CN103990126A - 一种***的增效药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属医药、生物技术领域，涉及一种***的增效药物组合物，尤其涉及由一种或多种细胞自噬抑制剂与β干扰素制成的复方药物或药物组合物，该增效药物组合物的一种或者几种自噬抑制剂与β干扰素，通过使用联合给药或是序贯给药的方式，可以通过抑制β干扰素诱导的肿瘤细胞的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对β干扰素治疗的拮抗作用，从而显著增强单独使用β干扰素对肿瘤的杀伤作用，增强β干扰素对肿瘤的治疗效果。该增效药物组合物可用于治疗神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌、肝肿瘤、脉管癌和骨髓瘤，可明显增强β干扰素单独使用对肿瘤的治疗效果。

Description

一种***的增效药物组合物

技术领域

本发明属医药、生物技术领域，涉及抗肿瘤药物，具体涉及一种***的增效药物组合物，尤其涉及由一种或多种细胞自噬抑制剂与β干扰素制成的复方药物或药物组合物，该增效药物组合物通过联合给药或序贯使用方式可用于治疗神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌、肝肿瘤、脉管癌和骨髓瘤。

背景技术

 恶性神经胶质瘤是中枢神经***中最常见，发病率最高的恶性肿瘤，约占成人脑瘤的30%。在过去的30年，手术治疗、放疗和化疗等多种治疗手段获得改进，在神经胶质瘤的治疗中发挥了一定作用，但患者存活率并没有显著增加。实践显示，由于恶性神经胶质瘤很容易扩散到正常组织，通过手术的方法很难彻底清除肿瘤，导致了恶性神经胶质瘤的高复发率，研究显示，从确诊到死亡，恶性神经胶质瘤病人的中位存活期只有14.5个月。

β干扰素是一种I型干扰素，主要由成纤维细胞产生，属于单一基因编码产生的蛋白质，可以通过干扰病毒RNA或DNA复制而抑制病毒的生长，并可以显著增强NK细胞的杀伤活性，通过促进MHC I 类分子表达而增强CTL对病毒感染细胞的识别和杀伤作用，具有抗病毒，抗肿瘤，免疫调节等活性。临床实践中，β干扰素广泛应用于多种疾病的治疗，对多发性硬化的治疗效果尤佳，是目前FDA批准的用于MS治疗的唯一生物制品类药物。

细胞自噬（autophagy）又称Ⅱ型程序性死亡(type Ⅱ programmed cell death)，是真核生物体内常见的“自我消化”(cellular degradation)的现象，通常根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种方式：大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）。近年来随着分子生物学及基因技术的发展和对细胞自噬的深入认识，发现其与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切。

一般来说，由于细胞自噬有利于细胞的存活，因此无论在正常细胞或是肿瘤细胞中，自噬都普遍被保留下来，并且在一般情况下都维持着基础自噬。但是自噬究竟是抑制还是促进肿瘤细胞的发生发展目前尚没有定论。研究显示，自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因素，一些已知的肿瘤抑制因子，例如PTEN、TSC1和TSC2能激活自噬，并且对自噬的抑制可使蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞( 如肝、胰腺、乳腺癌等) 尽管癌变前自噬能力各有不同，但是在癌变之后其自噬能力均减弱。由于自噬在肿瘤发生及发展中所起的作用尚不明确，故其在抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞过程中所起的作用也不尽相同，大致可以概括为两种：一种是对肿瘤细胞的保护，另一种则是对肿瘤细胞的杀伤。研究表明化疗药物5-FU能显著地诱导细胞自噬，且抑制由这3种药物产生的细胞自噬能显著增加肿瘤细胞对治疗的敏感性[Li J, Hou N, Faried A, Tsutsumi S, et al. Inhibition of Autophagy by 3-MA Enhances the Effect of 5-FU-Induced Apoptosis in Colon Cancer Cells. Ann Surg Oncol .2009; 16(3): 761–771.]。目前细胞自噬的调节类药物按其对自噬的作用可以分为两类，一类是自噬诱导剂如；雷帕霉素（Rapamycin），锂盐（lithium）和海藻糖（trehalose）等，还有一类则是自噬抑制剂如：3-MA（3-Methyladenine），渥曼青霉素（wortmannin）、LY294002 等，和NH₄Cl、氯喹（Chloroquine）和羟基氯喹（hydroxychloroquine）等。

目前为止，尚未见有细胞自噬抑制剂与β干扰素制成复方药物、组合物进行联合给药或是序贯给药***的相关报道。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗肿瘤的增效药物组合物，尤其涉及一种由细胞自噬抑制剂和β干扰组成的增效药物组合物。该增效药物组合物，其中的一种或多种细胞自噬抑制剂，其自身无明显细胞毒性但能通过抑制细胞自噬来增强β干扰素的疗效，从而降低β干扰素在***时的用量，减少其副作用的发生。

具体的，本发明提供了一种治疗肿瘤的增效药物组合物，其特征在于，该增效药物组合物由一种或多种细胞自噬抑制剂和β干扰素组成组成药物组合物；该增效药物组合物的一种或者几种自噬抑制剂与β干扰素，通过使用联合给药或是序贯给药的方式，可以通过抑制β干扰素诱导的肿瘤细胞的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对β干扰素治疗的拮抗作用，从而显著增强单独使用β干扰素对肿瘤的杀伤作用，增强β干扰素对肿瘤的治疗效果。

本发明中，所述的细胞自噬抑制剂包括（但不限于）：3-MA（3-Methyladenine）、渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002、放线菌酮、巴伐洛霉素 A1（Bafilomycin A1）、氯化铵、氯喹（Chloroquine）和羟基氯喹（Hydroxychloroquine）等；本发明的实施例中，优选3-MA（3-Methyladenine）、氯喹（Chloroquine）和羟基氯喹（Hydroxychloroquine）。

  本发明中  所述的β干扰素包括（但不限于）：重组人β干扰素1b (Ser 17)、重组人β干扰素1a、人β干扰素。

本发明中，所述的增效药物组合物可用于治疗的肿瘤包括神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌、肝肿瘤、脉管癌和骨髓瘤。

    本发明中，所述的增效药物组合物优选治疗神经胶质瘤；所述的神经胶质瘤包括室管膜瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤。

本发明还提供一种治疗肿瘤的增效复方药物，所述的与β干扰素组成的复方药物是指用自噬抑制剂中的一种或几种例如：3-MA（3-Methyladenine）、渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素A1（Bafilomycin A1）、NH₄Cl、氯喹（Chloroquine）和羟基氯喹（hydroxychloroquine），与β干扰素组成复方药物，序贯使用***。

本发明进行了体外细胞试验，结果表明：细胞自噬在β干扰素对神经胶质瘤的治疗过程中对β干扰素有抵抗作用；并且使用细胞自噬抑制剂能加强β干扰素对神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌、肝肿瘤、脉管癌和骨髓瘤，尤其是神经胶质瘤的疗效。 

本发明试验结果还表明，所述的β干扰素制成纳米药物可以进一步增强β干扰素对神经胶质瘤细胞的治疗效果。

 

附图说明

图1：β干扰素能引起人神经胶质瘤细胞自噬体形成，

其中，A为U251MG阴性对照；B为给予2000IU/mlβ干扰素处理48h后的U251MG；C为B图的部分放大；D为U87MG阴性对照；E为给予2000IU/mlβ干扰素处理48h后的U87MG；F为E图的部分放大。

图2：β干扰素能诱导人神经胶质瘤细胞自噬信号的发生，

其中，左图为U251MG细胞；右图为U87MG细胞， Hoechst 33342染料染细胞核，Cyto-ID Green Dye 染自噬信号。

图3：β干扰素能引起自噬相关蛋白LC3-II的增加，

其中，Ctrl为阴性对照，IFNβ为给予2000IU/mlβ干扰素处理48h的细胞。

图4：3-MA抑制细胞自噬增强β干扰素引起的人神经胶质瘤细胞生长抑制。

图5：CQ抑制细胞自噬增强β干扰素引起的人神经胶质瘤细胞生长抑制。

图6：3-MA抑制细胞自噬能增强β干扰素引起的人神经胶质瘤细胞凋亡。

图7：氯喹抑制细胞自噬能增强β干扰素引起的人神经胶质瘤细胞凋亡。

图8：β干扰素制成纳米药物进一步增强肿瘤抑制效果。

具体实施方式

实施例1：配制β干扰素及自噬抑制药物

制备β干扰素药物：称取0.25mg重组人干扰素β-1b，溶于1ml0.54%的无菌氯化钠溶液中，充分搅拌30分钟并用0.1μm无菌滤器过滤，分装成10管保存，每管100μl。β干扰素的活性为8.0MIU/ml；

    配制自噬抑制药物：

（1）氯喹的配制：取适量氯喹溶于纯水配成10mmol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；

（2）氯化铵的配制：取适量氯化铵溶于水配成0.4mol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃。体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬；

（3）羟基氯喹的配制：取适量羟基氯喹溶于纯水配成10mmol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；

（4）3-MA的配制：取适量3-MA干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃。体外实验时稀释50-200倍用于抑制细胞自噬；

（5）LY294002的配制：取适量LY294002干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃。体外实验时稀释50-100倍用于抑制细胞自噬；

（6）巴伐洛霉素A1的配制：取适量巴伐洛霉素A1干粉配制成0.5μg/ml的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自噬。

 

实施例2：β干扰素能引起人神经胶质瘤细胞自噬体形成

人神经胶质瘤细胞U251MG和U87MG细胞分别采用 2000IU/ml 的β干扰素处理48h，收集细胞固定，进行电镜样品制备，不给予β干扰素的细胞作为阴性对照，采用透射电子显微镜进行观察，结果显示，放大后的电子显微照片可以清晰的观察到具有双层至多层膜的自噬体结构（如图1所示）。

实施例3：β干扰素能引起人神经胶质瘤细胞自噬信号产生

人神经胶质瘤U251MG和U87MG细胞分别采用2000IU/mlβ干扰素处理48h，采用500nM 雷帕霉素处理12h的细胞作为阳性对照，不给药的细胞作为阴性对照，细胞采用Cyto-ID绿色自噬染料进行染色后用激光共聚焦显微镜观察，结果阴性对照没有自噬相关的绿色荧光出现，β干扰素同雷帕霉素处理的阳性对照均有自噬相关的绿色荧光（如图2所示）。

 

实施例4：β干扰素能引起人神经胶质瘤细胞自噬相关蛋白LC3-II增加

人神经胶质瘤U251MG和U87MG细胞采用0IU/ml和2000IU/ml的β干扰素处理48h，收集细胞，用0.01M PBS 洗涤2次，采用RIPA裂解液冰上裂解30min，13000rpm离心5-10min，收集上清，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，按每泳道20ug蛋白上样进行SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1h，分别加入抗LC3B和β-actin一抗，4℃孵育12h，采用TBST洗膜后加入二抗室温孵育2h，采用ECL化学发光试剂盒进行显色，试验结果显示，与对照相比，给予2000IU/ml β干扰素的神经胶质瘤细胞LC3-II的表达量明显增加（如图3所示）。

 

实施例5：β干扰素与细胞自噬抑制药物3-MA联合给药能明显增强β干扰素对人神经胶质瘤细胞的生长抑制

人神经胶质瘤U251MG和U87MG细胞贴壁培养24h后分别给予2000IU/ml β干扰素，联合给药组给予1mM 3-MA作用1h后加入2000IU/ml β干扰素，给药后继续培养48h，细胞生长抑制采用MTT在570nm进行检测，试验结果，加入自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后，明显增强了β干扰素引起的人神经胶质瘤细胞的生长抑制（如图4所示）。

 

实施例6：β干扰素与细胞自噬抑制药物氯喹联合给药能明显增强β干扰素对人神经胶质瘤细胞的生长抑制

人神经胶质瘤U251MG和U87MG细胞贴壁培养24h后分别给予2000IU/ml β干扰素，联合给药组给予5uM CQ作用1h后加入2000IU/ml β干扰素，给药后继续培养48h，细胞生长抑制采用MTT在570nm进行检测，试验结果显示，加入自噬抑制剂CQ抑制细胞自噬后，明显增强了β干扰素引起的人神经胶质瘤细胞的生长抑制9如图5所示)。

 

实施例7：β干扰素与细胞自噬抑制药物3-MA联合给药能明显增强β干扰素引起的人神经胶质瘤细胞凋亡

人神经胶质瘤U251MG和U87MG细胞贴壁培养24h后给予2000IU/ml β干扰素，联合给药组给予1mM 3-MA作用1h后加入2000IU/ml β干扰素，给药后继续培养48h，细胞凋亡采用流式细胞仪进行分析，结果显示，β干扰素可以引起人神经胶质瘤细胞U251MG和U87MG发生细胞凋亡，单独使用自噬抑制剂3-MA对U251MG和U87MG没有明显影响，β干扰素联合自噬抑制剂3-MA比单用β干扰素引起的细胞凋亡程度更高(如图6所示)，表明自噬抑制剂3-MA与β干扰素联用可以显著增强β干扰素对神经胶质瘤细胞的治疗效果。

 

实施例8：β干扰素与细胞自噬抑制药物氯喹联合给药能明显增强β干扰素引起的人神经胶质瘤细胞凋亡

人神经胶质瘤U251MG和U87MG细胞贴壁培养24h后给予2000IU/ml β干扰素，联合给药组给予5μM CQ作用1h后加入2000IU/ml β干扰素，给药后继续培养48h，细胞凋亡采用流式细胞仪进行分析，结果显示，β干扰素可以引起人神经胶质瘤细胞U251MG和U87MG发生细胞凋亡，单独使用自噬抑制剂CQ对U251MG和U87MG没有明显影响，β干扰素联合自噬抑制剂CQ比单用β干扰素引起的细胞凋亡程度更高（如图7所示），表明自噬抑制剂CQ与β干扰素联用可以显著增强β干扰素对神经胶质瘤细胞的治疗效果。

 

实施例9：β干扰素制成纳米缓释药物能进一步增强肿瘤治疗效果

人神经胶质瘤U87MG细胞贴壁培养24h后分别给予2000IU/ml β干扰素及纳米载药***PAMAM-β干扰素制成的纳米药物，给药后连续培养96h，细胞生长抑制采用MTT进行分析，结果显示，与普通β干扰素相比，纳米载药***PAMAM-β干扰素引起的细胞生长抑制程度更高（如图8所示）,表明β干扰素制成纳米药物可以进一步增强β干扰素对神经胶质瘤细胞的治疗效果。

Claims (10)

1.一种***的增效药物组合物，其特征在于，该增效药物组合物由一种或多种细胞自噬抑制剂和β干扰素组成组成药物组合物或复合药物。

2.按权利要求1所述的***的增效药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA（3-Methyladenine）、渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002、放线菌酮、巴伐洛霉素 A1（Bafilomycin A1）、氯化铵、氯喹（Chloroquine）或羟基氯喹（Hydroxychloroquine）。

3.按权利要求1所述的***的增效药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA（3-Methyladenine）、氯喹（Chloroquine）和羟基氯喹（Hydroxychloroquine）。

4.按权利要求1所述的***的增效药物组合物，其特征在于，所述的β干扰素选自重组人β干扰素1b (Ser 17)、重组人β干扰素1a或人β干扰素。

5.按权利要求1所述的***的增效药物组合物，其特征在于，所述的复方药物是由细胞自噬抑制剂中的一种或几种与β干扰素组成复方药物，该复方药物序贯使用。

6.按权利要求1所述的***的增效药物组合物，其特征在于，所述的复方药物中细胞自噬抑制剂选自3-MA（3-Methyladenine）、渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素A1（Bafilomycin A1）、NH₄Cl、氯喹（Chloroquine）和羟基氯喹（hydroxychloroquine）中的一种或几种。

7.按权利要求1-6任一所述的***的增效药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤包括神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌、肝肿瘤、脉管癌和骨髓瘤。

8.按权利要求1-6任一所述的***的增效药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤是神经胶质瘤。

9.按权利要求8所述的***的增效药物组合物，其特征在于，所述的神经胶质瘤是室管膜瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤或髓母细胞瘤。

10.按权利要求1所述的***的增效药物组合物，其特征在于，所述的β干扰素制成纳米药物。