CN103948920A - 一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法 - Google Patents

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吴金
张中洋
任培森
李秋菊
姜翠翠
高玉龙
许明会
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Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：对猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；然后在处理后的猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；制备疫苗稳定剂，然后按照细胞毒液与疫苗稳定剂7:1的比例进行定量分装，每头份病毒含量不低于106TCID50，分装后迅速进行冷冻真空干燥，得到猪伪狂犬病活疫苗。用细胞系代替鸡胚成纤维细胞生产猪伪狂犬病活疫苗，可以从源头控制外源污染，保证了生产猪伪狂犬病活疫苗的安全性，实现了制备出的猪伪狂犬病活疫苗质量均一、成本低廉，且疫苗安全性好、免疫效力高。

Description

一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法。
背景技术
目前我国生产猪伪狂犬病活疫苗主要用鸡胚成纤维细胞生产，此方法成本高，毒价低、劳动强度大。同时因各个转瓶都是独立单元，每瓶的细胞质量、病毒滴度均不相同，致使生产出的疫苗质量不稳定、批量差异大。因此，现有技术还有待于更进一步的改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，以实现制备出的猪伪狂犬病活疫苗质量均一、成本低廉，且疫苗安全性好、免疫效力高。
本发明的技术方案如下：
一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
A、对猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；
B、然后在步骤A处理后的猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；
C、制备疫苗稳定剂，然后按照细胞毒液与疫苗稳定剂7:1的比例进行定量分装，每头份病毒含量不低于106TCID50，分装后迅速进行冷冻真空干燥，得到猪伪狂犬病活疫苗。
所述的制备方法，其中，所述步骤A具体的包括：先用方瓶培养从液氮中复苏的猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系，待其长成单层后经胰酶消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成单层的细胞继续传代培养或接种病毒。
所述的制备方法，其中，所述步骤B具体的包括：取形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪伪狂犬病毒的细胞维持液，继续培养；当病变细胞达到75％以上时，获得猪伪狂犬病毒种。
所述的制备方法，其中，所述步骤B具体的还包括：取形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪伪狂犬病毒的维持液，继续培养；当CPE达到75％以上时，获得猪伪狂犬病毒液，将收获的获得猪伪狂犬病毒种置-20℃以下保存。
所述的制备方法，其中，所述步骤B具体的还包括：病毒的接种量为含0.5-1％的生产用细胞毒。
所述的制备方法，其中，细胞生长液的配方是：92％-95％的MEM液与5％-8％的犊牛血清，Ph值调整为7.2-7.4。
所述的制备方法，其中，细胞维持液的配方是：97％-98％的MEM液与2％-3％的犊牛血清，Ph值调整为7.3-7.5。
本发明提供的一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，采用复苏、传代、培养、毒种繁殖、毒液繁殖与灭活分装的步骤，用细胞系代替鸡胚成纤维细胞生产猪伪狂犬病活疫苗，可以从源头控制外源污染，保证了生产猪伪狂犬病活疫苗的安全性，使其抗原滴度高，大幅度提高了疫苗的免疫能力，可达到100％的保护，并且本发明操作简单、工艺稳定、病毒含量高、质量易控等优点，可显著提高疫苗产量和质量，利用本发明生产的猪伪狂犬病活疫苗安全性好、免疫效力高，而且原料成本低，适合规模化生产，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
本发明提供了一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
步骤101：对猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；
步骤102：然后在步骤101处理后的猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；
步骤103：制备疫苗稳定剂，然后按照细胞毒液与疫苗稳定剂7:1的比例进行定量分装，每头份病毒含量不低于106TCID50，分装后迅速进行冷冻真空干燥，得到猪伪狂犬病活疫苗。
更进一步的，所述步骤101具体的包括：先用方瓶培养从液氮中复苏的猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系，待其长成单层后经胰酶消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成单层的细胞继续传代培养或接种病毒。
在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤102具体的包括：取形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪伪狂犬病毒的细胞维持液，继续培养；当病变细胞达到75％以上时，获得猪伪狂犬病毒种。而且还取形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪伪狂犬病毒的维持液，继续培养；当CPE达到75％以上时，获得猪伪狂犬病毒液，将收获的获得猪伪狂犬病毒种置-20℃以下保存。
更进一步的，所述步骤102具体的还包括：病毒的接种量为含0.5-1％的生产用细胞毒。细胞生长液的配方是：92％-95％的MEM液与5％-8％的犊牛血清，Ph值调整为7.2-7.4。细胞维持液的配方是：97％-98％的MEM液与2％-3％的犊牛血清，Ph值调整为7.3-7.5。
为了更进一步描述本发明，以下列举更详尽的实施例进行说明。
实施例1
(1)选择猪睾丸细胞系(ST)作为制苗用细胞；
(2)制苗用细胞的传代与培养：先用方瓶培养从液氮中复苏的猪睾丸细胞系(ST)，待其长成单层后经胰酶分散液消化传代，加入细胞生长液于37℃条件下继续培养，形成单层的细胞继续传代培养或接种病毒；
(3)细胞毒种的繁殖：取形成良好单层的猪睾丸细胞系(ST)培养瓶，弃去细胞生长液，接种含1％猪伪狂犬病毒的细胞维持液，37℃条件下继续培养；当病变细胞(CPE)达到75％以上时即可收获毒液，作为生产用毒种；对猪安全无副作用，细胞毒种每毫升含量大于等于107TCID50。
(4)制苗毒液的繁殖：取形成良好单层的猪睾丸细胞系(ST)培养瓶，弃去细胞生长液，接种含1％生产用细胞毒种的维持液，在37℃条件下继续培养；当CPE达到75％以上时即可收获毒液，将收获的毒液置-20℃以下保存；
(5)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合均匀，按细胞毒液7份加入稳定剂1份，同时按每毫升毒液加入青霉素500单位、链霉素500单位，充分摇匀，充分摇匀，定量分装，每头份病毒含量不低于106TCID50，分装后迅速进行冷冻真空干燥，即得猪伪狂犬病活疫苗。
上述细胞生长液的配方是：92％的MEM液与8％的犊牛血清，Ph值调整为7.2。上述细胞维持液的配方是：97％的MEM液与3％的犊牛血清，Ph值调整为7.4。
实施例2
(1)选择仓鼠肾细胞系作为制苗用细胞；
(2)制苗用细胞的传代与培养：先用方瓶培养从液氮中复苏的仓鼠肾细胞系，待其长成单层后经胰酶分散液消化传代，加入细胞生长液于36.5℃条件下继续培养，形成单层的细胞继续传代培养或接种病毒；
(3)细胞毒种的繁殖：取形成良好单层的仓鼠肾细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含0.5％猪伪狂犬病毒的细胞维持液，36.5℃条件下继续培养；当病变细胞(CPE)达到75％以上时即可收获毒液，作为生产用毒种；对猪安全无副作用，细胞毒种每毫升含量大于等于107TCID50。
(4)制苗毒液的繁殖：取形成良好单层的仓鼠肾细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含0.5％生产用细胞毒种的维持液，在36.5℃条件下继续培养；当CPE达到75％以上时即可收获毒液，将收获的毒液置-20℃以下保存；
(5)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合均匀，按细胞毒液7份加入稳定剂1份，同时按每毫升毒液加入青霉素500单位、链霉素500单位，充分摇匀，充分摇匀，定量分装，每头份病毒含量不低于106TCID50，分装后迅速进行冷冻真空干燥，即得猪伪狂犬病活疫苗。
上述细胞生长液的配方是：95％的MEM液与5％的犊牛血清，Ph值调整为7.2。上述细胞维持液的配方是：98％的MEM液与2％的犊牛血清，Ph值调整为7.4。
采用3批本发明制备的猪伪狂犬病活疫苗与3批鸡胚成纤维细胞生产的猪伪狂犬病活疫苗，分别肌肉注射到6个月龄-18个月龄的羊体内，持续观察14日，其结果如表1所示。
表1
将本发明制备的猪伪狂犬病活疫苗与鸡胚成纤维细胞生产的猪伪狂犬病活疫苗用PBS做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6与10-7四个滴度，每个滴度接种相应的细胞6孔，每孔0.1ml，补充细胞维持液0.9ml，使之总量为1ml，观察并记录细胞病变情况，计算TCID50如表2所示的，
表2
将本发明制备的猪伪狂犬病活疫苗与鸡胚成纤维细胞生产的猪伪狂犬病活疫苗用PBS稀释为每毫升0.02头份(猪睾丸细胞系)，稀释每毫升0.2头份(鸡胚成纤维细胞)，肌肉注射12月龄无伪狂犬病毒中和抗体的绵羊4只，每只1ml，同时留3只绵羊观察不接种对照，14日后连同条件相同的对照绵羊，每只肌肉注射强毒1ml(含103TCID50)，再连续观察14日，其结果如表3所示的。
表3
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
A、对猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；
B、然后在步骤A处理后的猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；
C、制备疫苗稳定剂，然后按照细胞毒液与疫苗稳定剂7:1的比例进行定量分装，每头份病毒含量不低于106TCID50，分装后迅速进行冷冻真空干燥，得到猪伪狂犬病活疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A具体的包括：先用方瓶培养从液氮中复苏的猪睾丸细胞系或仓鼠肾细胞系，待其长成单层后经胰酶消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成单层的细胞继续传代培养或接种病毒。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体的包括：取形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪伪狂犬病毒的细胞维持液，继续培养；当病变细胞达到75％以上时，获得猪伪狂犬病毒种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体的还包括：取形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪伪狂犬病毒的维持液，继续培养；当CPE达到75％以上时，获得猪伪狂犬病毒液，将收获的获得猪伪狂犬病毒种置-20℃以下保存。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体的还包括：病毒的接种量为含0.5-1％的生产用细胞毒。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，细胞生长液的配方是：92％-95％的MEM液与5％-8％的犊牛血清，Ph值调整为7.2-7.4。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，细胞维持液的配方是：97％-98％的MEM液与2％-3％的犊牛血清，Ph值调整为7.3-7.5。
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