CN104045735B

CN104045735B - 一种用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法

Info

Publication number: CN104045735B
Application number: CN201410278752.4A
Authority: CN
Inventors: 庄铠燕; 林展新; 谢绍河
Original assignee: Guangdong Shao He Pearl Co Ltd
Current assignee: Guangdong Shao He Pearl Co Ltd
Priority date: 2014-06-21
Filing date: 2014-06-21
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2034-06-21
Also published as: CN104045735A

Abstract

本发明所述双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法，包括以下步骤：将蜈蚣藻加水搅拌均匀形成底料；加无水碳酸钠调pH至6.5～7.5；再称取0.25%～0.39%底料重的琼胶酶，用水溶解后加入上述调好pH值的底料中进行酶解，酶解温度20～35℃，酶解时间7～9h；在酶解液中加入乳酸、山梨酸钾，搅拌均匀，并使pH控制在4.8～5.2；再称取0.17%～0.22%底料重的纤维素酶，用水溶解后加入前面溶液中进行酶解，酶解温度45～55℃，酶解时间11～14h；反应结束后进行离心或抽滤，得清液；在清液中加入无水碳酸钠调整酸碱度调pH至6.5～7.5后加热进行灭菌灭酶，所得溶液即为全成分蜈蚣藻提取液。本发明确保了全成分蜈蚣藻提取物的纯度和有效提高了蜈蚣藻有效成分的提取率。

Description

一种用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法

技术领域

本发明涉及海藻的提取方法,特别是一种用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法。

背景技术

目前我国是世界上主要的海藻生产国，每年收获各种海藻（按干品计）150万吨以上。这些海藻用以生产海藻酸盐和酯、琼脂、卡拉胶，广泛用于加工食品、食品添加剂、药品、化工产品等行业。研究表明：海藻的活性物质，有海藻多糖、海藻寡糖、小分子肽以及各种维生素、微量元素，具有改善大脑的血液循环，增强心肌功能，预防心血管疾病的作用，特别对高血压、脑血栓等有特效，同时可增强人体免疫力，辅助抑制肿瘤。传统的海藻深加工方法，都是以提取某单一成分如海藻酸盐和酯、琼脂、卡拉胶、海藻多糖等为主，未有见全成分提取的报道，这样会造成海藻其它没有充分分解和提取的有效成分流失。

现有的海藻加工技术有：（1）现有技术1：期刊《广东农业科学》中《带状蜈蚣藻粗多糖的提取工艺优化》通过单因素试验和L₉(3³)正交试验对热水浸提法提取带状蜈蚣藻多糖的工艺进行了优化。优选方案为料液比1∶70、浸取温度95℃、浸取时间4.5h、醇沉浓度95%。在此条件下,带状蜈蚣藻多糖提取率为20.20%，得率为67.3%；（2）现有技术2：期刊《食品与机械》中《超声波辅助提取蜈蚣藻多糖的工艺优化研究》采用单因素试验和L₉(3³)正交试验研究温度、超声处理时间、提取次数和超声波功率对多糖提取率的影响。最佳工艺为超声波提取温度70℃、超声处理时间15min、超声波功率为450W、提取3次；多糖提取率为18.83%，得率为62.75%；（3）现有技术3：发明专利《水溶性海藻粉的制造方法》（专利公告号：CN101012286B），采用酶解法制备，以纤维素酶和蛋白酶为主要成分的复合酶，重量比例为50∶1～1∶1，酶解条件为pH3～10，温度35℃～65℃，灭酶过滤，取滤饼加浓度为20％的Na₂CO₃溶液至全部溶解，再将滤饼溶解液和过滤时所得滤液混合后调节pH值到中性，干燥制粉。

现有的这些提取蜈蚣藻多糖的技术，如热水提取法、醇沉提取法及超声波提取法存在多糖提取率较低，且长时间高温及超声波处理可能会对蜈蚣藻中的有效成分造成破坏等缺点。另蜈蚣藻细胞壁主要成分为纤维素和琼胶，现有技术3中的复合酶法采用纤维素酶和蛋白酶，酶解后产生大量的滤饼，需要引入大量Na₂CO_3、K₂CO₃进一步将滤饼溶解提纯。还有现有方法较难提取半胱氨酸、组氨酸、脯氨酸、色氨酸、锌、铁等组分,造成提取的有效成分流失。再加上现有技术中常采用盐酸、硫酸调节pH，盐酸及硫酸酸性强，腐蚀性大，添加条件难控制，实施过程中难操作，提取方法繁琐，且提取物应用于食品、化妆品安全性低。

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在问题和不足，提供一种可最大程度地破坏蜈蚣藻细胞壁，将绝大部分不溶物降解为可溶物，使蜈蚣藻中的有效物质充分溶出，从而确保全成分蜈蚣藻提取物的纯度和提高了蜈蚣藻有效成分的提取率，且提取方法操作简易的用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法。此外本发明中的提取液安全性高，可适合应用于食品、化妆品领域中。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明所述用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法，其特点是包括以下步骤：

（一）、称取所需量的蜈蚣藻，清洗后加去离子水，搅拌均匀，形成底料；

（二）、在上述底料中加入无水碳酸钠，调pH至6.5～7.5；

（三）、称取0.25%～0.39%底料重的琼胶酶，用去离子水溶解后加入上述调好PH值的底料中，搅拌均匀；再在反应锅内进行第一次酶解，酶解的温度为20～35℃，时间为7～9h；

（四）、在上述酶解液中加入乳酸、山梨酸钾，搅拌均匀，使pH控制在4.8～5.2范围内；

（五）、称取0.17%～0.22%底料重的纤维素酶，用去离子水溶解后加入步骤（四）的溶液中，搅拌均匀后在反应锅内进行第二次酶解，酶解的温度为45～55℃，时间为11-14h；

（六）、反应结束后，将酶解完成液进行离心或抽滤，得清液；

（七）、在清液中加入无水碳酸钠调整酸碱度，调pH至6.5～7.5后加热进行灭菌灭酶（放凉待用），所得溶液即为全成分蜈蚣藻提取液，所述全成分蜈蚣藻提取液的提取率为26.32%～27.92%，得率为87.73%～93.07%。

因为生产条件应控制在酶的最适范围内，温度的高低及pH的大小都会影响酶的活性大小或导致酶的失活，所以琼胶酶的最佳温度是25℃，最佳pH值是7；纤维素酶的最佳温度是50℃，最佳pH值是5。

同时因是用乳酸调节pH，乳酸温和，可用于食品、化妆品，反应条件易控制，操作安全性高。

其中上述步骤（三）和步骤（五）中采用的琼胶酶和纤维素酶的活力为30000单位。上述步骤（一）中去离子水的加入量一般为蜈蚣藻量的30-50倍。上述步骤（二）中无水碳酸钠的加入量一般为底料重的0.01%～0.016%。上述步骤（四）中上述酶解液中乳酸的加入量一般为底料重的0.02%～0.032%。上述步骤（七）中无水碳酸钠的加入量一般为底料重的0.03%～0.037%。

本发明由于采用纤维素酶和琼胶酶配合使用来对蜈蚣藻进行全成分提取的方法，通过这两种酶对全成分蜈蚣藻提取物提取的协同增效和促进作用，可最大程度地破坏蜈蚣藻细胞壁，将绝大部分不溶物（主要为琼胶、卡拉胶等）降解为可溶物，使蜈蚣藻中的有效物质充分溶出（如用其它方法较难提取的半胱氨酸、组氨酸、脯氨酸、色氨酸、锌、铁等有效物质的提取率得到大大提高），最大程度的保留蜈蚣藻的有效成分，提高了全成分蜈蚣藻提取物的提取率。这是因为蜈蚣藻细胞壁的主要成分是琼胶和纤维素，琼胶酶能够破坏蜈蚣藻的细胞壁，有利于细胞内含物中的多糖及其它成分溶出，并且能够降低蜈蚣藻液的粘度，有利于纤维素酶与底料结合，从而降低纤维素酶的添加量，提高蜈蚣藻有效成分的提取率。同时酶解过程中产生的琼胶降解物寡糖还具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等作用。由于本发明还采用食用乳酸代替盐酸及硫酸，乳酸温和，可用于食品、化妆品，反应条件易控制，操作安全性高。本发明技术中的酶解反应充分、温和，提取率高，不溶物滤饼极少，不需要再加碳酸钠溶解滤饼、可节省劳力物力，且操作方法简易，同时确保全成分蜈蚣藻提取物的纯度，这些技术效果是现有的蜈蚣藻提取方法所无法达到的，创造性高。

具体实施方式

（一）、称取所需量的蜈蚣藻，清洗后（用水洗净，确保无沙石、泥土或其它杂质），加去离子水，搅拌均匀，形成底料；

（二）、在上述底料中加入无水碳酸钠，调pH至6～8范围内；

（七）、在清液中加入无水碳酸钠调整酸碱度，调pH至6.5～7.5后加热进行灭菌灭酶(可放凉待用)，所得溶液即为全成分蜈蚣藻提取液，所述全成分蜈蚣藻提取液的提取率为26.32%～27.92%，得率为87.73%～93.07%。

本发明在提取的过程中，可通过纤维素酶和琼胶酶这两种酶对全成分蜈蚣藻提取物提取的协同增效和促进作用，可最大程度地破坏蜈蚣藻细胞壁，将绝大部分不溶物（主要为琼胶、卡拉胶等）降解为可溶物，使蜈蚣藻中的有效物质充分溶出，最大程度的保留蜈蚣藻的有效成分，提高了全成分蜈蚣藻提取物的提取率。

其中琼胶酶的最佳pH值是7；纤维素酶的最佳pH值是5。上述步骤（三）和步骤（五）中一般采用的琼胶酶和纤维素酶的活力为30000单位。上述步骤（一）中去离子水的加入量一般为蜈蚣藻量的30-50倍。优选是35倍。

为进一步的提高本发明的提取率和得率，上述步骤（二）中无水碳酸钠的加入量一般为底料重的0.01%～0.016%。上述步骤（七）中无水碳酸钠的加入量一般为底料重的0.03%～0.037%。上述步骤（四）中上述酶解液中乳酸的加入量一般为底料重的0.02%～0.032%。

上述山梨酸钾的主要作用是作为防腐剂，视情况添加即可。

本发明可最大程度地破坏蜈蚣藻细胞壁，将绝大部分不溶物降解为可溶物，使蜈蚣藻中的有效物质充分溶出，从而确保全成分蜈蚣藻提取物的纯度和提高了蜈蚣藻有效成分的提取率，且提取方法操作简易、提取液安全性高，可广泛适合应用于食品、化妆品领域中。

以下结合具体实施例对本发明作本一步详细的描述：

实施例一：称取2kg的蜈蚣藻，加入70kg去离子水，搅匀，加入7.2g无水碳酸钠，调pH至7。加入200g的琼胶酶，搅匀，在反应锅内25℃加热8h。加入144g山梨酸钾、23mL的乳酸，搅匀，调pH至5.0。加入122g的纤维素酶，搅匀，在反应锅内50℃加热12h。反应结束后，将酶解液离心（渣为576g）。在离心清液中加入22g无水碳酸钠，调pH至7，加热至100℃灭菌灭酶，所得溶液即为全成分蜈蚣藻提取液，放凉待用。全成分蜈蚣藻提取液的提取率为27.74%，得率为92.47%。

实施例二：称取2kg的蜈蚣藻，加入70kg去离子水，搅匀，加入8.4g无水碳酸钠，调pH至7.5。加入240g的琼胶酶，搅匀，在反应锅内25℃加热8h。加入144g山梨酸钾、25mL的乳酸，搅匀，调pH至5.1。加入140g的纤维素酶，搅匀，在反应锅内52℃加热12h。反应结束后，将酶解液离心（渣为920g）。在离心清液中加入20g无水碳酸钠，调pH至7，加热至100℃灭菌灭酶，所得溶液即为全成分蜈蚣藻提取液，放凉待用。全成分蜈蚣藻提取液的提取率为26.83%，得率为89.43%。

实施例三：称取2kg的蜈蚣藻，加入70kg去离子水，搅匀，加入7.2g无水碳酸钠，调pH至7。加入144g的琼胶酶，搅匀，在反应锅内25℃加热8h。加入144mL山梨酸钾、23mL的乳酸，搅匀，调pH至5.0。加入72g的纤维素酶，搅匀，在反应锅内50℃加热12h。反应结束后，将酶解液离心（渣为1728g）。在离心清液中加入22g无水碳酸钠，调pH至7，加热至100℃灭菌灭酶，所得溶液即为全成分蜈蚣藻提取液，放凉待用。全成分蜈蚣藻提取液的提取率为24.53%，得率为81.77%。

在该实施例中，因琼胶酶及纤维酶的添加量减少，导致细胞壁破坏不完全，不溶物增多,提取率下降。

实施例四：称取2kg的蜈蚣藻，加入70kg去离子水，搅匀，加入7.2g无水碳酸钠，调pH至8.0。加入200g的琼胶酶，搅匀，在反应锅内45℃加热8h。加入144g山梨酸钾、23mL的乳酸，搅匀，调pH至6.0。加入122g的纤维素酶，搅匀，在反应锅内65℃加热12h。反应结束后，将酶解液离心（渣为6840g）。在离心清液中加入22g无水碳酸钠，调pH至7，加热至100℃灭菌灭酶，所得溶液即为蜈蚣藻提取液，放凉待用。蜈蚣藻提取液的提取率为19.88%，得率为66.27%。

该实施例中各组分的提取率低的原因是：反应条件在琼胶酶及纤维酶的最适条件外，酶活性下降或失活，导致提取率下降。

实施例五：称取2kg的蜈蚣藻，加入70kg去离子水，144g山梨酸钾、23mL的乳酸，搅匀，调pH至4.8。加入122g的纤维素酶，搅匀，在反应锅内50℃加热12h。反应结束后，将酶解液离心（渣为2448g）。在离心清液中加入22g无水碳酸钠，调pH至7，加热至100℃灭菌灭酶，所得溶液即为蜈蚣藻提取液，放凉待用。蜈蚣藻提取液的提取率为24.32%，得率为81.07%。

本实施例因没有加琼胶酶，细胞壁破坏不完全，导致提取率下降。

实施六：称取2kg的蜈蚣藻，加入70kg去离子水，搅匀，加入6.5g无水碳酸钠，调pH至6.5。加入200g的蛋白酶，搅匀，在反应锅内25℃加热8h。加入144g山梨酸钾、21mL的乳酸，搅匀，调pH至5.0。加入122g的纤维素酶，搅匀，在反应锅内50℃加热12h。反应结束后，将酶解液离心（渣为6344g）。在离心清液中加入22g无水碳酸钠，调pH至7，加热至100℃灭菌灭酶，所得溶液即为蜈蚣藻提取液，放凉待用。蜈蚣藻提取液的提取率为20.24%，得率为67.45%。

该实施例由于采用其它双酶法来提取蜈蚣藻，导致渣多、提取率低。

以下为各实施例提取液主要营养成分分析表（测定组分的单位mg/ml）

	实施例一	实施例二	实施例三	实施例四	实施例五	实施例六
							蛋白质	6.98	6.72	6.12	4.72	5.36	5.08
粗脂肪	0.73	0.66	0.59	0.45	0.56	0.53
							多糖	7.65	7.24	6.56	5.28	6.33	5.68
天冬氨酸（Asp）	0.564	0.503	0.495	0.395	0.480	0.411
							苏氨酸（Thr）	0.254	0.244	0.232	0.185	0.216	0.192
丝氨酸（Ser）	0.287	0.245	0.237	0.189	0.225	0.210
							谷氨酸（Glu）	1.123	1.085	1.033	0.826	1.002	0.830
甘氨酸（Gly）	0.284	0.257	0.245	0.191	0.244	0.206
							丙氨酸（Ala）	0.481	0.463	0.422	0.301	0.401	0.350
半胱氨（Cys）	0.045	0.032	0.021	0.00	0.020	0.00
							缬氨酸（Val）	0.473	0.455	0.421	0.278	0.391	0.348
蛋氨酸（Met）	0.287	0.256	0.251	0.205	0.253	0.217
							异亮氨（Ile）	0.275	0.232	0.227	0.162	0.247	0.443
亮氨酸（Leu）	0.392	0.352	0.345	0.275	0.335	0.289
							酪氨酸（Tyr）	0.194	0.181	0.172	0.136	0.155	0.134
苯丙氨酸（Phe）	0.192	0.178	0.175	0.140	0.171	0.145
							赖氨酸（Lys）	0.246	0.232	0.203	0.159	0.202	0.185
组氨酸（His）	0.059	0.056	0.054	0.042	0.0524	0.00
							精氨酸（Arg）	0.858	0.820	0.755	0.511	0.722	0.620
脯氨酸（Pro）	0.089	0.084	0.082	0.060	0.078	0.00
							色氨酸（Trp）	0.076	0.065	0.045	0.046	0.058	0.00
钙（Ca）	0.325	0.302	0.295	0.245	0.285	0.231
							镁 (Mg)	0.178	0.165	0.154	0.122	0.145	0.128
铁 (Fe)	0.038	0.034	0.031	0.023	0.030	0.00
							锌 (Zn)	0.026	0.018	0.014	0.00	0.012	0.00
蜈蚣藻提取液的提取率	27.74%	26.83%	24.53%	19.88%	24.32%	20.24%
							得率	92.47%	89.43%	81.77%	66.27%	81.07%	67.45%

由实施例一和实施例四可看出，实施例四没加琼胶酶，其提取率明显小于实施例一，且离心渣的重量要多，所以提取液的成分还不够全面。由实施一和实施例五可看出，实施例五中加的是其他双酶，其提取率很低，提取液成分不全，很多组分为0。另从上述列表可明显看出，采用本发明所述提取方法（实施例一和实施例二），其提取液中很多组分的含量都要高于其它实施例，尤其是多糖、半胱氨酸、组氨酸、脯氨酸、色氨酸、锌、铁等有效物质的提取率明显高于其它实施例，本发明的提取率和得率比其它实施例高很多。

尽管本发明是参照具体实施例来描述，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，所公开的实施例的其他变化，对于本领域技术人员都是可以预料的，这种的变化应属于所属权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法，其特征在于包括以下步骤：

（一）、称取所需量的蜈蚣藻，清洗后加去离子水，搅拌均匀，形成底料，其中去离子水的加入量为蜈蚣藻量的30-50倍；

（二）、在上述底料中加入无水碳酸钠，调pH至6.5～7.5；

（四）、在上述酶解液中加入乳酸、山梨酸钾，搅拌均匀，并使pH控制在4.8～5.2范围内；

（七）、在清液中加入无水碳酸钠调整酸碱度，调pH至6.5～7.5后加热进行灭菌灭酶，所得溶液即为全成分蜈蚣藻提取液，所述全成分蜈蚣藻提取液的提取率为26.32%～27.92%，得率为87.73%～93.07%。

2.根据权利要求1所述的用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法，其特征在于上述步骤（三）和步骤（五）中采用的琼胶酶和纤维素酶的活力为30000单位。

3.根据权利要求1所述的用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法，其特征在于上述步骤（二）中无水碳酸钠的加入量为底料重的0.01%～0.016%。

4.根据权利要求1所述的用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法，其特征在于上述步骤（四）中上述酶解液中乳酸的加入量为底料重的0.02%～0.032%。

5.根据权利要求1所述的用双酶法高效提取全成分蜈蚣藻提取液的方法，其特征在于上述步骤（七）中无水碳酸钠的加入量为底料重的0.03%～0.037%。