CN103977408A - 整合素αMβ2的拮抗剂在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用 - Google Patents
整合素αMβ2的拮抗剂在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了整合素αMβ2的拮抗剂在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用。所述的血小板数量相关疾病包括原发性或继发性血小板减少症、原发性或继发性血小板增多症。所述的整合素αMβ2的拮抗剂为抗整合素αMβ2的抗体、整合素αMβ2的氨基酸序列多肽和寡肽、整合素αMβ2的氨基酸序列多肽和寡肽的衍生物及类似物、整合素αMβ2的小分子化合物拮抗剂。本发明首次提出整合素αMβ2的拮抗剂在制备治疗血小板数量相关疾病药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及整合素αΜβ2的拮抗剂在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用。
背景技术
临床上各种因素导致的血小板数量异常会引起相关疾病，如原发性或继发性血小板增多症、原发性或继发性血小板减少，包括免疫性血小板减少症等。血小板增多症是一种原因不明的异常增生伴血小板持续增多为主的骨髓增生性疾病，其临床特点为多见于40岁以上的成年人、常伴有自发性皮肤黏膜出血，反复发作、可以有血栓形成、脾肿大、血小板持久性明显增多，病因不明。该病的出血机理可能与血小板功能障碍或纤维蛋白溶解增强有关。按照欧美5国对原发性血小板增多症的流行病学调查，发病率为0.59/10万～2.53/10万，近20年来，发病率增加了3.2倍(Johansson P.Epidemiology of themyeloproliferative disorders polycytothemia vera and essentialthrombocythemia.Sem Thromb Haemost，2006，32：171-173)。
在血小板减少症中免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenia，ITP)是临床常见的出血性疾病，约占出血性疾病总数的30％(侯明，戴克胜，彭军，主编，《血小板疾病》，第二版，科技文献出版社，2012年，142页)。研究表明ITP是一种自身免疫性疾病，该病的发生是由于体内产生抗巨核细胞或血小板的自身抗体，其中抗血小板的抗体主要由抗血小板膜糖蛋白glycoprotein(GP)Ib-IX-V和GPIIb/IIIa的两大类抗体组成(Michelle LeeWebster,Ebrahim Sayeh,Min Crow,Pingguo Chen,Bernhard Nieswandt,JohnFreedman,and Heyu Ni.Relative efficacy of intravenous immunoglobulinG in ameliorating thrombocytopenia induced by antiplatelet GPIIbIIIaversus GPIbα antibodies.Blood,2006108:943-946)。两大类抗体与病人体内血小板结合后，主要通过抗体的Fc端与人体内的网状内皮***(reticuloendothelial system，RES)结合，导致血小板被脾脏等器官清除。
虽然，近年来，ITP的发病机制研究取得了一系列的进展，在体液免疫机制方面提出了自身抗体介导的巨核细胞数量和质量异常。在细胞免疫机制方面提出了细胞毒T细胞直接溶解血小板的理论，但是，关于ITP的确切发病机理尚未明确。
由于发病机理尚未弄明确，因此，尚无根治的方法。美国ITP指南建议血小板低于20～30×109/L或低于50×109/L合并明显皮肤黏膜出血以及有出血危险因素者接受治疗。目前主要的治疗策略是抑制抗体的产生和血小板的破坏，促进血小板的产生，包括各种免疫抑制剂、切除脾脏，促血小板生成等。治疗的目的是使患者血小板计数提高到安全水平，降低病死率。
当前的治疗药物主要为造血因子血小板生成素、白介素-11和免疫干预的糖皮质激素、单克隆抗体等，然而上述各种治疗药物各自具有各自的局限性，如ITP常用治疗药物重组人血小板生成素(rhTPO)存在血栓、骨髓纤维化、静脉堵塞等潜在副作用；静脉内注射免疫球蛋白(IVIG)适用于难治性或需紧急治疗ITP患者，副作用轻，使用无限制，但由于其作用时间短，价格昂贵，限制了临床应用(Beardsley DS,Ertem M.Platelet autoantibodies in immunethrombocytopenic purpura.Transfus Sci.1998；19:237-244)。因此找到一种有效治疗血小板数量相关疾病的药物是临床医学凾待解决的问题。
整合素是多种细胞外基质成分的受体，广泛存在于细胞表面，是一个相当大的受体家族。整合素一般都是由一条α链和一条β链经非共价键连接组成的异源二聚体。α亚基胞外的氨基端为7个同源的重复序列，形成7个β片层，折叠成一个螺旋桨样的结构。整合素家族中至少有16种α亚单位和8种β亚单位，按β亚单位的不同可将整合素家族分为8个组，其中αΜβ2(Mac-1,CD11b/CD18，C3R)属于β2亚家族，主要分布于白细胞，是一类重要的白细胞黏附因子，参与白细胞(如中性粒细胞)与内皮细胞等之间的黏附，介导白细胞功能，以往被公认为在炎症反应、免疫反应等方面起关键作用。
Mac-1的α亚基胞外的氨基端为7个同源的重复序列，形成7个β片层，折叠成一个螺旋桨样的结构，7个β片层分别被命名为W1-7，在W2和W3之间有一段约200个氨基酸残基的***序列，被称为I结构域，它在识别许多蛋白配体及非蛋白配体中起关键作用(杨华艳，2007学位论文，用原子力学显微镜测量Mac-1和ICAM-1单分子相互作用力)，I结构域是Mac-1与其绝大多数配体(包括ICAM-1)结合的部位。I结构域晶体结构已经被解析，呈小G蛋白样的折叠，由7个α螺旋围绕中央一个β折叠组成。在结构域的顶部是一个金属离子依赖的粘附位点(metal ion-dependent adhesion site,MIDAS),是I结构域结合配体的部位所在。目前已经发现I结构域晶体有两种构象存在，分别被称为“开放”构象和“关闭”构象。重组αΜβ2I结构域经胰酶酶解后肽段的Mr见附图1(侯晓敏、袁彩，彭奇等，整合素αΜβ2I结构域的基因合成和蛋白表达，《生物技术通讯》，2009，20(1):8-11)。
整合素αΜβ2的拮抗剂是指抑制整合素αΜβ2功能的物质，一般包括抗整合素αΜβ2的抗体、整合素αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽、整合素αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽的衍生物及类似物、整合素αΜβ2的小分子化合物拮抗剂，其结构可以是抗体、肽和小分子化合物，整合素αΜβ2的拮抗剂原先通常用来研究整合素αΜβ2的生物学性质。
发明内容
本发明目的是提供整合素αΜβ2的拮抗剂在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用。
所述的整合素αΜβ2的拮抗剂为抗整合素αΜβ2的抗体、整合素αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽、整合素αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽的衍生物及类似物、整合素αΜβ2的小分子化合物拮抗剂。
根据本发明，所述的整合素αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽是基于整合素αΜβ2的氨基酸序列所合成的各种多肽或寡肽。
根据本发明，所述的αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽的衍生物、类似物为基于整合素αΜβ2的氨基酸序列所合成的各种多肽或寡肽的衍生物、类似物。他们在序列和空间结构上与αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽非常接近的一类化合物，由于序列和空间结构的相似性，其在生物体内可以发挥与αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽相同的作用。
根据本发明，所述的整合素αΜβ2的小分子化合物拮抗剂是指应用基于药效团模型、生物电子等排取代、高通量文库筛选方法获得的整合素αΜβ2的小分子化合物拮抗剂。
根据本发明，所述的抗整合素αΜβ2的抗体是具有抗整合素αΜβ2免疫反应特征的单克隆抗体。
根据本发明，所述的血小板数量相关疾病包括但不限于原发性或继发性血小板增多症、原发性或继发性血小板减少症，凡是由血小板数量引起的疾病都包含在内。
所述的血小板减少症包括但不限于免疫性血小板减少症。
所述的药物可以仅是整合素αΜβ2的拮抗剂，也可以是含有整合素αΜβ2的拮抗剂的组合物。
所述的药物按照通常的方式可以制备成各种剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、贴剂。
所述的药物可以口服或者注射或者局部应用。
抗血小板GPIbαN端抗体可诱导血小板活化、凋亡，可导致血小板在肝脏被巨噬细胞迅速清除，本发明发现抗整合素αΜβ2的抗体、整合素αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽、整合素αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽的衍生物及类似物、整合素αΜβ2的小分子化合物拮抗剂能显著抑制血小板GPIbα抗体导致的血小板清除，调控血小板数量。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明开拓了整合素αΜβ2的拮抗剂在用于制备治疗血小板数量相关疾病药物的新领域，基于血小板数量相关疾病发病机制之一为抗血小板GPIbαN端抗体诱导血小板活化、凋亡，能导致血小板在肝脏被巨噬细胞迅速清除，而整合素αΜβ2的拮抗剂能显著抑制血小板GPIbαN端抗体导致的血小板清除，从而特异性强、疗效好。
(2)整合素αΜβ2的拮抗剂包括抗整合素αΜβ2的抗体、整合素αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽、整合素αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽的衍生物及类似物、整合素αΜβ2的小分子化合物拮抗剂来源广泛，成本较低，临床应用前景广阔。
附图说明
图1显示了重组αΜβ2I结构域经胰酶酶解后肽段的Mr。
图2显示了抗血小板GPIbα抗体AN51可诱导血小板聚集。图2A.分别向血小板血浆(PRP)中加入2μg/ml的IgG和AN51，用血小板聚集仪记录血小板聚集的变化。Risto代表瑞斯托霉素诱导的血小板聚集；图2B.多种单克隆抗体对血小板聚集的影响，纵坐标表示15min中内血小板的最大聚集率，其中仅有AN51可显著的诱导血小板聚集；图2C.分别向PRP中加入2μg/ml的IgG和AN51在聚集仪中搅动15min后，物镜放大40倍后呈像结果。
图3显示了AN51诱导的血小板聚集依赖于抗体诱导的GPIbα聚集，不依赖于Fc段。图3A.PRP分别与10μg/ml的小鼠IgG、IV.3在常温下温育10min，加入2μg/mlAN51，血小板聚集仪记录血小板聚集变化；图3B.图3A15min内最大聚集率的统计结果；图3C.分别向PRP中加入PBS和2μg/ml的AN51F(ab’)2片段，血小板聚集仪记录血小板聚集变化；图3D.图3C15min内最大聚集率的统计结果；图3E.分别向PRP中加入2μg/ml的AN51单体Fab片段、二聚体(AN51)和四聚体(AN51加羊抗小鼠F(ab’)2，AN51+GAM)，血小板聚集仪记录血小板聚集变化；图3F.图3E15min内最大聚集率的统计结果。
图4显示了AN51诱导血小板凋亡。图4A.2μg/ml的IgG、AN51与洗涤血小板温育1-6个小时后凋亡血小板的比例；图4B.2μg/mlIgG、HIP1和AN51与洗涤血小板温育6小时血小板凋亡蛋白表达的变化。
图5显示了AN51可导致豚鼠体内血小板数迅速下降。通过豚鼠前臂静脉分别向不同的豚鼠注射正常小鼠IgG、0.05mg/kg、0.1mg/kg和0.2mg/kgAN51，在指定时间点眼眶采血，计数血小板。
图6显示了整合素αΜβ2的拮抗剂(抗体SZITP)明显抑制了巨噬细胞(THP-1)吞噬血小板。分别将AN51刺激过的血小板加入到含有不同浓度的SZITP的巨噬细胞(THP-1)悬液中，流式检测血小板吞噬情况。
图7显示了整合素αΜβ2序列的多肽(SZDT)明显抑制巨噬细胞(THP-1)吞噬血小板。分别将AN51刺激过的血小板加入到含有多肽(SZDT，2mM)及其对照肽的巨噬细胞(THP-1)悬液中，流式检测血小板吞噬情况。
具体实施方式
本发明中整合素αΜβ2的拮抗剂在本行业众所周知，可以根据已知常规方法制备，也可以向Santa Cruz公司通过商业途径购得，以常规方法使用。
本发明的药物可以仅是整合素αΜβ2的拮抗剂，也可以是含有整合素αΜβ2的拮抗剂的组合物。
通常，可将药物制成各种剂型，所述药物可以是口服或者注射或者局部应用。
本发明中血小板数量相关疾病包括原发性或继发性血小板增多症、原发性或继发性血小板减少症，但并不限于上述疾病，凡是由血小板数量引起的疾病都包含在内。
发明人之前发现，抗血小板膜糖蛋白GPIb-IX-V的抗体与人的血小板结合后会导致血小板GPIbα胞外端聚集在一起，同时使得GPIbαN-末端上连接的-N-乙酰-D-葡糖胺聚集在一起。聚集后的-N-乙酰-D-葡糖胺对肝脏巨噬细胞表面αΜβ2integrin受体的亲和力大大增加，使得血小板被肝脏巨噬细胞吞噬清除。基于之前的发现，本发明人完成了本发明。
本发明发现整合素αΜβ2的拮抗剂能抑制血小板破坏，调控血小板数量。实验证实整合素αΜβ2的拮抗剂调控血小板数量的机制之一为抑制抗血小板GPIbα抗体导致的血小板清除。在一个优选的实施方案中，所述血小板数量相关疾病选自ITP。当然，血小板数量相关疾病不只包括ITP,还包括原发性或继发性血小板增多症、非免疫性血小板减少症等。
下面以实验例来具体说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实验材料
小鼠抗人血小板GPIbαN端抗体AN51、抗人GPIX抗体SZ1和抗人GPIIIa抗体SZ21由小鼠腹水通过protein G亲和层析法纯化得到。小鼠抗人GPIb抗体WM23由杜小平惠赠。其他抗人GPIb抗体AK2、HIP1、VM16d和SZITP分别购自Abcam、eBioscience、Thermo Scientifc和Santa Cruz公司。小鼠IgG片段化试剂盒购自Thermo Scientific公司。Protein G琼脂糖凝胶购自GE healthcare。正常小鼠IgG从Santa Cruz公司购买。抗人FcγRIIA单克隆抗体IV.3购自StemCell公司。JC-1、抗Bak，Bad，Bcl-2，Bcl-xl的抗体购自碧云天生物技术研究所。抗αΜβ2抗体SZITP从Santa Cruz公司购买,多肽(SZDT)从吉尔生化(上海)有限公司购买。
血小板的分离与洗涤
取正常人新鲜静脉血用ACD以1:7抗凝。300g分离出富含血小板血浆(PRP)，PRP通过1500g离心得到血小板，CGS缓冲液洗涤2次后，重悬在改良的Tyrode’s缓冲液中至3×108/ml，在常温下静置1-2h。用于血小板聚集实验的血液用3.8％柠檬酸钠1:9抗凝，300g分离出PRP。
血小板聚集
取柠檬酸钠抗凝的PRP分别加入正常小鼠IgG、抗血小板GPIbα多种单克隆抗体、瑞斯托霉素或AN51F(ab’)2，用血小板聚集仪(Chrono-log)检测血小板聚集。在研究抗FcγRIIA的单克隆抗体IV.3对AN51诱导的血小板聚集实验中，10μg/mlIV.3先与PRP在常温下温育5分钟，再加入AN51检测聚集。
流式细胞术检测血小板凋亡
洗涤血小板与2μg/mlAN51分别温育1-6小时后，JC-1标记血小板线粒体膜电位，流式细胞术检测血小板线粒体膜电位变化，将红色荧光转化为绿色荧光的血小板定义为凋亡血小板，并记凋亡血小板群体的百分比。
SDS-PAGE和Western Blot
洗涤血小板与正常小鼠IgG、对照抗体HIP1及AN51分别在37℃下温育6小时后经细胞裂解液在冰上裂解30min后加入6×SDS上样缓冲液。蛋白由SDS-PAGE分离后转印于硝酸纤维素膜后进行Western Blot。一抗分别为抗Bak，Bad，Bcl-2，Bcl-xl的抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔抗体，ECL发光法显色。流式检测THP-1细胞吞噬血小板
将标记过calcein的血小板加入到THP-1细胞中，并清除掉未被吞噬的血小板，流式细胞术检测被THP-1细胞所吞噬的血小板。
实验结果
1、抗血小板GPIbαN端抗体AN51可导致血小板聚集
单克隆抗体AN51的表位位于人血小板GPIbαN端1－35氨基酸残基处，如附图2A和B所示，用AN51与PRP温育可诱导血小板发生聚集(聚集率为10％－20％)。抗血小板GPIbα其他表位的抗体如AK2(35－59)、HIP1(59－81)、VM16d(201－168)、WM23(macroglycopeptide)或抗其他蛋白的抗体如SZ1(GPIX)、SZ21(GPIIIa)不能显著地诱导血小板聚集发生(附图2B)。显微成像结果表明AN51诱导血小板形成小聚集物(附图2C)。
2、AN51诱导的血小板聚集依赖于抗体诱导的GPIbα聚集，不依赖于Fc段
抗血小板抗体的Fc段可通过与FcγRIIA受体结合诱导血小板发生活化和聚集。为了研究AN51是否通过与FcγRIIA结合诱导血小板聚集，检测了拮抗FcγRIIA的抗体IV.3对AN51诱导的血小板聚集的影响。附图3A表明IV.3不抑制AN51诱导的聚集。另外，不包含Fc段的AN51F(ab’)2片段也可诱导血小板聚集(附图3B)，进一步说明AN51导致血小板聚集不依赖于Fc段。
血小板GPIbα多聚化可诱导血小板聚集，为了探讨AN51是否通过诱导GPIbα聚集从而活化血小板，检测了AN51单体Fab片段、AN51IgG(二聚体)及羊抗小鼠(GAM)二抗耦连的AN51(四聚体)对血小板聚集的影响。如附图3C所示，单体(Fab)不能诱导血小板聚集；与二聚体(AN51)相比，四聚体(AN51+GAM)可诱导更大的聚集发生(10％vs20％)。
因此，AN51诱导的血小板聚集依赖于抗体诱导的GPIbα聚集，不依赖于Fc段。
3、AN51可诱导血小板凋亡
线粒体膜电位去极化可作为血小板凋亡的指标之一。洗涤血小板，分别与2μg/ml的小鼠IgG、AN51在37℃下温育1-6小时，通过检测线粒体膜电位去极化检测细胞凋亡。图4A显示温育4小时后，AN51引起的凋亡细胞的比例与IgG相比具有统计学差异，并呈时间依赖趋势。另外检测了小鼠IgG、对照抗体HIP1及AN51对血小板凋亡蛋白表达的影响。2μg/ml抗体与洗涤血小板温育6小时后裂解血小板，Western Blot结果(附图4B)表明，与IgG和对照抗体HIP1相比，AN51可导致促凋亡蛋白Bad和Bak的表达上调，抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达下调。因此，AN51可诱导线粒体途径依赖的血小板凋亡。
4、AN51可导致豚鼠体内血小板迅速被清除
抗GPIbα的抗体具有清除小鼠体内血小板的作用。AN51可特异性的与豚鼠GPIbα结合并导致GPIbα发生聚集。为探讨AN51是否可清除豚鼠体内血小板，通过向豚鼠前臂静脉注射0.05mg/kg、0.1mg/kg和0.2mg/kg的AN51，在注射抗体前、注射抗体后5min、20min、1hr、3hr分别眼眶取血计数血小板。附图5表明，AN51在5分钟后即可清除血小板，并呈剂量依赖趋势。豚鼠血小板在注射抗体3小时后逐渐恢复到正常水平。AN51的F(ab’)2片段也可导致豚鼠血小板迅速减少。注射正常小鼠IgG对豚鼠血小板计数没有影响。
5、整合素αΜβ2的拮抗剂(抗αΜβ2抗体SZITP)明显抑制巨噬细胞(THP-1)吞噬血小板
AN51可以诱导巨噬细胞(THP-1)吞噬血小板。预先准备钙黄绿素(calcein)预染好的血小板,血小板的浓度为5×108/ml，分别孵育10μg/ml IgG和10μg/mlAN51。将孵育的血小板分别加入到THP-1细胞中(预先分别加入10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml的IgG或SZITP)，附图6表明SZITP能明显抑制THP-1细胞吞噬AN51刺激过的血小板，并呈现剂量依赖性。
6、源自整合素αΜβ2序列的多肽明显抑制巨噬细胞(THP-1)吞噬血小板
AN51可以诱导巨噬细胞(THP-1)吞噬血小板。预先准备钙黄绿素(calcein)预染好的血小板，血小板的浓度为5×108/ml，分别孵育10μg/ml IgG和10μg/mlAN51。将孵育的血小板分别加入到预先加入多肽(SZDT，2mM)及其对照肽(2mM)温育的THP-1细胞中，附图7表明多肽(SZDT)明显抑制THP-1细胞吞噬AN51刺激过的血小板。
综上，本发明整合素αΜβ2的拮抗剂：抗整合素αΜβ2的抗体、αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽、αΜβ2的氨基酸序列多肽和寡肽的衍生物及类似物、整合素αΜβ2的小分子化合物拮抗剂能明显抑制巨噬细胞(THP-1)吞噬血小板，能抑制血小板破坏，调控血小板数量，因此可以用于制备治疗血小板数量相关疾病的药物，这些疾病包括：原发性或继发性血小板增多症、原发性或继发性血小板减少症等。
Claims (10)
1.整合素αMβ2的拮抗剂在制备治疗血小板数量相关疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的整合素αMβ2的拮抗剂为抗整合素αMβ2的抗体、整合素αMβ2的氨基酸序列多肽和寡肽、整合素αMβ2的氨基酸序列多肽和寡肽的衍生物及类似物、整合素αMβ2的小分子化合物拮抗剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的抗整合素αMβ2的抗体是具有抗整合素αMβ2免疫反应特征的单克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的整合素αMβ2的氨基酸序列多肽和寡肽是基于整合素αMβ2的氨基酸序列所合成的各种多肽或寡肽。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的整合素αMβ2的小分子化合物拮抗剂为应用基于药效团模型、生物电子等排取代、高通量文库筛选方法获得的整合素αMβ2的小分子化合物拮抗剂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的血小板数量相关疾病包括原发性或继发性血小板减少症、原发性或继发性血小板增多症。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的血小板数量相关疾病为免疫性血小板减少性紫癜。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是含有整合素αMβ2的拮抗剂的组合物。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液或贴剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的药物是口服或者注射或者局部应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140813 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |