CN103952346A

CN103952346A - 植物乳杆菌、干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌复合菌剂的制备

Info

Publication number: CN103952346A
Application number: CN201410154685.5A
Authority: CN
Inventors: 高鹏飞; 贺润晶; 姚国强
Original assignee: Jiu Heyisheng Bio Tech Ltd Qingdao
Current assignee: Inner Mongolia Ketuo Micro Ecological Technology Development Co.,Ltd.
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2014-04-17
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2034-04-17
Also published as: CN103952346B

Abstract

本发明属于益生菌发酵技术领域，具体涉及一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌植物乳杆菌HM-10(Lactobacillus plantarum HM-10)、干酪乳杆菌HM-09(Lactobacillus casei HM-09)和地衣芽孢杆菌BL-09(Bacillus licheniformis BL-09)为菌种的混合固态发酵技术，可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，此方法可以生产出具有特殊酸香味的发酵型饲料产品，且发酵产品的活菌数高，豆粕蛋白质的降解率高。此制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。

Description

植物乳杆菌、干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌复合菌剂的制备

技术领域

本发明属于益生菌发酵技术领域，具体涉及一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌植物乳杆菌HM-10(Lactobacillus plantarum HM-10)、干酪乳杆菌HM-09(Lactobacilluscasei HM-09)和地衣芽孢杆菌BL-09(Bacillus licheniformis BL-09)为菌种的混合固态发酵技术，此技术可广泛应用于动物微生态等方面。

背景技术

目前，益生菌制品多采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余则采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作繁琐。因此本申请采用植物乳杆菌HM-10、干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09混合固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，采用固态发酵，其生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作。采用植物乳杆菌HM-10、干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09进行混菌固态发酵，可生产出一种具有酸香气味的发酵制品，改善动物饲料的适口性。其蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，有利于动物肠胃消化吸收。

专利《一种有效预防及改善牛***炎的复合乳酸菌微生态制剂》，CN103202391A，公开了含有干酪乳杆菌HM-09、植物乳杆菌HM-10的复合微生态制剂。所述干酪乳杆菌和植物乳杆菌已于2012年10月29日在地址为北京市大屯路，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，干酪乳杆菌HM-09(L.casei HM-09)保藏号：CGMCC No.6736；植物乳杆菌HM-10（L.plantarum HM-10）保藏号：CGMCC No.6741。

发明内容

本发明目的在于提供一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，采用植物乳杆菌HM-10(Lactobacillus plantarum HM-10)、干酪乳杆菌HM-09（Lactobacillus casei HM-09）和地衣芽孢杆菌BL-09（Bacillus licheniformis BL-09）进行混合固态发酵，可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，此方法可以生产出具有特殊酸香味的发酵型饲料产品，且发酵产品的活菌数高，豆粕蛋白质的降解率高。此制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。

本发明目的是通过下述技术方案实现的。

一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，包括植物乳杆菌HM-10、干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09的培养及其混合固态发酵，得到益生菌的固态发酵产品。

所述混合固态发酵培养为：先分别以1-5%接种量（v/w）将植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09接种于固态发酵培养基，控温30-37℃，相对湿度50%-60%,发酵0-12h后以2-8%接种量（v/w）接入地衣芽孢杆菌BL-09进行混合固态发酵，其他条件不变，继续发酵24-36h。

固态发酵培养基组成包括豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。水份含量控制在40-75%。

在最佳控制条件下，固态发酵中同时接种1%（v/w）的植物乳杆菌HM-10和1%（v/w）的干酪乳杆菌HM-09，其他条件保持一致，混菌发酵12h后，再接种5%（v/w）的地衣芽孢杆菌BL-09，再继续混菌发酵36h。测定游离氨基态氮含量可达到1090.0μmol/g，较发酵前提高约11倍。地衣芽孢杆菌BL-09芽孢率较单独发酵提高约3倍。混合发酵的益生菌活菌数在10¹⁰cfu/g以上，其中植物乳杆菌HM-10活菌数达3.55×0⁹cfu/g、干酪乳杆菌HM-09活菌数达3.89×0⁹cfu/g、地衣芽孢杆菌BL-09活菌数达1.29×10¹⁰cfu/g。

所述植物乳杆菌HM-10、干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09在混合固态发酵前分别经过种子培养。种子培养基为(g/L)：蛋白胨10-20，葡萄糖10-20，其余为水，pH7.0-7.2。地衣芽孢杆菌BL-09的种子培养条件：摇床转速为150-180r/min，温度为34-37℃，培养20-24h。所述的植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09的种子培养条件，分别置于恒温培养箱静置培养，培养温度30-37℃，培养时间为20-24h。

所述地衣芽孢杆菌BL-09于2011年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5686，分类名：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

所述地衣芽孢杆菌BL-09是一株分离自内蒙古自治区呼和浩特市地区健康牛肠道样品中的芽孢杆菌，属于兼性厌氧的、革兰氏阳性芽孢杆菌。菌体呈棒杆状，偶尔见长杆状，芽孢中生，呈椭圆形。最适生长温度为37±1℃，最适生长pH为7.0-7.4，固态发酵烘干产物常温储存6个月，芽孢损失率低于5%.营养琼脂平板培养12h左右，菌落不规则、边缘不光滑，菌落中央具有明显的凸起峰；培养至24-36h，菌落褶皱明显且褶皱内物质呈液体状，接种环挑取具有拉丝情况，镜检芽孢基本脱落。经过伯杰氏细菌手册（第9版）及细菌、菌落形态确定为地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌BL-09。体外实验证实，该菌株具有良好的耐高温、耐酸、耐胆盐等生化特性，还能够高产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶类及氨基酸、维生素、抗菌物质等多种生理活性物质，发酵后的固态培养基粘度很大，拉丝严重，培养器皿底部可见少量液体物质，证明其固态发酵中的保湿能力相对较强。

耐酸试验：

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，150r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于pH分别为2.0、3.0及4.0的缓冲溶液中，37℃培养1-3h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐酸性。

耐热试验：

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，150r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，获得的菌体用适量无菌生理盐水稀释后于80℃水浴加热处理10min以获得芽孢，再分别于80℃、90℃和100℃下分别处理5-30min，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐热性。

耐胆盐试验：

地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，150r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于含胆盐浓度分别为0.03%、0.10%、0.30%的生理盐水中，37℃培养1-6h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐胆盐性。结果如下表所示。

本发明所述复合益生菌发酵产品可以应用于饲料添加剂等领域。

有益效果：

1.本发明中采用植物乳杆菌HM-10、干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09进行混合固态发酵豆粕，利用地衣芽孢杆菌BL-09菌株优势并探索优化的混合发酵条件，具有生产成本低、资金投入少、下游处理简便、污染小、设备结构简单易操作等优势；

2.采用植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09进行发酵，可以产生乳酸及乙酸等酸味小分子物质，这些小分子物质赋予产品特有的酸香味、色泽和口感等感官特征的改善和多样化，使发酵产品更容易为动物所消化吸收；在作用机理方面，地衣芽孢杆菌的芽孢能够在进入宿主肠道后能够迅速萌发、繁殖，消耗肠内氧气，抑制有害需要菌的生长，而保护、促进益生菌的生长，以维护肠道微生态平衡。干酪乳杆菌与植物乳杆菌能定殖于宿主肠道中并能利用乳糖产生乳酸，有效的缓解亚洲人的乳糖不耐受症状。产生的乳酸能调节肠道pH，杀死不耐酸性病原菌，且产生的过氧化氢、细菌素等，对其他病原或腐败微生物具有显著的抑制作用，而对益生菌无影响，从而维持肠道菌群平衡；能够诱导免疫球蛋白A的分泌，提高宿主的免疫功能，可通过对白介素的调节而缓解结肠炎的症状；干酪乳杆菌发酵乳产生的寡肽和小肽对血管紧张素具有抑制作用，进而起到降血压作用；经常服用干酪乳杆菌活菌制剂，能降低血液中的胆固醇。本发明获得的地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌复合益生菌制剂兼具有以上功能，具有良好的应用发展前景。

3.采用地衣芽孢杆菌BL-09发酵豆粕、麸皮和玉米粉，可以使豆粕和玉米粉中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于肠胃的消化吸收。地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐高温、耐酸、耐胆盐等生化特性和产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶类等特点，使本发明产品在饲料中添加使用时，此类产品用于奶牛饲喂时能有效提高饲料的利用效率20-25%。本发明产品在饲料中的添加量为20-40克/kg。本发明产品使用后奶牛的受胎率提高了10-12%，经计算能提高奶牛的年产奶量约300公斤以上。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。

实施例1：益生菌制剂的混合固态发酵

（1）菌体的种子液制备

地衣芽孢杆菌BL-09从冻藏的甘油管中接种到液体种子培养基中，放置于摇床上，转速为150-180r/min，温度为30-37℃，培养20-24h。植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09分别接种到液体种子培养基中，置于恒温培养箱静置培养，培养温度30-37℃，培养时间为20-24h。其中液体种子培养基质量百分比组成为（g/L）：蛋白胨10-20，葡萄糖10-20，其余为水，pH7.0-7.2。

（2）混合固态发酵

先分别以1%-5%接种量（v/w）将植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09接种于固态发酵培养基，控温30-37℃，相对湿度50%-60%；发酵0-12h后以2-8%接种量（v/w）接入地衣芽孢杆菌BL-09进行混合固态发酵，其他条件不变，继续发酵24-36h。

固态发酵培养基组成包括豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。水份含量控制在40-75%，115℃灭菌20min。

（3）测定活菌数

一般采用平板计数法，操作步骤为：称取制备好的豆粕发酵制品10g，置于90ml的无菌生理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1ml的菌液加进另一个9ml的无菌生理盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度1ml打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。

（4）氨基态氮含量的测定

取10g发酵后的产品，用匀浆器破碎，之后与90ml的蒸馏水混合，在4℃冰箱放置1天。样品离心7000r/min，离心15min。上清液0.8ml置于试管中，然后加3.2ml蒸馏水、2.0ml显色剂，混匀，放入沸水浴中加热15min，同时作空白对照。然后冷水冷却，加入5.0ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。

实施例2：植物乳杆菌HM-10接种量对活菌数的影响

植物乳杆菌HM-10接种到液体种子培养基中，置于恒温培养箱静置培养，培养温度37℃，培养时间为20h。其中液体种子培养基质量百分比组成为（g/L）：蛋白胨10，葡萄糖20，其余为水，pH7.0-7.2。

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:10:0.5。水份含量控制在60%，115℃灭菌20min。

固态培养基中分别接种1%（v/w）、3%（v/w）、5%（v/w）的植物乳杆菌HM-10，单菌发酵48h后测得发酵产物中植物乳杆菌HM-10活菌数分别为3.11×10⁹cfu/g、2.76×10⁹cfu/g、2.81×10⁹cfu/g。故而确定植物乳杆菌HM-10的最佳接种量为1%（v/w）。

实施例3：干酪乳杆菌HM-09接种量对活菌数的影响

植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09分别接种到液体种子培养基中，置于恒温培养箱静置培养，培养温度37℃，培养时间为20h。其中液体种子培养基质量百分比组成为（g/L）：蛋白胨10，葡萄糖20，其余为水，pH7.0-7.2。

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:10:1。水份含量控制在60%，115℃灭菌20min。

固态发酵中接种1%（v/w）的植物乳杆菌HM-10，同时分别接种1%（v/w）、3%（v/w）、5%（v/w）的干酪乳杆菌HM-09，其他条件保持一致，混菌发酵48h后测得混合发酵产物中干酪乳杆菌HM-09活菌数分别为3.51×10⁹cfu/g、2.96×10⁹cfu/g、3.01×10⁹cfu/g，同时植物乳杆菌HM-10的活菌数分别为3.06×10⁹cfu/g、2.63×10⁹cfu/g、2.47×10⁹cfu/g。

故而，干酪乳杆菌HM-09的最佳接种量为1%（v/w）。

实施例4：地衣芽孢杆菌BL-09接种量对活菌数的影响

地衣芽孢杆菌BL-09从冻藏的甘油管中接种到液体种子培养基中，放置于摇床上，转速为180r/min，温度为37℃，培养20h。植物乳杆菌HM-10和干酪乳杆菌HM-09分别接种到液体种子培养基中，置于恒温培养箱静置培养，培养温度37℃，培养时间为20h。其中液体种子培养基质量百分比组成为（g/L）：蛋白胨10，葡萄糖20，其余为水，pH7.0-7.2。

固态发酵中同时接种1%（v/w）的植物乳杆菌HM-10和1%（v/w）的干酪乳杆菌HM-09，其他条件保持一致，混菌发酵12h后，再分别接种2%（v/w）、5%（v/w）、8%（v/w）的地衣芽孢杆菌BL-09，再继续混菌发酵36h。

当地衣芽孢杆菌BL-09的接种量为2%（v/w），测得混合发酵产物中地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为9.91×10⁹cfu/g，植物乳杆菌HM-10活菌数为2.71×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为2.96×10⁹cfu/g，测定游离氨基态氮含量可达到973.5μmol/g。

当地衣芽孢杆菌BL-09的接种量为5.0%（v/w），测得混合发酵产物中地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.35×10¹⁰cfu/g，植物乳杆菌HM-10活菌数为3.31×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为3.51×10⁹cfu/g，测定游离氨基态氮含量可达到1090.0μmol/g。

当地衣芽孢杆菌BL-09的接种量为8.0%（v/w），测得混合发酵产物中地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为1.20×10¹⁰cfu/g，植物乳杆菌HM-10活菌数为2.91×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09，活菌数为3.01×10⁹cfu/g，测定游离氨基态氮含量可达到988.6μmol/g。

故而，确定地衣芽孢杆菌BL-09的最佳接种量为5.0%（v/w）。

实施例5：混合固态发酵时间对活菌数的影响

固态发酵培养基组成为豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:9:1。水份含量控制在55%，115℃灭菌20min。

固态发酵中同时接种1%（v/w）的植物乳杆菌HM-10、1%（v/w）的干酪乳杆菌HM-09，和5%（v/w）的地衣芽孢杆菌BL-09，混菌发酵48h。发酵结束测得混合发酵产物中地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为3.66×10⁹cfu/g，植物乳杆菌HM-10活菌数为2.57×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为2.13×10⁹cfu/g，测定游离氨基态氮含量可达到934.5μmol/g

固态发酵中同时接种1%（v/w）的植物乳杆菌HM-10和1%（v/w）的干酪乳杆菌HM-09，其他条件保持一致，混菌发酵12h后，再接种5%（v/w）的地衣芽孢杆菌BL-09，再继续混菌发酵24h。发酵结束测得混合发酵产物中地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为5.18×10⁹cfu/g，植物乳杆菌HM-10活菌数为2.74×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为2.25×10⁹cfu/g，测定游离氨基态氮含量可达到973.3μmol/g。

固态发酵中同时接种1%（v/w）的植物乳杆菌HM-10和1%（v/w）的干酪乳杆菌HM-09，其他条件保持一致，混菌发酵24h后，再接种5%（v/w）的地衣芽孢杆菌BL-09，再继续混菌发酵24h。发酵结束测得混合发酵产物中地衣芽孢杆菌BL-09活菌数为4.66×10⁹cfu/g，植物乳杆菌HM-10活菌数为3.89×10⁹cfu/g，干酪乳杆菌HM-09活菌数为4.19×10⁹cfu/g，测定游离氨基态氮含量可达到940.5μmol/g。

Claims

1.一种复合益生菌发酵制剂，由植物乳杆菌CGMCC No.6741、干酪乳杆菌CGMCC No.6736、地衣芽孢杆菌经混合固态发酵制得，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.5686；所述混合固态发酵包括：先分别以1-5%v/w接种量将植物乳杆菌和干酪乳杆菌接种于固态发酵培养基，控温30-37℃，相对湿度50%-60%，发酵0-12h后以2-8%v/w接种量接入地衣芽孢杆菌BL-09进行混合固态发酵，其他条件不变，继续发酵24-36h。

2.如权利要求1所述的复合益生菌发酵制剂，其特征在于，所述固态发酵培养基的组成包括豆粕、麸皮和玉米粉，所述豆粕、麸皮和玉米粉的质量比例为：豆粕、麸皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%。

3.如权利要求1或2所述的复合益生菌发酵制剂，其特征在于，所述复合益生菌发酵制剂中游离氨基态氮含量达到1090.0μmol/g，益生菌活菌数在10¹⁰cfu/g以上，其中植物乳杆菌活菌数达3.55×0⁹cfu/g、干酪乳杆菌活菌数达3.89×0⁹cfu/g、地衣芽孢杆菌活菌数达1.29×10¹⁰cfu/g。

4.如权利要求1或2所述的复合益生菌发酵制剂，其特征在于，所述植物乳杆菌、干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌在混合固态发酵前分别经过种子培养，种子培养基为：蛋白胨10-20g/L，葡萄糖10-20g/L，其余为水，pH7.0-7.2；地衣芽孢杆菌的种子培养条件：摇床转速为150-180r/min，温度为30-37℃，培养20-24h；植物乳杆菌和干酪乳杆菌的种子培养条件：分别置于恒温培养箱静置培养，培养温度30-37℃，培养时间为20-24h。

5.权利要求1-4任一所述的复合益生菌发酵制剂的固态发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：植物乳杆菌CGMCC No.6741、干酪乳杆菌CGMCC No.6736和地衣芽孢杆菌CGMCCNo.5686分别经过种子培养制备菌剂；混合固态发酵：先分别以1-5%v/w接种量将植物乳杆菌和干酪乳杆菌接种于固态发酵培养基，控温30-37℃，相对湿度50%-60%，发酵0-12h后以2-8%接种量接入地衣芽孢杆菌BL-09进行混合固态发酵，其他条件不变，继续发酵24-36h。

6.权利要求1-4任一所述的复合益生菌发酵制剂在饲料添加剂中的应用。