CN103444539A - 一种茅苍术试管苗培养的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种茅苍术试管苗的快速繁殖方法。工艺步骤为：茅苍术无菌外植体的获得，腋芽的诱导、腋芽的增值、生根诱导，壮苗培养，氯化钙调控试管苗酶的活性及茅苍术挥发油含量等步骤，本发明方法所制备的茅苍术试管苗含有较高含量的次生代谢物含量。本发明方法发明了利用氯化钙对茅苍术试管苗进行有目的的调控，可以在短期内获得大量次生代谢物含量高的茅苍术试管苗，进行大规模的工业化生产，并能有效降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及组培条件下茅苍术幼苗的培养，尤其是氯化钙对茅苍术试管苗次生代谢物含量的调控。
背景技术
茅苍术的别名茅术、南苍术，主产于江苏、湖北、安徽、浙江、江西、河南等地，苍术性味辛苦、湿，具有健脾、燥湿、解郁和辟秽之功效。治湿盛困脾，倦怠嗜卧，脘痞腹胀，食欲不振，呕吐，泄泻，痢疾，疟疾，痰饮，时气感冒，风寒湿痹，足痿，夜盲等症，是我国珍贵的中药材，从而引起药厂、药市、药商和药农的高度重视，近年来，国际市场对苍术的需求量日益增加，苍术被掠夺性采挖，加之对苍术生态环境的人为破坏，造成苍术资源的枯竭，使其濒临灭绝。因此扩大苍术组织培养和人工栽培的规模是目前亟待解决的问题。茅苍术主要含挥发油，挥发油中苍术酮、苍术素、茅术醇和β-桉叶醇为其主要活性成分。目前，对苍术酮、苍术素、茅术醇和β-桉叶醇的定量分析方法主要有TLC， GC和HPLC等。
钙是植物必需的一种矿质元素，它对维持细胞壁，细胞膜，膜结合蛋白的稳定性，调节无机离子运输，作为细胞内生理生化反应的第二信使偶联外界信号，调控多种酶活性等都具有重要的作用，适当浓度的钙离子能提高植物组织或细胞的抗冷性、抗旱性、抗热性、抗盐性等。高浓度的钙离子也会对植物产生胁迫现象。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供茅苍术试管苗的快速繁殖方法，并通过氯化钙对试管苗生长和次生代谢物质的调控，获得生长良好，次生代谢物含量高的茅苍术试管苗，可以选育出优良的茅苍术品种，快速规模化的生产种植茅苍术幼苗，对制药领域的进一步开拓具有重要的现实意义。
为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案：
工艺步骤为：取茅苍术芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理10-12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分，获得的无菌茅苍术芽接种到MS培养基中进行诱导，诱导出来萌发的腋芽接种入增值培养基中（MS+NAA0.5mg/L+ZT0.2mg/L）进行丛生芽增值，增值培养3-4代，获得长势良好带有叶片的丛生芽，接种到附加激素0.5 mg/L2，4-D和1 mg/L TDZ的WPM培养基中进行生根诱导培养，获得完整的茅苍术试管苗。培养条件为温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000lx；光期14 h暗期10h，获得的生长强壮的茅苍术试管苗接种入WPM+0.5mg/L2，4-D+1mg/LTDZ+GA2mg/L氯化钙4mg/L，培养一段时间取茅苍术试管苗叶片，60℃烘干保存干样。精密称取研磨过的茅苍术叶片粉末0.5g，置试管中，准确加入正己烷15 mL，超声提取45min，用正己烷定容至15ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过。将提取溶液加入0.45μm的微孔滤膜滤过，为HP-1弹性石英毛细管，检测器FID；进样口温度250℃；检测器温度250℃；载气为氮气;分流进样，分流比30∶1；进样量1μL。色谱柱为HP-1弹性石英毛细管，检测器FID；进样口温度250℃；检测器温度250℃；载气为氮气;分流进样，分流比30∶1；进样量1μL。提取的挥发油的含量为1.976ml/g，生根率90%。
采用本发明调控出来的试管苗生根率高，长势好，挥发油的含量高，周期短，操作可控，可进行工业扩大化生产。
下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式
实施例1
取茅苍术芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理10-12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分，获得的无菌茅苍术芽接种到MS培养基中进行诱导，诱导出来萌发的腋芽接种入增值培养基中（MS+NAA0.5mg/L+ZT0.2mg/L）进行丛生芽增值，增值培养3-4代，获得长势良好带有叶片的丛生芽。接种到附加激素0.2 mg/L2，4-D和0.5 mg/L TDZ的WPM培养基中进行生根诱导培养，获得完整的茅苍术试管苗。培养条件为温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000lx；光期14 h暗期10h，获得的生长强壮的茅苍术试管苗接种入WPM+0.5mg/L2，4-D+1mg/LTDZ+GA2mg/L氯化钙2mg/L，培养一段时间取茅苍术试管苗叶片， 60℃烘干保存干样，采用超声提取法提取挥发油，采用GC法检测其含量，挥发油的含量为1.075ml/g，生根率80%。
实施例2
取茅苍术芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理10-12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分，获得的无菌茅苍术芽接种到MS培养基中进行诱导，诱导出来萌发的腋芽接种入增值培养基中（MS+NAA0.5mg/L+ZT0.2mg/L）进行丛生芽增值，增值培养3-4代，获得长势良好带有叶片的丛生芽，接种到附加激素0.4 mg/L2，4-D和0.5mg/L TDZ的WPM培养基中进行生根诱导培养，获得完整的茅苍术试管苗，培养条件为温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000lx；光期14 h暗期10h。获得的生长强壮的茅苍术试管苗接种入WPM+0.5mg/L2，4-D+1mg/LTDZ+GA2mg/L氯化钙2mg/L，培养一段时间取茅苍术试管苗叶片， 60℃烘干保存干样。采用超声提取法提取挥发油，采用GC法检测其含量，挥发油的含量为1.139ml/g，生根率85%。
实施例3
取茅苍术芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理10-12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分，获得的无菌茅苍术芽接种到MS培养基中进行诱导，诱导出来萌发的腋芽接种入增值培养基中（MS+NAA0.5mg/L+ZT0.2mg/L）进行丛生芽增值，增值培养3-4代，获得长势良好带有叶片的丛生芽，接种到附加激素0.5 mg/L2，4-D和1 mg/L TDZ的WPM培养基中进行生根诱导培养，获得完整的茅苍术试管苗，培养条件为温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000lx；光期14 h暗期10h。获得的生长强壮的茅苍术试管苗接种入WPM+0.5mg/L2，4-D+1mg/LTDZ+GA2mg/L氯化钙2mg/L，培养一段时间取茅苍术试管苗叶片， 60℃烘干保存干样。采用超声提取法提取挥发油，采用GC法检测其含量，挥发油的含量为1.240ml/g，生根率89%。
实施例4
取茅苍术芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理10-12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分，获得的无菌茅苍术芽接种到MS培养基中进行诱导，诱导出来萌发的腋芽接种入增值培养基中（MS+NAA0.5mg/L+ZT0.2mg/L）进行丛生芽增值，增值培养3-4代，获得长势良好带有叶片的丛生芽，接种到附加激素0.5 mg/L2，4-D和1.5 mg/L TDZ的WPM培养基中进行生根诱导培养，获得完整的茅苍术试管苗。培养条件为温度25℃，湿度50%-70%，光强度2000lx；光期14 h暗期10h，获得的生长强壮的茅苍术试管苗接种入WPM+0.5mg/L2，4-D+1mg/LTDZ+GA2mg/L氯化钙4mg/L，培养一段时间取茅苍术试管苗叶片， 60℃烘干保存干样。采用超声提取法提取挥发油，采用GC法检测其含量，挥发油的含量为1.356ml/g，生根率79%。
实施例5
取茅苍术芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理10-12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分，获得的无菌茅苍术芽接种到MS培养基中进行诱导，诱导出来萌发的腋芽接种入增值培养基中（MS+NAA0.5mg/L+ZT0.2mg/L）进行丛生芽增值，增值培养3-4代，获得长势良好带有叶片的丛生芽。接种到附加激素0.5 mg/L2，4-D和1.5 mg/L TDZ的WPM培养基中进行生根诱导培养，获得完整的茅苍术试管苗，培养条件为温度25℃，湿度50%～70%，光强度2000lx；光期14 h暗期10h，获得的生长强壮的茅苍术试管苗接种入WPM+0.5mg/L2，4-D+1mg/LTDZ+GA2mg/L氯化钙6mg/L，培养一段时间取茅苍术试管苗叶片， 60℃烘干保存干样。采用超声提取法提取挥发油，采用GC法检测其含量，挥发油的含量为1.576ml/g，生根率81%。
Claims (8)
1.一种茅苍术试管苗培养的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、腋芽的诱导、腋芽的增值、生根诱导，壮苗培养，氯化钙调控试管苗酶的活性及次生代谢物的含量，其主要步骤如下：
（1）按照植物组织培养常规消毒方法对野外采取的茅苍术芽进行消毒处理，获得无菌的外植体；
（2）将步骤（1）获得的无菌茅苍术芽接种到芽诱导培养基中进行诱导，诱导出来萌发的腋芽接种入增值培养基中进行丛生芽增值，增值培养3-4代，获得长势良好带有叶片的丛生芽；
（3）将步骤（2）获得的丛生芽接种到附加激素0.2-0.5 mg/L2，4-D和0.5-1.5 mg/L TDZ的WPM培养基中进行生根诱导培养，获得完整的茅苍术试管苗；
（4）将步骤（3）获得的生长强壮的茅苍术试管苗接种入WPM+0.5mg/L2，4-D+1mg/LTDZ+GA2mg/L氯化钙2-6mg/L，培养一段时间取茅苍术试管苗叶片， 60℃烘干保存干样，取样提取，检测挥发油中各成分的含量。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述无菌的黄芪外植体叶片和芽按照下述方法得到：取茅苍术芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理10-12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分。
3.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：所述的培养条件为温度25℃，湿度50%～70%，光强度2000lx；光期14 h暗期10h。
4.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：所述的诱导培养基为MS，无激素添加。
5.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：挥发油的提取方法为：精密称取研磨过的茅苍术叶片粉末0.5g，置试管中，准确加入正己烷15 mL，超声提取45min，用正己烷定容至15ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得待检测溶液。
6.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）中的GA为过滤灭菌。
7.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）中的挥发油主要成分为茅术醇、β-桉叶醇、茅术酮。
8.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）中的挥发油的检测方法为气相色谱法，色谱柱为HP-1弹性石英毛细管，检测器FID；进样口温度250℃；检测器温度250℃；载气为氮气;分流进样，分流比30∶1；进样量1μL。
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