CN103960129B - 一种茅苍术组培快繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茅苍术组培快繁的方法，包括如下步骤：种子的处理与消毒灭菌；建立无菌培养体系；愈伤组织诱导；愈伤组织分化成苗；无菌苗增殖培养；无菌苗生根培养；炼苗移栽。通过组培快繁技术能在短期内获得大量无菌苗，解决茅苍术种苗问题，为大规模栽培生产和繁殖种苗提供有效途径。通过组培不仅能提供优质茅苍术种苗，还可以在此基础上选育出高产优质的新品种，开辟新的药用资源，并对缓解供需矛盾，保护野生茅苍术资源具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种组培快繁体系的方法，尤其涉及茅苍术组培快繁的方法。
背景技术
茅苍术(Atractylodeslancea(Thunb.)DC.)是菊科苍术属多年生草本植物，以根茎入药，是我国传统中药材。茅苍术性辛、苦、温，归脾、胃、肝经。临床上主要用于治疗脘腹胀满,水肿，脚气痿辟，风湿痹痛，风寒感冒，雀目夜盲等。近年来对茅苍术的综合开发使苍术的用途扩大，除药用外可用作各种饮料的添加剂和加工工艺品香包。
茅苍术主要分布在海拔40~400米的丘陵山区，对土壤要求不高，荒山、坡地瘦土均能生长，分布区土壤类型多样，喜丛生在疏松的砂质土壤和富含腐殖质的土壤中。根际土壤多为酸性，pH在5左右，极少弱碱性(pH7.5)，向阳山坡疏林下及少见阳光的密林下皆可生长。至今茅苍术主要分布于长江流域的江苏、安徽、湖北、四川、浙江、江西等省，江苏茅山一带是茅苍术道地药材的产区。但长期以来，茅山野生苍术不受重视、疏于管理，被掠夺性采挖，野生资源面临枯竭。
人工繁殖茅苍术既可以用种子繁殖也可用根茎繁殖，但是种子繁殖其繁殖系数太低，种子的生命力较差；用根茎繁殖则需要大量根茎材料，而且品质易退化。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种能提高成活率的茅苍术组培快繁的方法，以期开辟新的药用资源，并且缓解供需矛盾，保护野生茅苍术资源。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种茅苍术组培快繁的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）茅苍术种子处理与消毒灭菌：选取茅苍术种子，清洗后进行消毒灭菌处理；
（2）建立无菌培养体系:将消毒灭菌后种子接入发芽培养基，在设定的培养条件下，10~14天发芽，约一个月后，长成幼苗；
（3）愈伤组织诱导:将步骤（2）培养的无菌幼苗去除根系，剪去叶片，保留嫩茎，基部向下接入愈伤组织诱导与分化培养基，在设定的培养条件下，培养10~14天后，嫩茎基部膨大逐渐形成绿色到褐色愈伤组织；
（4）愈伤组织分化成苗：在步骤（3）的基础上继续培养，20~28天后愈伤组织上分化出丛生芽，45~50天后丛生芽陆续形成丛生苗；
（5）无菌苗增殖培养：将步骤（4）中的丛生苗从愈伤组织基座上分株，剪去叶片，保留嫩茎，接入增殖培养基，在设定的培养条件下，5~9天后开始出芽，18~24天后形成丛苗；
（6）无菌苗生根培养：取步骤（5）中高5cm以上、性状稳定的单株健壮幼苗，接种至生根培养基，在设定的培养条件下，21~28天后完成生根；
（7）炼苗移栽：挑选步骤（6）中叶片数多于8片、不定根数多于12，苗高超过6cm的壮苗，先将组培瓶移至常温15℃下锻炼一周，移栽前两天开瓶盖，并浇水保持叶片不萎缩，移栽时将苗去除培养基并洗净后定植于穴盘，经灭菌处理后，将穴盘置于温室，相对湿度保持80%以上，14~21天苗长出新叶，即可认为成活。
优选，在步骤（7）中，移栽后每隔7天喷施一次多菌灵粉剂杀菌，喷施量以苗叶片湿润为宜，待苗长出新叶即可停止。
上述步骤（2）至步骤（6）中所述的设定的培养条件为光照强度:2000~2500lx；光照时间：12~15h/d；培养温度：（22±2）℃；培养地点无菌培养室。
步骤（1）中消毒灭菌处理方法为；将清洗后的种子加入清水浸泡0.5~1h，浸泡结束后，用流动水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗两次，然后用体积百分比为70%乙醇溶液浸泡约20~30s，再用质量百分比为0.1%氯化汞溶液浸泡15min~18min，最后用无菌水冲洗至少3遍，在无菌滤纸上吸干水分备用。
步骤（2）中发芽培养基为MS加入质量百分比为3%的蔗糖和0.75%琼脂，所述培养基PH为5.8~6.2。
步骤（3）中愈伤组织诱导与分化培养基为MS+0.5~1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.05~0.15mg/L的萘乙酸+质量百分比为3%的蔗糖+质量百分比为0.75%琼脂，所述培养基PH为5.8~6.2。
步骤（5）中增殖培养基为MS+0.5~1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1~0.3mg/L的萘乙酸+质量百分比为3%的蔗糖+质量百分比为0.75%琼脂，所述培养基PH为5.8~6.2。
步骤（6）中生根培养基为1/2MS+NAA（萘乙酸）0.1~0.2mg/L加入质量百分比为0.5%~0.8%的活性炭、3%的蔗糖和0.75%琼脂，所述培养基PH为5.8~6.2。
步骤（7）中在穴盘中装有移栽基质，移栽基质包括如下重量比的组分，泥炭土：蛭石：普通黄土=1~2：1~2：1~2。
有益效果：与现有技术相比，本发明是通过组培快繁技术能在4~5个月内获得大量无菌苗，解决茅苍术种苗问题，为大规模栽培生产和繁殖种苗提供有效途径。通过组培不仅能提供优质茅苍术种苗，还可以在此基础上选育出高产优质的新品种，开辟新的药用资源，并对缓解供需矛盾，保护野生茅苍术资源具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1：一种茅苍术组培快繁的方法，包括如下步骤：
1、种子处理与消毒灭菌
培养皿中放入大小适宜的滤纸，选取秋天收获的粒大饱满的野生茅苍术（Atractylodeslancea(Thunb.)DC.）种子，用洗衣粉清洗后，然后加入适量清水浸泡（以刚好没及种子为宜）0.5h；浸泡结束后，用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗两次；再将种子用体积百分比为70%乙醇浸泡30s，后再用质量百分比为0.1%氯化汞溶液浸泡15min，无菌水冲洗3遍，在无菌滤纸上吸干水分备用。
2、无菌培养体系建立
将上述消毒灭菌后种子接入发芽培养基，每瓶1粒；14天后发芽，一个月后，长成具有两片真叶的无菌幼苗，苗高约5cm。其中，发芽培养基为MS加入质量百分比为3%的蔗糖和质量百分比为0.75%琼脂，所述培养基PH为5.8。
3、愈伤组织诱导
将第2步得到的无菌幼苗去除根系，剪去叶片，保留嫩茎，基部向下接入愈伤组织诱导与分化培养基；培养2周，嫩茎基部膨大逐渐形成绿色到褐色愈伤组织。其中，愈伤组织诱导与分化培养基为MS+6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）1.0mg/L+NAA（萘乙酸）0.1mg/L加入质量百分比为3%的蔗糖和质量百分比为0.75%琼脂，所述培养基PH为5.8。
4、愈伤组织分化成苗
四周后愈伤组织上分化出丛生芽，七至八周后丛生芽陆续长成丛生苗。
5、无菌苗增殖培养
将丛生苗从愈伤组织基座上分株，剪去叶片，保留嫩茎，接入增殖培养基；1周开始出芽，3周后形成丛苗，平均增殖倍数约为6.0。其中，增殖培养基为MS+6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）1.0mg/L+NAA（萘乙酸）0.2mg/L加入质量百分比为3%的蔗糖和0.75%琼脂，所述培养基PH为5.8。
6、无菌苗生根培养
取第5步中得到的高5cm以上、性状稳定的单株健壮幼苗，接种至生根培养基，在设定的培养条件下，3周后完成生根，平均根长约8cm，不定根数量平均达10以上，生根率超过99%。其中，生根培养基为1/2MS+NAA（萘乙酸）0.15mg/L加入质量百分比为0.5%的活性炭、质量百分比为3%的蔗糖和质量百分比为0.75%琼脂，所述培养基PH为5.8。
上述步骤2至步骤6中所涉及到的设定培养条件如下：
光照强度:2000lx；光照时间：12h/d；培养温度：20℃。培养地点为无菌培养室。
7、炼苗移栽
挑选第6步中叶片数多于8片、不定根数多于12，苗高超过6cm的壮苗，将组培瓶先移至常温15℃下锻炼一周，移栽前两天开瓶盖，并浇适量水保持叶片不萎缩；移栽时将苗去除培养基并洗净后定植于72孔穴盘，移栽基质采用为泥炭土：蛭石：普通黄土=1：1：1，高压蒸汽灭菌处理；移栽***盘置于温室，相对湿度保持80%，每隔7天喷施多菌灵粉剂一次。21天后成活率88%。
实施例2：与实施例1基本相同，所不同的是：
步骤2至步骤6中所涉及到的设定培养条件如下：光照强度:2500lx；光照时间：15h/d；培养温度：24℃。
步骤（1）中消毒灭菌处理方法为；将清洗后的种子加入清水浸泡1h，浸泡结束后，用流动水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗两次，然后用体积百分比为70%乙醇溶液浸泡约20s，再用质量百分比为0.1%氯化汞溶液浸泡18min，最后用无菌水冲洗5遍，在无菌滤纸上吸干水分备用。
步骤（2）中在设定的培养条件下10天发芽，发芽培养基PH为6.2。
步骤（3）中愈伤组织诱导与分化培养基为：MS+0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.05mg/L的萘乙酸+质量百分比为3%的蔗糖+质量百分比为0.75%琼脂，PH为6.2。
步骤（5）中增殖培养基为：MS+0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1mg/L的萘乙酸+质量百分比为3%的蔗糖+质量百分比为0.75%琼脂，PH为6.2。
步骤（6）中生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L的萘乙酸+0.8%（质量）的活性炭+3%（质量）的蔗糖+0.75%（质量）琼脂，PH为6.2。
步骤（7）中移栽基质的成分按重量比计为，泥炭土：蛭石：普通黄土=2：2：1；温室的相对湿度保持90%，14天后成活率92%。
实施例3：与实施例1基本相同，所不同的是：
步骤2至步骤6中所涉及到的设定培养条件如下：光照强度:2500lx；光照时间：13h/d；培养温度：22℃。
步骤（1）中消毒灭菌处理方法为；将清洗后的种子加入清水浸泡0.7h，浸泡结束后，用流动水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗两次，然后用体积百分比为70%乙醇溶液浸泡约25s，再用质量百分比为0.1%氯化汞溶液浸泡17min，最后用无菌水冲洗5遍，在无菌滤纸上吸干水分备用。
步骤（2）中在设定的培养条件下13天发芽，发芽培养基PH为6.0。
步骤（3）中愈伤组织诱导与分化培养基为：MS+1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.15mg/L的萘乙酸+质量百分比为3%的蔗糖+质量百分比为0.75%琼脂，PH为6.0。
步骤（5）中增殖培养基为：MS+1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.3mg/L的萘乙酸+质量百分比为3%的蔗糖+质量百分比为0.75%琼脂，PH为6.0。
步骤（6）中生根培养基为：1/2MS+0.2mg/L的萘乙酸+0.7%的活性炭+3%的蔗糖+0.75%琼脂，PH为6.0。
步骤（7）中移栽基质的成分按重量比计为，泥炭土：蛭石：普通黄土=1：1：2；温室的相对湿度保持85%，14天后成活率90%。
Claims (4)
1.一种茅苍术组培快繁的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)茅苍术种子处理与消毒灭菌：选取茅苍术种子，清洗后进行消毒灭菌处理；
(2)建立无菌培养体系：将消毒灭菌后种子接入发芽培养基，在设定的培养条件下，10～14天发芽，一个月后，长成幼苗；发芽培养基为MS+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比为0.75％琼脂，所述培养基pH为5.8～6.2；
(3)愈伤组织诱导：将步骤(2)培养的无菌幼苗去除根系，剪去叶片，保留嫩茎，基部向下接入愈伤组织诱导与分化培养基，在设定的培养条件下，培养10～14天后，嫩茎基部膨大逐渐形成绿色到褐色愈伤组织；愈伤组织诱导与分化培养基为MS+0.5～1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.05～0.15mg/L的萘乙酸+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比为0.75％琼脂，所述培养基pH为5.8～6.2；
(4)愈伤组织分化成苗：在步骤(3)的基础上继续培养，20～28天后愈伤组织上分化出丛生芽，45～50天后丛生芽陆续形成丛生苗；
(5)无菌苗增殖培养：将步骤(4)中的丛生苗从愈伤组织基座上分株，剪去叶片，保留嫩茎，接入增殖培养基，在设定的培养条件下，5～9天后开始出芽，18～24天后形成丛苗；增殖培养基为MS+0.5～1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1～0.3mg/L的萘乙酸+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比为0.75％琼脂，所述培养基pH为5.8～6.2；
(6)无菌苗生根培养：取步骤(5)中高5cm以上、性状稳定的单株健壮幼苗，接种至生根培养基，在设定的培养条件下，21～28天后完成生根；生根培养基为1/2MS+0.1～0.2mg/L的萘乙酸+0.5％～0.8％的活性炭+3％的蔗糖+0.75％琼脂，所述培养基pH为5.8～6.2，以上百分数均为质量百分数；
(7)炼苗移栽：挑选步骤(6)中叶片数多于8片、不定根数多于12，苗高超过6cm的壮苗，先将组培瓶移至常温15℃下锻炼一周，移栽前两天开瓶盖，并浇水保持叶片不萎缩，移栽时将苗去除培养基并洗净后定植于穴盘，经灭菌处理后，将穴盘置于温室，相对湿度保持80％以上，14～21天苗长出新叶，即认为成活；在穴盘中装有移栽基质，移栽基质包括如下重量比的组分，泥炭土：蛭石：普通黄土＝1～2：1～2：1～2。
2.根据权利要求1所述的一种茅苍术组培快繁的方法，其特征在于，所述设定的培养条件为光照强度：2000～2500lx；光照时间：12～15h/d；培养温度：22±2℃；培养地点无菌培养室。
3.根据权利要求1所述的一种茅苍术组培快繁的方法，其特征在于，所述步骤(1)中消毒灭菌处理方法为：将清洗后的种子加入清水浸泡0.5～1h，浸泡结束后，用流动水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗两次，然后用体积百分比为70％乙醇溶液浸泡20～30s，再用质量百分比为0.1％氯化汞溶液浸泡15min～18min，最后用无菌水冲洗至少3遍，在无菌滤纸上吸干水分备用。
4.根据权利要求1所述的一种茅苍术组培快繁的方法，其特征在于，所述步骤(7)中移栽后每隔7天喷施一次多菌灵粉剂杀菌，喷施量以苗叶片湿润为宜，待苗长出新叶即停止喷施。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |