CN104024854A - 细胞摄取对照*** - Google Patents

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CN104024854A CN201280053505.3A CN201280053505A CN104024854A CN 104024854 A CN104024854 A CN 104024854A CN 201280053505 A CN201280053505 A CN 201280053505A CN 104024854 A CN104024854 A CN 104024854A
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D·A·吉尔约翰
R·康
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Abstract

本发明的各方面涉及新的方法和组合物，其用于在给定的细胞中评估纳米颗粒构建体的细胞摄取水平、评估纳米颗粒构建体的靶结合水平以及评估RNA和蛋白质水平。

Description

细胞摄取对照***
相关申请
本申请要求2011年9月11日提交的发明名称为“MRNA靶标的细胞内定量检测”的美国临时专利申请No.US61/533,238的35U.S.C.§119(e)下的权益，在此将其全部公开内容引入作为参考。
发明领域
本发明涉及监测颗粒的细胞摄取的方法和组合物。
发明背景
构建体(例如纳米颗粒构建体)的细胞递送是许多治疗和诊断方法的核心方面。例如，纳米颗粒构建体可用于递送药物(例如化疗药物)或会结合并调节细胞中生物分子的表达的结合部分(例如寡核苷酸或抗体)，并可用于评估细胞中的分子(例如RNA和蛋白质)水平。
对于许多涉及纳米颗粒构建体的递送的应用，其与确定构建体的细胞摄取水平相关，例如确定递送的有效性和/或评估构建体的推荐剂量。相同的纳米颗粒构建体可以以不同的速率进入不同类型的细胞。因此，相同的构建体可对不同类型的细胞有不同的作用。因此很难精确地确定一个构建体的细胞摄取的水平和准确地比较不同细胞类型之间的细胞摄取。通常，为了确定细胞之间构建体的不同作用是否是细胞摄取的差异的结果并为了标准化所述摄取，分析测定是必要的。对于金属颗粒，这种测试的一个例子是电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)。采用ICP-MS，可以确定细胞中存在的金属(例如金、银或铁)的量并将所述作用于细胞内存在的构建体的浓度相关联。
发明概述
本文所述的是用于测量纳米颗粒构建体的细胞摄取的新的方法和组合物。本发明的各方面涉及一种用于检测纳米颗粒构建体的细胞摄取的方法，包括：提供纳米颗粒构建体，所述纳米颗粒构建体包含：纳米颗粒核心，包含靶分子特异性结合部分的第一形式(modality)，其连接至所述纳米颗粒核心；以及包含摄取对照部分的第二形式，其连接至所述纳米颗粒核心并包括参考生色团；将所述纳米颗粒构建体接触细胞；以及检测所述细胞内所述参考生色团的水平，其中所述细胞内所述参考生色团的水平显示所述细胞内纳米颗粒构建体的细胞摄取水平。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒构建体包括一种以上的参考生色团。在某些实施方案中，所述摄取对照部分包括多核苷酸、多肽或多聚物。在某些实施方案中，所述参考生色团中的一种或多种是荧光团或量子点。在某些实施方案中，所述结合部分和/或所述摄取对照部分通过间隔体(spacer)连接至所述纳米颗粒核心。
在某些实施方案中，所述结合部分是多核苷酸或多肽。在某些实施方案中，其中多核苷酸充当结合部分，所述多核苷酸是RNA或DNA。在某些实施方案中，充当结合部分的所述多核苷酸是ssRNA。在某些实施方案中，充当结合部分的所述多核苷酸是dsRNA。在某些实施方案中，充当结合部分的所述多核苷酸是ssDNA。在某些实施方案中，其中多肽充当结合部分，所述多肽是抗体。
在某些实施方案中，所述结合部分是被标记的。在某些实施方案中，该标记是所述结合部分结合其靶分子时被检测到的可检测的标记物。在某些实施方案中，所述可检测的标记物是生色团。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒构建体的所述纳米颗粒核心是金属的。在某些实施方案中，所述金属选自金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍及其混合物组成的组。在某些实施方案中，所述纳米颗粒核心包含金。在某些实施方案中，所述纳米颗粒核心是包含可降解金的点阵结构。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒的直径是平均直径从1nm至大约250nm、平均直径大约1ran至大约240nm、平均直径大约1nm至大约230nm、平均直径大约1nm至大约220nm、平均直径大约1nm至大约210nm、平均直径大约1nm至大约200nm、平均直径大约1nm至大约190nm、平均直径大约1nm至大约180nm、平均直径大约1nm至大约170ran、平均直径大约1nm至大约160nm、平均直径大约1nm至大约150nm、平均直径大约1nm至大约140nm、平均直径大约1nm至大约130nm、平均直径大约1nm至大约120nm、平均直径大约1nm至大约110nm、平均直径大约1nm至大约100nm、平均直径大约1nm至大约90nm、平均直径大约1nm至大约80nm、平均直径大约1nm至大约70nm、平均直径大约1nm至大约60nm、平均直径大约1nm至大约50nm、平均直径大约1nm至大约40nm、平均直径大约1nm至大约30nm、或平均直径大约1nm至大约20nm、或平均直径大约1nm至大约10nm。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒构建体包括多个结合部分。在某些实施方案中，所述结合部分结合至一个靶分子。在其他实施方案中，所述结合部分结合至多个靶分子。
在某些实施方案中，所述方法涉及递送治疗或检测形式至细胞。
在某些实施方案中，所述方法涉及调节靶分子的表达。
本发明的其他方面涉及一种检测细胞中纳米颗粒构建体与靶分子的结合的方法，包括：提供纳米颗粒构建体，所述纳米颗粒构建体包含：纳米颗粒核心，包含靶分子特异性结合部分的第一形式，其连接至所述纳米颗粒核心并包括第一生色团；以及包含摄取对照部分的第二形式，其连接至所述纳米颗粒核心并包括第二生色团；将所述纳米颗粒构建体接触细胞；以及检测所述细胞内所述第一和第二生色团的水平，其中所述第一生色团的水平相对于所述第二生色团的水平指示细胞内所述纳米颗粒构建体与靶分子结合的水平。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒构建体包括一种以上的参考生色团。在某些实施方案中，所述摄取对照部分包括多核苷酸、多肽或多聚物。在某些实施方案中，所述参考生色团中的一种或多种是荧光团或量子点。在某些实施方案中，所述结合部分和/或所述摄取对照部分通过间隔体连接至所述纳米颗粒核心。
在某些实施方案中，所述结合部分是多核苷酸或多肽。在某些实施方案中，其中多核苷酸充当结合部分，所述多核苷酸是RNA或DNA。在某些实施方案中，充当结合部分的所述多核苷酸是ssRNA。在某些实施方案中，充当结合部分的所述多核苷酸是dsRNA。在某些实施方案中，充当结合部分的所述多核苷酸是ssDNA。在某些实施方案中，其中多肽充当结合部分，所述多肽是抗体。
在检测细胞中靶分子中的纳米颗粒构建体的结合的方法的某些实施方案中，所述结合部分结合至其靶分子时所述第一生色团被检测到。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒核心是金属的。在某些实施方案中，所述金属选自金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍及其混合物组成的组。在某些实施方案中，所述纳米颗粒核心包含金。在某些实施方案中，所述纳米颗粒核心是包含可降解金的点阵结构。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒的直径是平均直径从1nm至大约250nm、平均直径大约1ran至大约240nm、平均直径大约1nm至大约230nm、平均直径大约1nm至大约220nm、平均直径大约1nm至大约210nm、平均直径大约1nm至大约200nm、平均直径大约1nm至大约190nm、平均直径大约1nm至大约180nm、平均直径大约1nm至大约170ran、平均直径大约1nm至大约160nm、平均直径大约1nm至大约150nm、平均直径大约1nm至大约140nm、平均直径大约1nm至大约130nm、平均直径大约1nm至大约120nm、平均直径大约1nm至大约110nm、平均直径大约1nm至大约100nm、平均直径大约1nm至大约90nm、平均直径大约1nm至大约80nm、平均直径大约1nm至大约70nm、平均直径大约1nm至大约60nm、平均直径大约1nm至大约50nm、平均直径大约1nm至大约40nm、平均直径大约1nm至大约30nm、或平均直径大约1nm至大约20nm、或平均直径大约1nm至大约10nm。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒构建体包括多个结合部分。在某些实施方案中，所述结合部分结合至一个靶分子。在其他实施方案中，所述结合部分结合至多个靶分子。
在某些实施方案中，所述方法涉及递送治疗或检测形式至细胞。
在某些实施方案中，所述方法涉及调节靶分子的表达。
本发明的其他方面涉及一种纳米颗粒构建体包括：纳米颗粒核心；包含靶分子特异性结合部分的第一形式，其连接至所述纳米颗粒核心；以及包含摄取对照部分的第二形式，其连接至所述纳米颗粒核心并包括参考生色团。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒构建体包括一种以上生色团。在某些实施方案中，所述参考生色团中的一种或多种是荧光团或量子点。
在某些实施方案中，所述摄取对照部分通过多核苷酸、多肽或多聚物连接至所述纳米颗粒核心。
在某些实施方案中，所述结合部分和/或所述摄取对照部分通过间隔体连接至所述纳米颗粒核心。在某些实施方案中，所述结合部分是多核苷酸或多肽。在某些实施方案中，其中多核苷酸充当结合部分，所述多核苷酸是RNA或DNA。在某些实施方案中，充当结合部分的所述多核苷酸是ssRNA。在某些实施方案中，充当结合部分的所述多核苷酸是dsRNA。在某些实施方案中，充当结合部分的所述多核苷酸是ssDNA。在某些实施方案中，其中多肽充当结合部分，所述多肽是抗体。
在某些实施方案中，所述结合部分是被标记的。在某些实施方案中，该标记是所述结合部分结合其靶分子时被检测到的可检测的标记物。在某些实施方案中，充当标记的所述可检测的标记物是生色团。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒核心是金属的。在某些实施方案中，所述金属选自由金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍及其混合物组成的组。在某些实施方案中，所述纳米颗粒核心包含金。在某些实施方案中，所述纳米颗粒核心是包含可降解金的点阵结构。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒的直径是平均直径从1nm至大约250nm、平均直径大约1ran至大约240nm、平均直径大约1nm至大约230nm、平均直径大约1nm至大约220nm、平均直径大约1nm至大约210nm、平均直径大约1nm至大约200nm、平均直径大约1nm至大约190nm、平均直径大约1nm至大约180nm、平均直径大约1nm至大约170ran、平均直径大约1nm至大约160nm、平均直径大约1nm至大约150nm、平均直径大约1nm至大约140nm、平均直径大约1nm至大约130nm、平均直径大约1nm至大约120nm、平均直径大约1nm至大约110nm、平均直径大约1nm至大约100nm、平均直径大约1nm至大约90nm、平均直径大约1nm至大约80nm、平均直径大约1nm至大约70nm、平均直径大约1nm至大约60nm、平均直径大约1nm至大约50nm、平均直径大约1nm至大约40nm、平均直径大约1nm至大约30nm、或平均直径大约1nm至大约20nm、或平均直径大约1nm至大约10nm。
在某些实施方案中，所述纳米颗粒构建体包括多个结合部分。在某些实施方案中，所述结合部分结合至一个靶分子。在其他实施方案中，所述结合部分结合至多个靶分子。
本发明的其他方面涉及一种递送治疗或检测形式至细胞的方法，包括递送所述组合物的所述纳米颗粒构建体至所述细胞。
本发明的其他方面涉及一种试剂盒，包括：纳米颗粒；包括靶分子特异性的结合部分的形式；以及包括参考生色团的形式。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括使用说明。
本发明的每个限制可以涵盖本发明的各种实施方案。因此，预计本发明的涉及任何一个元素或元素的组合的每个限制可以包含在本发明的每个方面里。本发明并不局限于将其应用到阐述在下面的描述中或在附图中示出的结构的细节和部件的布置。本发明可以是其他实施方案并以各种方式被实践或被执行。
附图简述
所述附图无意于按比例绘制。在所述图中，各种图中示出的每个相同或几乎相同的组件由同样的数字来表示。为清楚起见，并非每个组件在每幅图中均被标明。在以下图中：
图1显示了含有双链治疗和/或检测形式的纳米颗粒构建体的非限制性的例子。
图2显示了含有双链治疗和/或检测形式和带有参考生色团的摄取对照寡核苷酸的纳米颗粒构建体的非限制性的例子。
图3证实带有Cy3生色团的摄取对照寡核苷酸在不同批次制备中以一致水平装载。
图4证实多个摄取对照寡核苷酸可以整合入同一个纳米颗粒构建体以增加所述摄取标准化信号的稳健性。例如，生色团Cy5和Cy3显示在该非限制性的例子中。这两种生色团可以一致地装入所述纳米颗粒使得通过不同制备得到的纳米颗粒构建体相同。
图5证实含有Cy5-和Cy3标记的寡核苷酸的纳米颗粒构建体的不同制剂的细胞摄取。
发明详述
本发明的各方面涉及一种用于在给定的细胞中评估纳米颗粒构建体的细胞摄取水平、评估纳米颗粒构建体的靶结合水平和评估RNA和蛋白质水平的新的方法和组合物。本发明是基于，至少是部分基于，能够连接至纳米颗粒构建体并含有生色团的摄取对照部分的开发。来自所述摄取对照部分的所述生色团的例如荧光信号的检测可以用于评估纳米颗粒构建体的细胞摄取水平。在某些方面，如果所述纳米颗粒构建体含有多个生色团，那么细胞摄取水平和/或所述纳米颗粒构建体的靶结合水平的评估可以包括例如荧光信号的一种以上生色团的信号水平的比较。
本发明并不局限于将其应用到阐述在下面的描述中或在附图中示出的结构的细节和部件的布置。本发明可以是其他实施方案并以各种方式被实践或被执行。同样，本发明所使用的措辞和术语是出于描述的目的，而不应被视为限制。本发明“包括”、“包含”、或“具有”、“含有”、“涉及”以及它们的变体的使用意味着涵盖其后列出的项目及其等效项目以及其他项目。
本发明的方法涉及纳米颗粒构建体。纳米颗粒构建体是指连接至一个或多个其它形式的纳米颗粒核心。如本发明中所使用的，纳米颗粒是具有纳米级上的平均直径的颗粒(即，在大约1nm和大约1微米之间。例如，在某些情况下，所述纳米颗粒的直径是平均直径从大约1nm至大约250nm、平均直径大约1nm至大约240nm、平均直径大约1nm至大约230nm、平均直径大约1nm至大约220nm、平均直径大约1nm至大约210nm、平均直径大约1nm至大约200nm、平均直径大约1nm至大约190nm、平均直径大约1nm至大约180nm、平均直径大约1nm至大约170ran、平均直径大约1nm至大约160nm、平均直径大约1nm至大约150nm、平均直径大约1nm至大约140nm、平均直径大约1nm至大约130nm、平均直径大约1nm至大约120nm、平均直径大约1nm至大约110nm、平均直径大约1nm至大约100nm、平均直径大约1nm至大约90nm、平均直径大约1nm至大约80nm、平均直径大约1nm至大约70nm、平均直径大约1nm至大约60nm、平均直径大约1nm至大约50nm、平均直径大约1nm至大约40nm、平均直径大约1nm至大约30nm、平均直径大约1nm至大约20nm、平均直径大约1nm至大约10nm、平均直径大约5nm至大约150nm、平均直径大约5至大约50nm、平均直径大约10至大约30nm、平均直径大约10至大约150nm、平均直径大约10至大约100nm、平均直径大约10至大约50nm、平均直径大约30至大约100nm、或平均直径大约40至大约80nm。
如本发明所使用的，纳米颗粒核心指纳米颗粒构建体的纳米颗粒成分，没有任何连接形式。在某些情况下，所述纳米颗粒核心是金属的。应当理解的是，纳米颗粒核心可包含任何金属。金属的一些非限制性例子包括金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍及其混合物。在某些实施方案中，所述纳米颗粒核心包含金。例如，所述纳米颗粒核心可以是包含可降解金的点阵结构。纳米颗粒也可以包括半导体和磁性材料。
与本发明的各方面兼容的纳米颗粒的非限制性例子由以下文献记载并引入作为参考：美国专利号7,238,472，美国专利公开号2003/0147966，美国专利公开号2008/0306016，美国专利公开号2009/0209629，美国专利公开号2010/0136682，美国专利公开号2010/0184844，美国专利公开号2010/0294952，美国专利公开号2010/0129808，美国专利公开号2010/0233270，美国专利公开号2011/0111974，PCT公开号WO2002/096262，PCT公开号WO2003/08539，PCT公开号WO2006/138145，PCT公开号WO2008/127789，PCT公开号WO2008/098248，PCT公开号WO2011/079290，PCT公开号WO2011/053940，PCT公开号WO2011/017690和PCT公开号WO2011/017456。与本发明相关的纳米颗粒可根据本领域已知的任何方法来合成或可商购获得。例如，纳米颗粒的商业供应商的几个非限制性例子包括：Ted Pella,Inc.,Redding,CA,Nanoprobes,Inc.,Yaphank,NY,Vacuum Metallurgical Co,.Ltd.,Chiba,Japan和Vector Laboratories,Inc.,Burlington,CA。
结合部分
纳米颗粒构建体的纳米颗粒核心可以连接至一个或多个形式。在某些情况下，所述纳米颗粒核心连接至包含具有结合细胞中靶分子的特异性的结合部分的形式。结合部分可以是任何具有结合至细胞上特异性靶分子能力的部分。例如，结合部分可以是多核苷酸、多肽或小分子。在某些方面，结合部分是多核苷酸，例如RNA或DNA。例如包括RNA的结合部分可以是ssRNA、dsRNA或任何其它具有结合至细胞中靶分子特异性的RNA分子或可以是ssDNA或任何其它具有结合至细胞中靶分子特异性的DNA分子。在其他情况下，结合部分是具有结合至细胞中靶分子特异性的多肽，例如抗体。
在某些方面，所述结合部分是未被标记的。在其他方面，所述结合部分是被标记的，例如带有可检测的标记物。例如，所述结合部分可用生色团标记，例如荧光团。在某些方面，结合部分的标记可以检测在细胞中的结合事件，因为信号在所述结合部分结合至在细胞中的靶分子时变成可检测的。例如，所述纳米颗粒构建体可以是纳米耀斑(nanoflare)，其可以定量的方式用于检测细胞中的靶标。纳米耀斑指寡核苷酸的三维结构，如进一步在美国专利公开号2010/0129808和PCT公开号WO/2008/098248(PCT申请号PCT/US2008/053603)中所记载的，其每一篇均将其全部内容引入作为参考。纳米耀斑中的寡核苷酸的布置提供了细胞摄取、对核酸酶降解的抗性以及为结合靶标作出反应的可检测的信号的释放。重要的是，由于信号剂和淬灭剂之间的接近，所述纳米耀斑的信号保持淬灭。一旦杂交或结合至细胞中感兴趣的靶分子，该信号被释放。纳米颗粒构建体可以包括能够结合一个或多个靶分子的多个结合部分。
所述结合部分可以是治疗或检测部分。如本发明所使用的，治疗部分是用于治疗目的被施用至细胞的部分，例如用于递送药物或生物的，包括例如DNA或RNA的多核苷酸，包括反义DNA、siRNA、miRNA、反义RNA、例如三链形成寡核苷酸的寡核苷酸、适体和抗体。检测部分是例如用于治疗目的被施用至细胞以检测RNA或蛋白质的部分。
摄取对照部分
与本发明相关的纳米颗粒构建体连接至包含摄取对照部分的形式。如本发明所使用的，摄取对照部分指参考生色团和用于连接所述生色团至所述纳米颗粒核心的连接装置。例如，摄取对照部分可以包括用于连接所述生色团至所述纳米颗粒核心的多核苷酸、多肽或多聚物。在其中所述摄取对照部分是多核苷酸的纳米颗粒构建体中，在某些情况下，所述多核苷酸在细胞的转录组里没有靶标。在其他情况下，所述多核苷酸在细胞的转录组里有靶标。例如，所述多核苷酸可以结合细胞内的看家基因，例如GAPDH或β-Actin。
所述摄取对照部分含有参考生色团，其用于确定细胞中纳米颗粒构建体的相对摄取。在某些情况下，所述摄取对照部分可能改变纳米颗粒构建体的细胞摄取。然而，其存在于每个构建体可以确保样品中所有细胞的摄取是均匀的。所述摄取对照部分可以被合成，这样它对细胞健康没有影响。在其他实施方案中，所述摄取对照部分可以被合成，这样它具有治疗作用。所述参考生色团正交于可用作所述结合部分的一部分的其它生色团。
摄取对照部分可以包含任何适于检测的生色团。此外，多个生色团可被连接至每个纳米颗粒核心，这样可以提高吸收比较的稳健性。如果生色团存在于不同摄取对照部分上，那么可以确定每个单独摄取对照部分的存在和其对细胞摄取的贡献。
测量细胞摄取和/或纳米颗粒构建体的靶结合
本发明的各方面涉及包含摄取对照部分的纳米颗粒构建体的合成和摄取对照部分用于测量纳米颗粒构建体的细胞摄取的用途。例如，与本发明相关的纳米颗粒构建体可以具有连接至纳米颗粒核心的一个或多个结合部分和包括连接至纳米颗粒核心的参考生色团的一个或多个摄取对照部分。所述结合部分可以是标记的或是未被标记的。如果所述结合部分是未被标记的，那么所述参考生色团的检测提供评估细胞吸收的包括所述结合部分的所述纳米颗粒构建体的水平的手段。因此，在不是优选标记结合部分的实施方案中，例如如果标签可以干扰所述结合部分的治疗或诊断目的，那么摄取对照部分可以用于评估所述结合部分的细胞递送水平，因为所述结合部分和所述摄取对照部分均连接至相同的纳米颗粒构建体。
本发明的其他方面涉及使用摄取对照部分测量细胞中纳米颗粒构建体与靶分子的结合。在某些方面，所述结合部分是被标记的，例如在上述纳米耀斑的例子中，其中所述结合部分是含有生色团的寡核苷酸，当所述寡核苷酸结合至其靶分子时所述生色团被检测到。标记的结合部分也可以是多肽，例如抗体，或小分子。一旦例如纳米耀斑的纳米颗粒构建体被合成、鉴定并转染入细胞，来自摄取对照部分上的参考生色团的信号可以被从来自纳米耀斑的信号中减去或分开以描绘由于靶结合从纳米耀斑所发出的例如荧光信号的信号的部分，从而允许跨细胞类型的靶结合和/或基因表达水平的定性和定量比较。
本发明所述的方法，涉及纳米颗粒构建体上一个或多个生色团的检测，是评估纳米颗粒构建体的细胞摄取、测量通过纳米颗粒构建体的靶结合以及测量例如细胞中RNA或蛋白质的靶分子的水平的侵扰程度较低的方法。与以前的例如测量细胞和细胞裂解物中的RNA水平的RTPCR或检测细胞中存在的金属量的ICP-MS的方法相反，本发明所述的方法利用例如流式细胞术和基于图像的分析的技术。与RTPCR不同，其要求细胞群的裂解以测量其平均基因表达，采用本发明所述的纳米颗粒构建体，可以处理单独活细胞中的RNA水平。此外，RNA水平的差异可以用于荧光激活细胞分选(FACS)以相似但更广泛的方式基于现有蛋白质进行群体分析和分选。
FACS常用于通过流式细胞术分离细胞群体。一个常见的分选方法是基于细胞表面蛋白来查询群体。通常，细胞上的膜结合蛋白用荧光染料标记的抗体标记、洗涤并随后通过FACS分析。与没有该膜蛋白的细胞相比，带有感兴趣的抗原的细胞有很强的荧光。然后，这些荧光细胞从低荧光细胞群体中机械分离。
基于活细胞的RNA含量的FACS是具有挑战性的但其代表了极其强大技术，因为FACS通常是基于有限的细胞表面蛋白和细胞渗透性染料的分析。与此相反，纳米颗粒构建体可以查询全部转录组。本发明所述的纳米颗粒构建体允许前所未有的活细胞基因型鉴定和细胞分选水平，从而为研究人员和临床医生提供非常有用的工具。
本发明所述的方法可以在体外、离体或体内进行，包括，例如，培养的哺乳动物细胞，例如培养的人细胞。
可以在例如脂质(例如阳离子脂质)或脂质体的递送试剂的存在下接触靶细胞(例如哺乳动物细胞)。
本发明的另一个方面提供调节哺乳动物细胞中靶基因表达的方法，包括将所述哺乳动物细胞与纳米颗粒构建体接触。
摄取对照部分允许细胞内和细胞间的生物相关信号的定量
先前的纳米颗粒构建体(例如纳米耀斑)的局限性在于由于细胞内的背景荧光它们无法准确定量细胞内RNA水平。在这里，可以用纳米颗粒构建体通过修饰纳米颗粒构建体以包括摄取对照部分从而获得相关RNA定量，所述摄取对照部分包含与连接至所述纳米颗粒构建体的所述结合部分的生色团不同的生色团。参考生色团的信号可以被从来自连接至允许确定结合部分的结合特异性信号的所述结合部分的生色团的信号中减去或分开。在某些情况下，所述摄取对照部分包括结合至靶基因例如GAPDH或β-Actin的寡核苷酸，而结合部分结合至感兴趣的基因，这样荧光信号的比较给出相关基因水平。在其他情况下，所述摄取对照部分不结合至细胞内的基因。所述参考生色团通过允许评估所述纳米颗粒构建体的细胞摄取水平和通过允许减去背景荧光从而允许靶结合信号的标准化。
纳米颗粒构建体(例如纳米耀斑)的用途的另一个局限性在于一直无法跨细胞类型精确比较基因表达水平。纳米颗粒构建体，例如纳米耀斑，被不同细胞类型并且在单独的细胞群中以不同的速率吸收并降解。原则上，从纳米耀斑检测到的荧光应当反映细胞中的生物学有意义的结合实际，纳米耀斑的更大的细胞摄取和降解提高细胞内的荧光信号，导致高背景水平，这使得结合事件信号变得难以区分。为了把摄取、降解和靶结合事件的贡献互相区分开，本发明所述的方法和组合物涉及通过减去从参考生色团所检测到的荧光对结合部分所检测到的信号进行标准化。本发明记载了包括与RNA靶向的纳米耀斑具有相似摄取和稳定性的摄取对照部分的纳米颗粒构建体的合成。
摄取对照部分和结合部分的标记
本发明相关的摄取对照部分包含生色团以允许在细胞中对它们的检测。细胞可以具有一个或多个摄取对照部分和一个或多个参考生色团。生色团的非限制性例子包括荧光团和量子点。寡核苷酸可以根据现有技术已知的方法标记生色团。标记部分可以包括荧光、比色、放射性、量子点、NIR活性、磁性、催化、酶、蛋白质、质谱标签和化学发光剂。
在某些情况下，所述生色团是荧光团。荧光团的几个非限制性例子包括：1,8-ANS(8-苯胺基萘-1-磺酸)、8-苯胺基萘-1-磺酸(1,8-ANS)、5-(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素pH9.0、5-FAM pH9.0、5-ROX(5-羧基-X-罗丹明，三乙胺盐)、5-ROX pH7.0、5-TAMRA、5-TAMRA pH7.0、5-TAMRA-甲醇、6JOE、6,8-二氯-7-羟基-4-甲基香豆素pH9.0、6-羧基罗丹明(6-Carboxyhrodamine)6G pH7.0、6-羧基罗丹明6G,盐酸盐、6-HEX,SE pH9.0、6-TET,SE pH9.0、7-氨基-4-甲基香豆素pH7.0、7-羟基-4-甲基香豆素、7-羟基-4-甲基香豆素pH9.0、Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa Fluor430抗体结合物pH7.2、Alexa Fluor488抗体结合物pH8.0、Alexa Fluor488酰肼-水、Alexa Fluor532抗体结合物pH7.2、Alexa Fluor555抗体结合物pH7.2、Alexa Fluor568抗体结合物pH7.2、Alexa Fluor610R-藻红蛋白链霉素pH7.2、Alexa Fluor647抗体结合物pH7.2、Alexa Fluor647R-藻红蛋白链霉素pH7.2、AlexaFluor660抗体结合物pH7.2、Alexa Fluor680抗体结合物pH7.2、Alexa Fluor700抗体结合物pH7.2、别藻蓝蛋白pH7.5、AMCA结合物、氨基香豆素、APC(别藻蓝蛋白)、Atto647、BCECF pH5.5、BCECF pH9.0、BFP(蓝色荧光蛋白)、BO-PRO-1-DNA、BO-PRO-3-DNA、BOBO-1-DNA、BOBO-3-DNA、BODIPY650/665-X、甲醇、BODIPY FL结合物、BODIPY FL,甲醇、Bodipy R6G SE、BODIPY R6G,甲醇、BODIPY TMR-X抗体结合物pH7.2、BodipyTMR-X结合物、BODIPY TMR-X,甲醇、BODIPY TMR-X,SE、BODIPY TR-X类鬼笔毒环肽pH7.0、BODIPY TR-X,甲醇、BODIPYTR-X,SE、BOPRO-1、BOPRO-3、钙黄绿素(Calcein)、钙黄绿素pH9.0、钙红(Calcium Crimson)、钙红Ca2+、钙绿、钙绿-1Ca2+、钙橙、钙橙Ca2+、羧基萘基荧光素pH10.0、瀑布蓝(Cascade Blue)、瀑布蓝BSA pH7.0、瀑布黄、瀑布黄抗体结合物pH8.0、CFDA、CFP(青色荧光蛋白)、CI-NERF pH2.5、CI-NERF pH6.0、黄水晶(Citrine)、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、CyQUANTGR-DNA、丹磺酰尸胺、丹磺酰尸胺,甲醇、DAPI、DAPI-DNA、Dapoxyl(2-氨基乙基)磺酰胺、DDAO pH9.0、Di-8ANEPPS、Di-8-ANEPPS-脂质、DiI、DiO、DM-NERF pH4.0、DM-NERF pH7.0、DsRed、DTAF、dTomato、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、伊红(Eosin)、伊红抗体结合物pH8.0、赤藓红-5-异硫氰酸酯(Erythrosin-5-isothiocyanate)pH9.0、溴化乙锭、乙锭均二聚物(Ethidium homodimer)、乙锭均二聚物-1-DNA、eYFP(增强型黄色荧光蛋白)、FDA、FITC、FITC抗体结合物pH8.0、FlAsH、Fluo-3、Fluo-3Ca2+、Fluo-4、Fluor-红宝石、荧光素(Fluorescein)、荧光素0.1M NaOH、荧光素抗体结合物pH8.0、荧光素右旋糖酐pH8.0、荧光素pH9.0、Fluoro-Emerald、FM1-43、FM1-43脂质、FM4-64、FM4-64,2％CHAPS、Fura Red Ca2+、Fura Red,高Ca、Fura Red,低Co、Fura-2Ca2+、Fura-2,高Cu"Fura-2,no Cu、GFP(S65T)、HcRed、Hoechst33258、Hoechst33258-DNA、Hoechst33342、Indo-1Ca2+、Indo-1,无Ca、Indo-1,Ca饱和、JC-1、JC-1pH8.2、丽丝胺罗丹明(Lissamine rhodamine)、LOLO-1-DNA、荧光(Lucifer)黄、CH、LysoSensor蓝、LysoSensor蓝pH5.0、LysoSensor绿、LysoSensor绿pH5.0、LysoSensor黄pH3.0、LysoSensor黄pH9.0、LysoTracker蓝、LysoTracker绿、LysoTracker红、镁绿、镁绿Mg2+、镁橙、镁蓝、mBanana、mCherry、mHoneydew、MitoTracker绿、MitoTracker绿FM,甲醇、MitoTracker橙、MitoTracker橙,甲醇、MitoTracker红、MitoTracker红,甲醇、mOrange、mPlum、mRFP、mStrawberry、mTangerine、NBD-X、NBD-X,甲醇、NeuroTrace500/525、绿色荧光Nissl染色的RNA、尼罗(Nile)蓝,乙醇、尼罗红、尼罗红-脂质、Nissl、俄勒冈(Oregon)绿488、俄勒冈绿488抗体结合物pH8.0、俄勒冈(Oregon)绿514、俄勒冈绿514抗体结合物pH8.0、太平洋(Pacific)蓝、太平洋蓝抗体结合物pH8.0、藻红蛋白、PicoGreen dsDNA定量试剂、PO-PRO-1、PO-PRO-1-DNA、PO-PRO-3、PO-PRO-3-DNA、POPO-1、POPO-1-DNA、POPO-3、碘化丙啶、碘化丙啶-DNA、R-藻红蛋白pH7.5、ReAsH、试卤灵(Resorufin)、试卤灵pH9.0、Rhod-2、Rhod-2Ca2+、罗丹明、罗丹明110、罗丹明110pH7.0、罗丹明123,甲醇、罗丹明绿、罗丹明鬼笔环肽(phalloidin)pH7.0、罗丹明红-X抗体结合物pH8.0、罗丹明绿pH7.0、对甲氨基酚(Rhodol)绿抗体结合物pH8.0、蓝宝石(Sapphire)、SBFI-Na+、钠绿(Sodium Green)Na+、磺酰罗丹明101,乙醇、SYBR绿I、SYPRO红宝石、SYTO13-DNA、SYTO45-DNA、SYTOX蓝-DNA、四甲基罗丹明抗体结合物pH8.0、四甲基罗丹明右旋糖酐pH7.0、德克萨斯红-X抗体结合物pH7.2、TO-PRO-1-DNA、TO-PRO-3-DNA、TOTO-1-DNA、TOTO-3-DNA、TRITC、X-Rhod-1Ca2+、YO-PRO-1-DNA、YO-PRO-3-DNA、YOYO-1-DNA和YOYO-3-DNA。
应当理解，本发明进一步记载在美国专利公开号2010/0129808中并将其引入作为参考的其它类型的可检测的标记物和标签与本发明的各方面相兼容。
与本发明各方面兼容的淬灭部分包括Dabcyl、孔雀石绿、QSY7、QSY9、QSY21、QSY35、爱荷华黑和黑洞猝灭剂、蛋白质和肽。所述纳米颗粒核心也可以作为在其他淬灭部分不存在或其存在之外的淬灭剂。
形式与纳米颗粒的连接
与本发明相关的形式，包含摄取对照部分和结合部分，例如多核苷酸、多肽和小分子，可以通过本领域已知的任何方法与纳米颗粒核心连接。美国专利公开号2010/0129808详细描述了将寡核苷酸与纳米颗粒连接的方法并将其引入作为参考。
纳米颗粒可以被官能化，以便连接多核苷酸。可替代地或另外地，所述多核苷酸可以被官能化。官能化的一个机制是烷烃硫醇法，其中在与金纳米颗粒或含有其他金属、半导体或磁性材料的纳米颗粒连接之前，寡核苷酸在其3’或5’末端官能化上烷基硫醇。该方法被例如Whitesides,Proceedings of the Robert A.Welch Foundation39thConference On Chemical Research Nanophase Chemistry,Houston,Tex.,pages109-121(1995),和Mucic等Chem.Commun.555-557(1996)记载。寡核苷酸还可以采用其他官能团连接至纳米颗粒，例如美国专利号5,472,881所记载并引入作为参考的硫代磷酸酯(phosophorothioate)基团，或Burwell,Chemical Technology,4,370-377(1974)和Matteucci与Caruthers,J.Am.Chem.Soc.,103,3185-3191(1981)所记载并引入作为参考的取代的烷基硅氧烷。在某些情况下，多核苷酸通过以5’或3’硫代核苷终止该多核苷酸与纳米颗粒相连接。在其他情况下，老化过程是用于多核苷酸连接到纳米颗粒，以下文献记载并引入作为参考：美国专利号6,361,944、6,506,569、6,767,702和6,750,016以及PCT公开号WO1998/004740、WO2001/000876、WO2001/051665和WO2001/073123。
在某些情况下，所述摄取对照部分和/或所述结合部分共价连接至所述纳米颗粒核心，例如通过金硫醇连接。间隔序列可包含于连接位点与摄取对照部分和/或结合部分之间。在某些实施方案中，间隔序列包括或由寡核苷酸、肽、多聚物或低聚乙烯组成。
纳米颗粒构建体可以被设计成具有多种化学成分。例如可以使用DTPA(dithiol phosphoramidite，二硫醇亚磷酰胺)连接。DTPA抵抗耀斑胞内释放硫醇，可以有助于提高信噪比。
多核苷酸
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本发明可互换使用，指多个核苷酸(即含有连接至磷酸酯基团和可交换的有机碱基(可以是取代的嘧啶(例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)、或鸟嘌呤(G))的糖(例如核糖或脱氧核糖)的分子)。如本发明所使用的，该术语指寡核糖核苷酸以及寡脱氧核糖核苷酸。该术语还包括多核苷(即除去磷酸酯的多核苷酸)和任何含有其他有机碱基的聚合物。核酸分子可以获取自现有的核酸源(例如基因组或cDNA)，但优选为合成的(例如通过核酸合成制得)。在某些实施方案中，所述多核苷酸是DNA、RNA或LNA分子。
连接至纳米颗粒核心的多核苷酸可以是单链或双链的。双链多核苷酸也被本发明称为双链体。本发明的双链寡核苷酸可以包括两个独立的互补的核酸链。
如本发明所使用的，“双链体”包括双链核酸分子，其中互补序列彼此氢键键合。所述互补序列可以包括有义链和反义链。反义核苷酸序列可以与靶基因相同或足够相同以介导对靶基因序列有效的靶基因的抑制(例如至少大约98％相同、96％相同、94％、90％相同、85％相同或80％相同)。
双链多核苷酸可以在其全长上是双链的，这意味着它没有悬垂的单链序列，并因此是平端。在其他实施方案中，双链多核苷酸的两条链可以具有不同的长度，产生一条或更多单链悬垂。本发明的双链多核苷酸可以包含错配和/或环或突起。在某些实施方案中，寡核苷酸长度的至少大约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是双链。在某些实施方案中，本发明的所述双链多核苷酸包含至少或多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
与本发明相关的多核苷酸可以在例如糖部分、磷酸二酯键和或碱基被修饰。如本发明所使用的，“糖部分”包括天然、未修饰的糖，包括戊糖、核糖和脱氧核糖，修饰的糖和糖类似物。糖部分的修饰可以包括用卤素、杂原子或脂肪族基团取代羟基，以及可以包括羟基的官能化为例如醚、胺或硫醇。
糖部分的修饰可以包括2’-O-甲基核苷酸，这被称为“甲基化”。在某些情况下，与本发明相关的多核苷酸可以仅包含修饰的或未修饰的糖部分，而在其他情况下，多核苷酸包含一些修饰的糖部分和一些没有修饰的糖部分。
在某些情况下，修饰核苷酸单体包括糖或骨架修饰的核糖核苷酸。修饰的核糖核苷酸可以包含非天然存在的碱基，例如在5’-位置修饰的尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷，例如5’-(2-氨基)丙基尿嘧啶核苷和5’-溴尿嘧啶核苷；在8-位置修饰的腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷，例如8-溴鸟嘌呤核苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺嘌呤核苷；以及N-烷基化的核苷酸，例如N6-甲基腺嘌呤核苷。此外，糖修饰的核糖核苷酸可以是2’-OH基团由以下基团取代：H、烷氧基(或OR)、R或烷基、卤素、SH、SR、氨基(例如NH2、NHR、NR2、)、或CN基，其中R是低级烷基、烯基或炔基。在某些实施方案中，修饰的核糖核苷酸可以与相邻的核糖核苷酸连接的磷酸二酯基被修饰的基团取代，例如硫代磷酸酯基团。
在某些方面，2’-O-甲基修饰可以有助于减少细胞应激反应，如应答双链核酸的干扰素。修饰的糖可以包括D-核糖、2’-O-烷基(包括2’-O-甲基和2’-O-乙基)，即2’-烷氧基、2’-氨基、2’-S-烷基、2’-卤素(包括2’-氟)、2’-甲氧乙氧基、2’-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2’-炔基、2’-丙基、乙炔基，乙烯基，丙烯基和氰基等。糖部分也可以是己糖。
术语“烷基”包括饱和的脂肪族基团，包括直链烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支链烷基(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷基(脂环族)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其骨架上具有6个或更少的碳原子(例如直链C1-C6，支链C3-C6)，更优选为4个或更少。同样，优选的环烷基在其环结构具有3-8个碳原子，更优选为在其环结构具有5或6个碳原子。术语C1-C6包括含有1至6个碳原子的烷基。
除非另有说明，术语烷基包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，其中后者是指具有独立选择的取代基取代了烃骨架的一个或多个碳上的氢的烷基部分。这些取代基可以包括，例如，烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根、次膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或芳族或杂环部分。环烷基可进一步被例如被上述取代基取代。“烷基芳基”或“芳基烷基”部分是被芳基取代的烷基(例如苯基甲基(苄基))。术语“烷基”还包括天然和非天然氨基酸的侧链。术语“n-烷基”是指直链(即无支链的)未取代的烷基。
术语“烯基”包括长度类似和可能被上述烷基取代的不饱和脂肪族基团，但其含有至少一个双键。例如，术语“烯基”包括直链烯基(例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)、支链烯基、环烯基(脂环族)(环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基)、烷基或烯基取代的环烯基和环烷基或环烯基取代的烯基。在某些实施方案中，直链或支链烯基在其骨架上具有6个或更少的碳原子(例如直链C2-C6，支链C3-C6)。同样，优选的环烯基在其环结构具有3-8个碳原子，更优选为在其环结构具有5或6个碳原子。术语C2-C6包括含有2至6个碳原子的烯基。
除非另有说明，术语烯基包括“未取代的烯基”和“取代的烯基”，其中后者是指具有独立选择的取代基取代了烃骨架的一个或多个碳上的氢的烯基部分。这些取代基可以包括，例如，烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根、次膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或芳族或杂环部分。
术语“炔基”包括长度类似和可能被上述烷基取代的不饱和脂肪族基团，但其含有至少一个三键。例如，术语“炔基”包括直链炔基(例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)、支链炔基和环烷基或环烯基取代的炔基。在某些实施方案中，直链或支链炔基在其骨架上具有6个或更少的碳原子(例如直链C2-C6，支链C3-C6)。术语C2-C6包括含有2至6个碳原子的炔基。
除非另有说明，术语炔基包括“未取代的炔基”和“取代的炔基”，其中后者是指具有独立选择的取代基取代了烃骨架的一个或多个碳上的氢的炔基部分。这些取代基可以包括，例如，烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根、次膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或芳族或杂环部分。
除非另有注明碳原子的数目，本发明所使用的“低级烷基”指烷基，如上所定义，但是具有在其骨架结构中从一至五个碳原子。“低级烯基”和“低级炔基”具有例如2-5个碳原子的链长度。
术语“烷氧基”包括取代和未取代的共价连接至氧原子的烷基、烯基和炔基。烷氧基的例子包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。取代的烷氧基的例子包括卤代烷氧基。所述烷氧基可以被独立选自以下组的所取代：例如，烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根、次膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或芳族或杂环部分。卤素取代的烷氧基的例子包括，但不限于，氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等。
术语“疏水性修饰”是指碱基的修饰使得全部的疏水性增加并且该碱基仍然能够形成接近常规的Watson-Crick相互作用。碱基修饰的非限制性例子包括5-位置尿嘧啶核苷和胞嘧啶核苷修饰像苯基、4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基和异丁基、苯基(C6H5OH)；色氨酰基(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、异丁基、丁基、氨基苄基；苯基；萘基、
术语“杂原子”包括除碳或氢以外的任何元素的原子。在某些实施方案中，优选的杂原子是氮、氧、硫和磷。术语“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”包括具有-OH或-O-(带有合适的抗衡离子)的基团。术语“卤素”包括氟、溴、氯、碘等。术语“全卤代”通常指其中所有的氢都被卤素原子取代的部分。
术语“取代的”包括独立选择的取代基，其可被置于部分上并允许该分子执行其预定功能。取代基的例子包括烷基、烯基、炔基、芳基、(CR′R″)0-3NR′R″、(CR′R″)0-3CN、NO2、卤素、(CR′R″)0-3C(卤素)3、(CR′R″)0-3CH(卤素)2、(CR′R″)0-3CH2(卤素)、(CR′R″)0-3CONR′R″、(CR′R″)0-3S(O)1-2NR′R″、(CR′R″)0-3CHO、(CR′R″)0-3O(CR′R″)0-3H、(CR′R″)0-3S(O)0-2R′、(CR′R″)0-3O(CR′R″)0-3H、(CR′R″)0-3COR′、(CR′R″)0-3CO2R′或(CR′R″)0-3OR′基团；其中每个R′和R″各自独立地是氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基或芳基，或者R′和R″一起为亚苄基(benzylidene)或—(CH2)2O(CH2)2-基团。
术语“胺”或“氨基”包括在其中氮原子共价连接至至少一个碳原子或杂原子的化合物或部分。术语“烷基氨基”包括其中氮结合至少一个额外的烷基的基团和化合物。术语“二烷基氨基”包括其中氮原子结合至少两个额外的烷基的基团。
术语“醚”包括含有结合至两个不同碳原子或杂原子的氧的化合物或部分。例如，该术语包括“烷氧基”，其指共价连接至氧原子的烷基、烯基或炔基，所述氧原子共价连接至其他烷基。
术语“碱基”包括已知的嘌呤和嘧啶杂环碱基、脱氮嘌呤和类似物(包括杂环取代类似物，例如氨基乙氧基吩恶嗪)、衍生物(例如，1-烷基-、1-烯基-、杂芳基-和1-炔基衍生物)及其互变异构体。嘌呤的例子包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、二氨基嘌呤、黄嘌呤和类似物(例如，8-氧代-N6-甲基腺嘌呤或7-二氮杂黄嘌呤)及其衍生物。嘧啶包括，例如，胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶以及它们的类似物(例如，5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶和4,4-桥亚乙基胞嘧啶)。合适的碱基的其他例子包括非嘌呤和非嘧啶碱基，例如2-氨基吡啶和三嗪。
在某些方面，本发明的多核苷酸的核苷酸单体是RNA核苷酸，包括修饰的RNA核苷酸。
术语“核苷”包括共价连接至糖部分优选核糖或脱氧核糖的碱基。优选的核苷的例子包括核糖核苷和脱氧核糖核苷。核苷还包括连接至氨基酸或氨基酸类似物(其可包括游离羧基、游离氨基或保护基团)的碱基。合适的保护基团是本领域公知的(参见P.G.M.Wuts和T.W.Greene,“Protective Groups in Organic Synthesis”,第2版,Wiley-Interscience,New York,1999年)。
术语“核苷酸”包括还进一步包括磷酸酯基团或磷酸酯类似物的核苷。
如本发明所使用的，术语“连接(linkage)”包括共价连结相邻核苷酸单体的天然存在的、未修饰的磷酸二酯基部分(-O-(PO2-)-O-)。如本发明所使用的，术语“取代连接”包括共价连结相邻核苷酸单体的天然磷酸二酯基的任何类似物或衍生物。取代连接包括磷酸二酯基类似物，例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和P-乙氧基磷酸二酯(ethyoxyphosphodiester)、P-乙氧基磷酸二酯(ethoxyphosphodiester)、P-烷氧基磷酸三酯、甲基膦酸二乙酯和含非磷的键，例如缩醛和酰胺。这些取代连接是本领域已知的(例如，Bjergarde等1991年.Nucleic Acids Res.19:5843；Caruthers等1991年.Nucleosides Nucleotides.10:47)。在某些实施方案中，非水解键是优选的，例如硫代磷酸酯键。
在某些方面，本发明的多核苷酸包括3’和5’末端(除了环状寡核苷酸)。多核苷酸的3’和5’末端可以基本上不受核酸酶酶切，例如，通过修饰3’或5’键(例如美国专利号5,849,902和WO98/13526)。寡核苷酸可以通过引入“封闭基团”制得抗性。本发明所使用的术语“封闭基团”指可连接至寡核苷酸或核苷酸单体的取代基(例如不是OH的基团)，作为保护基团或用于合成的结合基团(例如，FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、二醇(-O-CH2-CH2-O-)、磷酸根(PO3 2-)、氢膦酸(hydrogen phosphonate)、亚磷酰胺(phosphoramidite))。“封闭基团”还包括“末端封闭基团”或“核酸外切酶封闭基团”，其保护寡核苷酸的5’和3’末端，包括修饰的核苷酸和非核苷酸外切酶抗性结构。
示例性末端封闭基团包括帽结构(例如，7-甲基鸟苷帽)、反转核苷酸单体，例如有3'-3'或5'-5'末端反转(参见例如Ortiagao等1992年Antisense Res.Dev.2:129)、甲基膦酸二乙酯、亚磷酰胺、非核苷酸基团(例如非核苷酸连接物、氨基连接物、结合物)等。3'末端核苷酸单体可以包括修饰的糖部分。3'末端核苷酸单体包括可选被封闭基团取代的3'-O，所述封闭基团防止寡核苷酸的3'-核酸外切酶降解。例如，3'-羟基可通过3'→3'核苷酸间键被酯化到核苷酸。例如，烷基可以是甲氧基、乙氧基或异丙氧基，并优选乙氧基。任选地，3'末端的3'→3'连接的核苷酸可以通过取代连接进行连接。为了降低核酸酶降解，该最5'末端的3'→5'键可以是修饰的键，例如，硫代磷酸酯或P-烷氧基磷酸三酯键。优选地，两个最5'末端的3'→5'键可以是修饰的键。任选地，所述5'端羟基部分可以用一个含磷基团酯化，例如，磷酸盐、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸酯。
在某些方面，多核苷酸可以包括DNA和RNA
在某些方面，连续多核苷酸的至少一部分是由取代连接连接，例如硫代磷酸酯键。由于对血清蛋白更高的亲和力，取代连接的存在可以提高药物动力学。
在某些方面，反义(引导)序列可以包括“吗啉代寡核苷酸”。吗啉代寡核苷酸是非离子型的并通过RNase H依赖性机制起作用。吗啉代寡核苷酸的4个基因碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶)的每一个连接到6元吗啉环。吗啉代寡核苷酸是由通过加入4个不同的亚基类型，例如，非离子型磷酰二胺亚基间的键制得的。由吗啉代寡核苷酸赋予的优势包括：抗核酸酶(Antisense&Nucl.AcidDrug Dev.1996.6:267)；可预测的靶标(Biochemica Biophysica Acta.1999.1489:141)；细胞中活性可靠(Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1997.7:63)；良好的序列特异性(Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1997.7:151)；最低的非反义活性(Biochemica Biophysica Acta.1999.1489:141)和简单的渗透压或刮细胞递送(Antisense&Nucl.AcidDrug Dev.1997.7:291)。高剂量的吗啉代寡核苷酸还具有低毒性。吗啉代寡核苷酸在Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1997.7:187中进一步讨论。多核苷酸的修饰的进一步的讨论见于美国专利公开号2010/0129808，并将其引入作为参考。
多肽
在某些情况下，所述结合部分是多肽。如本发明所使用的，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，因此，术语多肽可用于指代全长多肽，并且还可以用于指代全长多肽的片段。所述多肽可以是合成的多肽。如本发明所使用的，术语“合成”是指人工制备。合成多肽是合成的多肽，并且不是天然产生的多肽分子(例如，在动物或微生物不生产)。应当理解的是，天然多肽(例如，内源多肽)的序列可以与合成多肽的序列相同，但后者会是已经采用至少一个合成步骤制备的。
所述多肽可以是分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合于细胞中的多肽。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段连接到可检测的标签。
如本发明所使用的，术语“抗体”是指一种蛋白质，其可包括至少两个重链(H)和两条轻链(L)，之间通过二硫键连接。每条重链包含重链可变区(本发明缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区由三个结构域：CH1、CH2和CH3组成。每条轻链包含轻链可变区(本发明缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步分成高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫***的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一成分(C1q)。
本发明所使用的术语抗体的“抗原结合片段”，是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个部分。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。结合片段的例子涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内，包括(i)Fab片段，由VL，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包括在铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature341:544-546)，其由重链抗体的VH结构域或可变结构域组成，如骆驼科动物重链抗体(如VHH)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；和(vii)包括(i)-(vi)的抗原结合片段的多肽构建体。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，分别由不同的基因编码，它们可以被连接，使用重组方法，通过合成接头使得它们能够制备为单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等(1988)Science242:423-426)和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此类单链抗体也打算涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”里。这些抗体片段采用常规方法获得，如蛋白质水解片段化方法，如J.Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp98-118(N.Y.Academic Press1983)所述，其引入作为参考，还可通过本领域技术人员已知的其他技术获得，例如重组核酸的表达。所述片段用与完整抗体同样的方式筛选。
本发明的分离的抗体涵盖各种抗体亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgE。如本发明所使用的，“亚型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如IgM或IgG1)。本发明的抗体可以是全长或者可以仅抗原结合片段如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE的抗体恒定和/或可变结构域或者由Fab片段、F(ab')2片段和Fv片段组成。
抗体可以是多克隆、单克隆或多克隆抗体和单克隆抗体的混合物。本发明的抗体可通过本发明所述的方法或通过本领域已知的各种技术生产得到。本发明所使用的术语“单克隆抗体”是指单分子组成的抗体分子的制备。单克隆抗体显示单一的结合特异性和特定表位的亲和力。单克隆抗体显示单一的结合特异性和特定表位的亲和力。术语“多克隆抗体”是指包含特异性结合特定抗原活性的抗体的混合物的抗体分子的制备。
在其他实施方案中，抗体可以是重组抗体。本发明所使用的术语“重组抗体”旨在包括通过重组方法所制备、表达、产生或分离的抗体，例如对另一物种的免疫球蛋白基因转基因的从动物(例如，小鼠)分离的抗体、基因工程抗体、使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合抗体文库中分离的抗体或者，由涉及免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。
治疗
本发明的各方面涉及一种纳米颗粒构建体至受体治疗和/或诊断用途的递送。所述颗粒可以单独使用或以任何适当的药物载体给药，如液体，例如盐水，或粉末，用于体内给药。它们也可以与较大的载体颗粒或置于给药装置内共同递送。所述颗粒可被配制。本发明的制剂可以施用于药学上可接受的解决方案，其可以常规地含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、佐剂和任选的其它治疗成分。在某些实施方案中，与本发明相关的纳米颗粒构建体与诸如乳液(例如，aquaphor)的物质混合并施用于受体的皮肤，从而纳米颗粒构建体通过受体的皮肤递送。应当理解的是，本领域已知的纳米颗粒的任何递送方法可以与本发明的各方面兼容。
对于治疗用途，所述颗粒的有效量可以通过以所希望的任何方式递送所述颗粒至细胞来施用给受体。施用药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方式来完成。给药途径包括但不限于口服、肠胃外、肌内、静脉内、皮下、粘膜、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼、***、皮肤、直肠和通过直接注射。
试剂盒
在其他方面，本发明涉及一种包括前面所讨论的一种或多种组合物的试剂盒。本发明所使用的“试剂盒”通常定义了一种组件或组合装置，包括本发明的一种或多种组合物，和/或与本发明相关的其它组合物，例如，如前面所讨论的。所述试剂盒的每个组合物，如果存在的话，可以以液体形式(例如，在溶液中)，或固体形式(例如，干燥粉末)提供。在某些情况下，一些组合物可以是组成性的或要不然是可处理的(例如，以活性形式)，例如，通过加入合适的溶剂或其它物质，其可以或可以不在试剂盒中提供。与本发明可能相关的其他组合物的例子包括，但不限于，溶剂、表面活性剂、稀释剂、盐、缓冲剂、乳化剂、螯合剂、填料、抗氧化剂、粘合剂、填充剂、防腐剂、干燥剂、抗菌剂、针头、注射器、包装材料、管、瓶、培养瓶、烧杯、盘、玻璃料、过滤器、环、夹子、包装、贴片、容器、胶带、粘合剂等，例如用于使用、施用、修饰、装配、存储、包装、制备、混合、稀释和/或为特定用途保存组合物的成分，例如，给样品和/或受体。
在某些实施方案中，与本发明相关的试剂盒包括一种或多种纳米颗粒核心，例如包含金的纳米颗粒核心。试剂盒也可以包括一个或多个结合部分，例如特异性针对细胞中一个或多个靶分子的多核苷酸或多肽。试剂盒也可以包括可包含一类或多类生色团的一个或多个摄取对照部分。
在某些情况下，本发明的试剂盒可以包括任何形式的使用说明，其针对本发明的组合物提供以使本领域技术人员能够认识到该使用说明与本发明的组合物相关。例如，所述使用说明可以包括以下说明：使用、修饰、混合、稀释、保存、施用、装配、存储、包装和/或组合物的制备和/或与所述试剂盒相关的其他组合物。在某些情况下，所述使用也说明可以包括组合物使用的说明，例如为特定用途，例如，给样品。所述使用说可以任何形式提供，以使本领域技术人员可识别为合适的载体容纳该说明，例如，书面或出版的、口头的，可听的(例如，电话)、数字的、光学的、视觉的(例如，录像带，DVD等)或者电子通信(包括互联网或基于网络的通信)，以任何方式提供。
在某些实施方案中，本发明涉及一种推广如本发明所讨论的一个或多个实施方案的方法。如本发明所使用的，“推广”包括所有商业方法包括，但不限于，以下内容的方法：销售、广告、分配、许可、合同、指导、教育、研究、进口、出口、谈判、融资、垫资、交易、自动售货、重新销售、分销、维修、更换、保险、诉讼、专利等，所述方法与本发明所讨论的***、设备、装置、物品、方法、组合物、试剂盒等相关。推广方法可通过任何一方进行，包括，但不限于，私人团体、企业(公共或私人)、合伙、公司、信托、合同或分包合同机构、教育机构如学院和大学、研究机构、医院或其它临床机构、政府机构等。推广活动可以包括清楚地与本发明相关的任何形式的沟通(例如，书面的，口头的，和/或电子通讯，例如，但不限于，电子邮件，电话，因特网，基于网络的，等等)。
在一组实施方案中，推广方法可以包括一个或多个说明。如本发明所使用的，“说明”可以定义指导程序的组成部分(例如指示、指导、警告、标签、注意事项、FAQs或“常见问题解答”等)，并通常涉及本发明或与本发明相关和/或与本发明的包装相关的书面说明。说明也可以包括任何形式的指导沟通(如，口头的、电子的、可听的、数字的、光学的、视觉的等)，以任何方式提供，只要用户能够清楚识别该说明与本发明相关，例如本发明所讨论的。
本发明进一步由以下实施例说明，其不应解释为进一步的限制。本申请全文引用所有参考文献(包括参考文献、已授权的专利、公开的专利申请和共同待批的专利申请)的全部内容在此明确引入作为参考。
实施例
实施例1：含有带有参考生色团的摄取对照寡核苷酸的纳米颗粒 构建体的设计
如图2所示的带有摄取对照的纳米耀斑通过以下步骤合成。0.7OD/mL的3’-DTPA捕获链寡核苷酸和0.3OD/mL摄取对照链与5’-Cy3和3’-DTPA与直径13nm的金纳米颗粒(AuNP)通过涡旋振荡和简单超声进行混合。接下来，1.56μL/mL10％Tween20加至寡核苷酸/AuNP混合物并涡旋振荡。156μL/mL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)加至混合物并涡旋振荡。最后，390μL/mL的2M NaCL加至混合物并涡旋振荡。混合物超声处理10秒，然后放置在一个旋转器/摇床在室温下以低速过夜。次日，将混合物在PBS(无Ca2+/Mg2+)中进行4个系列离心步骤于15k rpm离心25分钟洗涤。每个离心步骤之间，吸出上清液并且AuNP沉淀重悬于新鲜PBS；超声处理使得沉淀完全成胶体。最后的离心步骤后，寡核苷酸官能化的AuNP重悬于小体积PBS(大致为起始体积的1/10)。采用UV/Vis分光光度法测定524nm处的吸光度对AuNPs进行定量。
然后，通过以下步骤对所述官能化的AuNP进行5’-Cy5标记寡核苷酸的双联法：过量50标记的寡核苷酸/AuNP加至所述官能化的AuNP。该混合物简单涡旋振荡、超声，然后65℃孵育1小时。然后样品立即转至冰浴迅速降温至2-6℃并4℃孵育过夜。次日，将混合物在PBS中进行4个系列离心步骤于15k rpm室温离心15分钟洗涤以去除任何没有双工化的寡核苷酸。每个离心步骤之间，吸出上清液并且AuNP沉淀重悬于新鲜PBS；超声处理使得沉淀完全成胶体。最后的离心步骤后，纳米耀斑重悬于PBS至所需浓度。
实施例2：在不同批次制备物中以一致水平装载的带有Cy3生色 团的摄取对照寡核苷酸。
在某些实施方案中，有关的是，在不同批次纳米颗粒中摄取对照部分的均匀装载，以便能够对批内和跨批次的纳米颗粒进行精确比较。
五批，每批带有独特的捕获序列，每AuNP装载Cy3摄取对照寡核苷酸被合成并表征。如图3所述的Cy3摄取对照寡核苷酸的定量通过对已知浓度的最终官能化的纳米颗粒以125mM KCN处理以氧化AuNP并释放官能化的寡核苷酸来进行。通过与游离Cy3摄取对照寡核苷酸产生的标准曲线比较测量在这些样品中的Cy3的荧光来计算每AuNP的装载。采用synergy4荧光板读数器获取所有荧光测量值。
实施例3：多个摄取对照寡核苷酸整合入纳米颗粒构建体增加摄 取标准化信号的稳健性
两批纳米颗粒被合成并表征，相对数量的Cy3和Cy5标记的寡核苷酸装载到每批纳米颗粒上。Cy3和Cy5标记的寡核苷酸的定量通过对已知浓度的官能化的纳米颗粒以125mM KCN处理以氧化AuNP并释放官能化的寡核苷酸来进行。KCN处理后Cy5和Cy3的荧光显示于图4。采用Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog3模块化荧光分光光度计(modular spectrofluorometer)获取所有荧光测量值。这些样品的荧光与已知浓度的含有Cy3和Cy5标记的寡核苷酸的标准曲线进行比较。该图显示批次之间Cy3和Cy5的相对荧光的一致性(图4)。Cy5和Cy3生色团均显示能够一致地装载到纳米颗粒，使得制备物间的纳米颗粒构建体一致。
实施例4：含有Cy5和Cy3标记的寡核苷酸的纳米颗粒构建体的 不同制剂的细胞摄取
两批带有独特捕获链序列的纳米颗粒采用前述方法合成。MCF-7细胞(MEM，10％热灭活的FBS，2％L-谷氨酰胺，2％青霉素/链霉素)以15,000细胞/孔接种于96孔板。细胞完全贴附到板表面之后，来自2nM储液(PBS)的官能化的纳米颗粒加至每个孔，使得纳米颗粒的终浓度为100μL细胞培养基中100pM。用手旋动板以混合溶液。每个板于37℃孵育16小时。以纳米颗粒孵育后，吸出细胞培养基并且细胞用PBS洗涤两次。细胞用30μL胰酶/孔进行胰酶消化直到细胞从板脱落。90μL培养基加回至每个孔，用力吹吸以获得单个分散的细胞样品。分析Cy5和Cy3发射的数据以测量每个荧光团的荧光(图5)。板在Millipore Guava8HT流式细胞仪上读取并且采用Incyte软件包分析数据。每个生色团的相对摄取是由荧光激活细胞分选测定(图5)。每个细胞类型的预期生色团水平被用来标准化的第二生色团的摄取。该测定允许跨不同实验条件或任何其它可变参数对测量进行标准化。此***可用于监测和确定各种治疗(例如抗体、siRNA、适体和化学治疗剂)的有效载荷的相对递送。
等价物
本领域技术人员将认识到或能够采用不超过常规实验即可查明本发明所记载的具体实施方案的许多等价物。这些等价物旨在由以下权利要求所涵盖。
本发明公开的所有参考文献(包括专利文件)通过引用的方式以其整体并入。

Claims (72)

1.一种用于检测纳米颗粒构建体的细胞摄取的方法，其包括：
提供纳米颗粒构建体，所述纳米颗粒构建体包含：
纳米颗粒核心，
包含靶分子特异性结合部分的第一形式，其连接至所述纳米颗粒核心；以及
包含摄取对照部分的第二形式，其连接至所述纳米颗粒核心并包括参考生色团；
将所述纳米颗粒构建体接触细胞；以及
检测所述细胞内所述参考生色团的水平，其中所述细胞内所述参考生色团的水平显示所述细胞内纳米颗粒构建体的细胞摄取水平。
2.权利要求1所述的方法，其中所述纳米颗粒构建体包含一种以上的参考生色团。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述摄取对照部分包括多核苷酸、多肽或多聚物。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述参考生色团中的一种或多种是荧光团或量子点。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述结合部分和/或所述摄取对照部分通过间隔体连接至所述纳米颗粒核心。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述结合部分是多核苷酸或多肽。
7.权利要求6所述的方法，其中所述多核苷酸是RNA或DNA。
8.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸是ssRNA。
9.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸是dsRNA。
10.权利要求6所述的方法，其中所述多肽是抗体。
11.权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述结合部分是被标记的。
12.权利要求11所述的方法，其中所述标记是当所述结合部分结合其靶分子时被检测到的可检测的标记物。
13.权利要求12所述的方法，其中所述可检测的标记物是生色团。
14.权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒核心是金属的。
15.权利要求14所述的方法，其中所述金属选自由金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍及其混合物组成的组。
16.权利要求15所述的方法，其中所述纳米颗粒核心包含金。
17.权利要求16所述的方法，其中所述纳米颗粒核心是包含可降解金的点阵结构。
18.权利要求1-17任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒的直径是平均直径从1nm至大约250nm、平均直径大约1ran至大约240nm、平均直径大约1nm至大约230nm、平均直径大约1nm至大约220nm、平均直径大约1nm至大约210nm、平均直径大约1nm至大约200nm、平均直径大约1nm至大约190nm、平均直径大约1nm至大约180nm、平均直径大约1nm至大约170ran、平均直径大约1nm至大约160nm、平均直径大约1nm至大约150nm、平均直径大约1nm至大约140nm、平均直径大约1nm至大约130nm、平均直径大约1nm至大约120nm、平均直径大约1nm至大约110nm、平均直径大约1nm至大约100nm、平均直径大约1nm至大约90nm、平均直径大约1nm至大约80nm、平均直径大约1nm至大约70nm、平均直径大约1nm至大约60nm、平均直径大约1nm至大约50nm、平均直径大约1nm至大约40nm、平均直径大约1nm至大约30nm、或平均直径大约1nm至大约20nm、或平均直径大约1nm至大约10nm。
19.权利要求1-18任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒构建体包括多个结合部分。
20.权利要求19所述的方法，其中所述结合部分结合至一个靶分子。
21.权利要求19所述的方法，其中所述结合部分结合至多个靶分子。
22.权利要求1-21任一项所述的方法，其中所述方法涉及递送治疗或检测形式至细胞。
23.权利要求1-22任一项所述的方法，其中所述方法涉及调节靶分子的表达。
24.一种检测纳米颗粒构建体与细胞中的靶分子的结合的方法，其包括：
提供纳米颗粒构建体，所述纳米颗粒构建体包含：
纳米颗粒核心，
包含靶分子特异性结合部分的第一形式，其连接至所述纳米颗粒核心并包括第一生色团；以及
包含摄取对照部分的第二形式，其连接至所述纳米颗粒核心并包括第二生色团；
将所述纳米颗粒构建体接触细胞；以及
检测所述细胞内所述第一和第二生色团的水平，其中所述第一生色团的水平相对于所述第二生色团的水平指示细胞内所述纳米颗粒构建体与靶分子结合的水平。
25.权利要求24所述的方法，其中所述纳米颗粒构建体包括一种以上的参考生色团。
26.权利要求24或25所述的方法，其中所述摄取对照部分包括多核苷酸、多肽或多聚物。
27.权利要求24-26任一项所述的方法，其中所述参考生色团中的一种或多种是荧光团或量子点。
28.权利要求24-27任一项所述的方法，其中所述结合部分和/或所述摄取对照部分通过间隔体连接至所述纳米颗粒核心。
29.权利要求24-28任一项所述的方法，其中所述结合部分是多核苷酸或多肽。
30.权利要求29所述的方法，其中所述多核苷酸是RNA或DNA。
31.权利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸是ssRNA。
32.权利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸是dsRNA。
33.权利要求29所述的方法，其中所述多肽是抗体。
34.权利要求24所述的方法，其中当所述结合部分结合至其靶分子时所述第一生色团被检测到。
35.权利要求24-34任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒核心是金属的。
36.权利要求35所述的方法，其中所述金属选自由金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍及其混合物组成的组。
37.权利要求36所述的方法，其中所述纳米颗粒核心包含金。
38.权利要求37所述的方法，其中所述纳米颗粒核心是包含可降解金的点阵结构。
39.权利要求24-38任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒的直径是平均直径从1nm至大约250nm、平均直径大约1ran至大约240nm、平均直径大约1nm至大约230nm、平均直径大约1nm至大约220nm、平均直径大约1nm至大约210nm、平均直径大约1nm至大约200nm、平均直径大约1nm至大约190nm、平均直径大约1nm至大约180nm、平均直径大约1nm至大约170ran、平均直径大约1nm至大约160nm、平均直径大约1nm至大约150nm、平均直径大约1nm至大约140nm、平均直径大约1nm至大约130nm、平均直径大约1nm至大约120nm、平均直径大约1nm至大约110nm、平均直径大约1nm至大约100nm、平均直径大约1nm至大约90nm、平均直径大约1nm至大约80nm、平均直径大约1nm至大约70nm、平均直径大约1nm至大约60nm、平均直径大约1nm至大约50nm、平均直径大约1nm至大约40nm、平均直径大约1nm至大约30nm、或平均直径大约1nm至大约20nm、或平均直径大约1nm至大约10nm。
40.权利要求24-39任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含多个结合部分。
41.权利要求40所述的方法，其中所述结合部分结合至一个靶分子。
42.权利要求40所述的方法，其中所述结合部分结合至多个靶分子。
43.权利要求24-42任一项所述的方法，其中所述方法涉及递送治疗或检测形式至细胞。
44.权利要求24-43任一项所述的方法，其中所述方法涉及调节靶分子的表达。
45.一种纳米颗粒构建体，其包含：
纳米颗粒核心；
包含靶分子特异性结合部分的第一形式，其连接至所述纳米颗粒核心；以及
包含摄取对照部分的第二形式，其连接至所述纳米颗粒核心并包括参考生色团。
46.权利要求45所述的纳米颗粒构建体，其中所述纳米颗粒构建体包含一种以上的生色团。
47.权利要求45或46所述的纳米颗粒构建体，其中所述摄取对照部分通过多核苷酸、多肽或多聚物连接至所述纳米颗粒核心。
48.权利要求45-47任一项所述的纳米颗粒构建体，其中所述参考生色团中的一种或多种是荧光团或量子点。
49.权利要求45-48任一项所述的纳米颗粒构建体，其中所述结合部分和/或所述摄取对照部分通过间隔体连接至所述纳米颗粒核心。
50.权利要求45-49任一项所述的纳米颗粒构建体，其中所述结合部分是多核苷酸或多肽。
51.权利要求50所述的纳米颗粒构建体，其中所述多核苷酸是RNA或DNA。
52.权利要求51所述的纳米颗粒构建体，其中所述多核苷酸是ssRNA。
53.权利要求51所述的纳米颗粒构建体，其中所述多核苷酸是dsRNA。
54.权利要求50所述的纳米颗粒构建体，其中所述多肽是抗体。
55.权利要求45-54任一项所述的纳米颗粒构建体，其中所述结合部分是被标记的。
56.权利要求55所述的纳米颗粒构建体，其中该标记是当所述结合部分结合其靶时被检测到的可检测的标记物。
57.权利要求56所述的纳米颗粒构建体，其中所述可检测的标记物是生色团。
58.权利要求45-57任一项所述的纳米颗粒构建体，其中所述纳米颗粒核心是金属的。
59.权利要求58所述的纳米颗粒构建体，其中所述金属选自由金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍及其混合物组成的组。
60.权利要求59所述的纳米颗粒构建体，其中所述纳米颗粒核心包含金。
61.权利要求45-60任一项所述的纳米颗粒构建体，其中所述纳米颗粒核心是包含可降解金的点阵结构。
62.权利要求45-61任一项所述的构建体，其中所述纳米颗粒的直径是平均直径从1nm至大约250nm、平均直径大约1ran至大约240nm、平均直径大约1nm至大约230nm、平均直径大约1nm至大约220nm、平均直径大约1nm至大约210nm、平均直径大约1nm至大约200nm、平均直径大约1nm至大约190nm、平均直径大约1nm至大约180nm、平均直径大约1nm至大约170ran、平均直径大约1nm至大约160nm、平均直径大约1nm至大约150nm、平均直径大约1nm至大约140nm、平均直径大约1nm至大约130nm、平均直径大约1nm至大约120nm、平均直径大约1nm至大约110nm、平均直径大约1nm至大约100nm、平均直径大约1nm至大约90nm、平均直径大约1nm至大约80nm、平均直径大约1nm至大约70nm、平均直径大约1nm至大约60nm、平均直径大约1nm至大约50nm、平均直径大约1nm至大约40nm、平均直径大约1nm至大约30nm、或平均直径大约1nm至大约20nm、或平均直径大约1nm至大约10nm。
63.权利要求45-62任一项所述的纳米颗粒构建体，其中所述构建体包括多个结合部分。
64.权利要求63所述的纳米颗粒构建体，其中所述结合部分结合至一个靶分子。
65.权利要求63所述的纳米颗粒构建体，其中所述结合部分结合至多个靶分子。
66.一种递送治疗或检测形式至细胞的方法，包括递送权利要求45-65任一项所述的纳米颗粒构建体至所述细胞。
67.一种调节靶分子的表达的方法，包括递送权利要求45-65任一项所述的纳米颗粒构建体至所述细胞。
68.一种试剂盒，其包含：
纳米颗粒；
包括靶分子特异性结合部分的形式；以及
包括参考生色团的形式。
69.权利要求68所述的试剂盒，还包含使用说明。
70.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸是ssDNA。
71.权利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸是ssDNA。
72.权利要求51所述的纳米颗粒构建体，其中所述多核苷酸是ssDNA。
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