CN103980099B - 一种从石斛中提取毛兰素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从石斛中提取毛兰素的方法，该方法包括应用碱性有机溶剂提取、非水相有机溶剂混合萃取、小孔径树脂分离、有机溶剂结晶等工艺,制备得到高纯度毛蓝素方晶，与现有的有工艺方法相比，具有工艺简单、粗提溶剂成本低、目标物非水相萃取杂质少、柱层析陈本低、填料分离精度高可反复利用，层析溶剂陈本低、对环境污染相对较轻、毛兰素得率高、纯度高等优点，适合工业化生产。

Description

一种从石斛中提取毛兰素的方法

技术领域

本发明涉及一种高效、低成本的从石斛中提取毛兰素的方法，属于植物活性物质提取领域。

背景技术

石斛属DendrobiumSw.为兰科最大属之一，共有l500多种植物，广泛分布于亚洲、欧洲及大洋洲等热带及亚热带地区。我国约有80多种，主要分布于西南、华东及华南地区。石斛属植物为附生植物，生长环境独特，对小气候环境要求十分严格。多生于温凉高湿的阴坡、半阴坡微酸性岩层峭壁上，群聚分布，上有林木遮阴，下有溪沟水源，冬春季节稍耐干旱，但严重缺水时常叶片落尽，裸茎渡过不良环境，到温暖季节重新萌发枝叶。在我国传统医学中，石斛属多种植物的新鲜或干燥茎被收做药用，统称石斛herbadendrobii。2000年以前《神农本草经》中就有记载。千年以来它一直和灵芝、人参、冬虫夏草等一样被列为上品中药。其性味：甘淡微咸。性属清润，清中有补，补中有清。古人把石斛当作药材。据《本草备至》叙述，它对人体有驱解虚热，益精强阴等疗效。

国产石斛分布于秦岭、淮河以南，我国的云南、广西、广东、贵州、台湾为国产本属植物的分布中心。石斛属植物中主要有效成分为石斛类多糖及生物碱，另外还有酚类、菲类、倍半萜类及香豆素等。石斛多糖是从石斛中提取出来的具有多种生物活性且结构复杂的杂多糖或其复合物。大量研究证明，石斛联苄类成分具有抗肿瘤、增强免疫力、抗鼻咽癌、抗白内障等多种作用。我国目前对石斛菲类的开发利用并不多，从2006年至今，涉及石斛联苄类毛兰素的文献技术不多，关于石斛毛兰素的功效研究、产品开发等还存在着很大的研究价值和空间。

铁皮石斛是我国传统的名贵中药材。有人比较了石斛属的多种植物，发现联苄类化合物是铁皮石斛的抗癌特征性成分。随着人们对联苄类功效的认识增多，已有人发现联苄类化合物中的毛兰素具有较强的抗肿瘤生物活性。现代分析化学研究发现，石斛中含有石斛菲类、联苄类等多种生物活性成分，毛兰素是其中联节类化合物的一种，其结构式为3-轻基-4，3，4，5，-四甲氧基联节，分子量为318，在石解属植物中有广泛分布，其中鼓槌石斛中含量较高、其次流苏石斛。文献报道药效学研究证实，毛兰素对肺癌、肝癌、乳腺癌、多种人体肿瘤的生长均有抑制作用，是一种天然低毒的抗肝癌肿瘤药物。现有专利报道毛兰素提取方法有超临界二氧化碳萃取法，有机溶剂提取氯仿萃取、硅胶柱层析法、液相制备法等。这些提取方法设备投资成本高，萃取目标物杂质过多、氯仿萃取法毛兰素萃取物含量仅能达到1-10%、提取硅胶柱层析溶剂用量大周期长、填料重复利用性低，不适宜工业化大规模生产。

发明内容

本发明的目的是针对现有产业化分离毛兰素技术的不足，提供一种工艺设备简单、生产周期短、投资规模小、对环境污染相对较轻、制备成本低、得率较高的高纯度毛兰素的提取方法。

本发明通过以下方法实现本发明目的：

（1）取干燥石斛全株粉碎至粒度为40-60目；

（2）石斛粉末用pH=8-10的甲醇溶液回流提取3次，提取温度为75-80℃，其中第一次回流提取2-3h，第二次提取1.5-2h，第三次提取0.5-1h，合并三次提取液，回收甲醇得到粗提物；

（3）用乙腈超声溶解粗提物，过滤，不溶残渣再使用乙腈溶解一次过滤，合并乙腈溶解液，备用；

（4）按体积比1:1-1:2的比例，在乙腈溶解液中加入石油醚二氯甲烷混合溶液或者环己烷二氯甲烷混合溶液萃取，静置分层后取上层液，下层液再萃取分层，重复2-3次，合并上层液，下层液经薄层鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）无毛兰素斑点后丢弃，上层液浓缩得到油性膏状物；

（5）采用新配置的pH=10的甲醇溶液回流提取油性膏状物3次，温度60-80℃，合并三次提取液，用盐酸调节提取液pH=6后，静置24后过滤，即得到含有毛蓝素的沉淀，含有毛蓝素的沉淀用甲醇、乙醇或丙醇溶解成上样液，备用；

（6）取小孔径分离树脂加压装柱，用体积百分比浓度为35-50%的甲醇、乙醇或丙酮水溶液平衡柱子，然后将上样液缓慢滴加上样，上样完毕静置1-1.5h后用体积百分比浓度为40-60%甲醇、乙醇或丙酮水溶液加压洗脱，薄层鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）收集毛兰素段洗脱液，浓缩回收溶剂，最后用石油醚冰乙酸混合溶液、石油醚丙酮混合溶或丙酮结晶2次，固体干燥即得到毛兰素，HPLC检测含量大于98.0%。

本发明方法步骤（2）中pH=8-10的甲醇溶液是指用碳酸氢钠、氢氧化钠或氨水调节质量百分比浓度为50-70%的甲醇溶液的pH为8-10而制得。

本发明方法步骤（4）中石油醚二氯甲烷混合溶液是石油醚与二氯甲烷按体积比5:1-7:1的比例混合制得；环己烷二氯甲烷混合溶液是环己烷和二氯甲烷按体积比10:1-17:1的比例混合制得。

本发明方法步骤（5）中pH=10的甲醇溶液是指用碳酸氢钠调节质量百分比浓度为40-80%的甲醇溶液的pH为10而制得。

本发明方法步骤（6）中小孔径分离树脂为市售MCI树脂、紫杉醇分离专用树脂R型树脂Chroma-R204（北京瑞乐康分离科技有限公司）或树脂PRP5（北京聚福树脂厂）。

本发明方法石油醚冰乙酸混合溶液是石油醚和冰乙酸按体积比9:2混合制得，石油醚丙酮混合溶是石油醚和丙酮按体积比9:1混合制得。

本发明方法的优点如下：因毛蓝素结构式上带有羟基用碱性有机溶剂提取，使毛兰素成盐，水溶解性更好，使其在低浓度溶剂中就能充分溶出，无需高浓度有机溶剂提取。萃取时采用乙腈溶解石斛粗提物，石油醚或环己烷混合二氯甲烷的混合溶剂萃取，薄层鉴别其石油醚二氯甲烷层斑点非常清晰，萃取物杂质含量较低，萃取含量检测毛蓝素含量大于25%，最大的杂质为鼓槌菲和流苏菲。将萃取物碱水回流后去除小极性脂溶性杂质后上小孔径加压分离树脂、采用不同浓度丙酮、乙醇或甲醇等为洗脱剂均能较好分离得到TLC上毛兰素单一斑点。能有效分离开主要杂质鼓槌菲和流苏菲；高精细分离小孔径吸附树脂不会造成对样品的死吸附，其可重复利用，洗脱溶剂成本低、上样量大等优点。

本发明方法工艺设备简单、生产周期短、投资规模小、对环境污染相对较轻、制备成本低，毛兰素得率高、纯度高，适于工业化生产。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中如无特殊说明，使用试剂为常规市售试剂，或按常规方法制得的试剂。

实施例1：本从石斛中提取毛兰素的方法，具体操作如下：

（1）取云南德宏产干燥鼓槌石斛1公斤粉碎至粒度为60目；

（2）石斛粉末用pH=10的甲醇溶液（用碳酸氢钠调节质量百分比浓度为60%的甲醇溶液的pH为10而制得）回流提取三次，提取温度80℃，其中第一次5L甲醇溶液回流提取2小时过滤，滤渣用4L甲醇溶液第二次回流提取1.5小时后过滤，滤渣用4L甲醇溶液第三次回流提取0.5小时过滤，合并三次提取液；回收甲醇得黑红色粗提膏状物113克；

（3）用乙腈250ml超声溶解粗提物，过滤，不溶残渣再使用50毫升乙腈溶解一次，过滤，合并乙腈溶解液得300ml，备用；

（4）在乙腈溶解液300ml中加入300ml石油醚二氯甲烷混合溶液（石油醚与二氯甲烷按体积比5:1的比例混合制得）萃取，静置分层后取上层液，下层液再添加石油醚二氯甲烷混合溶液萃取分层，重复3次，合并上层液，下层液萃取三次后经薄层鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）无毛兰素斑点后丢弃，上层液浓缩得到12g油性膏状物；

（5）使用新配pH=10甲醇溶液（用碳酸氢钠调节质量百分比浓度为50%的甲醇溶液的pH为10而制得）50ml回流提取油性膏状物，温度60℃回流3次；合并三次提取液，用质量百分比浓度为0.5%盐酸溶液调节提取液pH=6后，静置24后过滤，即得到含有毛蓝素的沉淀3.5g，含有毛蓝素的沉淀用5ml甲醇溶解成上样液，备用；

（6）取100g小孔径分离树脂PRP5（北京聚福树脂厂）加压装柱，用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液平衡柱子，然后将上样液缓慢滴加上样，上样完毕静置1h后体积百分比浓度为60%甲醇水溶液加压洗脱，TLC鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）收集毛兰素段洗脱液，回收甲醇，最后用石油醚冰乙酸混合溶液（体积比9:2）结晶2次，固体干燥得毛蓝素0.6克，HPLC检测含量98.6%。

实施例2：本从石斛中提取毛兰素的方法，具体操作如下：

（1）取云南广南干燥铁皮石斛1公斤粉碎到50目；

（2）石斛粉末用PH=9的甲醇溶液（用氢氧化钠调节质量百分比浓度为70%的甲醇溶液的pH为9而制得）回流提取三次，提取温度75℃，其中第一次5L甲醇溶液回流提取提取2.5小时后过滤，滤渣用4L甲醇溶液回流提取2小时后过滤，滤渣用4L甲醇溶液回流提取0.6小时后过滤，合并三次提取液；回收甲醇得黑红色粗提膏状物71克；

（3）粗提物用乙腈250毫升超声溶解，过滤，不溶残渣再使用50毫升乙腈溶解一次，过滤，合并乙腈溶液得300毫升，备用；

（4）在乙腈溶解液300ml中加入450ml石油醚二氯甲烷混合溶液（石油醚与二氯甲烷按体积比7:1的比例混合制得）萃取，静置分层后取上层液，下层液再添加石油醚二氯甲烷混合溶液萃取分层，重复3次，合并上层液，下层液萃取三次后经薄层鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）无毛兰素斑点后丢弃，上层液浓缩得到5g油性膏状物；

（5）使用新配pH=10甲醇溶液（用碳酸氢钠调节质量百分比浓度为40%的甲醇溶液的pH为10而制得）50ml回流提取油性膏状物，温度70℃回流3次；合并三次提取液，用质量百分比浓度为0.5%盐酸溶液调节提取液pH=6后，静置24后过滤，即得到含有毛蓝素的沉淀0.9g，含有毛蓝素的沉淀用5ml甲醇溶解成上样液，备用；

（6）取100g小孔径分离树脂MCIGELCHP55Y加压装柱，用体积百分比浓度为40%的乙醇水溶液平衡柱子，然后将上样液缓慢滴加上样，上样完毕静置1.5h后体积百分比浓度为50%乙醇水溶液加压洗脱，TLC鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）收集毛兰素段洗脱液，回收乙醇，最后用石油醚冰丙酮混合溶液（体积比9:1）结晶2次，固体干燥得毛蓝素0.1克，HPLC检测含量99.1%。

实施例3：本从石斛中提取毛兰素的方法，具体操作如下：

（1）取云南广南干燥流苏石斛1公斤粉碎到40目；

（2）石斛粉末用PH=8的甲醇溶液（用氨水调节质量百分比浓度为50%的甲醇溶液的pH为8而制得）回流提取三次，提取温度78℃，其中第一次5L甲醇溶液回流提取提取3小时后过滤，滤渣用4L甲醇溶液回流提取1.5小时后过滤，滤渣用4L甲醇溶液回流提取1小时后过滤，合并三次提取液；回收甲醇得黑红色粗提膏状物150克；

（3）粗提物用乙腈250毫升超声溶解，过滤，不溶残渣再使用50毫升乙腈溶解一次，过滤，合并乙腈溶液得300毫升，备用；

（4）在乙腈溶解液300ml中加入600ml环己烷二氯甲烷混合溶液（环己烷与二氯甲烷按体积比10:1的比例混合制得）萃取，静置分层后取上层液，下层液再添加石油醚二氯甲烷混合溶液萃取分层，重复3次，合并上层液，下层液萃取三次后经薄层鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）无毛兰素斑点后丢弃，上层液浓缩得到7g油性膏状物；

（5）使用新配pH=10甲醇溶液（用碳酸氢钠调节质量百分比浓度为80%的甲醇溶液的pH为10而制得）50ml回流提取油性膏状物，温度80℃回流3次；合并三次提取液，用质量百分比浓度为0.5%盐酸溶液调节提取液pH=6后，静置24后过滤，即得到含有毛蓝素的沉淀2.4g，含有毛蓝素的沉淀用5ml乙醇溶解成上样液，备用；

（6）取100g小孔径紫杉醇分离专用树脂R型树脂Chroma-R204加压装柱，用体积百分比浓度为35%的丙酮水溶液平衡柱子，然后将上样液缓慢滴加上样，上样完毕静置1.2h后体积百分比浓度为40%丙酮水溶液加压洗脱，TLC鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）收集毛兰素段洗脱液，回收丙酮，最后用丙酮结晶2次，固体干燥得毛蓝素0.4克，HPLC检测含量98.0%。

实施例4：本从石斛中提取毛兰素的方法，具体操作如下：

（1）取云南广南干燥流苏石斛1公斤粉碎到45目；

（2）石斛粉末用PH=10的甲醇溶液（用氨水调节质量百分比浓度为55%的甲醇溶液的pH为10而制得）回流提取三次，提取温度80℃，其中第一次5L甲醇溶液回流提取提取2小时后过滤，滤渣用4L甲醇溶液回流提取1.7小时后过滤，滤渣用4L甲醇溶液回流提取0.8小时后过滤，合并三次提取液；回收甲醇得黑红色粗提膏状物120克；

（3）粗提物用乙腈250毫升超声溶解，过滤，不溶残渣再使用50毫升乙腈溶解一次，过滤，合并乙腈溶液得300毫升，备用；

（4）在乙腈溶解液300ml中加入350ml环己烷二氯甲烷混合溶液（环己烷与二氯甲烷按体积比15:1的比例混合制得）萃取，静置分层后取上层液，下层液再添加石油醚二氯甲烷混合溶液萃取分层，重复2次，合并上层液，下层液萃取2次后经薄层鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）无毛兰素斑点后丢弃，上层液浓缩得到10g油性膏状物；

（5）使用新配pH=10甲醇溶液（用碳酸氢钠调节质量百分比浓度为60%的甲醇溶液的pH为10而制得）50ml回流提取油性膏状物，温度65℃回流3次；合并三次提取液，用质量百分比浓度为0.5%盐酸溶液调节提取液pH=6后，静置24后过滤，即得到含有毛蓝素的沉淀3.0g，含有毛蓝素的沉淀用5ml乙醇溶解成上样液，备用；

（6）取100g小孔径紫杉醇分离专用树脂R型树脂Chroma-R204加压装柱，用体积百分比浓度为45%的丙酮水溶液平衡柱子，然后将上样液缓慢滴加上样，上样完毕静置1.5h后体积百分比浓度为45%丙酮水溶液加压洗脱，TLC鉴别（展开剂为石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯按体积比6:4混合制得）收集毛兰素段洗脱液，回收丙酮，最后用丙酮结晶2次，固体干燥得毛蓝素0.5克，HPLC检测含量98.5%。

Claims (4)

1.一种从石斛中提取毛兰素的方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）取干燥石斛全株粉碎至粒度为40-60目；

（2）石斛粉末用pH=8-10的甲醇溶液回流提取3次，提取温度为75-80℃，其中第一次回流提取2-3h，第二次提取1.5-2h，第三次提取0.5-1h，合并三次提取液，回收甲醇得到粗提物；

（3）用乙腈超声溶解粗提物，过滤，不溶残渣再使用乙腈溶解一次过滤，合并乙腈溶解液，备用；

（4）按体积比1:1-1:2的比例，在乙腈溶解液中加入石油醚二氯甲烷混合溶液或者环己烷二氯甲烷混合溶液萃取，静置分层后取上层液，下层液再萃取分层，重复2-3次，合并上层液，下层液经薄层鉴别无毛兰素斑点后丢弃，上层液浓缩得到油性膏状物；

（5）采用新配置的pH=10的甲醇溶液回流提取油性膏状物3次，温度60-80℃，合并三次提取液，用盐酸调节提取液pH=6后，静置24后过滤，即得到含有毛蓝素的沉淀，含有毛蓝素的沉淀物用甲醇、乙醇或丙醇溶解制备成上样溶液备用；

（6）取小孔径分离树脂加压装柱，用体积百分比浓度为35-50%的甲醇、乙醇或丙酮水溶液平衡柱子，然后将上样样品溶液缓慢滴加上样，上样完毕静置1-1.5h后用体积百分比浓度为40-60%甲醇、乙醇或丙酮水溶液加压洗脱，薄层鉴别收集毛兰素段洗脱液，浓缩回收溶剂，最后用石油醚冰乙酸混合溶液、石油醚丙酮混合溶液或丙酮结晶2次，固体干燥即得到毛兰素；

其中步骤（2）中pH=8-10的甲醇溶液是指用碳酸氢钠、氢氧化钠或氨水调节质量百分比浓度为50-70%的甲醇溶液的pH为8-10而制得；

所述步骤（6）中小孔径分离树脂为MCI树脂、树脂Chroma-R204或树脂PRP5。

2.根据权利要求1所述从石斛中提取毛兰素的方法，其特征在于：步骤（4）中石油醚二氯甲烷混合溶液是石油醚与二氯甲烷按体积比5:1-7:1的比例混合制得；环己烷二氯甲烷混合溶液是环己烷和二氯甲烷按体积比10:1-17:1的比例混合制得。

3.根据权利要求1所述从石斛中提取毛兰素的方法，其特征在于：步骤（5）中pH=10的甲醇溶液是指用碳酸氢钠调节质量百分比浓度为40-80%的甲醇溶液的pH为10而制得。

4.根据权利要求1所述从石斛中提取毛兰素的方法，其特征在于：石油醚冰乙酸混合溶液是石油醚和冰乙酸按体积比9:2混合制得，石油醚丙酮混合溶液是石油醚和丙酮按体积比9:1混合制得。