CN103626834B - 一种重组蛋白复性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用,所述缓冲液由基础液和5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20、10mM的β-环糊精、1M的L-半胱氨酸以及4M的尿素组成;其配制方法为先向基础液中加入4M的尿素;后加入体积比为5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20以及10mM的β-环糊精和1M的L-半胱氨酸,即形成重组蛋白复性缓冲液;本发明所述缓冲液应用于初始蛋白浓度高于1mg/mL的重组蛋白复性,操作简单,成本低,方便工业化生产,复性后蛋白体积增大较少,蛋白浓度稀释较小,并且复性率较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域,特别是一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用。
背景技术
由于重组蛋白在细菌体内表达导致肽链的不完全修饰、错误折叠和聚集,一般以包涵体的形式存在。破碎细菌获得纯净的包涵体,经变性剂(6M盐酸胍或8M尿素)溶解后,必须经过复性使蛋白正确折叠,提高溶解度并且恢复生物活性后才能达到临床应用的水平。如果蛋白不能很好地复性,则直接表现为溶解度下降,蛋白析出沉淀,从而造成蛋白的大量损失。由于技术水平的限制,蛋白质的复性和纯化是限制生物制药领域快速发展的瓶颈。目前常用的包涵体蛋白复性的技术主要有:透析复性、稀释复性、人工分子伴侣、柱色谱复性以及反胶团溶解复性等。上述各复性方法多少存在着种种问题,例如:透析复性将变性蛋白放入透析袋中,通过缓慢联系的降低变性剂的浓度实现蛋白复性,虽然操作简单但是耗时长,处理体积小,无法大规模工业化应用。稀释复性是通过将变性蛋白溶液用水或复性缓冲液稀释,实现变性剂浓度的缓慢下降,达到蛋白复性的目的,但是在目前没有通用的复性缓冲液,而且据目前文献报道,通过该方法复性时,需将蛋白浓度控制在较低的水平,不适用于高浓度的蛋白,目前的稀释复性方法中一般将初始蛋白浓度控制在10-100μg/mL,甚至更低。因此,用传统的复性方法会大量稀释蛋白,最终造成体积的快速增加,导致后期蛋白浓缩困难,也不适用于工业化的生产。人工分子伴侣的复性常用Hsp家族蛋白和GroES/GroEL等,人工分子伴侣能够显著提高蛋白复性率,但同时也会显著提高生产成本。柱色谱复性以及反胶团溶解复性需要材料和设备特殊、成本较高、不适用于制药工业的大量制备等,而且操作过程相对繁琐。总之,目前尚未有适用于初始蛋白浓度高于1mg/mL的复性报道。
发明内容
本发明的目的在于提供针对蛋白复性技术的不足,提供一种高浓度重组蛋白快速复性的缓冲液。本发明的目的是这样实现的:
一种重组蛋白复性缓冲液,其特征在于,所述缓冲液由基础液和5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20、10mM的β-环糊精、1M的L-半胱氨酸以及4M的尿素组成;所述基础液包括20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl和无菌水。
本发明中,所述的缓冲液的配制方法:
A)基础液的配制:在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl,调节pH为8.0;
B)向步骤A所述基础液中加入4M的尿素;
C)向步骤B溶液中加入体积比为5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20以及10mM的β-环糊精和1M的L-半胱氨酸,形成重组蛋白复性缓冲液。
一种如权利要求1所述的缓冲液在初始蛋白浓度高于1mg/mL的重组蛋白复性中的应用。
本发明的优点在于:操作简单,成本低,所需的仪器药品均为实验室常规用品,方便工业化生产,而且可以对浓度高于1mg/mL的蛋白进行复性。复性后蛋白体积增大较少,蛋白浓度稀释较小,并且复性率较高;复性后的蛋白可以经过等电点沉淀后,去除残留的药物,同时可以除去一部分杂蛋白,等电点脱盐和初步纯化的蛋白为清澈透明液体,方便后续纯化操作。
具体实施方式
实施例1重组蛋白复性缓冲液配置
A)基础液的配制:在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl,调节pH为8.0;
B)向步骤A所述基础液中加入4M的尿素;
C)向步骤B溶液中加入体积比为5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20以及10mM的β-环糊精和1M的L-半胱氨酸,形成重组蛋白复性缓冲液。
实施例2初始蛋白溶液的配制
基础液的配制:
在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl,调节pH为8.0;
向基础液中加入8M的尿素,搅拌均匀,配制成混合溶液,将初步纯化的重组猪抑制素α亚基蛋白包涵体10g溶解在500mL所述混合溶液中,得到初始浓度为20mg/mL的重组猪抑制素α亚基蛋白包涵体溶液(以下简称初始蛋白溶液)。
本实施例涉及的初步纯化的重组猪抑制素α亚基蛋白包涵体是申请人依据中国专利CN201010618516.4公开的方法获得。
实施例3重组蛋白的复性
基础液的配制:
在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl,调节pH为8.0;
(1)将实施例2获得的浓度为20mg/mL的初始蛋白溶液在4℃下慢速加入实施例1获得的重组蛋白复性缓冲液(以下简称缓冲液)中,同时缓慢搅拌,所述初始蛋白溶液与缓冲液的体积比为1:1;搅拌均匀后在4℃环境下,12000rpm离心10min,收集蛋白上清液;
(2)将基础液慢速加入缓冲液中,形成稀释的复性缓冲液,其中尿素的终浓度为1M,所述基础液与缓冲液的体积比为3:1;将步骤(1)获得的蛋白上清液在4℃环境下缓慢加入所述稀释的缓冲液中,同时缓慢搅拌,所述的蛋白上清液与稀释的缓冲液的体积比为1:1;搅拌均匀后,在4℃环境下,以12000rpm离心10min,收集蛋白上清液;
(3)将步骤(2)获得的蛋白上清液慢速加入等体积的基础液中,同时缓慢搅拌,搅拌均匀后,在4℃以12000rpm离心10min,收集蛋白上清液,即为复性的重组猪抑制素α亚基蛋白溶液,完成重组猪抑制素α亚基蛋白的复性。
经OD280法检测,复性的重组猪抑制素α亚基蛋白溶液中蛋白终浓度约为2.2mg/mL。蛋白的复性,直接表现在蛋白的溶解度上,即:复性好的蛋白呈溶解状态,未复性的蛋白则沉淀析出,经过离心去除。根据复性前和复性后呈溶解状态的蛋白的含量,复性蛋白占总蛋白的百分比,计算出蛋白的复性率。
复性率计算公式如下:
本实施例中,复性前蛋白总量为10g,复性后的蛋白为约8.8g,因此蛋白复性率为88%。
实施例4复性蛋白液的脱盐和初步纯化
(1)实施例3中所得到的复性的重组猪抑制素α亚基蛋白溶液通过调节pH至蛋白的等电点,约5.5左右,蛋白沉淀析出。经过离心(12000rpm,4℃)弃上清,收集蛋白沉淀。加入无菌水重悬,调节pH值到8.0,蛋白质重新溶解;
(2)重复步骤(1)两次,并将蛋白再次沉淀;
(3)将收集的蛋白沉淀,加入无菌水重悬,调节pH值至8.0使蛋白溶解。并调节pH至7.0,获得纯净蛋白。所得到的纯净蛋白中含盐量极低,并且,复性过程中添加的有毒β-巯基乙醇等均被除去,经过高效气相色谱检测发现,β-巯基乙醇的残留量检不出。在收集蛋白沉淀时,一些等电点偏离的蛋白而溶解在上清中,弃上清的同时杂蛋白也被除去,起到进一步纯化的作用。
实施例5与传统的稀释复性进行对照试验
依实施例2所述方法配制初始浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的初始蛋白溶液。
对照实验分为实验组与对照组,实验组依照实施例3所述重组蛋白复性方法;
对照组采用如下复性方法:
复性缓冲液的配制:在无菌水中加入50mMTris-HCL、150mMNaCl、1mMEDTA以及2M尿素,pH调至8.0;
在4℃环境下,缓慢将初始蛋白溶液加入复性缓冲液中,所述蛋白溶液与复性缓冲液体积比为1:7;并用磁力搅拌器不断搅拌24h,然后在4℃以12000rpm离心10min,除去沉淀,收集蛋白上清液,用OD280法测定蛋白浓度。结果如表1所示。
表1不同浓度初始蛋白的复性效率
在高蛋白浓度下,用传统复性缓冲液,蛋白复性率很差,不足10%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,而非对本发明的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种重组蛋白复性方法,其特征在于,重组蛋白复性过程为:
(1)按体积比1:1将浓度为20mg/mL的初始蛋白溶液在4℃下加入重组蛋白复性缓冲液中,搅拌均匀后在4℃环境下,12000rpm离心10min,收集蛋白上清液;
(2)将基础液加入重组蛋白复性缓冲液中,形成尿素终浓度为1M的稀释的复性缓冲液,按体积比1:1将步骤(1)获得的蛋白上清液在4℃环境下加入上述稀释的复性缓冲液中,搅拌均匀后,在4℃环境下,以12000rpm离心10min,收集蛋白上清液;
(3)将步骤(2)获得的蛋白上清液加入等体积的基础液中,搅拌均匀后,在4℃环境下,以12000rpm离心10min,收集蛋白上清液,即为复性的重组蛋白溶液;
其中,所述基础液的配置方法为:在无菌水中加入20mM的Tris-HCl和200mM的NaCl,调节pH为8.0;
所述重组蛋白复性缓冲液的配置方法为:向基础液中加入4M的尿素以及体积比为5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20以10mM的β-环糊精和1M的L-半胱氨酸,形成重组蛋白复性缓冲液;
所述浓度为20mg/mL的初始蛋白溶液是指:向基础液中加入8M的尿素,搅拌均匀,配制成混合溶液,然后将10g蛋白包涵体溶解在500mL所述混合溶液中,即得到浓度为20mg/mL的初始蛋白溶液。
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包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展;王增;《中国生物工程杂志》;20090731;第29卷(第7期);102~ 107 * |
包涵体蛋白的层析复性技术研究进展;高飞;《生物技术通报》;20060228(第2期);56-60 * |
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