CN103948915A - 一种能够提高稳定性和口服疗效的用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能够提高稳定性和口服疗效的用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物,其特征在于,含有纳豆激酶和磷脂酰丝氨酸。所述纳豆激酶与磷脂酰丝氨酸的重量比为100∶1-100∶1000,优选100∶1-100∶100.进一步优选100∶3-100∶30。
Description
技术领域:本发明涉及一种高效吸收的纳豆激酶制品,尤其涉及一种用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物及其制造方法。
背景技术:
纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白激酶,是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacil lus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶,具有溶解血栓,降低血粘度,改善血液循环,软化和增加血管弹性等作用。
20世纪80年代,在美国从事血栓研究的Hiroyuki Sumi(须见洋行)在各种天然产物中寻找抗血栓新物质时发现,纳豆粘性物质的提取物具有极强的溶解人工血栓能力,并从中分离出此种物质为丝氨酸蛋白酶,即纳豆激酶(Nattokinase,NK)(Sumi,H.,et al.,A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese Natto;a typical and popular soybean food in the Japanese diet.Cellular and Molecular Life Sciences,1987.43(10):p.1110-1111.)。1995年,Fujita等报道了NK对大鼠颈动脉血管内皮细胞损伤所形成血栓的溶解作用,使动脉血流恢复率高达62.0%,而纤溶酶只有15.8%,弹性蛋白酶没有任何恢复(Fujita,M.,et al.,Thrombolyt ic effect of nattokinase on a chemically indueed thrombosis model in rat.Biological&pharmaceutical bulletin,1995.18(10):p.1387.)。段智变等发现,颈动脉血栓模型家兔中,十二指肠内注射NK高剂量(4500IU·kg-1)、低剂量(2500IU·kg-1)和生理盐水,给药后1-1.5h内,相比于生理盐水组,NK高剂量组的凝血时间、凝血酶原时间、凝血酶时间与活化的部分凝血活酶时间均显著延长,而低剂量组只有凝血酶时间显著延长;给药后2h,NK高剂量组的优球蛋白溶解时间和纤维蛋白原含量显著降低,纤维蛋白降解产物含量明显增高(段智变,江汉湖,等.纳豆激酶粗制液对家兔溶血栓作用及其机制研究.营养学报,2003.25(001):p.46-51.)。在 人体口服NK试验中发现,使用者优球蛋白的纤溶活性提高,在第4天达到最高值,并维持到第8天(Kumada,K.,T.Onga,and H.Hoshino,The effect of natto possessing a high fibrinolytic activity in human plasma.Igaku ta Seibutsugaku,1994.128(3):p.117-119.)。最近,Kim等报道20-80岁高血压患者口服NK胶囊(2000FU/天)8周后,舒张压和收缩压均较对照组(服用安慰剂)明显降低(Kim,J.Y.,et al.,Effects of nattokinase on blood pressure:a randomized,controlled trial.Hypertension research,2008.31(8):1583-1588.)。
经过20余年的研究发现,NK具有多种药理作用,可以将其作为一种预防和治疗冠心病、心绞痛、脑中风、老年痴呆和关节炎等疾病,因此产生了许多专利,如预防老年性痴呆的专利(NATTOK INASE FOR DEGRADING AND REDUCING AMYLOID FIBRILS-ASSOCIATED WITH ALZHEIMER’S DISEASE,PRION DISEASES AND OTHER AMYLOIDOSES US8,137,666B2)、降低病人全血粘度的专利(Nattokinase for reducing whole blood viscosity,WO2007002572A3)、抑制血小板聚集专利(JP2003357848,US20040043015Process for inhibiting platelet aggregation)、关节炎等等(Anti-inflammatory agent US8,017,162)、US7,951,844Tranquilizer镇定剂and functional food;有专利申请(纳豆激酶在制备脑保护剂类药物中的用途CN101601859B);将NK与其它酶类物质组合治疗眼病(老年性黄斑变性、缺血性增值性视网膜病)(眼病的治疗CN101505790A;WO2006025276)还有降低血糖和血液总胆固醇和甘油三酯等方面的用途(JP2004115434)和中枢神经***保护剂(CN101601859B)
一般而言,蛋白质/多肽类药物直接口服,容易被胃酸/胃肠道蛋白酶破坏而失去生物学活性。蛋白质/多肽类药物口服吸收需要克服三大屏障:酶/酸的降解、黏液层的扩散屏障以及粘膜的吸收屏障。纳豆激酶口服给药存在同样问题,在pH<5的情况下,活性逐渐丧失,暴露在胃酸(pH1.23)的环境下1h,几乎完全失活。虽有文章报道通过聚谷氨酸微胶囊技术包裹纳豆激酶,但未解决胃酸失活的问题(Hsieh,CW,Lu WC,Hsieh,WC,Huang YP,Lai CH,Ko WC.Improvement of the stability of nattokinase using[gamma]-polyglutamic acid as a coating material for microencapsulation.LWT-Food Science and Technology,2009,42:144-149)。有文献报道,通过甲基丙烯酸甲基丙烯酸甲酯聚合物包衣技术制备纳豆激酶肠溶片剂,解决了纳豆激酶片剂胃酸失活的问题(Law D,Zhang Z.Stabilization and target delivery of nattokinase using compression coating.Drug Dev Ind Pharm,2007,33:495-503)。也有专利将NK制备成微囊(纳豆激酶纯化工艺及微囊制剂工艺CN1309826C;纳豆激酶纯化工艺及微囊制剂工艺CN100500839C),或者加入纤维素酸酯类、丙烯酸树脂类、聚乙烯醇酞酸酯、甲基丙烯酸共聚物、虫胶和玉米朊等肠溶材料保护NK(一种纳豆激酶组合物及其制备方法CN101862447A;一种纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法CN103238829A);或者制备环糊精包合物(张云峰,纳豆激酶羟丙基-β-环糊精包合物的制备和鉴定.广东化工,2011.38(001):p.10-10.张云峰,等.专利.CN201010287914.2一种制备纳豆激酶环糊精包合物的方法CN102406942A);制备脂质体(张霞,尹宗宁,王怡鑫,纳豆激酶脂质体的制备及其体外释放.中国药学杂志,2007.42(4):p.279-282.);制备分别选取了两种肠溶体系(海藻酸钙胶囊和以CAP为包衣的肠溶微丸体系)来制备纳豆激酶肠溶制剂,均未达到理想效果。
发明内容:
针对上述技术问题,本发明的发明人通过潜心研究发现,若将磷脂酰丝氨酸(PS)与不同来源的纳豆激酶NK(不同微生物、重组蛋白)组合使用时,能够解决纳豆激酶因口服而容易被胃酸/胃肠道蛋白酶破坏而失去生物学活性的技术问题。此外,本发明针对性解决不同来源的NK(不同微生物、重组蛋白)普遍存在的问题即口服吸收、热/pH酸/酶的稳定性低。
本申请人惊奇地首次发现,虽然磷脂酰丝氨酸本身没有抗血栓的效果,但是磷脂酰丝氨酸能够增加纳豆激酶在胃酸中的稳定性。解决了纳豆激酶因口服而容易被胃酸/胃肠道蛋白酶破坏而失去生物学活性的技术问题,从而增加了纳豆激酶的抗血栓效果。
另外,还令人惊奇地发现,通过进一步与金属离子、分散剂、抗氧化剂、多聚阳离子物质、琥珀酸酯(TPGS)类、低聚糖等等组合后,口服吸收 效果进一步提高,并且耐酸、耐热。作为药物剂型可以实现喷雾干燥、粉末包衣和超临界包衣等。
本发明的目的在于提供一种能够增加口服药效的用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物,其特征在于,含有纳豆激酶和磷脂酰丝氨酸。作为添加成分还可以进一步含有选自抗氧化剂、金属离子化合物、分散剂、多聚阳离子化合物和多元醇中的至少一种。
另外,本发明的目的还在于提供一种纳豆激酶组合物的制备方法,其特征在于,其至少包括如下工序:
使纳豆激酶溶解或分散于溶剂中制备纳豆激酶溶液的工序;
使磷脂酰丝氨酸溶解或分散于有机溶剂中制备磷脂酰丝氨酸溶液的工序;以及使所述纳豆激酶溶液与磷脂酰丝氨酸溶液混合的工序。
最后,本发明的目的还在于提供一种用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物,其特征在于,包括纳豆激酶制剂和磷脂酰丝氨酸制剂,所述纳豆激酶制剂和/或磷脂酰丝氨酸制剂中还可以进一步含有选自抗氧化剂、金属离子化合物、分散剂、多聚阳离子化合物和多元醇中的至少一种。
通过本发明的上述技术方案,与现有技术的纳豆激酶制剂相比,能够显著提高纳豆激酶的口服吸收和稳定性,同时能够提高纳豆激酶的口服药效。本发明涉及一种用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物,其特征在于,含有纳豆激酶和纳豆激酶吸收促进剂,所述纳豆激酶吸收促进剂为磷脂酰丝氨酸。
本发明提供如下技术方案:
1.一种用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物,其特征在于,含有纳豆激酶和纳豆激酶吸收促进剂,所述纳豆激酶吸收促进剂为磷脂酰丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,还进一步含有抗氧剂和/或金属离子化合物。
3.根据权利要求1或2所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,还进一步含有选自分散剂、多聚阳离子化合物和多元醇中至少一种。
4.根据权利要求1中任一项所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,所述纳豆激酶与磷脂酰丝氨酸的重量比为100∶1-100∶1000,优选100∶1-100∶ 100.进一步优选100∶3-100∶30。
5.根据权利要求2所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,所述抗氧剂选自亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、二硫代氨基甲酸盐、胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、硫辛酸、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、氢基香豆素、生育酚、没食子酸丙酯、叔丁基对羟基茴香醚、二叔丁基对甲酚、去甲二氢愈创木酸、氮气、氦气;所述金属离子化合物选自一价至六价离子化合物。
6.根据权利要求6所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,所述金属离子化合物选自一价、二价和三价的金属阳离子,更优选银离子、钙离子、锌离子、镁离子、硒离子、铁离子化合物,最优选化合物包括氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、柠檬酸钙、谷氨酸钙、氨基酸螯合钙、葡萄糖酸钙、果糖酸钙、抗坏血酸钙、氯化锌、碳酸锌、磷酸锌、磷酸氢锌、柠檬酸锌、谷氨酸锌、氨基酸螯合锌、葡萄糖酸锌、果糖酸锌、抗坏血酸锌、氯化镁、硫酸镁、有机硒盐、无机硒盐、氯化铜、硫酸铜、氯化铁、硫酸亚铁、富马酸亚铁、琥珀酸亚铁、枸橼酸铁铵、蔗糖铁,***钠。
7.根据权利要求2所述的纳豆激酶组合物,所述磷脂酰丝氨酸与金属离子化合物的质量比为100∶0-100∶1000。
8.根据权利要求3-8中的任一项所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,所述分散剂选自维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、泊洛沙姆类、乳清蛋白;所述多聚阳离子化合物选自聚赖氨酸、聚精氨酸,所述多元醇选自甘露醇、山梨醇、右旋糖酐、木糖醇、蔗糖、葡萄糖、低聚糖、海藻糖、寡聚糖、壳多糖。
9.根据权利要求3所述的纳豆激酶组合物,所述磷脂酰丝氨酸与分散剂的质量比为100∶0-100∶100。
10.根据权利要求2中所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,所述抗氧剂的用量占整个组合物的0.0-0.1w/w%。
11.一种制剂,其含有权利要求1-11任一项所述的纳豆激酶组合物,所述制剂为药物制剂、保健品、功能食品、功能饮料或食品添加剂。
12.权利要求1-11中任一项所述的纳豆激酶组合物的制备方法,其特征在于,其至少包括如下工序:
使纳豆激酶溶解或分散于溶剂中制备纳豆激酶溶液或分散液的工序;
使磷脂酰丝氨酸溶解或分散于有机溶剂中制备磷脂酰丝氨酸溶液或分散液的工序;使所述纳豆激酶溶液与磷脂酰丝氨酸溶液混合的工序、以及冷冻干燥的工序。
13.一种用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶的纳豆激酶组合物,其特征在于,包括纳豆激酶制剂与纳豆激酶吸收促进剂,所述纳豆激酶吸收促进剂为磷脂酰丝氨酸制剂。
14.根据权利要求14所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,所述纳豆激酶制剂和/或磷脂酰丝氨酸制剂中还进一步含有选自抗氧剂、金属离子化合物、分散剂、多聚阳离子化合物和多元醇中至少一种。
15.一种纳豆激酶吸收促进剂在制备纳豆激酶抗血栓增效剂中的应用,所述纳豆激酶吸收促进剂为磷脂酰丝氨酸。
16.磷脂酰丝氨酸作为纳豆激酶吸收促进剂的应用。
通过本发明的上述技术方案,与现有技术的纳豆激酶制剂相比,能够显著提高纳豆激酶的口服吸收和稳定性,同时能够提高纳豆激酶的口服药效。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细说明。
(1)磷脂酰丝氨酸(PS)
作为本发明中使用的磷脂酰丝氨酸(PS)按照来源不同,磷脂酰丝氨酸实际上是一类化合物的总称,包括各种不同脂肪羧酸链的PS。具体可以分为天然PS、半合成PS、全合成PS。天然PS例如可以举出大豆PS、和脑PS。半合成来源的PS是指在天然来源的PS基础上进行“氢化”而获得的PS。全合成PS是通过人工合成手段得到。所述合成磷脂酰丝氨酸可以为例如二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)及其盐、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸等。
本发明的磷脂酰丝氨酸(PS)与纳豆激酶的配合量,按照重量比计,优选纳豆激酶/磷脂酰丝氨酸的重量比为100∶1-100∶1000,优选100∶1-100∶100.进一步优选100∶3-100∶30。
所述的纳豆激酶与磷脂酰丝氨酸的重量比是以磷脂酰丝氨酸的实际 含量计算获得的。在实际应用过程中,为了商业化使用,可以采用市售的磷脂酰丝氨酸产品,其可以是具有一定含量的磷脂酰丝氨酸的商业化产品。
(2)抗氧剂
本发明的发明人发现通过在本发明的组合物中添加抗氧剂,能够进一步提高其稳定性,从而提高口服药效,推断可能是由于抗氧剂提高了该组合物的物理化学稳定性的缘故。
作为本发明中使用的抗氧剂,可以使用通常用于药物制剂中的抗氧剂。但是从提高本发明的口服药效及稳定性考虑,优选亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、二硫代氨基甲酸盐、胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、硫辛酸、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、氢基香豆素、生育酚、没食子酸丙酯、叔丁基对羟基茴香醚、二叔丁基对甲酚、去甲二氢愈创木酸、氮气、氦气等。
所述抗氧剂的使用量,优选占整个组合物的0.0-0.1w/w%,进一步优选0.01-0.08w/w%,进一步优选0.03-0.06w/w%,最优选0.04-0.06w/w%。
(3)金属离子化合物
本发明的发明人还发现若在本发明的纳豆激酶组合物中进一步添加金属离子化合物,能够进一步提高口服药物的稳定性和药物疗效。
作为用于本发明的金属离子化合物,可以举出一价、二价和三价的金属阳离子,从提高稳定性和药物疗效出发,优选银离子、钙离子、锌离子、镁离子、硒离子、铁离子化合物,最优选化合物包括氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、柠檬酸钙、谷氨酸钙、氨基酸螯合钙、葡萄糖酸钙、果糖酸钙、抗坏血酸钙、氯化锌、碳酸锌、磷酸锌、磷酸氢锌、柠檬酸锌、谷氨酸锌、氨基酸螯合锌、葡萄糖酸锌、果糖酸锌、抗坏血酸锌、氯化镁、硫酸镁、有机硒盐、无机硒盐、氯化铜、硫酸铜、氯化铁、硫酸亚铁、富马酸亚铁、琥珀酸亚铁、枸橼酸铁铵、蔗糖铁,***钠等。
磷脂酰丝氨酸与金属离子化合物的质量比范围为100∶0-100∶1000,优选100∶0.1-100∶100,更有选100∶0.5-100∶50,更有选100∶0.5-100∶10。
(4)分散剂
若在本发明的纳豆激酶组合物中添加分散剂,能够进一步提高口服药物的稳定性和药物疗效。
所述分散剂可以使用药物制剂中通常使用的分散剂,但是从提高本发明的稳定性和疗效来看,优选维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、泊洛沙姆类;所述多聚阳离子化合物选自聚赖氨酸、聚精氨酸,所述多元醇选自甘露醇、山梨醇、右旋糖酐、木糖醇、蔗糖、葡萄糖、低聚糖、海藻糖、寡聚糖、壳多糖、乳清蛋白等。
磷脂酰丝氨酸与分散剂的质量比范围为100∶0-100∶100,优选100∶1-100∶50。
(5)其他添加剂
作为能够用于本发明的纳豆激酶组合物中的添加剂,除了上述所述的添加剂之外,在不影响本发明的药物活性及稳定性的前提下,还可以使用本领域常规的其它添加剂。
从提高本发明纳豆激酶组合物的口服药效及稳定性的观点考虑,可以举出多聚阳离子化合物、多元醇、GABA、红曲等。
作为多聚阳离子化合物,优选聚赖氨酸、聚精氨酸,其使用量为纳豆激酶与多聚阳离子化合物的质量比范围为100∶0-100∶1000
作为多元醇,优选为甘露醇、山梨醇、右旋糖酐、木糖醇、蔗糖、葡萄糖、低聚糖、海藻糖、寡聚糖、壳多糖、乳清蛋白、其使用量纳豆激酶与多元醇的质量比范围为100∶0-100∶10000。
为了提高NK的生物利用度,特别是减少NK在胃肠道中所受影响的因素,减少个体差异,确保疗效。
(6)本发明所述的纳豆激酶组合物的制备方法
将PS和脂溶性抗氧化剂用有机溶媒溶液/或者分散在水中,加入NK水溶液(水溶性抗氧化剂),搅拌混合,加入金属盐、分散剂(必要时含 有甘露糖醇、木糖醇、山梨醇、蔗糖),混合均匀,均质机分散,冷冻干燥/喷雾干燥。
然后,将所得到物料可以直接制成制剂(装入胶囊、压制片剂、肠溶包衣片剂等),也可以通过粉末包衣,制备各种pH响应性包衣颗粒(如胃溶型、小肠溶解型、结肠溶解型),再制备成颗粒剂、胶囊剂、片剂等。
所述有机溶媒可以为叔丁醇、乙醇、氯仿、***和异丙醚等。
另外,如上所述,本发明目的还在于提供一种用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物,其中所述的纳豆激酶制剂和磷脂酰丝氨酸制剂,可以根据上述的制备方法分别制备,然后再服用时进行混合即可。
需要说明的是,本发明所述的比例或含量除特殊说明外均以质量为基准。
与现有技术相比,按照本发明所述的处方和工艺将纳豆激酶与磷脂酰丝氨酸、金属盐、抗氧化剂与分散剂组合在一起(按照本发明所述的处方和工艺将纳豆激酶与磷脂酰丝氨酸组合在一起,或者将纳豆激酶与磷脂酰丝氨酸、金属盐、抗氧化剂、分散剂及多聚阳离子等组合在一起),可明显提高NK的口服吸收和稳定性,同时提高了纳豆激酶的口服药效。
实施例
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但这些实施例不能被理解为限制了本发明的范围。
实施例中所用各成分的简称如下:
纳豆激酶NK
市售磷脂酰丝氨酸PS
市售二油酰磷脂酰丝氨酸DOPS
市售二油酰磷脂酰胆碱DOPC
聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯TPGS
在本发明中,所有的设备或原料等均可从市场获得或是本行业常用的,实施例中采用的用量为按照市售产品的实际标示含量折算获得的。
实施例1NK与DOPS/DOPC组合物的比较
按照比例(NK-PS;NK-PC比例100∶10,w/w)将NK水溶液加入至PS或者PC叔丁醇水分散体系中,搅拌混匀,冷冻干燥。将所得冷冻干燥产物装入大鼠专用肠溶小胶囊,得到试验制剂。
将30只wistar大鼠随机分成5组,每组6只,各组分别为:
1、空白组(Control),灌服与给药组数目相同的空胶囊。
2、NK-PS胶囊低剂量组(NK-PS-L),给药剂量为10kIU·kg-1。
3、NK-PS胶囊高剂量组(NK-PS-H),给药剂量为20kIU·kg-1。
4、NK-PC胶囊低剂量组(NK-PC-L),给药剂量为10kIU·kg-1。
5、NK-PC高剂量组(NK-PC-H),给药剂量为20kIU·kg-1。
6、单独PS组,剂量相当于NK-PS组中的PS量。
7、单独NK组,剂量相当于NK-PS高剂量组中的NK量。
每日给药1次,连续7日。给药后第8天,将大鼠以3.5%水合氯醛进行腹腔麻醉(1ml/100g),手术分离双侧颈总动脉。在双侧颈总动脉下各垫一条1.2cm×3.0cm的塑料薄片,用浸渍有50μl FeCl3溶液(10%,w/w)的滤纸条(1.0cm×1.5cm)覆盖双侧颈总动脉。20min后取下滤纸条,剪下变色区域并用生理盐水洗净,滤纸吸干水分后测量其长度,并用分析天平精密称重。
单位长度血栓的重量记为相对栓重(mg/cm),并以下述公式计算抗栓率(%)。
抗栓率%=(W对照-W给药)/W对照×100%
W对照-对照组平均相对栓重;W给药-给药组平均相对栓重。
按上式计算抗栓率,并对结果进行统计学分析,结果见表1。
表1不同给药组抗栓率结果
结果表明,与对照组、PS组、NK组相比,各种NK制剂均有显著的抗栓效果(P<0.05)。NK-PS组的抗栓效果均显著强于NK-PC(P<0.05。
由此可知,提高吸收的物质是PS而非PC,即PS能够显著性增加NK的吸收量。
实施例2市售PS不同纯度的比较
由于DOPS价格昂贵(10mg的售价为52美元),严重阻碍了产品市场化,因此比较市售20%、40%、60%含量的PS增加NK吸收的效果。按照比例(NK-PS或NK-PC比例为100∶10,W/w)将NK水溶液加入至PS或者PC叔丁醇水分散体系,搅拌混匀,冷冻干燥。将所得冷冻干燥产物装入大鼠专用肠溶小胶囊,得到试验制剂。
将30只wistar大鼠随机分成5组,每组6只,各组分别为:
1、空白组(Control),灌服与给药组数目相同的空胶囊。
2、NK-PC胶囊组(NK-PC),给药剂量为10kIU·kg-1。
3、NK-PS(20%)胶囊组(NK-PS-20),给药剂量为10kIU·kg-1。
4、NK-PS(40%)胶囊组(NK-PC-40),给药剂量为10kIU·kg-1。
5、NK-PS(60%)胶囊组(NK-PC-60),给药剂量为10kIU·kg-1。
每日给药1次,连续7日。给药后第8天,将大鼠以3.5%水合氯醛进行腹腔麻醉(1ml/100g),手术分离双侧颈总动脉。在双侧颈总动脉下各垫一条1.2cm×3.0cm的塑料薄片,用浸渍有50μl FeCl3溶液(10%,w/w)的滤纸条(1.0cm×1.5cm)覆盖双侧颈总动脉。20min后取下滤纸条,剪下变色区域并用生理盐水洗净,滤纸吸干水分后测量其长度,并用分析天平精密称重。
单位长度血栓的重量记为相对栓重(mg/cm),并以下述公式计算抗栓率(%)。
抗栓率%=(W对照-W给药)/W对照×100%
W对照-对照组平均相对栓重;W给药-给药组平均相对栓重。
按上式计算抗栓率,并对结果进行统计学分析,结果见表2。
表2不同给药组抗栓率结果
结果表明,与空白组相比,各种NK制剂均有显著的抗栓效果(P<0.05),NK-PS组的抗栓效果均显著强于NK-PC(P<0.05)
实施例3不同比例范围
采用市售60%PS,考察不同比例,按照比例100∶1-100∶1000(NK-PS;NK-PC比例100∶10,w/w)将NK水溶液加入至PS或者PC叔丁醇水分散体系中,搅拌混匀,冷冻干燥。将所得冷冻干燥产物装入大鼠专用肠溶小胶囊,得到试验制剂。
将60只wistar大鼠随机分成12组,每组5只。
每日给药1次,连续7日。给药后第8天,将大鼠以3.5%水合氯醛进行腹腔麻醉(1ml/100g),手术分离双侧颈总动脉。在双侧颈总动脉下各垫一条1.2cm×3.0cm的塑料薄片,用浸渍有50μl FeCl3溶液(10%,w/w)的滤纸条(1.0cm×1.5cm)覆盖双侧颈总动脉。20min后取下滤纸条,剪下变色区域并用生理盐水洗净,滤纸吸干水分后测量其长度,并用分析天平精密称重。
单位长度血栓的重量记为相对栓重(mg/cm),并以下述公式计算抗栓率(%)。
抗栓率%=(W对照-W给药)/W对照×100%
W对照-对照组平均相对栓重;W给药-给药组平均相对栓重。
按上式计算抗栓率,并对结果进行统计学分析,结果见表3。
备注:NK-PS(100/0)组即为NK-PC(100/10)
表3不同给药组抗栓率结果
结果表明,与NK-PS(100/0)相比,各种NK制剂均有显著的抗栓效果NK-PS组的抗栓效果均显著强于(P<0.05)。而且,当纳豆激酶:磷脂酰丝氨酸比例为100∶3时,抗栓率由29.52%升高到51.71%,显著增加NK的吸收;当NK与PS的比例达到100∶30时,抗栓率为60.41%,接近最高值。当NK与PS比例为100∶1000时,抗栓率降为51.02%。
实施例4金属离子对吸收的影响
取DOPS氯仿溶液置于烧瓶中,旋转除去氯仿,制备DOPS磷脂膜。取NK水溶液,按照NK∶DOPS为100∶10加入NK溶液,搅拌10分钟,并按照钙离子计算NK/Ca++质量比(100∶1)分别氯化钙、硫酸钙(石膏)、碳酸钙、乳酸钙。冷冻干燥。加入混合均匀后,灌入小鼠专用肠溶小胶囊,得到NK粉末胶囊。
将30只wistar大鼠随机分成6组,每组5只,各组分别为:
1、空白组(Control),灌服与给药组数目相同的空胶囊。
2、氯化钙组(NK-PS-CL),给药剂量为5kIU·kg-1。
3、硫酸钙组(NK-PS-S),给药剂量为5kIU·kg-1。
4、碳酸钙组(NK-PS-C),给药剂量为5kIU·kg-1。
5、乳酸钙组(NK-PS-L),给药剂量为5kIU·kg-1。
6、未加钙盐组(NK-PS),给药剂量为5kIU·kg-1。
每日给药1次,连续7日。给药后第8天,将大鼠以3.5%水合氯醛进行腹腔麻醉(1ml/100g),手术分离双侧颈总动脉。在双侧颈总动脉下各垫一条1.2cm×3.0cm的塑料薄片,用浸渍有50μl FeCl3溶液(10%,w/w)的滤纸条(1.0cm×1.5cm)覆盖双侧颈总动脉。20min后取下滤纸条,剪下变色区域并用生理盐水洗净,滤纸吸干水分后测量其长度,并用分析天平精密称重,计算抗栓率,结果见表4。
表4不同钙盐抗栓率结果
结果表明,与未加钙盐组相比,各种加入钙盐的NK制剂均进一步提高抗栓效果。
实施例5TPGS对吸收的影响
取口服级PS(60%),以氯仿溶解,并置于烧瓶中,旋转除去氯仿,制备PS磷脂膜。取NK水溶液,按照NK-PS100∶10加入NK溶液,搅拌10分钟,并按照钙离子计算NK/Zn++质量比(100∶1)分别葡萄糖酸锌。冷冻干燥。按照NK-TPGS不同质量比(100∶10;100∶30;100∶50,w/w)加入TPGS(分别记为NK-PS-Z-T1、NK-PS-Z-T3、NK-PS-Z-T5)混合均匀后,灌入大鼠专用肠溶小胶囊,得到NK粉末胶囊。
将30只wistar大鼠随机分成5组,每组6只,各组分别为:
1、空白组(Control),灌服与给药组数目相同的空胶囊。
2、未加TPGS组(NK-PS-Z),给药剂量为5kIU·kg-1。
3、加入TPGS组(NK-PS-Z-T1),给药剂量为5kIU·kg-1。
4、加入TPGS组(NK-PS-Z-T3),给药剂量为5kIU·kg-1。
5、加入TPGS组(NK-PS-Z-T5),给药剂量为5kIU·kg-1。
每日给药1次,连续7日。给药后第8天,将大鼠以3.5%水合氯醛进行腹腔麻醉(1ml/100g),手术分离双侧颈总动脉。在双侧颈总动脉下各垫一条1.2cm×3.0cm的塑料薄片,用浸渍有50μl FeCl3溶液(10%,w/w)的滤纸条(1.0cm×1.5cm)覆盖双侧颈总动脉。20min后取下滤纸条,剪下变色区域并用生理盐水洗净,滤纸吸干水分后测量其长度,并用分析天平精密称重,计算抗栓率,结果见表5。
表5不同钙盐抗栓率结果
结果表明,与未加TPGS组相比,各种加入TPGS的NK制剂均进一步提高抗栓效果。
实施例6多聚阳离子物质增加NK吸收
将NK与市售40%PS的磷脂酰丝氨酸按照100∶100(w/w)进行混合,并用乙醇水溶解,并根据NK与牛奶钙质量比为100∶100、NK与多聚赖氨酸(或者多聚精氨酸)的质量比为100∶20和NK与木糖醇质量比为100∶1000进行投料,加入牛奶钙、多聚赖氨酸/或者多聚精氨酸和木糖醇,采用喷雾干燥方法制备粉体。将所得喷雾干燥产物装入大鼠专用肠溶小胶囊,得到试验制剂。
将20只wistar大鼠随机分成4组,每组5只,各组分别为:
1、空白组(Control),灌服与给药组数目相同的空胶囊。
2、NK-PS多聚赖氨酸组(NK-PS-PL),给药剂量为10kIU·kg-1。
3、NK-PS多聚精氨酸组(NK-PS-PA),给药剂量为10kIU·kg-1。
4、NK-PS胶囊组(NK-PS),给药剂量为10kTU·kg-1。
每日给药1次,连续7日。给药后第8天,将大鼠以3.5%水合氯醛进行腹腔麻醉(1ml/100g),手术分离双侧颈总动脉。在双侧颈总动脉下各垫一条1.2cm×3.0cm的塑料薄片,用浸渍有50μl FeCl3溶液(10%,w/w)的滤纸条(1.0cm×1.5cm)覆盖双侧颈总动脉。20min后取下滤纸条,剪下变色区域并用生理盐水洗净,滤纸吸干水分后测量其长度,并用分析天平精密称重。
表6不同多聚阳离子化合物抗栓率结果
结果表明,与未加多聚阳离子化合物组相比,加入多聚赖氨酸/或者多聚精氨酸的NK制剂均进一步提高抗栓效果。
实施例7提高稳定性
NK-PS组合物的配制:用乙醇水分散PS(60%),将NK水溶液加入其中(NK/PS质量比为100/1000),搅拌混合均匀,加入10mM抗坏血酸钙和10mM硫酸锌溶液,均质机分散后,再加入TPGS(或者泊洛沙姆F68)、半胱氨酸、低聚糖(或者壳寡糖及低聚壳聚糖)、甘露醇和/或右旋糖酐溶液,混合均匀后,喷雾干燥。所得NK-PS组合物进行如下试验。
温度稳定性:将溶液NK原粉与NK-PS组合物粉体分别放置于37℃环境中,30天后,运用纤维蛋白平板法测定各样品的酶活性,计算残余酶活力。
人工胃液稳定性:以浓盐酸/或者稀盐酸配制0.1mol/L的溶液,将溶 液与复合物分别放置于其中(37℃),2小时后,运用纤维蛋白平板法测定各样品的酶活性,计算残余酶活力。
结果:NK溶液与NK-PS组合物粉体在37℃环境中放置30天后,残余酶活力分别为31.6%和76.0%,说明组合物提高了NK的温度稳定性。
人工胃液中2小时后,NK与NK-PS组合物粉体的残余酶活力分别为6.3%和53.5%,组合物极显著地提高了NK的热稳定性。
此外,以上实施例只是作为本发明的示例实施方式而提供的,仅仅是简单的示例不能解释为限定。对于本领域技术人员而言显而易见的本发明的变形形式也包含在本发明的保护范围之内。
产业上的可利用性
本发明的纳豆激酶组合物适于作为药物制剂、保健品、功能食品、功能饮料或食品添加剂使用。
Claims (10)
1.一种用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物,其特征在于,含有纳豆激酶和纳豆激酶吸收促进剂,所述纳豆激酶吸收促进剂为磷脂酰丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,还进一步含有抗氧剂和/或金属离子化合物。
3.根据权利要求1或2所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,还进一步含有选自分散剂、多聚阳离子化合物和多元醇中至少一种。
4.根据权利要求1中任一项所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,所述磷脂酰丝氨酸选自天然磷脂酰丝氨酸、半合成磷脂酰丝氨酸、全合成磷脂酰丝氨酸。
5.一种制剂,其含有权利要求1-4任一项所述的纳豆激酶组合物,所述制剂为药物制剂、保健品、功能食品、功能饮料或食品添加剂。
6.权利要求1-4中任一项所述的纳豆激酶组合物的制备方法,其特征在于,其至少包括如下工序:
使纳豆激酶溶解或分散于溶剂中制备纳豆激酶溶液或分散液的工序;
使磷脂酰丝氨酸溶解或分散于有机溶剂中制备磷脂酰丝氨酸溶液或分散液的工序;使所述纳豆激酶溶液与磷脂酰丝氨酸溶液混合的工序、以及冷冻干燥的工序。
7.一种用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶的纳豆激酶组合物,其特征在于,包括纳豆激酶制剂与纳豆激酶吸收促进剂,所述纳豆激酶吸收促进剂为磷脂酰丝氨酸制剂。
8.根据权利要求7所述的纳豆激酶组合物,其特征在于,所述纳豆激酶制剂和/或磷脂酰丝氨酸制剂中还进一步含有选自抗氧剂、金属离子化合物、分散剂、多聚阳离子化合物和多元醇中至少一种。
9.一种纳豆激酶吸收促进剂在制备纳豆激酶抗血栓增效剂中的应用,所述纳豆激酶吸收促进剂为磷脂酰丝氨酸。
10.磷脂酰丝氨酸作为纳豆激酶吸收促进剂的应用。
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