免了酶制剂在旋风分离器中的黏壁现象，酶活回收率可达到80％以上，而且干燥的酶制剂具有较好的溶解性，更易于实际应用。 
实施例3 
一种采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，步骤如下： 
向发酵液中直接添加保护剂糊精，糊精加入15％，g/100mL，设置喷雾干燥机运行参数，进风温度和物料流速125℃，物料流速为400mL/h，喷雾干燥获得乳糖酶粉剂。 
其他需要说明的部分如下： 
以菌株MF2-2为出发菌株进行发酵，获得含有乳糖酶的乳酸菌细胞。进一步通过本发明通过化学和物理方法破碎菌体细胞壁，获得高活力的乳糖酶粗酶液，但粗酶液不稳定，易失活。本发明利用喷雾干燥方法直接制备乳糖酶制剂，向发酵液中添加一定量保护剂，如脱脂奶粉和糊精，减少乳糖酶因高温而失去的活力，同时调整喷雾干燥设备的运行参数，如进风温度和物料流速，获得乳糖酶粉剂，制得的乳糖酶制剂性质稳定。具体步骤是： 
利用化学法破壁制备乳糖酶：取1mL发酵液至试管中，加入3mL Z-buffer缓冲液，混匀后加入80μL氯仿、80μL甲苯或氯仿和10％SDS各80μL，充分振荡，即得到乳糖酶粗酶液，并测定乳糖酶活力。 
利用物理法破壁制备乳糖酶：将10mL罗伊氏乳杆菌MF2-2发酵液放置-80℃冰箱冷冻15min，取出后室温至冰冻菌液完全融解，反复冻融3次，测定乳糖酶活力。取10mL罗伊氏乳杆菌发酵液置于离心管中，冰浴进行超声波细胞破碎处理，测定乳糖酶活力。取200mL罗伊氏乳杆菌MF2-2发酵液，置于超高压均质破碎细胞机中，测定乳糖酶活力。 
喷雾干燥技术制备乳糖酶粉剂：向发酵液中加入10％～20％(w/v)糊精，或同时加入脱脂奶粉和糊精，添加比例为3:1～7:1，共添加15％～20％(w。 

Claims (6)

1.一种采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，其特征在于：在产乳糖酶的乳酸菌发酵液中直接添加保护剂，加料至喷雾干燥机，通过调节喷雾干燥机运行参数，破碎乳酸菌细胞，释放胞内乳糖酶，喷雾得到乳糖酶固体粉剂，所述保护剂为糊精、脱脂奶粉与糊精的混合物，所述糊精加入量为：10％～20％，g/100mL，所述脱脂奶粉与糊精的混合物的加入量为15％～20％，g/100mL。
2.根据权利要求1所述的采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，其特征在于：所述脱脂奶粉与糊精添加比例为脱脂奶粉：糊精＝3～7:1。
3.根据权利要求1所述的采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，其特征在于：所述喷雾干燥机运行参数为进风温度和物料流速。
4.根据权利要求1所述的采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，其特征在于：所述干燥后乳糖酶固体粉剂的乳糖酶酶活回收率超过80％。
5.根据权利要求1所述的采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，其特征在于：所述喷雾干燥机进风温度为125℃～135℃。
6.根据权利要求1所述的采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法，其特征在于：所述喷雾干燥机内物料流速为400-800mL/h。
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