CN103992400A - 重组人血管内皮抑素的复性液及其制备、使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的重组人血管内皮抑素的复性液，包括以下成分：盐酸胍、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽以及络合剂，所述复性液的pH值为4.0-5.0。本发明还提供了所述重组人血管内皮抑素的复性液的制备及使用方法。本发明的重组人血管内皮抑素的复性液，可实现重组人血管内皮抑素的高复性率，进而保证重组人血管内皮抑素的大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于重组人血管内皮抑素的提取纯化领域，具体涉及一种重组人内皮抑素的复性液及其制备、使用方法。
背景技术
人血管内皮抑素，是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂。实验表明，内皮抑素对血管内皮细胞、生长的血管可产生抑制作用，可对肿瘤的生长和转移起到较好的抑制作用。从其作用机理来讲，人血管内皮抑素是通过抑制人体内肿瘤组织的血液供应使肿瘤缺乏营养物质和氧气而停止生长、进而逐步萎缩直至死亡的，相较于目前临床普遍使用的化疗药物，具有无明显毒副作用的优点，因而受到了医学界的广泛关注。
目前，人血管内皮抑素主要是先通过基因重组技术获得携带人血管内皮抑素基因的工程菌，再将工程菌表达目标蛋白经提取纯化而制备得到的。在重组人血管内皮抑素的提取纯化过程中，由于表达的重组人血管内皮抑素蛋白以包涵体形式存在，所以通常需经过复性才能变成有生物活性的内皮抑素。在复性过程中，重组人血管内皮抑素的二硫键重新形成，其伸展的多肽肽链会由二级结构折叠成三级结构的天然构象，从而使生物活性得以恢复。
然而，由于人血管内皮抑素的自然折叠率低，大部分二硫键均需要在复性的过程中形成，而人血管内皮抑素又具有两对二硫键，两对二硫键均需正确配对，才能复性为有生物活性的内皮抑素，加之蛋白质二级结构本身具有可变性，形成正确的二硫键并不容易，错误折叠和聚合往往会造成复性收率较低，因此，实现高的复性收率具有较大的难度。同时，内皮抑素本身呈偏酸性，在中性和碱性环境下活性和溶解性均不稳定、易失活，对环境的敏感性也在一定程度上增加了重组人血管内皮抑素的实现高复性收率的难度。
在复性过程中，重组人血管内皮抑素蛋白在复性液中恢复生物活性，因此，复性液的性能对复性收率的高低会产生极大的影响。中国专利文献CN101220081A公开的重组蛋白提取纯化方法中，对变性纯化后的重组蛋白液进行复性，其采用的复性液为：1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，20mmol/L NaAc，pH值为4.0。
采用上述复性液对重组人血管内皮抑素进行复性时，虽然可实现重组人血管内皮素的复性，但由于内皮抑素结构的特殊性，复性收率仅能达到10％左右，最终产品的收率较低，无法实现重组人血管内皮抑素的大规模生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中在对重组人血管内皮抑素进行复性时，采用的复性液无法使得内皮抑素的两对二硫键较好的正确配对,导致复性收率低的问题，进而提供一种可实现重组人血管内皮抑素高复性收率的复性液，同时也保证了重组人血管内皮抑素的大规模生产。
本发明的重组人血管内皮抑素的复性液，每1L所述复性液包括以下组分：
盐酸胍 1-2mol；
还原型谷胱甘肽 2-3mmol；
氧化型谷胱甘肽 0.2-0.3mmol；
络合剂 2-8mmol；
所述复性液的pH值为 4.0-5.0。
需要说明的是，在上述组方中，本领域技术人员根据实际情况，还可选择性的添加三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、二硫苏糖醇(DTT)等成分。
进一步的，所述还原型谷胱甘肽与所述氧化型谷胱甘肽的摩尔比为8:1。
优选的，所述重组人血管内皮抑素的复性液，每1L所述复性液包括以下组分：
所述复性液的pH值为5.0。
进一步的，每1L所述复性液还包括pH调节剂10-20mmol。
优选的，每1L所述复性液包括以下组分：
所述复性液的pH值为5.0。
所述络合剂为EDTA。所述pH调节剂为HAc-NaAc。当然，本领域技术人员可根据实际情况，适宜性的选择其他络合剂，以达到使蛋白溶液中的金属离子形成络合离子的目的；同样的，所述pH调节剂也不限于HAc-NaAc，还可以是其他弱酸及其盐形成的pH缓冲体系。
制备本发明的重组人血管内皮抑素的复性液的方法，包括以下步骤：取特定量的pH值为4.0-5.0的溶液，加入特定量的盐酸胍、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、络合剂，混合均匀，即得。
本发明的重组人血管内皮抑素的复性液的使用方法，包括以下步骤：将蛋白浓度为8-10mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液加入复性液中，混合均匀，2-8℃下静置至少10h，除去所述复性液，即可。
进一步的，采用透析或超滤平衡除去所述重组人血管内皮抑素蛋白溶液与所述复性液的混合液中的复性液。
所述透析采用的缓冲液为pH值为4.0为的浓度10mmol/L的NaAc溶液。
所述变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液与所述复性液的体积比为1：(100-200)。
所述变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液以8ml/min的速度加入所述复性液中。
本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明的重组人血管内皮抑素的复性液，每1L所述复性液，包括1-2mol的盐酸胍、2-3mmol的还原型谷胱甘肽、0.2-0.3mmol的氧化型谷胱甘肽、2-8mmol的络合剂、10-20mmol的pH调节剂，其pH值为4.0-5.0。在上述组分中，对于盐酸胍的含量控制最为严格，盐酸胍为强变性剂，通常认为不应加入复性液中，而盐酸胍含量过高，会导致复性液功能上趋近于变性液，待复性的重组人血管内皮抑素在其中即使复性，也仅能以极为微量的速度复性。本发明创造性的在复性液中加入了盐酸胍，反向利用了盐酸胍在1-2mol/L的用量下，可起到维持及稳定重组人血管内皮抑素蛋白的二级结构的作用，增大了内皮抑素的两个二硫键正确配对的机会，并且，可显著促进不溶于水的重组人血管内皮抑素的包涵体蛋白在复性液中的溶解，有助于加快复性的进度；与此同时，保证还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽在本发明的用量范围内，可较好的催化二硫键的形成，与盐酸胍的维持、稳定二级结构作用相配合，可较好的实现两对二硫键的正确配对，显著提高复性收率，可更好的保证重组人血管内皮抑素的大规模生产。
(2)本发明的复性液，保证所述还原型谷胱甘肽与所述氧化型谷胱甘肽的用量比为8:1，其催化二硫键形成的效果更为理想。与盐酸胍及其他组分相互配合，可得到优越的复性效果。
具体实施方式
实施例1
本实施例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由1mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.3mmol氧化型谷胱甘肽、2mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc、10mmol DTT组成，pH值为5.0。
上述复性液在制备时，首先需要选取上述特定量的盐酸胍、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、EDTA、DTT，以及1L的pH值为5.0、浓度为10mmol/L的HAc-NaAc溶液，再将上述组分溶解于HAc-NaAc溶液中，即可。
采用上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，首先，将蛋白浓度为10mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液100ml以8ml/min的速度加入15L的复性液中，混合均匀，于4℃下静置10h，采用超滤平衡除去所述复性液，即可。
实施例2
本实施例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由2mol盐酸胍、2.5mmol还原型谷胱甘肽、0.2mmol氧化型谷胱甘肽、8mmolEDTA、20mmol HAc-NaAc组成，pH值为4.0。
上述复性液在制备时，首先需要选取上述特定量的盐酸胍、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、EDTA，以及1L的pH值为4.0、浓度为20mmol/L的HAc-NaAc溶液，再将上述组分溶解于HAc-NaAc溶液中，即可。
采用上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，首先，将蛋白浓度为8mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液125ml以8ml/min的速度加入12.5L的复性液中，混合均匀，于8℃下静置24h，采用超滤平衡除去所述复性液，即可。
实施例3
本实施例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由1.2mol盐酸胍、3mmol还原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、15mmol HAc-NaAc组成，pH值为4.5。
上述复性液在制备时，首先需要选取上述特定量的盐酸胍、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、EDTA，以及1L的pH值为4.5、浓度为15mmol/L的HAc-NaAc溶液，再将上述组分溶解于HAc-NaAc溶液中，即可。
采用上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，首先，将蛋白浓度为9mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液100ml以8ml/min的速度加入20L的复性液中，混合均匀，于2℃下静置160h，采用超滤平衡除去所述复性液，即可。
实施例4
本实施例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由1.5mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.3mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc组成，pH值为5.0。
上述复性液的制备方法与实施例1中的制备方法相同。
采用上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，首先，将蛋白浓度为9mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液100ml以8ml/min的速度加入15L的复性液中，混合均匀，于5℃下静置100h，采用pH值4.0为的浓度10mmol/L的NaAc溶液为缓冲液，透析除去所述复性液，即可。
实施例5
本实施例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由1.5mol盐酸胍、3mmol还原型谷胱甘肽、0.2mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc组成，pH值为5.0。
上述复性液的制备方法与实施例1中的制备方法相同。
采用上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，首先，将蛋白浓度为8mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液100ml以8ml/min的速度加入15L的复性液中，混合均匀，于4℃下静置10h，采用pH值为4.0的浓度10mmol/L的NaAc溶液为缓冲液，透析除去所述复性液，即可。
实施例6
本实施例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由1.5mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc组成，pH值为5.0。
上述复性液的制备方法与实施例1中的制备方法相同。
采用上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，首先，将蛋白浓度为8mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液100ml加入30L的复性液中，混合均匀，于4℃下静置18h，除去所述复性液，即可。
对比例1
本对比例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由1mmol还原型谷胱甘肽、0.1mmol氧化型谷胱甘肽、1mmol EDTA、20mmol HAc-NaAc组成，所述复性液的pH值为5.0。
上述复性液的制备方法与实施例1中的制备方法相同。
上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，采用的方法与实施例1中的使用方法相同。
对比例2
本对比例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由2mmol还原型谷胱甘肽、0.33mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmolHAc-NaAc组成，所述复性液的pH值为5.0。
上述复性液的制备方法与实施例1中的制备方法相同。
上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，采用的方法与实施例1中的使用方法相同。
对比例3
本对比例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由2mmol还原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmolHAc-NaAc组成，所述复性液的pH值为5.0。
上述复性液的制备方法与实施例1中的制备方法相同。
上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，采用的方法与实施例1中的使用方法相同。
对比例4
本对比例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由6mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.35mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc组成，所述复性液的pH值为5.0。
上述复性液的制备方法与实施例1中的制备方法相同。
上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，采用的方法与实施例1中的使用方法相同。
对比例5
本对比例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由3mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc组成，所述复性液的pH值为5.0。
上述复性液的制备方法与实施例1中的制备方法相同。
上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，采用的方法与实施例1中的使用方法相同。
对比例6
本对比例中，1L的所述的重组人血管内皮抑素的复性液，由0.5mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc组成，所述复性液的pH值为5.0。
上述复性液的制备方法与实施例1中的制备方法相同。
上述制备得到的复性液对变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液进行复性时，采用的方法与实施例1中的使用方法相同。
效果实验例
为说明本发明的技术效果，对实施例1-6及对比例1-6中制备得到的复性液，做以下检测：
1、测定包涵体蛋白溶解量及加入复性液后重组人血管内皮抑素的溶解量
首先取变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液的上清液0.5ml，用溶解液(每升溶解液含尿素8mol、NaCl5mmol、EDTA20mmol、Tris-HCl20mmol、DTT10.7mmol)稀释20倍，并用所述溶解液作对照，在280nm，260nm处分别测吸光值，分别记为A280、A260，再由吸光值计算得到包涵体蛋白浓度和蛋白量。
然后，取实施例1-6及对比例1-6中的复性液，分别将蛋白浓度为10mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液4L以8ml/min的速度加入各复性液中，混合均匀，于4℃下静置15h，采用超滤平衡除去所述复性液，取除去复性液后的蛋白溶液的上清液0.5ml，用所述溶解液稀释20倍，并用所述溶解液作对照，在280nm，260nm处分别测吸光值，分别记为A280、A260，再由吸光值计算得到加入复性液后重组人血管内皮抑素的蛋白浓度和蛋白量。
其计算公式如下：
蛋白浓度(mg/ml)＝(1.45A280-0.74A260)×20
蛋白量(mg)＝蛋白浓度(mg/ml)×体积(ml)
最后，由加入复性液后重组人血管内皮抑素的溶解蛋白量与包涵体蛋白溶解液中的蛋白量之间的比值，得到蛋白溶解度。
2、测定离子交换后蛋白量：
取上述除去复性液的蛋白溶液，采用阳离子交换层析柱用0.4mol/L的NaCl溶液洗涤，0.8mol/L的NaCl溶液洗脱，取0.2ml离子交换后的样品用0.8mol/L的NaCl溶液稀释5倍，并以0.8mol/L的NaCl溶液为对照，测定280nm，260nm的吸光值，分别记为A280、A260，再由吸光值计算蛋白浓度、蛋白量。
其计算公式如下：
蛋白浓度(mg/ml)＝(1.45A280-0.74A260)×5
蛋白量(mg)＝蛋白浓度(mg/ml)×体积(ml)。
然后，由离子交换后蛋白量与包涵体蛋白溶解液中的蛋白量的比值，得到离子交换后蛋白收率。
3、测定电泳纯度
采用2010版中国药典中的聚丙烯酰胺凝胶电泳法对经离子层析交换后的蛋白溶液进行电泳纯度的测定。
实验结果如下：
表1实施例1-6及对比例1-6的复性液的各指标测试结果
采用实施例1-6的复性液进行重组人血管内皮抑素的复性，其蛋白溶解度，明显高于对比例1-6，并且，在保证电泳纯度99％以上的情况下，得到具有活性的重组人血管内皮抑素的蛋白量，也明显高于对比例1-6。
进一步对比可知，实施例1-6中，加入适量盐酸胍并保证还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的摩尔比为8:1的实施例6，蛋白溶解度可达到99.3％，离子交换后蛋白收率可达到39.7％。加入盐酸胍的实施例1-6在蛋白溶解度及离子交换后的蛋白收率上明显高于未加入盐酸胍的对比例1-3，而加入高于本发明中盐酸胍的量的对比例4、5，则其蛋白溶解度以及离子交换后蛋白收率比对比例1-3更低，加入少量盐酸胍的对比例6，即使在本发明优选的还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值在8:1的情况下，蛋白溶解度以及离子交换后蛋白收率也仍然相对较低。
由此可见，本发明的重组人血管内皮抑素的复性液，溶解包涵体蛋白的溶解度高、重组人血管内皮抑素复性后，蛋白收率高，可更好的保证重组人血管内皮抑素的大规模生产。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (12)
1.一种重组人血管内皮抑素的复性液，其特征在于，每1L所述复性液包括以下组分：
盐酸胍 1-2mol；
还原型谷胱甘肽 2-3mmol；
氧化型谷胱甘肽 0.2-0.3mmol；
络合剂 2-8mmol；
所述复性液的pH值为 4.0-5.0。
2.根据权利要求1所述的重组人血管内皮抑素的复性液，其特征在于，所述还原型谷胱甘肽与所述氧化型谷胱甘肽的摩尔比为8:1。
3.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮抑素的复性液，其特征在于，每1L所述复性液包括以下组分：
所述复性液的pH值为5.0。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组人血管内皮抑素的复性液，其特征在于，每1L所述复性液还包括pH调节剂10-20mmol。
5.根据权利要求4中所述的重组人血管内皮抑素的复性液，其特征在于，每1L所述复性液包括以下组分：
所述复性液的pH值为5.0。
6.根据权利要求1-5中任一所述的重组人血管内皮抑素的复性液，其特征在于，所述络合剂为EDTA。
7.根据权利要求4或5中所述的重组人血管内皮抑素的复性液，其特征在于，所述pH调节剂为HAc-NaAc。
8.一种制备权利要求1-7中任一所述的重组人血管内皮抑素的复性液的方法，包括以下步骤：取特定量的pH值为4.0-5.0的溶液，加入特定量的盐酸胍、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、络合剂，混合均匀，即得。
9.权利要求1-7中任一所述的重组人血管内皮抑素的复性液的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：将蛋白浓度为8-10mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液加入复性液中，混合均匀，2-8℃下静置至少10h，除去所述复性液，即可。
10.根据权利要求9所述的重组人血管内皮抑素的复性液的使用方法，其特征在于，采用透析或超滤平衡除去所述重组人血管内皮抑素蛋白溶液与所述复性液的混合液中的复性液。
11.根据权利要求9或10所述的重组人血管内皮抑素的复性液的使用方法，其特征在于，所述透析采用的缓冲液为pH值为4.0的浓度10mmol/L的NaAc溶液。
12.根据权利要求9-11中任一所述的重组人血管内皮抑素的复性液的使用方法，其特征在于，所述变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液与所述复性液的体积比为1：(100-200)。
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