CN103954666A - 一种酶传感器的制备方法及其测定过氧化氢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶传感器的制备方法及其测定过氧化氢的方法，该方法利用辣根过氧化物酶对过氧化氢的高催化性能，碳纳米管的信号增强作用。本发明通过电沉积把水滑石-酶负载在碳纳米管修饰的基础电极表面制备酶传感器，通过简单的电沉积法制备水滑石将辣根过氧化物酶固定于电极表面使酶紧密的负载在电极表面，有利于酶的固定和酶的直接电子传递。
Description
技术领域
本发明涉及酶传感器和电分析化学检测技术领域，尤其涉及一种以水滑石为载体测定过氧化氢的酶传感器的制备方法及其测定。
背景技术
水滑石是一类由带正电荷的金属氢氧化物及层和层间填充的可交换的阴离子所构成的层状化合物。由于水滑石具有强吸附性、比表面积大、生物相容性良好和离子交换性能好等特点，近年来一直受到人们的广泛关注，并被应用到酶传感器中作为固定化酶的载体和化学修饰电极中作为修饰剂。但由于水滑石的弱导电性不利于水滑石修饰电极的电子传递，降低了电极材料的电化学性能，限制其在电化学领域的大力发展。最近，金纳米粒子、碳纳米管和石墨烯等具有良好导电性的纳米材料引入到水滑石修饰电极中提高其电化学性能。如Wang等通过共沉淀方法制备金纳米粒子-水滑石复合纳米材料构建测定甲醇的修饰电极，由于金纳米粒子和水滑石的协同作用，该电极催化氧化甲醇的峰电流远大于水滑石修饰电极的峰电流（Wang Y., Zhang D., Tang M., Xu S., Li M. Electrochimica Acta, 2010, 55: 4045-4049.）。
碳纳米管自发现以来，以它独一无二的结构、电化学和机械性能而备受关注，由于其直径小，高表面能且原子配位不足，至使碳纳米管的表面原子活性非常高，极易发生电子转移作用，由于其独特的结构，使其具有大的比表面积和较好的生物相容性，是良好的电化学纳米材料。
过氧化氢是一种重要的化工产品，同时也参与过氧化物酶的酶促反应，它在生物、环保、食品、医药和工业等领域的定量测定具有重要的意义。相对于传统的过氧化氢测定方法如紫外-可见分光光度法、化学发光和荧光等方法，基于酶电极的电化学传感器法，因其灵敏度高，响应速度快、选择性好的特点，受到广大研究者的亲睐。如Chen等通过滴涂法将辣根过氧化物酶和镍铝水滑石固定在玻碳电极表面，制备测定过氧化氢的酶传感器（Chen X., Fu C., Wang Y., Yang W., Evans D.G., Biosensors and Bioelectronics, 2008, 24: 356-361 ），但由于在固定化酶的方法上的缺点，使酶很容易脱落，受环境的影响大，限制了它的应用。
目前，以水滑石为固定化酶的载体制备辣根过氧化物酶传感器并用于检测过氧化氢的报道，都是先通过共沉淀法或水热法合成水滑石，然后采用滴涂法或层层组装法制备辣根过氧化物酶传感器。上述方法繁琐、复杂费时，本发明专利通过简单的电沉积法将辣根过氧化物酶固定在水滑石载体上制备辣根过氧化物酶传感器，通过简单的电沉积法制备水滑石将辣根过氧化物酶固定于电极表面使酶紧密的负载在电极表面，有利于酶的固定化和酶的直接电子传递；另外，本发明专利将碳纳米管的引入到基础电极表面，改善水滑石修饰电极的导电性而提高酶传感器的性能。
发明内容
本发明的目的是，针对目前以水滑石为载体制备辣根过氧化物酶传感器的方法复杂、繁琐及水滑石修饰电极的导电性差的缺点，通过简单的一步电沉积法在碳纳米管修饰基础电极表面制备了以水滑石为载体的辣根过氧化物酶传感器并用于检测过氧化氢。
实现本发明的技术方案是，本发明通过滴涂的方法先将碳纳米管修饰于电极表面，然后通过一步电沉积法将水滑石和辣根过氧化物酶固定在碳纳米管修饰的电极表面，利用辣根过氧化物酶对过氧化氢的催化还原和酶的直接电子传递，建立了一种新的测定过氧化氢的方法。
本发明以水滑石为载体制备酶传感器的制备方法，所述方法步骤如下：
（1）用微量注射器取2～15 μl分散好的0.3～2.0 mg/mL 碳纳米管悬浮液均匀的滴加在干净的玻碳电极表面，在室温下自然晾干，用去离子水冲洗干净，得到碳纳米管修饰电极。
（2）先配制含硝酸钴15～25 mmol/L、硝酸铝5～10 mmol/L、硝酸钾0.1～0.5 mol/L和辣根过氧化物酶0.3～1.5 mg/mL的电沉积液，然后将碳纳米管修饰电极置于电沉积液中于-0.6～-1.2 V下进行恒电位沉积，时间为10～80s，沉积结束之后用去离子水冲洗干净，得到水滑石-辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极，该辣根过氧化物酶修饰电极即为测定过氧化氢的酶传感器。
本发明以水滑石为载体制备酶传感器检测过氧化氢的方法如下：
本发明利用辣根过氧化物酶对过氧化氢的催化还原和酶与电极之间的直接电子传递，将前述辣根过氧化物酶修饰电极作为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，即可实现对过氧化氢的检测。
该传感器测定过氧化氢的线性范围为2.5×10-6～7.85×10-4 mol/L，检测限为1.6×10-6 mol/L，灵敏度为0.00881 A·L/mol。用同一批制备的5支修饰电极对0.25mmol/L H2O2进行测定，其相对标准偏差为3.2%。采用同一支修饰电极对过氧化氢进行5次检测，其对过氧化氢响应的相对标准偏差为2.1%。酶修饰电极在0.25mmol/L H2O2置于4 ℃的环境中考察其稳定性，四周后，仍保留响应电流值的83%。表明该电极具有良好的重现性和稳定性。
本发明的有益效果是，本发明利用碳纳米管的大比表面积、良好的导电性和生物相容性，通过一步电沉积法在碳纳米管修饰的基础电极表面将辣根过氧化物酶负载在水滑石上实现了酶的直接电化学并用于测定过氧化氢。
附图说明
图1为本发明中的酶修饰电极在0.2 mol/L PBS (pH 7.0)中的循环伏安图，（a）未加过氧化氢，（b）加入125 μmol/L过氧化氢；
图2为本发明中不同修饰电极的循环伏安曲线，（a）水滑石修饰电极，（b）水滑石/碳纳米管修饰电极，（c）辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极，（d）水滑石-辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极；
图3为酶修饰电极对过氧化氢的计时电流曲线；
图4酶修饰电极的电流响应对过氧化氢浓度的校准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但决不限制本发明的保护范围。
实施例1
以水滑石为载体制备酶传感器。
（1）用微量注射器取3μl分散好的0.5 mg/mL 碳纳米管悬浮液均匀的滴加在干净的玻碳电极表面，在室温下自然晾干，用去离子水冲洗干净，得到碳纳米管修饰电极。
（2）先配制含硝酸钴15 mmol/L、硝酸铝5 mmol/L、硝酸钾0.1 mol/L和辣根过氧化物酶0.3 mg/mL的电沉积液，然后将碳纳米管修饰电极置于电沉积液中于-0.6 V下进行恒电位沉积，时间为80s，沉积结束之后用去离子水冲洗干净，得到水滑石-辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极，该辣根过氧化物酶修饰电极即为测定过氧化氢的酶传感器。
实施例2
以水滑石为载体制备酶传感器。
（1）用微量注射器取5μl分散好的0.5 mg/mL 碳纳米管悬浮液均匀的滴加在干净的玻碳电极表面，在室温下自然晾干，用去离子水冲洗干净，得到碳纳米管修饰电极。
（2）先配制含硝酸钴21 mmol/L、硝酸铝7 mmol/L、硝酸钾0.2 mol/L和辣根过氧化物酶0.5 mg/mL的电沉积液，然后将碳纳米管修饰电极置于电沉积液中于-0.8 V下进行恒电位沉积，时间为70s，沉积结束之后用去离子水冲洗干净，得到水滑石-辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极，该辣根过氧化物酶修饰电极即为测定过氧化氢的酶传感器。
实施例3
以水滑石为载体制备酶传感器。
1）用微量注射器取5μl分散好的1.0 mg/mL 碳纳米管悬浮液均匀的滴加在干净的玻碳电极表面，在室温下自然晾干，用去离子水冲洗干净，得到碳纳米管修饰电极。
（2）先配制含硝酸钴22.5 mmol/L、硝酸铝7.5 mmol/L、硝酸钾0.3 mol/L和辣根过氧化物酶1.0 mg/mL的电沉积液，然后将碳纳米管修饰电极置于电沉积液中于-0.9 V下进行恒电位沉积，时间为30s，沉积结束之后用去离子水冲洗干净，得到水滑石-辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极，该辣根过氧化物酶修饰电极即为测定过氧化氢的酶传感器。
实施例4
电化学测试。
将实施例3得到的酶修饰电极进行电化学测试：
（1）酶修饰电极的循环伏安测试。
酶修饰电极作为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极；底液为0.2 mol/L PBS (pH 7.0)和加了125μmol/L的过氧化氢；扫描速度为0.1 V/s。循环伏安图见图1，从图1可见，加入过氧化氢后，还原峰的峰电流增大，氧化峰的峰电流减小，说明酶修饰电极对过氧化氢产生了催化还原，催化电流是由酶电极中的辣根过氧化物酶催化还原过氧化氢产生的。
（2）不同修饰电极的循环伏安表征。
分别将水滑石修饰电极、水滑石/碳纳米管修饰电极、辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极和水滑石-辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极；底液为0.2 mol/L PBS (pH 7.0)，电位范围为0.4 ~ -0.8 V，扫速为100m V/s；循环伏安测定结果见图2。从图中可以看出，直接电沉积了水滑石的修饰电极(曲线a)在此电位区间是没有明显的氧化还原峰出现；而水滑石/碳纳米管修饰电极(曲线b)出现了一对较小的氧化还原峰，这是在电极表面修饰了一层碳纳米管而出现的峰，此时由于碳纳米管的作用，使其充电电流变大；辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极 (曲线c)是在碳纳米管表面滴加了一层辣根过氧化物酶之后，在-0.097V和-0.293V出现一对明显的可逆氧化还原峰，这是辣根过氧化物酶在PBS溶液中的Fe(Ⅱ) /Fe(Ⅲ)氧化还原所产生的可逆峰，但通过滴涂法使辣根过氧化物酶固定在碳纳米管表面的方法在进行电化学检测时容易脱落，会导致实验的稳定性差；水滑石-辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极(曲线d)通过电沉积水滑石法固定辣根过氧化物酶于碳纳米管修饰电极表面，使酶的氧化还原峰电流变得更大，并且也保证了实验的稳定性。
（3）酶修饰电极的计时电流测试
将水滑石-辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极；底液为0.2 mol/L PBS (pH 7.0)；测定电位为-0.3 V，在磁力搅拌下，连续滴加一定浓度的过氧化氢，测定结果见图3、图4。测定过氧化氢的线性范围为2.5×10-6～7.85×10-4 mol/L，检测限为1.6×10-6 mol/L，灵敏度为0.00881 A·L/mol。平行测定5次的相对标准偏差为2.1%，四周后测定过氧化氢的响应电流保持在83%以上。
Claims (4)
1.一种酶传感器的制备方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：
（1）用微量注射器取2～15 μl分散好的0.3～2.0 mg/mL 碳纳米管悬浮液均匀的滴加在干净的玻碳电极表面，在室温下自然晾干，用去离子水冲洗干净，得到碳纳米管修饰电极；
（2）先配制含硝酸钴15～25 mmol/L、硝酸铝5～10 mmol/L、硝酸钾0.1～0.5 mol/L和辣根过氧化物酶0.3～1.5 mg/mL的电沉积液，然后将碳纳米管修饰电极置于电沉积液中于-0.6～-1.2 V下进行恒电位沉积，时间为10～80s，沉积结束之后用去离子水冲洗干净，得到水滑石-辣根过氧化物酶/碳纳米管修饰电极，该辣根过氧化物酶修饰电极即为测定过氧化氢的酶传感器。
2.根据权利要求1所述的一种酶传感器的制备方法，其特征在于，所述电沉积液为含硝酸钴15～25 mmol/L、硝酸铝5～10 mmol/L、硝酸钾0.1～0.5 mol/L和辣根过氧化物酶0.3～1.5 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种酶传感器的制备方法，其特征在于，所述电沉积条件为-0.6～-1.2 V下进行恒电位沉积，时间为10～80s。
4.一种以水滑石为载体的酶传感器检测过氧化氢的方法，其特征在于，所述方法利用辣根过氧化物酶对过氧化氢的催化性能，碳纳米管的信号增强作用，辣根过氧化物酶的直接电子传递等特性，将辣根过氧化物酶修饰电极作为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对过氧化氢的灵敏检测。
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