CN103930558A - 用于生产甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯类的微生物以及与之相关的方法 - Google Patents

用于生产甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯类的微生物以及与之相关的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103930558A
CN103930558A CN201280026997.7A CN201280026997A CN103930558A CN 103930558 A CN103930558 A CN 103930558A CN 201280026997 A CN201280026997 A CN 201280026997A CN 103930558 A CN103930558 A CN 103930558A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coa
enzyme
acid
ester
dehydratase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280026997.7A
Other languages
English (en)
Inventor
M·J·伯克
A·P·博加德
罗宾·E·奥斯特豪特
孙军
普里蒂·法克雅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genomatica Inc
Original Assignee
Genomatica Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genomatica Inc filed Critical Genomatica Inc
Publication of CN103930558A publication Critical patent/CN103930558A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种非天然存在的微生物，其具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径。该微生物包含编码甲基丙烯酸途径中的酶的至少一种外源性核酸。此外，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的方法。该方法可以包括培养生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的微生物，其中该微生物在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯这么长的时间内，以足以生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的量表达编码甲基丙烯酸途径酶的至少一种外源性核酸。

Description

用于生产甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯类的微生物以及与之相关的方法
背景技术
本申请要求如下美国临时申请的优先权权益：2011年4月1日提交的美国临时申请序列号61/471,078；以及2011年6月22日提交的美国临时申请序列号61/571,232；以及2011年7月19日提交的美国临时申请序列号61/509,560；以及2011年7月20日提交的美国临时申请序列号61/510,054；以及2011年7月27日提交的美国临时申请序列号61/512,348，所述美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
本发明一般地涉及生物合成过程，更具体地涉及具有甲基丙烯酸生物合成能力的生物。
甲基丙烯酸（MMA）甲酯是一种具有式CH2=C(CH3)CO2CH3的有机化合物。这种无色液体是甲基丙烯酸（MMA）的甲基酯以及是用于生产透明塑料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的单体。
甲基丙烯酸甲酯的主要应用是聚甲基丙烯酸甲酯的丙烯酸类塑料的生产。此外，甲基丙烯酸甲酯被用来生产甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS），该共聚物用作PVC改性剂。甲基丙烯酸甲酯的聚合物和共聚物被用于水性涂料，如乳胶漆。据发现，还可用于粘合剂配方中。当代的应用包括在板中的用途，该板保持光线均匀地分布在液晶显示器（LCD）电脑和电视屏幕上。甲基丙烯酸甲酯也用于制备解剖器官（如心脏冠状动脉）的腐蚀铸型。
甲基丙烯酸或2-甲基-2-丙烯酸是一种低分子量的羧酸，其少量天然存在于罗马春黄菊油中。它是一种具有刺鼻难闻气味的腐蚀性液体。它可溶于温水中以及可与多数有机溶剂混溶。经加热或用催化量的强酸（如HCl）处理后，甲基丙烯酸容易聚合。所得到的聚合物是一种陶瓷样的塑料。甲基丙烯酸在工业上被用于制备其酯类，统称为甲基丙烯酸酯，如甲基丙烯酸甲酯。甲基丙烯酸酯，尤其是在聚合物的制造中，具有多种用途。
大多数商业生产者应用丙酮氰醇（ACH）路径来生产甲基丙烯酸（MAA），其中用丙酮和氰化氢作为原材料。中间体氰醇与硫酸转化成甲基丙烯酰胺的硫酸酯，所述硫酸酯水解提供硫酸氢铵和MAA。一些生产商以异丁烯或，等价地，叔丁醇开始，经氧化成为异丁烯醛，并再次氧化成为甲基丙烯酸。然后用甲醇将MAA酯化成为MMA。
利用丙酮氰醇路径的传统生产工艺涉及氰化氢（HCN）和丙酮到丙酮氰醇的转化，然后经过酸辅助的水解和用甲醇进行的酯化，得到MMA。处理潜在致命HCN的困难以及副产品（每吨MMA形成1.2吨硫酸氢铵）处理的高成本已经引发旨在更清洁以及更经济的工艺的大量研究。在过去的二十年中，一些新工艺已经商业化，以及更多的接近商业化。Asahi的“DirectMetha”路径涉及异丁烯氧化为异丁烯醛，然后将异丁烯醛与甲醇混合，用空气氧化并酯化为MMA，该路径已经被描述为一种经济型工艺。
除MMA聚合物之外，这个行业的其他主要产品是占MMA生产总量20%左右的粗制甲基丙烯酸。粗制MAA被加工成丁基甲基丙烯酸酯和/或“冰”MAA，这是高度纯化的粗制MAA。冰MAA可以在各种聚合物中直接用作共聚单体，还被用来制造各种小体积的甲基丙烯酸酯。另一方面，MAA也可以通过用甲醇酯化，被转化成MMA。
因此，需要有一种有效地生产诸如甲基丙烯酸的化合物的替代方法。本发明满足了这种需要，而且还提供了有关的优点。
发明内容
本发明提供了一种非天然存在的微生物，其具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类（如甲基丙烯酸甲酯）、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径。该微生物包含编码甲基丙烯酸途径中酶的至少一种外源性核酸。此外，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类（如甲基丙烯酸甲酯）、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的方法。该方法可以包括在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的微生物，其中该微生物以足以生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的量表达编码甲基丙烯酸途径酶的至少一种外源性核酸。
本发明还提供包含甲基丙烯酸酯类或甲基丙烯酸甲酯途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸酯类或甲基丙烯酸甲酯酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类或甲基丙烯酸甲酯的量表达的至少一种外源性核酸，该微生物包含编码该甲基丙烯酸酯类或甲基丙烯酸甲酯途径中的酶的至少一种外源性核酸以及编码通过如下方式提高甲基丙烯酸酯类或甲基丙烯酸甲酯收率的酶的至少一种外源性核酸：（i）经由还原TCA循环增强碳固定；和/或（ii）使用来自气态碳源和/或合成气组分（如CO、CO2和/或H2）的额外还原当量。在某些方面，该非天然存在的微生物包含(i)包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中该至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶、柠檬酸裂解酶、富马酸还原酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；(ii)包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中该至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、CO脱氢酶以及H2氢化酶；或(iii)编码选自CO脱氢酶、H2氢化酶及其组合的酶的至少一种外源性核酸。此外，本发明提供通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸酯类或甲基丙烯酸甲酯这么长的时间内培养一种包含甲基丙烯酸酯类或甲基丙烯酸甲酯途径的非天然存在的微生物，将这类微生物用于生产甲基丙烯酸酯类或甲基丙烯酸甲酯的方法。
附图说明
图1示出了从丙酮酸和乙酰基-CoA，以及从乌头酸到甲基丙烯酸的示例性途径。酶是A.柠苹酸合酶；B.柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；C.柠康酸脱羧酶；D.柠苹酰-CoA裂解酶；E.柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；F.柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；G.柠康酸异构酶；H.中康酸脱羧酶；I.乌头酸脱羧酶；J.衣康酸异构酶；K.柠苹酰-CoA脱水酶以及L.衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶。
图2示出了从甲基丙烯酸酯到甲基丙烯酸酯类的示例性途径。甲基丙烯酸酯可以形成自图1所描绘的途径或其他甲基丙烯酸酯途径，如WO2009/135074和U.S.公开2009/0275096中所述的那些途径。异丁烯酰基-CoA可以经由异丁烯酰基-CoA转移酶或异丁烯酰基-CoA合成酶形成自甲基丙烯酸酯。甲基丙烯酸酯类可以形成自异丁烯酰基-CoA以及当醇转移酶存在时形成自醇。甲基丙烯酸酯类还可以直接形成自甲基丙烯酸酯以及通过甲基丙烯酸酯类形成酶或通过化学转化（例如，当存在脱水剂，如酸时加热）直接形成自醇。R指任何有机官能团，包括但不仅限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、仲丁基以及叔丁基、戊基或己基官能团。例如，如果R指甲基基团，则R-OH指甲醇以及该途径的产物是甲基丙烯酸甲酯。
图3示出了经由3-羟基异丁酸酯从琥珀酰-CoA到MMA的示例性新陈代谢途径。
图4示出了经由3-氨基-2-甲基丙酸从琥珀酰-CoA到MAA的示例性途径。“集中反应”（步骤2-3）通过1）甲基丙二酰基-CoA表异构酶以及2）甲基丙二酰基-CoA还原酶催化。
图5示出了经由3-羟基异丁酸酯或异丁烯酰基-CoA进行的从4-羟基丁酰基-CoA到MAA的示例性途径。步骤2可以通过三种替代性酶催化：3-羟基异丁酰基-CoA合成酶、3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶。类似地，步骤5可以通过如下三种替代性酶催化：异丁烯酰基-CoA合成酶、异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶。
图6示出了经由苏-3-甲基天冬氨酸从α-酮戊二酸到MAA的示例性途径。
图7示出了经由2-羟基戊二酸从α-酮戊二酸到MAA的示例性途径。
图8示出了乙酰基-CoA或4-羟基丁酰基-CoA转化为MAA或2-羟基异丁酸酯的示例性新陈代谢途径。
图9示出了从乙酰基-CoA到MAA的示例性途径。
图10示出了从丙酮酸到丙烯酰基-CoA到MAA的示例性途径。
图11示出了从2-酮戊酸到MAA的示例性途径。2-酮异戊酸可以生产自缬氨酸或丙酮酸。用于将丙酮酸转化为2-酮异戊酸的一组示例性酶由乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶以及二羟酸脱水酶组成。
图12示出了用于将CO2固定在作为底物的碳水化合物上的逆向TCA循环。酶催转换通过所示的酶完成。
图13示出了用于将合成气转化为乙酰基-CoA，耦合有一氧化碳脱氢酶以及氢化酶的逆向TCA循环的途径。
图14示出了利用尺寸标准（泳道5）以及热醋穆尔氏菌CODH（Moth_1202/1203）或Mtr（Moth_1197）蛋白质（50、150、250、350、450、500、750、900以及1000ng）的10μg ACS90（泳道1）、ACS91（泳道2）、Mta98/99（泳道3和4）细胞提取物的Western印迹。
图15示出了CO氧化测定结果。培育了细胞（具有CODH/ACS操纵子的热醋穆尔氏菌或大肠杆菌；ACS90或ACS91或空载体:pZA33S）以及制备了提取物。在制备提取物当天的不同时间，在55℃执行测定。随后，在120秒时间过程后，在578nm处甲基紫精还原。
图16A示出了用于甲基丙烯酸和3-羟基异丁酸的生物合成的途径。显示的酶催转换通过如下酶完成：（1）氢化酶；（2）一氧化碳脱氢酶；（3）琥珀酰-CoA转移酶、琥珀酰-CoA合成酶；（4）甲基丙二酰基-CoA变位酶；（5）甲基丙二酰基-CoA表异构酶；（6）甲基丙二酰基-CoA还原酶；（7）甲基丙二酸半醛还原酶以及（8）3-羟基异丁酸酯脱水酶。
图16B示出了经由4-羟基丁酰基-CoA中间体从葡萄糖生物合成甲基丙烯酸的途径。酶催转换通过如下酶完成：（1）氢化酶；（2）一氧化碳脱氢酶；（3）琥珀酰-CoA转移酶、琥珀酰-CoA合成酶；（4）琥珀酰-CoA还原酶（醛形成）；（5）4-羟基丁酸脱氢酶；（6）4-羟基丁酸激酶；（7）磷酸转-4-羟基丁酰基酶；（8）琥珀酸还原酶；（9）琥珀酰-CoA还原酶（醇形成）；（10）4-羟基丁酰基-CoA合成酶、4-羟基丁酰基-CoA转移酶；（11）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；（12）3-羟基异丁酰基-CoA合成酶、转移酶或水解酶；（13）3-羟基异丁酸酯脱水酶；（14）3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；（15）异丁烯酰基-CoA合成酶、转移酶或水解酶。
图16C示出了通量分布，该通量分布显示当碳经由还原TCA循环时，葡萄糖上甲基丙烯酸的提高的最大理论收率。酶催转换通过如下酶完成：（1）ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶、乙酰基-CoA合成酶；或柠檬酸裂解酶、醋酸激酶、磷酸转乙酰基酶；（2）苹果酸脱氢酶；（3）富马酸酶；（4）富马酸还原酶；（5）琥珀酰-CoA合成酶或转移酶；（6）α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；（7）异柠檬酸脱氢酶；（8）乌头酸酶；（9）丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；丙酮酸氧化酶、乙酰基-CoA合成酶；或丙酮酸氧化酶、醋酸激酶、磷酸转乙酰基酶；（10）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；（11）乙酰乙酰基-CoA还原酶；（12）3-羟基丁酰基-CoA变位酶；（13）2-羟基丁酰基-CoA脱水酶；（14）异丁烯酰基-CoA合成酶、转移酶或水解酶；（15）2-羟基异丁酰基-CoA合成酶、转移酶或水解酶。
图16D示出了通量分布，该通量分布显示当碳经由还原TCA循环时，葡萄糖上甲基丙烯酸的提高的最大理论收率。酶催转换通过如下酶完成：（1）ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶、乙酰基-CoA合成酶；或柠檬酸裂解酶、醋酸激酶、磷酸转乙酰基酶；（2）苹果酸脱氢酶；（3）富马酸酶；（4）富马酸还原酶；（5）琥珀酰-CoA合成酶或转移酶；（6）α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；（7）异柠檬酸脱氢酶；（8）乌头酸酶；（9）丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；丙酮酸氧化酶、醋酸激酶、磷酸转乙酰基酶；（10）柠苹酸合酶；（11）柠苹酸脱水酶以及（12）柠康酸脱羧酶。
图16E示出了用于从乙酰基-CoA以及丙酮酸生物合成甲基丙烯酸的途径。酶催转换通过所示的酶完成。酶为如下：（1）柠苹酸合酶；（2）柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；（3）柠康酸脱羧酶；（4）柠苹酰-CoA裂解酶；（5）柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；（6）柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；（7）柠康酸异构酶；（8）中康酸脱羧酶；（9）乌头酸脱羧酶；（10）衣康酸异构酶；（11）衣康酰-CoA转移酶或合成酶以及（12）衣康酰-CoA水合酶。
图17A以及图17B示出了示例性途径。酶催转换通过所示的酶完成。图17A示出了利用该还原TCA循环将CO2固定到琥珀酰-CoA的途径。图17B示出了从琥珀酰-CoA生物合成3-羟基异丁酸以及甲基丙烯酸的示例性途径；显示的酶催转换通过如下酶完成：A.甲基丙二酰基-CoA变位酶；B.甲基丙二酰基-CoA表异构酶；C.甲基丙二酰基-CoA还原酶；D.甲基丙二酸半醛还原酶；E.3-羟基异丁酸酯脱水酶。
图18A以及图18B示出了示例性途径。酶催转换通过所示的酶完成。图18A示出了利用该还原TCA循环将CO2固定到琥珀酸的途径。图18B示出了从琥珀酸生物合成3-羟基异丁酸以及甲基丙烯酸的示例性途径；显示的酶催转换通过如下酶完成：A.3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；B.异丁烯酰基-CoA合成酶、转移酶或水解酶；C.琥珀酰-CoA转移酶或合成酶；D.琥珀酰-CoA还原酶（醛形成）；E.4-羟基丁酸脱氢酶；F.4-羟基丁酸激酶；G.磷酸转-4-羟基丁酰基酶；H.琥珀酸还原酶；I.琥珀酰-CoA还原酶（醇形成）；J.4-羟基丁酰基-CoA合成酶或转移酶；K.4-羟基丁酰基-CoA变位酶；L.3-羟基异丁酰基-CoA合成酶、转移酶或水解酶；M.3-羟基异丁酸酯脱水酶。
图19A以及图19B示出了示例性途径。图19A示出了利用该还原TCA循环将CO2固定到乙酰基-CoA以及丙酮酸的途径。图19B示出了从乙酰基-CoA以及丙酮酸生物合成甲基丙烯酸酯的示例性途径；显示的酶催转换通过如下酶完成：1.柠苹酸合酶；2.柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；3.柠康酸脱羧酶；4.柠苹酰-CoA裂解酶；5.柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；6.柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；7.柠康酸异构酶；8.中康酸脱羧酶；9.乌头酸脱羧酶；10.衣康酸异构酶；11.衣康酰-CoA转移酶或合成酶；12.衣康酰-CoA水合酶。
图20A以及图20B示出了示例性途径。图20A示出了利用该还原TCA循环将CO2固定到乙酰基-CoA的途径。图20B示出了从乙酰基-CoA生物合成甲基丙烯酸和2-羟基异丁酸的示例性途径。
图21A以及图21B示出了示例性途径。图21A示出了利用该还原TCA循环将CO2固定到乙酰基-CoA的途径。图21B示出了从乙酰基-CoA生物合成甲基丙烯酸和3-羟基异丁酸的示例性途径；显示的酶催转换通过如下酶完成：1）乙酰乙酰基-CoA硫解酶（AtoB）；2）3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶（Hbd）；3）巴豆酸酶（Crt）；4）巴豆酰基-CoA水合酶（4-Budh）；5）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；6）3-羟基异丁酰基-CoA水解酶、合成酶或转移酶；7）3-羟基异丁酸脱水酶；8）3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；9）异丁烯酰基-CoA水解酶、合成酶或转移酶。
图22A示出了来自艾瓦诺卡氏菌（GNM_720）的羧酸还原酶的核苷酸序列（SEQ ID NO:1），以及图22B示出了经编码的氨基酸序列（SEQ IDNO:2）。
图23A示出了经密码子优化的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的核苷酸序列（SEQ ID NO:3），以及图23B示出了经编码的氨基酸序列（SEQ ID NO:4）。
图24A示出了来自***垢分支杆菌mc(2)155的羧酸还原酶（指定890）的核苷酸序列（SEQ ID NO:5），以及图24B示出了经编码的氨基酸序列（SEQ ID NO:6）。
图25A示出了来自鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10的羧酸还原酶（指定891）的核苷酸序列（SEQ ID NO:7），以及图25B示出了经编码的氨基酸序列（SEQ ID NO:8）。
图26A示出了来自海分枝杆菌M的羧酸还原酶（指定892）的核苷酸序列（SEQ ID NO:9），以及图26B示出了经编码的氨基酸序列（SEQ IDNO:10）。
图27A示出了羧酸还原酶（指定891GA）的核苷酸序列（SEQ IDNO:11），以及图27B示出了经编码的氨基酸序列（SEQ ID NO:12）。
图28示出了经由3-羟基异丁酸酯和/或3-羟基异丁酰基-CoA通向甲基丙烯酸酯类的示例性途径。R-OH指任何有机醇。
图29示出了经由2-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酰基-CoA通向甲基丙烯酸酯类的示例性途径。R-OH指任何有机醇。
图30示出了通向示例性甲基丙烯酸酯类-甲基丙烯酸甲酯的示例性途径。
具体实施方式
本发明旨在设计和生产具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成生产能力的细胞和生物。如本文所披露，新陈代谢途径可以进行设计和重组工程以实现在大肠杆菌和其他细胞或者生物中甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成。甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成生产通过构建具有设计的新陈代谢基因型的菌株来证实。这些经过新陈代谢工程的细胞或者生物还可以经受适应性进化，以进一步增强甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成，包括在接近理论最大增长量的条件下。
用于生产甲基丙烯酸（MAA）的微生物已有先前描述（参见，例如，WO2009/135074以及U.S.公开2009/0275096，其通过引用方式并入本文）。本发明提供用于设计用于生产甲基丙烯酸（MAA）的微生物的附加途径。图1提供经由中间体柠苹酸从乙酰基-CoA以及丙酮酸到MAA的示例性途径。还显示从乌头酸到MAA的途径。在一个途径中，乙酰基-CoA以及丙酮酸首先通过柠苹酸合酶转化为柠苹酸。柠苹酸脱水可以出产柠康酸（步骤B）或中康酸（步骤C）。在步骤G中，中康酸以及柠康酸通过顺式/反式异构酶相互转化。中康酸（步骤H）或柠康酸（步骤C）脱羧出产MAA。在替代性途径中，柠苹酸在步骤D和E中经由柠苹酰-CoA中间体形成自乙酰基-CoA以及丙酮酸，通过柠苹酰-CoA裂解酶以及柠苹酰-CoA水解酶、转移酶或合成酶催化。
本发明还包含从乌头酸到MAA的途径。在一个途径中，乌头酸首先通过乌头酸脱羧酶脱羧为衣康酸（步骤I）。然后，衣康酸通过衣康酸Δ-异构酶（步骤J）异构化为柠康酸。柠康酸到MAA的转化直接通过脱羧或间接经由中康酸进行。在替代性途径中，衣康酸中间体首先通过CoA转移酶或合成酶转化为衣康酰-CoA（步骤L）。衣康酰-CoA经水合作用出产柠苹酰-CoA，其如前所述，然后可以转化为MAA。下文对示例性MAA途径的额外细节以及实施方式做了描述。
如本文所用，术语“非天然存在的”当关于本发明的微生物使用时，意指该微生物具有至少一种通常不会在相关物种的天然存在的菌株（包括相关物种的野生型菌株）中发现的基因改变（genetic alteration）。基因改变包括，例如，引入编码新陈代谢多肽的可表达的核酸的修饰（modification）、其他核酸新增、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其他功能中断。这些修饰包括，例如，相关物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和功能片段。其他修饰包括，例如，其中该修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调控区域。示例性的新陈代谢多肽包括在甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径内的酶或蛋白质。
新陈代谢修饰是指从其天然存在的状态发生改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可以具有对编码新陈代谢多肽的核酸或其功能片段的基因修饰。本文披露了示例性的新陈代谢修饰。
如本文所用，术语“分离”当关于微生物使用时，意指当相关微生物在自然界中被发现时，基本上不含至少一种组分的生物。该术语包括当在其自然环境中被发现时从部分或全部组分中脱离的微生物。该术语还包括当其在非天然存在的环境中被发现时从部分或全部组分中脱离的微生物。因此，当分离的微生物在自然界中被发现或者当其在非天然存在的环境中培育、储存或生存时，它部分或全部地从其他物质中分离。分离的微生物的具体例子包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。
如本文所用，术语“微生物”意在指任何作为包含在古菌域、细菌域或真核域的显微细胞（microscopic cell）存在的生物。因此，该术语意包括原核或真核细胞或具有显微尺寸的生物并包括所有种类的细菌、古菌和真细菌以及真核微生物（如酵母和真菌）。该术语还包括任何种类的可被培养用于生产生物化学品的细胞培养物。
如本文所用，“甲基丙烯酸”具有化学式CH2=C(CH3)CO2（见图1）（IUPAC名称为2-甲基-2-丙烯酸），其是甲基丙烯酸酯的酸形式，以及可理解的是，本文中，甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯可以互换使用，指任何中性或离子形式的化合物，包括其任何盐形式。技术人员可理解的是，具体形式将取决于pH。
如本文所用，“甲基丙烯酸酯类”指具有化学式CH2=C(CH3)COOR（见图28以及图29）的化合物，其中R是C1到C6支链或直链的低级烷基，包括但不仅限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、仲丁基以及叔丁基、戊基或己基，其任何一种可以是不饱和的，从而是，例如丙烯基、丁烯基、戊基以及己烯基。示例性甲基丙烯酸酯类包括但不仅限于甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯以及甲基丙烯酸正丙酯。如本文所用，甲基丙烯酸酯类还包括其他中链到长链（即C7-C22）的R基团，其中该甲基丙烯酸酯类衍生自脂肪族醇，如庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、月桂醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、棕榈醇、十七醇、十八醇、十九醇、花生醇、二十一醇和二十二醇，其任何一种可以可选地是支链和/或包含不饱和。
如本文所用，术语“CoA”或者“辅酶A”意在指有机辅因子或者辅基（酶的非蛋白质部分），它的存在为许多酶（脱辅基酶）的活性所需以形成活性酶***。辅酶A在某些缩合酶中起作用，在乙酰基或者其他酰基基团转移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其他乙酰基化中起作用。
如本文所用，术语“基本上厌氧”当关于培养或培育条件使用时意指氧量少于液体培养基内溶解的氧的饱和量的约10%。该术语还意在包括在小于约1%的氧的气氛中保持的液体或固体培养基的密封室。
如本文所用，“外源”意指有关分子或有关活性被引入宿主微生物。分子可以例如，通过将编码核酸引入宿主遗传物质，如通过整合入宿主染色体或作为非染色体遗传物质（如质粒）被引入。因此，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指将编码核酸以可表达的形式引入微生物。当关于生物合成活性使用时，该术语指被引入宿主有关生物的活性。来源可以是例如，表达引入宿主微生物后有关活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源”指在宿主内存在的有关分子或活性。同样，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指包含在微生物体内编码核酸的表达。术语“异源”指来自与有关物种不同的来源的分子或活性而“同源”指来自宿主微生物的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源性表达可以利用异源编码核酸和同源编码核酸的其一或两者。
理解的是，当微生物内包含一种以上的外源性核酸时，所述一种以上的外源性核酸指相关的编码核酸或者生物合成活性，如上文所讨论。进一步理解的是，如本文所披露，这类一种以上的外源性核酸可以被引入在单独的核酸分子上、在多顺反子核酸分子上或者在其组合上的宿主微生物，并且仍然被看作是一种以上的外源性核酸。例如，如本文所披露，微生物可被设计以表达两种或者两种以上的编码所需的途径酶或者蛋白质的外源性核酸。在两种编码所需活性的外源性核酸被引入宿主微生物的情况下，理解的是，该两种外源性核酸可以作为单一核酸被引入例如，在单一质粒上、在单独的质粒上，可以被整合入位于单个位点或者多个位点的宿主染色体，以及仍然被看作是两种外源性核酸。同样，理解的是，两种以上的外源性核酸可以任何所需的组合形式被引入例如，在单一质粒上、在单独的质粒上的宿主生物，可以被整合入位于单一位点或者多个位点的宿主染色体，以及仍然被看作是两种或者两种以上的外源性核酸，例如三种外源性核酸。因此，相关的外源性核酸或者生物合成活性的数量指编码核酸的数量或者生物合成活性的数量，而非被引入宿主生物的单独的核酸的数量。
本发明的该非天然存在的微生物可以包含稳定的基因改变，这指可以培养超过五代而无改变损失的微生物。一般地，稳定的基因改变包括持续超过10代的修饰，具体地，稳定的修饰将持续超过约25代，以及更具体地，稳定的基因修饰将超过50代，包括永久地。
本领域的技术人员会理解所述基因改变（包括本文示例性的新陈代谢修饰）是关于合适的宿主生物（如大肠杆菌）及其相应的新陈代谢反应或所需的新陈代谢途径的所需的遗传物质（如基因）的合适的来源生物描述的。然而，如果有各种各样的生物的完整的基因组测序和基因组学领域的高水平技能，本领域的技术人员将能够很容易地将本文提供的教诲和指导应用于基本上所有的其他生物。例如，本文示例性的大肠杆菌新陈代谢改变可以通过纳入来自非相关物种的物种的相同或类似的编码核酸很容易地应用到其他物种。一般地，这类基因改变包括例如，物种同系物的基因改变，以及具体地，直系同源、旁系同源或非直系同源基因置换。
直系同源是通过垂直传递（vertical descent）相关且导致不同的生物内基本上相同或相似的功能的一种或多种基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶因环氧化物水解的生物功能可以被认为是直系同源。例如，当基因共有足够量的序列相似性以表明它们是同源的或者通过进化自共同的祖先相关时，所述基因通过垂直传递相关。如果基因共有足够量的三维结构但不一定共有序列相似性以表明它们进化自共同的祖先达到基本序列相似性无法识别的程度，也认为它们是直系同源。直系同源的基因可以编码具有约25%到100%氨基酸序列一致性的序列相似性的蛋白质。如果编码共有的氨基酸相似性小于25%的蛋白质的基因其三维结构也显示出相似性，则所述基因也可以被认为通过垂直传递产生。酶类的丝氨酸蛋白酶家族的成员（包括组织型纤维蛋白溶酶原激活剂和弹性蛋白酶）被认为通过垂直传递产生自共同的祖先。
直系同源包括通过例如，进化在结构或整体活性方面趋异的基因或其编码基因产物。例如，当一种物种编码显示两种功能的基因产物以及当这类功能在第二个物种内已经分为不同的基因时，这三个基因及其相应的产物被认为是直系同源。对于生化产品的生产，本领域的技术人员会理解含待引入或破坏的新陈代谢活性的直系同源的基因将被选择用于所述非天然存在的微生物的构建。显示各自活性的直系同源的例子是当两个或两个以上物种之间或一个单一物种内部不同的活性已经分为不同的基因产物的情况。具体的例子是弹性蛋白酶蛋白质水解和纤维蛋白溶酶原蛋白质水解（两种类型的丝氨酸蛋白酶活性）分离为作为纤维蛋白溶酶原激活剂和弹性蛋白酶的不同分子。第二个例子是支原体5'-3'核酸外切酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的核酸外切酶和聚合酶其一或两者的直系同源，反之亦然。
相反，旁系同源是通过例如，复制然后进化趋异相关的同系物并具有相似或共同的，但不完全相同的功能。旁系同源可以源自例如，相同物种或源自不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶（环氧化物水解酶I）和可溶性环氧化物水解酶（环氧化物水解酶II）可以被认为是旁系同源，因为它们代表两种不同的酶类，协同进化自共同的祖先，催化不同的反应并在相同的物种内具有不同的功能。旁系同源是来自彼此具有显著的序列相似性的相同物种的蛋白质，这表明它们是同源的或通过协同进化自共同的祖先而相关。旁系同源蛋白质家族的群体包括HipA同系物、荧光素酶基因、肽酶以及其他。
非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因，可以替代一种不同的物种内有关基因功能。替代包括例如，能够在起源物种内执行与所述不同的物种内所述有关功能相比基本上相同或相似的功能。虽然一般地，非直系同源基因置换可看作是与编码有关功能的已知基因结构相关，不过结构相关性差但功能相似的基因及其相应的基因产物仍然会如本文所用，落入所述术语的含义之内。功能相似性要求例如，与编码试图被替代的功能的基因相比，在非直系同源基因产物的活性位点或结合区域具有至少一些结构相似性。因此，直系同源基因包括例如，旁系同源或不相关的基因。
因此，识别和构建本发明的具有甲基丙烯酸生物合成能力的非天然存在的微生物时，本领域的技术人员会将本文提供的教诲和指导应用于特定的物种并会理解新陈代谢修饰的识别可以包括直系同源的识别和包含或灭活。如果编码催化相似或基本上相似的新陈代谢反应的酶的旁系同源和/或非直系同源基因置换存在于参照微生物内，本领域的技术人员还可以利用这些进化上相关的基因。
直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换可以通过本领域的技术人员熟知的方法确定。例如，对两种多肽的核酸或氨基酸序列的检验将揭示所比较的序列之间的序列一致性和相似性。基于这种相似性，本领域的技术人员可以确定相似性是否足够高以表明蛋白质是通过进化自共同的祖先而相关的。本领域的技术人员熟知的算法（如Align、BLAST、Clustal W以及其他）比较并确定原始序列相似性或一致性，以及还确定序列内空隙的存在或大小，其可以被赋予权数或得分。这类算法在本领域也已知并同样适用于确定核苷酸序列的相似性或一致性。足够的相似性以确定相关性的参数的计算基于熟知的用于计算统计相似性的方法或在随机多肽中发现相似匹配的几率以及确定的所述匹配的程度。如果需要，两个或两个以上序列的计算机对比还可以由本领域的技术人员进行可视优化。相关的基因产物或蛋白质应该具有高度的相似性，例如，25%到100%的序列一致性。不相关的蛋白质可以具有一致性，所述一致性基本上与预计将发生的几率相同，如果扫描一个具有相当规模的数据库（约5％）。5%到24%之间的序列可代表或不代表足以得出所比较的序列具有相关性的结论的同源性。在给定数据集的大小的情况下，可以进行额外的确定这种匹配的程度的统计分析，以确定这些序列的相关性。
用于使用例如，所述BLAST算法确定两个或两个以上序列的相关性的示例性参数可以如下文描述。简言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP版本2.0.8（1999年1月5日）以及以下参数执行：矩阵：0BLOSUM62；空位开放：11；空位延伸:1；x_dropoff：50；期望值：10.0；序列长度：3；过滤器：开。核酸序列比对可以使用BLASTN版本2.0.6（1998年9月16日）以及以下参数执行：匹配：1；错配：-2；空位开放：5；空位延伸:2；x_dropoff：50；期望值：10.0；序列长度：11；过滤器：关。本领域的技术人员会知道对以上参数作何修改会例如，增加或减少比较的严格性，以及确定两个或两个以上序列的相关性。
在一个实施方式中，本发明提供了一种具有甲基丙烯酸酯类途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸，其中该甲基丙烯酸酯类途径包含醇转移酶或酯形成酶，以及脱水酶。在特定的实施方式中，该微生物包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸酯类途径酶。例如，该两种外源性核酸可以编码醇转移酶以及脱水酶或替代性地，酯形成酶和脱水酶。在特定的实施方式中，该至少一种外源性核酸可以是异源性核酸。在另一实施方式中，该非天然存在的微生物可以在基本上厌氧的培养基中。此外，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸酯类的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸酯类这么长的时间内培养本文披露的具有甲基丙烯酸酯类途径的非天然存在的微生物。
此外，本发明提供了一种了具有甲基丙烯酸甲酯途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸甲酯途径酶的以足以生产甲基丙烯酸甲酯的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸甲酯途径包含醇转移酶或酯形成酶，以及脱水酶。在进一步的实施方式中，该微生物可以包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸甲酯途径酶。在特定的实施方式中，该两种外源性核酸可以编码醇转移酶以及脱水酶或替代性地，酯形成酶和脱水酶。在另一实施方式中，该至少一种外源性核酸可以是异源性核酸。在另一实施方式中，该非天然存在的微生物可以在基本上厌氧的培养基中。本发明还提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸甲酯这么长的时间内培养一种具有甲基丙烯酸甲酯途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸甲酯的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有甲基丙烯酸酯类途径的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸，所述甲基丙烯酸酯类途径包含醇转移酶或酯形成酶，以及脱水酶。在一个方面，该非天然存在的微生物包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸酯类途径酶。在一个方面，该两种外源性核酸编码醇转移酶以及脱水酶或替代性地，酯形成酶和脱水酶。在另一方面，该至少一种外源性核酸是异源性核酸。在另一方面，该非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
在一个实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其中所述脱水酶将3-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸酯转化为所述甲基丙烯酸酯类。在一个实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其中所述醇转移酶将3-羟基异丁酰基-CoA转化为3-羟基异丁酸酯或将2-羟基异丁酰基-CoA转化为2-羟基异丁酸酯。
在一个实施方式中，本发明了一种非天然存在的微生物，其中所述微生物进一步包含甲基丙烯酸酯类途径，该途径包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸，所述甲基丙烯酸酯类途径包含选自如下的途径：（a）3-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或3-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；醇转移酶；以及脱水酶；（b）3-羟基异丁酸酯形成酶和脱水酶脱水酶；（c）2-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或2-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；醇转移酶；以及脱水酶；或（d）2-羟基异丁酸酯形成酶和脱水酶。在一个方面，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸酯类这么长的时间内培养本文披露的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸酯类的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有甲基丙烯酸甲酯途径的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸甲酯途径酶的以足以生产甲基丙烯酸甲酯的量表达的至少一种外源性核酸，所述甲基丙烯酸甲酯途径包含醇转移酶或酯形成酶，以及脱水酶。在一个方面，该微生物包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸甲酯途径酶。在另一方面，该两种外源性核酸编码醇转移酶以及脱水酶或替代性地，酯形成酶和脱水酶。在另一方面，该至少一种外源性核酸是异源性核酸。在另一方面，该非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸甲酯的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸甲酯这么长的时间内培养本文所述的非天然存在的微生物。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸酯类的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产3-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养一种非天然存在的微生物并将所述3-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸酯类，其中所述非天然存在的微生物包含编码醇转移酶或3-羟基异丁酸酯形成酶的以足以生产3-羟基异丁酸酯的量表达的外源性核酸。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸酯类的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产2-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养一种非天然存在的微生物并将所述2-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸酯类，其中所述非天然存在的微生物包含编码醇转移酶或2-羟基异丁酸酯形成酶的以足以生产2-羟基异丁酸酯的量表达的外源性核酸。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸甲酯的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产甲基-3-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养一种非天然存在的微生物并将所述甲基-3-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸甲酯，其中所述非天然存在的微生物包含编码醇转移酶或酯形成酶的以足以生产甲基-3-羟基异丁酸酯的量表达的外源性核酸。
在上述方法的一个方面，该外源性核酸是异源性核酸。在上述方法的另一方面，该非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述微生物进一步包含3-羟基异丁酸酯途径，该途径包含编码3-羟基异丁酸酯途径酶的以足以生产3-羟基异丁酸酯的量表达的至少一种外源性核酸，所述3-羟基异丁酸酯途径包含选自如下的途径：（a）3-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或3-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；以及醇转移酶；或（b）3-羟基异丁酸酯形成酶。在另一实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述微生物进一步包含2-羟基异丁酸酯途径，该途径包含编码2-羟基异丁酸酯途径酶的以足以生产2-羟基异丁酸酯的量表达的至少一种外源性核酸，所述2-羟基异丁酸酯途径包含选自如下的途径：（a）2-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或2-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；以及醇转移酶；或（b）2-羟基异丁酸酯形成酶。
如本文所披露，本发明提供具有甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸。示例性途径包括但不仅限于图1中所披露的途径。示例性甲基丙烯酸途径包括，例如，对应于图1中所显示的酶的途径（如下以及在下文中做了更详细的讨论）：途径（1）A/B/C；途径（2）A/B/G/H；途径（3）A/F/G/C；途径（4）A/F/H；途径（5）D/E/B/C；途径（6）D/E/B/G/H；途径（7）D/E/F/H；途径（8）D/E/F/G/C；途径（9）I/J/C；途径（10）I/J/G/H；途径（11）I/L/K/E/B/C；途径（12）I/L/K/E/B/G/H；途径（13）I/L/K/E/F/H；以及途径（14）I/L/K/E/F/G/C。
在特定的实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有甲基丙烯酸途径的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（1）A/B/C）。如本文所披露，该微生物可以包含编码甲基丙烯酸途径酶（包括途径中乃至所有酶）的一种以上外源性核酸，例如，编码柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶的三种外源性核酸。
在特定的实施方式中，本发明的生产MAA的非天然存在的微生物可以具有至少一种外源性核酸，该外源性核酸是异源性核酸。在另一实施方式中，该生产MAA的非天然存在的微生物可以在基本上厌氧的培养基中。
在另一实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）、柠康酸异构酶（G）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（2）A/B/G/H）。在仍然另一实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）、柠康酸异构酶（G）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（3）A/F/G/C）。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（4）A/F/H）。在又一进一步的实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酰-CoA裂解酶（D）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（5）D/E/B/C）。
在附加实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酰-CoA裂解酶（D）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）；柠康酸异构酶（G）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（6）D/E/B/G/H）。在仍然另一实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酰-CoA裂解酶（D）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（7）D/E/F/H）。
在另一实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酰-CoA裂解酶（D）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F），柠康酸异构酶（G）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（8）D/E/F/G/C）。另外地，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）、衣康酸异构酶（J）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（9）I/J/C）。
在又一进一步的实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）、衣康酸异构酶（J）、柠康酸异构酶（G）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（10）I/J/G/H）。在附加实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L）；柠苹酰-CoA脱水酶（K）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（11）I/L/K/E/B/C）。
本发明还提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L）；柠苹酰-CoA脱水酶（K）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）；柠康酸异构酶（G）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（12）I/L/K/E/B/G/H）。在仍然进一步的实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有甲基丙烯酸途径的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L）；柠苹酰-CoA脱水酶（K）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（13）I/L/K/E/F/H）。在附加实施方式中，本发明提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L）；柠苹酰-CoA脱水酶（K）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）；柠康酸异构酶（G）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（14）I/L/K/E/F/G/C）。
在附加实施方式中，本发明提供了一种具有甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，其中该非天然存在的微生物包含编码酶或蛋白质的至少一种外源性核酸，所述酶或者蛋白质进行选自如下的从底物到产品的转化：乙酰基-CoA以及丙酮酸到柠苹酸，柠苹酸到柠康酸，以及柠康酸到甲基丙烯酸酯类；乙酰基-CoA以及丙酮酸到柠苹酰-CoA，柠苹酰-CoA到柠苹酸，柠苹酸到柠康酸，以及柠康酸到甲基丙烯酸酯；乌头酸到衣康酸，衣康酸到衣康酰-CoA，衣康酰-CoA到柠苹酰-CoA，柠苹酰-CoA到柠苹酸，柠苹酸到中康酸，中康酸到甲基丙烯酸酯类，以及诸如此类，如本文所述的反应以及图1中所显示的示例性甲基丙烯酸途径中所显示的那些底物以及产品。本领域的技术人员会理解这些仅仅是示例性以及基于本文的教导，本领域的技术人员可以容易地确定本文披露的任何适于生产所需产品以及具有从底物到产品的转化所需的适当活性的底物-产品对。因此，本发明提供了一种包含编码酶或者蛋白质的至少一种外源性核酸的非天然存在的微生物，其中该酶或者蛋白质转化甲基丙烯酸途径的底物以及产品，如图1中所示。此外，提供包含如下酶的甲基丙烯酸途径：乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶（或巴豆酰基-CoA水合酶，4-羟基）；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶（见实施例XXII以及图21）。还提供包含如下酶的甲基丙烯酸途径：乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶（见实施例XXII以及图21）。
虽然本文中一般地描述了一种包含甲基丙烯酸途径的微生物，但是可以理解的是，本发明另外提供了一种非天然存在的微生物，该微生物包括编码甲基丙烯酸途径酶的以足以产生甲基丙烯酸途径的中间体的量表达的至少一种外源性核酸。例如，如本文所披露，甲基丙烯酸途径的示例见图1。因此，除了包含生产甲基丙烯酸的甲基丙烯酸途径的微生物，本发明还提供了一种包括编码甲基丙烯酸途径酶的至少一种外源性核酸的非天然存在的微生物，其中该微生物生产甲基丙烯酸途径中间体，例如，柠苹酰-CoA、衣康酰-CoA、衣康酸、柠康酸、柠苹酸以及中康酸。
理解的是，本文披露的，如实施例中所述的以及附图1-30的途径中示范的任何途径可用以生成一种根据需要生产任何途径中间体或者产品的非天然存在的微生物。如本文所披露，这类生产中间体的微生物可以与另一种表达下游途径酶的微生物组合使用，以生产所需的产品。然而，理解的是，生产甲基丙烯酸途径中间体的非天然存在的微生物可用以将该中间体作为所需的产品来生产。
本发明还部分地针对经设计的生物合成途径，以改善通向甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的路径中通过中央新陈代谢中间体的碳通量。本发明提供具有一种或多种外源性基因的非天然存在的微生物，所述基因编码可以在通向甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的路径中催化各种酶催转换的酶。在某些实施方式中，这些酶催转换是还原三羧酸（RTCA）循环的一部分以及被用于改善产物收率（包括但不仅限于基于碳水化合物的碳原料的产物收率）。
在众多工程途径中，还原当量不足或还原当量和/或碳消耗为副产物阻碍了基于碳水化合物原料的最大产品收率的实现。根据某些实施方式，本发明通过如下方式提高甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的收率：（i）经由还原TCA循环增强碳固定；和/或（ii）使用来自气态碳源和/或合成气组分（如CO、CO2和/或H2）的额外还原当量。除了合成气，这类气体的其他来源包括但不仅限于如自然界中发现或生成的大气。
CO2固定还原三羧酸（RTCA）循环是利用还原当量以及ATP（图12）的CO2同化的吸能合成代谢途径。一轮RTCA循环将2mol的CO2同化为1mol的乙酰基-CoA；或将4mol的CO2同化为1mol的草酰乙酸。乙酰基-CoA的这种附加可用性改善了衍生自基于碳水化合物的碳原料的产物分子的最大理论收率。示例性碳水化合物包括但不仅限于葡萄糖、蔗糖、木糖、***糖以及甘油。
在某些实施方式中，该还原TCA循环耦合有一氧化碳脱氢酶和/或氢化酶，可以被用于允许微生物利用合成气、CO2、CO、H2和/或其他气态碳源。具体地，合成气体（合成气）是一种主要含H2和CO，有时包括一定量的CO2的混合物，其可以通过气化任何有机原料（如煤炭、煤油、天然气、生物质或有机废物）获得。已经开发了多种气化工艺，以及大多数设计是基于部分氧化，其中高温（500-1500℃）下，有限的氧避免了有机材料的充分燃烧，以提供作为0.5:1-3:1H2/CO混合物的合成气。除了煤炭之外，还有许多类型的生物质已经被用于合成气生产并代表了一种用于可再生化学品和燃料的生物生产的廉价且灵活的原料。二氧化碳可以从大气中或以浓缩形式（例如从缸筒中）或者经由固态CO2升华提供。类似地，CO和氢气可以以试剂形式提供和/或以任何所需的比例混合。其他气态碳形式可以包括，例如甲醇或类似的挥发性有机溶剂。
合成气体和/或其他碳源的组分可以提供还原TCA循环运行所需的足量CO2、还原当量和ATP。一轮RTCA循环将2mol的CO2同化为1mol的乙酰基-CoA并需要2份ATP和4份还原当量。CO和/或H2可以分别通过一氧化碳脱氢酶和氢化酶提供还原当量。还原当量的形式可以是NADH、NADPH、FADH、被还原的醌类、被还原的铁氧还蛋白、被还原的黄素氧化还原蛋白以及硫氧还蛋白。该还原当量，具体地是NADH、NADPH以及被还原的铁氧还蛋白，可以作为RTCA循环酶（例如，苹果酸脱氢酶；富马酸还原酶；α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（替代性地，称为2-氧代戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、α-酮戊二酸合酶或2-氧代戊二酸合酶）；丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶以及异柠檬酸脱氢酶）的辅因子。来自这些还原当量的电子可以替代性地通过产生离子梯度的电子运输链，其中它们被传送到受体，如氧、硝酸盐、氧化的金属离子、质子或电极。该离子梯度然后可以用于经由ATP合酶或类似酶生成ATP。
据报道，该还原TCA循环首次发现于绿硫光合细菌泥生绿菌中(Evans等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.55:928-934(1966))。类似途径已经被表征于某些原核生物（变形菌门、绿硫细菌以及嗜热Knallgas细菌）以及依赖硫的古生菌中(Hugler等人,J.Bacteriol.187:3020-3027(2005;Hugler等人,Environ.Microbiol.9:81-92(2007).在某些情况下，还原以及氧化（Krebs）TCA循环存在于相同的生物中（Hugler等人，同上（2007）；Siebers等人，J.Bacteriol.186:2179-2194（2004））。一些产甲烷菌和专性厌氧微生物具有不完整的氧化或还原TCA循环，该循环可以起作用，以合成生物合成的中间体(Ekiel等人,J.Bacteriol.162:905-908(1985);Wood等人,FEMSMicrobiol.Rev.28:335-352(2004))。
该还原TCA循环的关键碳固定酶是α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶以及异柠檬酸脱氢酶。额外的碳可以在通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸或通过苹果酸酶将丙酮酸转化为苹果酸的过程中得以固定。
该TCA循环中的许多酶是可逆的以及可以按还原和氧化方向催化反应。然而，一些TCA循环反应则是活体内不可逆的以及因此，不同的酶被用于按逆向TCA循环所需的方向催化这些反应。这些反应是：（1）柠檬酸到草酰乙酸以及乙酰基-CoA的转化；（2）富马酸到琥珀酸的转化；以及（3）琥珀酰-CoA到α-酮戊二酸的转化。在该TCA循环中，柠檬酸形成自草酰乙酸以及乙酰基-CoA的冷凝。柠檬酸到草酰乙酸以及乙酰基-CoA的逆向反应、裂解是依赖ATP的以及通过ATP-柠檬酸裂解酶或柠檬酰基-CoA合成酶以及柠檬酰基-CoA裂解酶催化。替代性地，柠檬酸裂解酶可以连接到乙酰基-CoA合成酶、乙酰基-CoA转移酶或磷酸转乙酰基酶以及醋酸激酶，以从柠檬酸形成乙酰基-CoA以及草酰乙酸。琥珀酸到富马酸的转化通过琥珀酸脱氢酶催化，而逆向反应则通过富马酸还原酶催化。在该TCA循环中，琥珀酰-CoA形成自通过α-酮戊二酸脱氢酶复合体的α-酮戊二酸的依赖NAD(P)+的脱羧。逆向反应则通过α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶催化。
能够利用该逆向三羧酸循环以在1）CO；2）CO2和H2；3）CO和CO2；4）包含CO和H2的合成气体；以及5）包含CO、CO2和H2的合成气体或其他气态碳源上实现乙酰基-CoA源的产物的生产的生物可以包括任何如下酶活性：ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸还原酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；醋酸激酶；磷酸转乙酰基酶；乙酰基-CoA合成酶；乙酰基-CoA转移酶；丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶；一氧化碳脱氢酶；氢化酶；以及铁氧还蛋白（见图13）。本文描述了酶以及这些活性所需的相应基因。
来自合成气或其他气态碳源的碳可以经由该逆向TCA循环及其组分固定。具体地，具有用于从乙酰基-CoA形成甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的途径的某些碳气体利用途径组分的组合通过提供用于将外源性地提供或从CO内源性地生产的二氧化碳中存在的碳固定到乙酰基-CoA中的高效机制获得这些产物的高收率。
在某些实施方式中，本发明的一种非天然存在的微生物中的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径可以利用（1）CO；（2）CO2；（3）H2的任何组合或其混合物，以提高除了驱动该还原TCA循环之外，还涉及还原的生物合成步骤的收率。
在某些实施方式中，一种具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物包括编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸。该至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶、柠檬酸裂解酶、富马酸还原酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；以及至少一种外源性酶选自以允许利用（1）CO；（2）CO2；（3）H2；（4）CO2和H2；（5）CO和CO2；（6）CO和H2或（7）CO、CO2和H2的足够的量表达的一氧化碳脱氢酶、氢化酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶以及铁氧还蛋白。
在某些实施方式中，一种方法包括培养一种非天然存在的微生物，该微生物具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径，该途径还包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸。该至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶、柠檬酸裂解酶、富马酸还原酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。另外地，这样一种生物还可以包括选自如下以允许利用（1）CO；（2）CO2；（3）H2；（4）CO2和H2；（5）CO和CO2；（6）CO和H2或（7）CO、CO2和H2以生产产品的足够的量表达的至少一种外源性酶：一氧化碳脱氢酶、氢化酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶以及铁氧还蛋白。
在某些实施方式中，一种具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物进一步包括以足以提高通过乙酰基-CoA的碳通量的量表达的还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸。该至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；异柠檬酸脱氢酶；乌头酸酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。
在某些实施方式中，一种具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物包括编码酶的至少一种外源性核酸，所述酶以足以提高存在一氧化碳和/或氢时还原当量的可用性的量表达，从而提高经由基于碳水化合物的碳原料的氧化还原受限的产物的收率。该至少一种外源性核酸选自一氧化碳脱氢酶；氢化酶；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶以及铁氧还蛋白。在某些实施方式中，本发明提供了一种用于提高存在一氧化碳或氢时还原当量的可用性，从而提高经由基于碳水化合物的碳原料（如糖类或气态碳源）的氧化还原受限的产物的收率的方法，该方法包括在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养这种非天然存在的微生物。
在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物包括两种外源性核酸，每种均编码还原TCA途径酶。在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物包括三种外源性核酸，每种均编码还原TCA途径酶。在某些实施方式中，该非天然存在的微生物包括编码ATP-柠檬酸裂解酶、富马酸还原酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的三种外源性核酸。在某些实施方式中，该非天然存在的微生物包括编码柠檬酸裂解酶、富马酸还原酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的三种外源性核酸。在某些实施方式中，该非天然存在的微生物包括编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶的四种外源性核酸。在某些实施方式中，该非天然存在的微生物包括编码CO脱氢酶以及H2氢化酶的两种外源性核酸。
在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物进一步包括编码选自如下酶的外源性核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；醋酸激酶；磷酸转乙酰基酶；乙酰基-CoA合成酶；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶；及其组合。
在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物进一步包括编码选自如下酶的外源性核酸：一氧化碳脱氢酶；乙酰基-CoA合酶；铁氧还蛋白；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶；及其组合。
在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物利用选自如下的碳原料：（1）CO；（2）CO2；（3）CO2和H2；（4）CO和H2或（5）CO、CO2和H2。在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物将氢用于还原当量。在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物将CO用于还原当量。在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物将CO和氢的组合用于还原当量。
在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物进一步包括编码选自如下酶的一种或多种核酸磷酸：烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶以及苹果酸酶。
在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物进一步包括编码选自如下酶的一种或多种核酸：苹果酸脱氢酶、富马酸酶、富马酸还原酶、琥珀酰-CoA合成酶以及琥珀酰-CoA转移酶。
在某些实施方式中，该具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的非天然存在的微生物可以具有或可选地进一步包括编码如下的至少一种外源性核酸：柠檬酸裂解酶；ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酰基-CoA合成酶；柠檬酰基-CoA裂解酶；乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；醋酸激酶；磷酸转乙酰基酶；乙酰基-CoA合成酶以及铁氧还蛋白。
本领域技术人员理解的是，本文所描述的用于提高产品收率的途径可以结合本文所披露的任何途径，包括附图中描述的那些途径。本领域技术人员将理解的是，根据通向所需产品的途径和该途径的前体和中间体，本文所讨论的以及在实施例中的用于提高产品收率的特定途径或这种途径的组合可以结合通向所需产品的途径使用，以增加该产品或途径中间体的收率。
本发明还提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有甲基丙烯酸途径的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸；所述非天然存在的微生物进一步包含:（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；其中所述甲基丙烯酸途径包含选自如下的途径：（a）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶；（b）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；（c）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）、柠康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；（d）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）以及中康酸脱羧酶；（e）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶；（f）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；（g）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）以及中康酸脱羧酶；（h）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；（i）乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；（j）乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；（k）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶；（l）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；（M）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）以及中康酸脱羧酶；（n）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；（o）3-羟基异丁酸酯脱水酶；（p）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；（q）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；（r）甲基丙二酰基-CoA变位酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；（s）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；（t）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶；（u）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶；（v）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；（w）天冬氨酸氨基转移酶、谷氨酸变位酶、3-甲基天冬氨酸酶以及中康酸脱羧酶；（x）α-酮戊二酸还原酶、2-羟基谷氨酸变位酶、3-甲基苹果酸脱水酶以及中康酸脱羧酶；（y）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA转移酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶；（z）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；烯酰基-CoA水合酶；以及3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；（aa）4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶；巴豆酸酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA转移酶的任何一种；（bb）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；（cc）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；丁酰基-CoA脱氢酶；异丁酰基-CoA变位酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；（dd）乳酸脱氢酶、乳酸-CoA转移酶、乳酰基-CoA脱水酶、酰基-CoA脱氢酶、丙酰基-CoA羧化酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；（ee）缬氨酸氨基转移酶；2-酮异戊酸脱氢酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；（ff）缬氨酸氨基转移酶；2-酮异戊酸脱氢酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；乙酰乳酸合酶；乙酰羟酸还原异构酶以及二羟酸脱水酶；（gg）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；以及（hh）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶。
此外，本发明提供了一种具有2-羟基异丁酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码2-羟基异丁酸途径酶的以足以生产2-羟基异丁酸的量表达的至少一种外源性核酸。这样一种非天然存在的微生物可以进一步包含（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中该至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中该至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；其中该2-羟基异丁酸途径包含选自如下的途径：（a）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；以及2-羟基异丁酰基-CoA转移酶或2-羟基异丁酰基-CoA水解酶或2-羟基异丁酰基-CoA合成酶；以及（b）4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶；巴豆酸酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；以及2-羟基异丁酰基-CoA水解酶或2-羟基异丁酰基-CoA合成酶或2-羟基异丁酰基-CoA转移酶的任何一种（见图16C）。该非天然存在的微生物可以包含两种、三种、四种或五种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸途径酶，乃至该途径的所有酶。
本发明进一步提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有3-羟基异丁酸途径的微生物，该途径包含编码3-羟基异丁酸途径酶的以足以生产3-羟基异丁酸的量表达的至少一种外源性核酸。该非天然存在的微生物可以进一步包含（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中该至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶；以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；其中该3-羟基异丁酸途径包含选自如下的途径：（a）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；以及（b）4-羟基丁酰基-CoA变位酶以及3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶（见图16B）。该非天然存在的微生物可以包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸途径酶。
本发明还提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有3-羟基异丁酰基-CoA途径的微生物，该途径包含编码3-羟基异丁酸途径酶的以足以生产3-羟基异丁酸的量表达的至少一种外源性核酸。该非天然存在的微生物可以进一步包含（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中该至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中该至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；其中该3-羟基异丁酰基-CoA途径包含4-羟基丁酰基-CoA变位酶（见图16B）。
在进一步的实施方式中，包含（i）的微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；醋酸激酶；磷酸转乙酰基酶；乙酰基-CoA合成酶；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶；铁氧还蛋白；及其组合；包含（ii）的微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；及其组合。
这样一种微生物可以包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸途径酶，乃至途径的所有酶。例如，该微生物可以包含（a）编码柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶的三种外源性核酸；（b）编码柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶的四种外源性核酸；（c）编码柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）、柠康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶的四种外源性核酸；（d）编码柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）以及中康酸脱羧酶的三种外源性核酸；（e）编码柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；以及柠康酸脱羧酶的四种外源性核酸；（f）编码柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶；以及中康酸脱羧酶的五种外源性核酸；（g）编码柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；以及中康酸脱羧酶的四种外源性核酸；（h）编码柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶；以及柠康酸脱羧酶的五种外源性核酸；（i）编码乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶的三种外源性核酸；（j）编码乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶的四种外源性核酸；（k）编码乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；以及柠康酸脱羧酶的六种外源性核酸；（l）编码乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶；以及中康酸脱羧酶的七种外源性核酸；（M）编码乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；以及中康酸脱羧酶的六种外源性核酸；或（n）编码乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶；以及柠康酸脱羧酶的七种外源性核酸；（o）编码3-羟基异丁酸酯脱水酶的一种外源性核酸；（p）编码甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶的四种外源性核酸；（q）编码甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶的五种外源性核酸；（r）编码甲基丙二酰基-CoA变位酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶的三种外源性核酸；（s）编码甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶的四种外源性核酸；（t）编码甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶的四种外源性核酸；（u）编码甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶的五种外源性核酸；（v）编码4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶的三种外源性核酸；（w）编码天冬氨酸氨基转移酶、谷氨酸变位酶、3-甲基天冬氨酸酶以及中康酸脱羧酶的四种外源性核酸；（x）编码α-酮戊二酸还原酶、2-羟基谷氨酸变位酶、3-甲基苹果酸脱水酶以及中康酸脱羧酶的四种外源性核酸；（y）编码乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA转移酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶的五种外源性核酸；（z）编码乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；烯酰基-CoA水合酶；以及3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶的七种外源性核酸；（aa）编码4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶；巴豆酸酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA转移酶的任何一种的六种外源性核酸；（bb）编码4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶的三种外源性核酸；（cc）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；丁酰基-CoA脱氢酶；异丁酰基-CoA变位酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；（dd）乳酸脱氢酶、乳酸-CoA转移酶、乳酰基-CoA脱水酶、酰基-CoA脱氢酶、丙酰基-CoA羧化酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；（ee）缬氨酸氨基转移酶；2-酮异戊酸脱氢酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；（ff）缬氨酸氨基转移酶；2-酮异戊酸脱氢酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；乙酰乳酸合酶；乙酰羟酸还原异构酶以及二羟酸脱水酶；（gg）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；以及（hh）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶。
在另一实施方式中，微生物可以包含两种、三种、四种或五种外源性核酸，每种均编码（i）、（ii）或（iii）的酶。例如，包含（i）的微生物可以包含编码ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的四种外源性核酸；包含（ii）的微生物可以包含编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶；以及H2氢化酶的五种外源性核酸；或包含（iii）的微生物可以包含两种外源性核酸编码CO脱氢酶以及H2氢化酶。
此外，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有2-羟基异丁酸途径的微生物，该途径包含编码2-羟基异丁酸途径酶以足以生产2-羟基异丁酸的量表达的至少一种外源性核酸；其中所述2-羟基异丁酸途径酶选自图16C中所显示的那些酶；所述非天然存在的微生物进一步包含：（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有3-羟基异丁酸途径的微生物，该途径包含编码3-羟基异丁酸途径酶的以足以生产3-羟基异丁酸的量表达的至少一种外源性核酸；其中所述2-羟基异丁酸途径酶选自图16B中显示的那些酶；所述非天然存在的微生物进一步包含（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合。
本发明部分地旨在将合成气或其组分、氢、二氧化碳以及一氧化碳作为还原当量的源来提高产品的理论收率。在众多工程途径中，还原当量不足或还原当量和/或碳消耗为副产物阻碍了基于碳水化合物原料的最大产品收率的实现。如果氢和/或一氧化碳可以提供足够的还原当量，则碳水化合物原料上一些产品的理论收率会大幅上升。例如，当存在H2时，MAA、2-羟基异丁酸酯以及3-羟基异丁酸酯的理论收率提高到2mol/mol葡萄糖。
还原当量或电子可以分别利用一氧化碳脱氢酶（CODH）以及氢化酶提取自合成气体组分（如CO和H2）。该还原当量然后被传送到受体，如被氧化的铁氧还蛋白、被氧化的醌类、被氧化的细胞色素、NADP+、水或过氧化氢，以分别形成被还原的铁氧还蛋白、被还原的醌类、被还原的细胞色素、NAD(P)H、H2或水。被还原的铁氧还蛋白和NAD(P)H是特别有用的，因为它们可以作为用于各种Wood-Ljungdahl途径以及还原TCA循环酶的氧化还原载体。
本文中，我们展示关于来自CO和/或H2的附加氧化还原可用性如何可以改善被还原的产物（如甲基丙烯酸、2-羟基异丁酸酯以及3-羟基异丁酸酯）的收率的具体实施例。
甲基丙烯酸（MAA）、3-羟基丁酸以及2-羟基异丁酸是示例性被还原的产品。通过发酵生产MAA的理论收率是1.33mol MAA/mol葡萄糖。最常见的是，将原料丙酮以及氰化氢作为原料从丙酮氰醇（ACH）路径进行生产。用硫酸将中间体氰醇转化为甲基丙烯酰胺的硫酸酯，所述硫酸酯水解提供硫酸氢铵和MAA。其他生产商以异丁烯或，等价地，叔丁醇开始，经氧化成为异丁烯醛，并再次氧化成为甲基丙烯酸。然后用甲醇将MAA酯化为MMA。甲基丙烯酸在工业上被用于制备其酯类，统称为甲基丙烯酸酯，如甲基丙烯酸甲酯。甲基丙烯酸酯，尤其是在聚合物的制造中，具有多种用途。
C6H12O6→1.33C4H6O2+0.67CO2+2H2O
当将联合原料策略应用到MAA生产时，从合成气生成的还原当量可以通过图16A和图16B中详述的途径将从葡萄糖到MAA的理论收率提高到2mol MAA/mol葡萄糖。
1C6H12O6+2CO2+6H2→2C4H6O2+6H2O
或者
1C6H12O6+2CO+4H2→2C4H6O2+4H2O
类似地，通过发酵对3-羟基异丁酸的生产可以通过该联合原料策略得以改善。通过发酵对3-羟基异丁酸的生产具有1.33mol3-羟基异丁酸/mol葡萄糖的理论收率。
3C6H12O6→4C4H8O3+2CO2+2H2O
当将该联合原料策略应用到3-羟基异丁酸生产时，从合成气生成的还原当量可以通过图16A和图16B中详述的途径将从葡萄糖到3-羟基异丁酸的理论收率提高到2mol3-羟基异丁酸/mol葡萄糖。
1C6H12O6+2CO2+6H2→2C4H8O3+4H2O
类似地，通过发酵对2-羟基异丁酸的生产可以通过该联合原料策略得以改善。通过发酵对2-羟基异丁酸的生产具有1.33mol2-羟基异丁酸/mol葡萄糖的理论收率。
3C6H12O6→4C4H8O3+2CO2+2H2O
当将该联合原料策略应用到3-羟基异丁酸生产时，从合成气生成的还原当量可以通过图16B中详述的途径将从葡萄糖到3-羟基异丁酸的理论收率提高到2mol2-羟基异丁酸/mol葡萄糖。
1C6H12O6+2CO2+6H2→2C4H8O3+4H2O
本发明还部分地旨在通过经由该还原TCA循环增强碳固定来改善通向产物分子的路径中通过中央新陈代谢中间体乙酰基-CoA的碳通量。示例性产物分子包括甲基丙烯酸和2-羟基异丁酸酯，虽然有了本文所提供的教导，本领域的技术人员将认识到，任何将乙酰基-CoA作为基础材料的产物分子可以通过增加通过乙酰基-CoA的碳通量表现出增加的产量。本发明提供具有一种或多种外源性基因的非天然存在的微生物，所述基因编码可以在通向乙酰基-CoA的路径中催化各种酶催转换的酶。在某些实施方式中，这些酶催转换是还原三羧酸（RTCA）循环的一部分以及被用于改善基于碳水化合物的碳原料的产物收率。在其他实施方式中，这些酶催转换是Wood-Ljungdahl途径的一部分。
CO2固定还原三羧酸（RTCA）循环是利用NAD(P)H以及ATP的CO2同化的吸能合成代谢途径。一轮RTCA循环将2mol的CO2同化为1mol的乙酰基-CoA；或将4mol的CO2同化为1mol的草酰乙酸。乙酰基-CoA的这种附加可用性改善了衍生自基于碳水化合物的碳原料的产物分子的最大理论收率。示例性碳水化合物包括但不仅限于葡萄糖、蔗糖、木糖、***糖以及甘油。注意，本文所述的示例性产物分子的途径均通过乙酰基-CoA进行。
不存在还原TCA循环活性时，经由图16C、图16D和图16E中显示的途径从糖类生产MAA的最大收率是1mol MAA/mol消耗的葡萄糖。通过该还原TCA循环的碳固定将这些途径的收率提高到从糖类到MAA的最大理论收率。图16C和图16D是示例性通量分布，其显示了通过该还原TCA循环生成的附加碳如何将这些途径生产的甲基丙烯酸的收率从1mol/mol葡萄糖提高到1.33mol/mol葡萄糖。
C6H12O6→1.33C4H6O2+0.67CO2+2H2O
在一个实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有甲基丙烯酸酯类途径的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸；所述非天然存在的微生物进一步包含：（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；其中所述甲基丙烯酸酯类途径包含醇转移酶或酯形成酶，以及脱水酶。在一个方面，该脱水酶将3-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸酯转化为所述甲基丙烯酸酯类。在一个方面，该醇转移酶将3-羟基异丁酰基-CoA转化为3-羟基异丁酸酯或将2-羟基异丁酰基-CoA转化为2-羟基异丁酸酯。
在一个实施方式中，本发明提供了一种微生物，其中该微生物进一步包含甲基丙烯酸酯类途径，该途径包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸，所述甲基丙烯酸酯类途径包含选自如下的途径：（a）3-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或3-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；醇转移酶；以及脱水酶；（b）3-羟基异丁酸酯形成酶和脱水酶；（c）2-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或2-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；醇转移酶；以及脱水酶；或（d）2-羟基异丁酸酯形成酶和脱水酶。在另一方面，包含（i）的微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；醋酸激酶；磷酸转乙酰基酶；乙酰基-CoA合成酶；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶；铁氧还蛋白；及其组合。在另一方面，包含（ii）的微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；及其组合。
在一个方面，该微生物包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸途径酶。在另一方面，该两种外源性核酸编码醇转移酶以及脱水酶；或替代性地，编码酯形成酶和脱水酶。
在一个实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其中包含（i）的所述微生物包含编码ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的四种外源性核酸；其中包含（ii）的所述微生物包含编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶；以及H2氢化酶的五种外源性核酸；或者，其中包含（iii）的所述微生物包含编码CO脱氢酶以及H2氢化酶的两种外源性核酸。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸酯类的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸酯类这么长的时间内培养本文所述的非天然存在的微生物。
本文一般地参照新陈代谢反应、反应物或其产物，或者具体地参照一种或多种编码酶（所述酶与所参照的新陈代谢反应、反应物或产物有关或者催化所参照的新陈代谢反应、反应物或产物）的核酸或基因对本发明进行描述。除非本文另有明确规定，本领域的技术人员会理解对反应的参照也构成了对所述反应的反应物以及产物的参照。同样，除非本文另有明确规定，对反应物或产物的参照也是对反应的参照，以及对任何这些新陈代谢组分的参照也是参照一种或者多种的编码酶或蛋白质的基因，所述酶催化所参照的反应、反应物或产物以及所述蛋白质包含在所参照的反应、反应物或产物中。同样地，考虑到熟知的新陈代谢生物化学、酶学和基因组学领域，本文对基因或编码核酸的参照也构成对相应的被编码的酶和其催化的反应；或者与所述反应以及所述反应的反应物和产物相关的蛋白质的参照。
如本文所披露，产品甲基丙烯酸以及其他中间体是可以以不同的离子化形式（包括完全质子化的、部分质子化的和完全去质子化的形式）发生的羧酸。因此，后缀“酯”或酸形式可以互换使用，以描述游离酸形式以及任何去质子化的形式，特别是因为，已知离子化形式依赖于化合物被发现时的pH。理解的是，羧化物产品或者中间体包括羧化物产品或者途径中间体的酯形式，例如O-羧酸酯和S-羧酸酯。O-羧化物和S-羧化物可以包括较低级的烷基，即C1到C6的支链或者直链羧化物。一些这类O-羧化物或S-羧化物包括但不仅限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基O-羧化物或S-羧化物，其中任何一种可以进一步具有不饱和，提供例如丙烯基、丁烯基、戊基和己烯基O-羧化物或S-羧化物。O-羧化物可以是生物合成途径的产物。经由生物合成途径获得的示例性的O-羧化物可以包括但不仅限于甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯以及甲基丙烯酸正丙酯。其他可通过生物合成获得的O-羧化物可以包括中链到长链基团，即衍生自脂肪族醇（例如庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、月桂醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、棕榈醇、十七醇、十八醇、十九醇、花生醇、二十一醇和二十二醇）的C7-C22O-羧酸酯，其中任何一种可以可选地是支链的和/或包含不饱和。O-羧酸酯还可以经由化学过程（例如游离羧酸产品的酯化作用或者O-羧化物或S-羧化物的转酯作用）获得。S-羧化物的例子是CoA S-酯类、半胱氨酰S-酯类、烷基硫酯类以及各种芳基和杂芳基硫酯类。另外地，已经提出经由甲基丙烯醛基-CoA中间体形成甲基丙烯酸酯类（WO/2007/039415以及美国专利号7,901,915）。甲基丙烯醛基-CoA可以利用WO/2007/039415以及美国专利号7,901,915中所述的甲基丙烯醛基-CoA合成酶或通过应用甲基丙烯醛基-CoA转移酶（见图2以及实施例III）形成自甲基丙烯酸酯类。异丁烯酰基-CoA转移酶可以将CoA部分从几种CoA供体转移到甲基丙烯酸酯类，所述供体包括但不仅限于乙酰基-CoA、琥珀酰-CoA、丁酰基-CoA以及丙酰基-CoA。甲基丙烯酸酯类可以形成自图1中所描绘的途径或WO/2009/135074或U.S.公开2009/0275096中所述的途径。异丁烯酰基-CoA可以替代性地，经由WO/2009/135074中所述的2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶、3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶、3-羟基异丁酸酯脱水酶或异丁酰基-CoA脱氢酶产自2-羟基异丁酰基-CoA、3-羟基异丁酰基-CoA、3-羟基异丁酸酯或异丁酰基-CoA。
因此，本发明附加地提供用于生产甲基丙烯酸酯类的微生物。这类生物可以包含甲基丙烯酸酯类途径，该途径包含异丁烯酰基-CoA转移酶。这样一种微生物可以进一步包含甲基丙烯酸酯类途径，该途径包含异丁烯酰基-CoA合成酶和/或醇转移酶（见图2以及实施例III）。可理解的是，这样一种生产甲基丙烯酸酯类的生物可以经设计以包含一种包含甲基丙烯酸或异丁烯酰基-CoA途径的微生物，该途径包括但不仅限于本文披露的（见实施例I和V-XIV以及图1-11）或WO2009/135074或U.S.公开2009/0275096中所述的甲基丙烯酸途径。因此，所披露的生产甲基丙烯酸的任何微生物可以进一步包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸酯类途径包含异丁烯酰基-CoA合成酶、异丁烯酰基-CoA转移酶以及醇转移酶。甲基丙烯酸到甲基丙烯酸酯类的示例性酶催和化学转化如实施例IV中所述。
因此，本发明附加地提供了一种包含甲基丙烯酸酯类途径以及进一步包含本文披露的甲基丙烯酸途径（包括图1和图3-11以及实施例I和实施例V-XIV中所述的甲基丙烯酸途径）的微生物。在特定的实施方式中，包含甲基丙烯酸酯类途径的微生物进一步包含选自如下的甲基丙烯酸途径：3-羟基异丁酸酯脱水酶；甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；甲基丙二酰基-CoA变位酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶；甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶，3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶，以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；天冬氨酸氨基转移酶、谷氨酸变位酶、3-甲基天冬氨酸酶以及中康酸脱羧酶；α-酮戊二酸还原酶、2-羟基谷氨酸变位酶、3-甲基苹果酸脱水酶以及中康酸脱羧酶；乙酰乙酰基-CoA硫解酶，乙酰乙酰基-CoA还原酶，3-羟基丁酰基-CoA变位酶，2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶，以及异丁烯酰基-CoA转移酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶；乙酰乙酰基-CoA硫解酶，乙酰乙酰基-CoA还原酶，3-羟基丁酰基-CoA变位酶，2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶，烯酰基-CoA水合酶，以及3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶，以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶，乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰基-CoA变位酶，2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶，以及异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA转移酶的任何一种；以及4-羟基丁酰基-CoA变位酶，3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶，以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶（见实施例V-XIV）。
示例性能生产甲基丙烯酸的非天然存在的微生物如本文所披露。例如，提供甲基丙烯酸途径，其中琥珀酰-CoA是前体（见实施例V-VI、图3以及图4）。在一个实施方式中，一种非天然存在的微生物具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶（见实施例V和VI以及图3）。在另一实施方式中，一种非天然存在的微生物具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶（见实施例V）。另外地，一种非天然存在的微生物可以具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶（见实施例VI以及图4）。
此外，提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径将4-羟基丁酰基-CoA作为前体。一种这类实施方式是一种具有甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶（见实施例VII以及图5）。替代性地，该途径可以包括4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶。
进一步提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径将α-酮戊二酸作为前体。一种这类实施方式是一种具有甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含天冬氨酸氨基转移酶、谷氨酸变位酶、3-甲基天冬氨酸酶以及中康酸脱羧酶（见实施例VIII以及图6）。在仍然另一实施方式中，一种非天然存在的微生物具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含α-酮戊二酸还原酶、2-羟基谷氨酸变位酶、3-甲基苹果酸脱水酶以及中康酸脱羧酶（见实施例IX以及图7）。
在仍然另一实施方式中，一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径将乙酰基-CoA作为前体。例如，一种非天然存在的微生物可以具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA转移酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶（见实施例X以及图8）。在另一实施方式中，一种非天然存在的微生物具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；烯酰基-CoA水合酶；以及3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶（见实施例X）。
在进一步的实施方式中，非天然存在的微生物可以包含将4-羟基丁酰基-CoA作为前体的甲基丙烯酸。例如，一种非天然存在的微生物具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶；巴豆酸酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA转移酶（见实施例XIV以及图8）。
在仍然另一实施方式中，一种非天然存在的微生物具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；丁酰基-CoA脱氢酶；异丁酰基-CoA变位酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶（见实施例XI以及图9）。
进一步提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径将丙酮酸作为前体。例如，一种非天然存在的微生物可以具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乳酸脱氢酶、乳酸-CoA转移酶、乳酰基-CoA脱水酶、酰基-CoA脱氢酶、丙酰基-CoA羧化酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶（见实施例XII以及图10）。
还提供了一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物，该途径将2-酮异戊酸作为前体。例如，一种非天然存在的微生物可以具有甲基丙烯酸途径，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含缬氨酸氨基转移酶；2-酮异戊酸脱氢酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶（见实施例XIII以及图11）。这类甲基丙烯酸途径可以进一步包含将缬氨酸转化为2-酮异戊酸（图11）的缬氨酸氨基转移酶。另外，这类甲基丙烯酸途径可以进一步包含将丙酮酸转化为2-酮异戊酸（图11）的酶，如乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶以及二羟酸脱水酶（见实施例XIII）。
本发明还提供了一种具有甲基丙烯酸酯类途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸酯类途径包含异丁烯酰基-CoA转移酶和醇转移酶。在进一步的实施方式中，这类甲基丙烯酸酯类途径可以进一步包含异丁烯酰基-CoA合成酶。在特定的实施方式中，该具有甲基丙烯酸酯类途径的微生物可以包含编码异丁烯酰基-CoA以及醇转移酶的两种外源性核酸。在仍然进一步的实施方式中，本发明提供了一种具有甲基丙烯酸酯类途径的微生物，其可以包含编码异丁烯酰基-CoA合成酶、异丁烯酰基-CoA转移酶以及醇转移酶的三种外源性核酸。
本发明所述的非天然存在的微生物可以通过引入可表达的核酸来生产，该核酸编码一种或者多种的参与一种或者多种的甲基丙烯酸生物合成途径的酶。根据选定用于生物合成的宿主微生物，可以表达用于部分或者全部的具体甲基丙烯酸生物合成途径的核酸。例如，如果在所需的生物合成途径中，选定的宿主存在一种或者多种的酶的缺陷，则将用于缺陷的一种或者多种的酶或蛋白质的可表达的核酸引入该宿主用于后续的外源性表达。替代性地，如果该选定的宿主显示出一些途径酶的内源性表达，但是在其他方面存在缺陷，则需要用于缺陷的一种或者多种的酶或蛋白质的编码核酸，以实现甲基丙烯酸的生物合成。因此，可以通过引入外源酶或者蛋白质活性以获得所需的生物合成途径来生产本发明的非天然存在的微生物或者可以通过引入与一种或者多种内源性的酶或者蛋白质一起生产所需的产品（如甲基丙烯酸）的一种或者多种外源酶或者蛋白质活性以获得所需的生物合成途径。
宿主微生物可以选自以及所述非天然存在的微生物可以生成于，例如细菌、酵母、真菌或各种其他适用于发酵过程的微生物的任意一种。示例性的细菌包括选自如下的物种：大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、菜豆根瘤菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、氧化葡糖杆菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、萤光假单胞菌以及恶臭假单胞菌。示例性的酵母或真菌包括选自如下的物种：酿酒酵母、人体酵母菌探针、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉、毕赤酵母、无根根霉菌、稻根霉菌（Rhizobus oryzae）、解脂耶氏酵母等等。大肠杆菌是一种特别有用的宿主生物（organisms），因为其是一种适于基因工程的具有良好表征的微生物。其他特别有用的宿主生物包括酵母，如酿酒酵母。理解的是，任何适合的宿主微生物可用以引入新陈代谢和/或基因修饰，以生产所需的产品。
依据选定的宿主微生物的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成途径构成，本发明所述的非天然存在的微生物将包括至少一种外源性表达的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的编码核酸乃至用于一种或者多种甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径的所有的编码核酸。例如，通过外源性表达相应的编码核酸在存在途径酶或者蛋白质缺陷的宿主内建立甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成。在存在甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的所有的酶或者蛋白质缺陷的宿主内，可以包含该途径中所有的酶或者蛋白质的外源性表达，虽然理解的是，即使该宿主包含至少一种途径酶或者蛋白质，也可以表达该途径的所有的酶或者蛋白质。例如，可以包含用于生产甲基丙烯酸的途径中所有的酶或者蛋白质的外源性表达，例如柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（1）A/B/C）；柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）、柠康酸异构酶（G）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（2）A/B/G/H）；柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）、柠康酸异构酶（G）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（3）A/F/G/C）；柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（4）A/F/H）；柠苹酰-CoA裂解酶（D），柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E），柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B），以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（5）D/E/B/C）；柠苹酰-CoA裂解酶（D），柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E），柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B），柠康酸异构酶（G），以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（6）D/E/B/G/H）；柠苹酰-CoA裂解酶（D），柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E），柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F），以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（7）D/E/F/H）；柠苹酰-CoA裂解酶（D），柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E），柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F），柠康酸异构酶（G），以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（8）D/E/F/G/C）；乌头酸脱羧酶（I）、衣康酸异构酶（J）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（9）I/J/C）；乌头酸脱羧酶（I）、衣康酸异构酶（J）、柠康酸异构酶（G）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（10）I/J/G/H）；乌头酸脱羧酶（I），衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L），柠苹酰-CoA脱水酶（K），柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E），柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B），以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（11）I/L/K/E/B/C）；乌头酸脱羧酶（I），衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L），柠苹酰-CoA脱水酶（K），柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E），柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B），柠康酸异构酶（G），以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（12）I/L/K/E/B/G/H）；乌头酸脱羧酶（I），衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L），柠苹酰-CoA脱水酶（K），柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E），柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F），以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（13）I/L/K/E/F/H）；以及乌头酸脱羧酶（I），衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L），柠苹酰-CoA脱水酶（K），柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E），柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F），柠康酸异构酶（G），以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（14）I/L/K/E/F/G/C）。
考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员会理解以可表达的形式引入的编码核酸的数量将，至少，等于所选定的宿主微生物的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径缺陷量。因此，本发明的非天然存在的微生物可以根据该途径，具有一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种，包括乃至所有的编码本文披露的构成甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径的酶的核酸。在一些实施方式中，该非天然存在的微生物还可以包括其他促进或者优化甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成或者赋予该宿主微生物其他有用的功能的基因修饰。一种这类的其他功能性可以包括例如，对一种或者多种甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径前体（如乙酰基-CoA、丙酮酸或乌头酸）的合成的增强。
一般地，宿主微生物应该这样选择以便其生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的前体，作为自然生产的分子或作为工程产物，其提供所需前体的从新生产或由该宿主微生物自然生产的前体的增加生产。例如，乌头酸、乙酰基-CoA以及丙酮酸自然产生于宿主生物，如大肠杆菌。宿主生物可以设计以增加前体的生产，正如本文所披露。此外，已被设计以生产所需前体的微生物可用作宿主生物并进一步被设计，以表达甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的酶或蛋白质。
在一些实施方式中，本发明的非天然存在的微生物生成自包含合成甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的酶催能力的宿主。在该特定的实施方式中，其可用以增加甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径产物的合成或堆积以，例如促使发生甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径反应，以便生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯。合成或堆积的增加可以通过，例如编码本文所述的一种或多种甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径酶或蛋白质的核酸的过表达来完成。该一种或多种甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径酶和/或蛋白质的过表达的发生可以，例如通过一种或多种内源性基因的外源性表达或通过一种或多种异源性基因的外源性表达。因此，根据该途径的酶的数目，通过一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种，即乃至所有的编码甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径酶或蛋白质的核酸的过表达，天然存在的生物可以很容易地生成为本发明的，例如生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的非天然存在的微生物。此外，非天然存在的生物可以通过造成甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径中酶活性的增加的内源性基因的诱变来生成。
在特别有用的实施方式中，采用编码核酸的外源性表达。外源性表达赋予对宿主定制表达和/或调节元件的能力以及获得使用人控制的所需的表达水平的应用。然而，其他实施方式中还可以利用内源性表达，例如当连接至诱导型启动子或其他调节元件时，通过去除负调节效应子或基因启动子的诱导利用内源性表达。因此，具有天然存在的诱导型启动子的内源性基因可以通过提供适当的诱导剂上调；或者内源性基因的调节区域可设计以纳入诱导调节元件，从而允许在需要的时候调节内源性基因的上调表达。同样，可以包括诱导型启动子，作为针对引入非天然存在的微生物的外源性基因的调节元件。
理解的是，在本发明的方法中，任何所述一种或者多种外源性核酸可被引入微生物以生产本发明的一种非天然存在的微生物。该核酸可被引入以便赋予该微生物，例如甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径。替代性地，可以引入编码核酸，以生产具有生物合成能力的中间体微生物，以催化所需的反应的一些，从而赋予甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成能力。例如，具有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径的非天然存在的微生物可以包括至少两种编码所需的酶或者蛋白质的外源性核酸，所述酶的例子有如下组合：柠苹酸合酶和柠康酸脱羧酶；柠康酸异构酶和中康酸脱羧酶；或衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶和衣康酸异构酶等等。因此，应理解的是，生物合成途径的两种或两种以上酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中。同样，应理解的是，按照要求，生物合成途径的三种（例如，柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；柠苹酰-CoA裂解酶，柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶以及柠苹酸脱水酶；或乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶以及中康酸脱羧酶等等）或三种以上酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中，只要所需的生物合成途径的酶或蛋白质的组合导致相应的所需产品的产生。同样，按照要求，本文披露的生物合成途径的四种（例如，柠苹酰-CoA裂解酶，柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶，柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及中康酸脱羧酶；乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶等等）或四种以上酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中，包括途径中的乃至所有酶，只要所需的生物合成途径的酶的组合导致相应的所需产品的产生。
除本文所述的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成之外，本发明所述的非天然存在的微生物和方法也可以通过彼此间以及与本领域熟知的其他微生物和方法进行各种组合来应用，以通过其他路径实现产品生物合成。例如，除了使用甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生产者之外，一种生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的替代性方法是通过加入另一种能够将甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中间体转化为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的微生物。一种这样的程序包括例如，生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中间体的微生物的发酵。该甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中间体然后可以用作将甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中间体转化为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的第二微生物的底物。该甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中间体可以被直接加入该第二生物的另一培养物或该甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中间体生产者的原始培养物可以通过，例如细胞分离耗尽这些微生物，然后可以利用将第二生物随后加入发酵肉汤，以生产最终产品而无中间体纯化的步骤。
在其他实施方式中，本发明的所述非天然存在的微生物和方法可以在各种各样的子途径中进行组合，以实现，例如甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成。在这些实施方式中，可以将用于本发明的所需产品的生物合成途径分离到不同的微生物中，以及可以共同培养该不同的微生物，以生产最终产品。在这种生物合成方案中，一种微生物的产物是用于第二微生物的底物，直至合成最终产品。例如，可以通过构建如下微生物完成甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成：该微生物包含用于将一个途径中间体转化为另一途径中间体或产物的生物合成途径。替代性地，也可以通过利用相同器皿内的两种生物的共同培养或共同发酵从微生物生物合成生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯，其中第一种微生物生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体以及第二种微生物将该中间体转化为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯。
考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员会理解存在针对本发明的所述非天然存在的微生物和方法，连同其他微生物、具有子途径的其他非天然存在的微生物的共同培养物以及本领域熟知的生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的其他化学和/或生化程序的组合的各种各样的组合和排列。
用于甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径酶或蛋白质的编码核酸的源可以包括，例如其中被编码的基因产物能够催化参照反应的任何物种。这类物种既包括原核生物又包括真核生物，包括但不仅限于细菌（包括古生细菌和真细菌）以及真核生物（包括酵母）、植物、昆虫、动物以及哺乳动物（包括人）。针对这种源的示例性物种包括，例如埃希氏杆菌属（包括大肠杆菌、弗格森埃希氏菌）；詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）；问号钩体(Leptospirainterrrogans)；硫还原地杆菌；橙色绿屈挠菌；玫瑰弯菌属RS-1；绿曲挠丝状菌；氧化木糖无色杆菌（Achrombacter xylosoxidans）；梭菌属（Clostridia）（其包括克鲁佛氏梭菌、共生梭菌、丙酮丁醇梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、扬氏梭菌、***滴虫G3、布氏锥虫、发酵氨基酸球菌）；梭杆菌属（其包括具核梭杆菌、死亡梭杆菌、谷氨酸棒杆菌）；褐鼠；智人；酵母属（其包括酿酒酵母）；曲霉属（其包括土曲霉、米曲霉、黑曲霉）；玉米赤霉；树干毕赤酵母；分支杆菌属（其包括***垢分支杆菌、鸟型分枝杆菌（其包括亚种类结核））；稀有海洋放线菌（Salinispora arenicola）；假单胞菌属（其包括假单胞菌属CF600、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、绿脓假单胞菌）；罗尔斯通氏菌属（其包括富养罗尔斯通氏菌、富养罗尔斯通氏菌JMP134、富养罗尔斯通氏菌H16、皮氏罗尔斯通氏菌）；植物乳杆菌；产酸克雷伯氏菌；芽孢杆菌属（其包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌）；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；绿屈挠菌属（其包括橙色绿屈挠菌、绿曲挠丝状菌）；类球红细菌；詹氏甲烷球菌；问号钩体；麦芽糖假丝酵母；沙门氏菌属（其包括鼠伤寒沙门氏菌）；希瓦氏菌属（其包括奥奈达湖希瓦氏菌、希瓦氏菌属MR-4）；粪产碱杆菌；嗜热脂肪地芽孢杆菌；粘质沙雷氏菌；霍乱弧菌；巴克氏真杆菌；多毛拟杆菌；闪烁古生球菌；闪烁古生球菌；死海盐盒菌；耐超高温热棒菌菌株IM2；根瘤菌属（其包括豌豆根瘤菌）以及本文披露的或可作为相应基因的源生物的其他示例性物种。然而，今天超过550个物种的完整的基因组序列是可得的（这些物种中超过一半的基因组序列在公用数据库，如NCBI中可以得到），包括395种微生物基因组和各种酵母、真菌、植物以及哺乳动物基因组，在这种情况下，编码针对近缘或远缘物种中一种或多种基因的必要的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成活性的基因的识别（包括，例如已知基因的同系、直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换）以及生物之间基因改变的互换在本领域是常规且熟知的。因此，实现本文所述的关于特定生物（如大肠杆菌）的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成的新陈代谢改变可以以同样的方式很容易地应用到其他微生物，包括原核和真核生物。考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员会得知在一种生物中示范的新陈代谢改变可以同样地应用于其他生物。
在某些情况下，例如当替代性的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径存在于不相关的物种中时，可以通过，例如来自催化相似的、但非完全相同的新陈代谢反应以取代参照反应的不相关物种的一种旁系同源物或多种旁系同源物的外源性表达，赋予该宿主物种甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成。由于不同的生物之间存在新陈代谢网络间的某些差异，本领域的技术人员会理解不同生物之间的实际的基因用法可以存在差异。然而，考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员还会理解，本发明的教诲和方法可以通过利用对本文那些示例性的微生物所作的同源新陈代谢改变应用于所有的微生物，以在有关的物种中构建会合成甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的微生物。
可以例如，通过本领域熟知的重组和检测方法操作用于构建和测试生产非天然存在的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的宿主的表达水平的方法。这类方法的描述可以见于，例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版，ColdSpring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等人,Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。
可以利用本领域熟知的技术（包括但不限于接合、电穿孔术、化学转化法、转导、转染和超声转化）将用于生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的途径中涉及的外源性核酸序列稳定或瞬时地引入宿主细胞。对于大肠杆菌或其他原核细胞中的外源性表达，真核细胞核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码导向信号（targeting signal），如N-末端线粒体导向信号或其他导向信号，如果需要，其可以在转换进入原核宿主细胞之前被去除。例如，线粒体前导序列的去除导致了大肠杆菌中表达的上调(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于酵母或其他真核细胞中的外源性表达，可以在胞质溶胶中表达基因，而不添加前导序列；或者可以通过添加适于宿主细胞的合适的导向序列（如线粒体导向或分泌信号）将基因导向线粒体或其他细胞器或者导向分泌。因此，理解的是，对核酸序列的适当的以去除或包含导向序列的修改可被纳入外源性核酸序列中，以提供所需的特性。此外，以本领域熟知的技术可以使基因经受密码子优化，以实现蛋白质的优化表达。
表达载体可以被构建以包括如本文所示范的可操作地连接于宿主生物中功能性的表达调控序列的一种或多种甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径编码核酸。适用于本发明的宿主微生物的表达载体包括，例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体（包括可操作地用以稳定地整合到宿主染色体的载体和选择序列或标记）。此外，该表达载体可以包括一种或多种选择标记基因和适当的表达调控序列。还可以包括，例如提供抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或者提供培养基中没有的关键营养物的选择标记基因。表达调控序列可以包括组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子以及本领域熟知的诸如此类的表达调控序列。当两个或两个以上外源性编码核酸被共同表达时，两个核酸都可以被***，例如单一表达载体或独立表达载体。对于单一载体表达，编码核酸可被可操作地连接到一个共同的表达调控序列或连接到不同的表达调控序列，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以利用本领域熟知的方法确定新陈代谢或合成途径中涉及的外源性核酸序列的转化。这类方法包括，例如核酸分析法，如Northern印迹法或mRNA聚合酶链反应（PCR）扩增；或基因产物表达免疫印迹法；或其他合适的测试被引入的核酸序列或其相应的基因产物的表达的分析方法。本领域的技术人员理解的是，以足以生产所需产品的量来表达外源性核酸以及进一步理解的是，可以利用本领域熟知的和本文披露的方法优化表达水平以获得足够的表达。
此外，本发明提供利用本发明包含甲基丙烯酸途径的微生物生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的方法。在特定的实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，所述微生物包含具有甲基丙烯酸途径的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（1）A/B/C）。如本文所披露，该微生物可以包含编码甲基丙烯酸途径酶，包括途径中乃至所有酶的一种以上外源性核酸，例如，编码柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶的三种外源性核酸。
在特定的实施方式中，本发明生产MAA的非天然存在的微生物可以具有至少一种外源性核酸，所述外源性核酸是异源性核酸。在另一实施方式中，该生产MAA的非天然存在的微生物可以在基本上厌氧的培养基中。
在另一实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，所述途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）、柠康酸异构酶（G）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（2）A/B/G/H）。在仍然另一实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）、柠康酸异构酶（G）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（3）A/F/G/C）。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酸合酶（A）、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（4）A/F/H）。在又一进一步的实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酰-CoA裂解酶（D）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）；以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（5）D/E/B/C）。
在附加实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酰-CoA裂解酶（D）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）；柠康酸异构酶（G）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（6）D/E/B/G/H）。在仍然另一实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酰-CoA裂解酶（D）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）；以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（7）D/E/F/H）。
在另一实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含柠苹酰-CoA裂解酶（D）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）；柠康酸异构酶（G）；以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（8）D/E/F/G/C）。另外地，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）、衣康酸异构酶（J）以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（9）I/J/C）。
在又一进一步的实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）、衣康酸异构酶（J）、柠康酸异构酶（G）以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（10）I/J/G/H）。在附加实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L）；柠苹酰-CoA脱水酶（K）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）；以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（11）I/L/K/E/B/C）。
本发明还提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L）；柠苹酰-CoA脱水酶（K）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）（B）；柠康酸异构酶（G）；以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（12）I/L/K/E/B/G/H）。在仍然进一步的实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内培养一种非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，所述微生物包含具有甲基丙烯酸途径的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L）；柠苹酰-CoA脱水酶（K）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）；以及中康酸脱羧酶（H）（图1，途径（13）I/L/K/E/F/H）。在附加实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内，培养一种包含甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物来生产甲基丙烯酸的方法，该途径包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，该甲基丙烯酸途径包含乌头酸脱羧酶（I）；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（L）；柠苹酰-CoA脱水酶（K）；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶（E）；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）（F）；柠康酸异构酶（G）；以及柠康酸脱羧酶（C）（图1，途径（14）I/L/K/E/F/G/C）。
本发明还提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产3-羟基异丁酸酯这么长的时间内，培养一种非天然存在的微生物，以及如图28和图30、步骤6和步骤7中所示例的，将所述3-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸酯类的方式，生产甲基丙烯酸酯类的方法，其中该非天然存在的微生物包括编码醇转移酶或3-羟基异丁酸酯形成酶的外源性核酸，所述酶以足以生产3-羟基异丁酸酯的量表达。在另一实施方式中，本发明提供了一种用于通过在各种条件下以及在足以生产甲基-3-羟基异丁酸酯这么长的时间内，培养一种非天然存在的微生物，以及如图30、步骤6和步骤7中所示例的，将所述甲基-3-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸甲酯的方式，生产甲基丙烯酸甲酯的方法，其中该非天然存在的微生物包括编码醇转移酶或酯形成酶的外源性核酸，所述酶以足以生产甲基-3-羟基异丁酸酯的量表达。在本发明的某些方面，本文披露的用于生产甲基丙烯酸酯类或甲基丙烯酸甲酯的方法进一步包括该非天然存在的微生物包括编码图1-11和图28-30所述的3-羟基异丁酰基-CoA途径酶或其任何组合的至少一种外源性核酸。在某些方面，本发明规定，该外源性核酸是异源性核酸。在某些方面，本发明规定，该非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
在一个实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物，其包含具有甲基丙烯酸甲酯途径的微生物，该途径包含编码甲基丙烯酸甲酯途径酶的以足以生产甲基丙烯酸甲酯的量表达的至少一种外源性核酸；所述非天然存在的微生物进一步包含：（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；其中所述甲基丙烯酸甲酯途径包含醇转移酶或酯形成酶，以及脱水酶。在另一方面，本发明提供了一种方法，其中该微生物包含（i）进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；醋酸激酶；磷酸转乙酰基酶；乙酰基-CoA合成酶；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶；铁氧还蛋白；及其组合。在另一方面，本发明提供了一种方法，其中包含（ii）的微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；及其组合。在一个方面，该微生物包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸甲酯酶。在进一步的方面，该两种外源性核酸编码醇转移酶和脱水酶；或替代性地，编码酯形成酶和脱水酶。
在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中包含（i）的微生物包含编码ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的四种外源性核酸；其中包含（ii）的所述微生物包含编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶的五种外源性核酸；或者，其中包含（iii）的所述微生物包含编码CO脱氢酶以及H2氢化酶的两种外源性核酸。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸甲酯的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸甲酯这么长的时间内培养本文披露的非天然存在的微生物。
在另一实施方式中，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸酯类的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产3-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养一种非天然存在的微生物，以及将所述3-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸酯类，其中所述非天然存在的微生物包含编码醇转移酶或3-羟基异丁酸酯形成酶的以足以生产3-羟基异丁酸酯的量表达的外源性核酸，以及所述非天然存在的微生物进一步包含：（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合。在另一实施方式中，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸酯类的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产2-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养一种非天然存在的微生物，以及将所述2-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸酯类，其中所述非天然存在的微生物包含编码醇转移酶或2-羟基异丁酸酯形成酶的以足以生产2-羟基异丁酸酯的量表达的外源性核酸，以及所述非天然存在的微生物进一步包含：（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合。在仍然另一实施方式中，本发明提供了一种用于生产甲基丙烯酸甲酯的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产甲基-3-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养一种非天然存在的微生物，以及将所述甲基-3-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸甲酯，其中所述非天然存在的微生物包含编码醇转移酶或酯形成酶的以足以生产甲基-3-羟基异丁酸酯的量表达的外源性核酸，以及所述非天然存在的微生物进一步包含：（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合。在上述方法的一个方面，至少一种所述外源性核酸是异源性核酸。在上述方法的另一方面，该非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
在一个实施方式中，本发明提供如上以及此处所披露的一种方法，其中包含（i）的所述微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；醋酸激酶；磷酸转乙酰基酶；乙酰基-CoA合成酶；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶；铁氧还蛋白；及其组合。在另一实施方式中，本发明提供如上以及此处所披露的一种方法，其中包含（ii）的所述微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；及其组合。在仍然另一实施方式中，本发明提供如上以及此处所披露的一种方法，其中包含（i）的所述微生物包含编码ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的四种外源性核酸；其中包含（ii）的所述微生物包含编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶的五种外源性核酸；或者，其中包含（iii）的所述微生物包含编码CO脱氢酶以及H2氢化酶的两种外源性核酸。
在一个方面，本文披露的方法可以进一步包含一种包含3-羟基异丁酸酯途径的微生物，该途径包含编码3-羟基异丁酸酯途径酶的以足以生产3-羟基异丁酸酯的量表达的至少一种外源性核酸，所述3-羟基异丁酸酯途径包含选自如下的途径：（a）3-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或3-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；以及醇转移酶；或（b）3-羟基异丁酸酯形成酶。在一个方面，本文披露的方法可以进一步包含一种包含2-羟基异丁酸酯途径的微生物，该途径包含编码2-羟基异丁酸酯途径酶的以足以生产2-羟基异丁酸酯的量表达的至少一种外源性核酸，所述2-羟基异丁酸酯途径包含选自如下的途径：（a）2-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或2-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；以及醇转移酶；或（b）2-羟基异丁酸酯形成酶。
可以利用熟知的方法进行适用于甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生产测试的纯化和/或测定。可以为每个设计的待测菌株培育合适的复制品，如一式三份的培养物。例如，可以监测所设计的生产宿主中产物和副产物的形成。可以通过各种方法，例如HPLC（高效液相色谱）、GC-MS（气相色谱-质谱法）和LC-MS（液相色谱-质谱法）或者其他利用本领域熟知的例行程序的合适的分析方法来分析最终产品和中间体以及其他有机化合物。也可以利用培养上清液对产物在发酵肉汤中的释放进行测试。可以利用，例如针对葡萄糖和醇的折光率检测器以及针对有机酸的紫外检测器(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))通过HPLC或本领域熟知的其他合适的测定和检测方法对副产物和残余葡萄糖进行定量。也可以利用本领域熟知的方法对来自外源性DNA序列的个别酶或蛋白质活性进行测定。例如，可以通过监测经纯化的蛋白质、乙酰基-CoA、丙酮酸和缓冲液的溶液中随着时间推移的CoA生产情况来测定柠苹酸合酶活性(Atsumi等人，AEM74:7802-7808(2008))。
可以利用本领域熟知的各种方法从培养物中的其他组分中分离甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯。这类分离方法包括，例如萃取程序以及包括如下的方法：连续液液萃取法、全蒸发法、膜滤法、膜分离法、反渗透法、电渗析法、蒸馏法、结晶法、离心法、萃取过滤法、离子交换色谱法、体积排阻色谱法、吸附色谱法以及超滤法。所有上述方法为本领域所熟知。
本文所述的任何所述非天然存在的微生物可以培养以生产和/或分泌本发明的生物合成产物。例如，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生产者可以培养用于甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成生产。
为了生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯，在具有碳源和其他必需营养物的培养基中培养重组菌株。在发酵罐中保持厌氧条件以降低整个过程的消耗，这在有时候是需要的并且肯定是非常可取的。这种条件的获取可以通过，例如首先用氮喷射该培养基，然后用垫片和钳口盖密封烧瓶。对于培育不遵循厌氧的菌株，可以通过在该垫片上打一小孔进行有限通气来采用微氧或者基本上厌氧的条件。示例性的厌氧条件已有先前描述并为本领域所熟知。示例性的有氧和厌氧条件的描述见于，例如2007年8月10日提交的美国公布号2009/0047719。如本文所披露，可以以分批、补料分批或连续的方式进行发酵。
如果需要，可以将培养基的pH值保持为所需的pH值，特别是按需要通过添加碱（如NaOH或其他碱）或酸保持为中性pH值（如约7的pH值），以将培养基保持在所需的pH值。可以通过利用分光光度计（600nm）测量光密度确定生长速率，以及可以通过监测随着时间的推移碳源的消耗确定葡萄糖摄取速率。
生长培养基可以包括，例如任何可以向该非天然存在的微生物提供碳源的碳水化合物源。这类源包括，例如糖类（如葡萄糖、木糖、***糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉）。其他碳水化合物源包括，例如可再生的原料和生物质。可在本发明所述的方法中用作原料的示例性类型的生物质包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木素原料或原料的木素部分。这类生物质原料包含，例如用作碳源的碳水化合物底物（如葡萄糖、木糖、***糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉）。考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员会理解除上文那些示例性的原料和生物质，可再生的原料和生物质也可用以培养用于生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的本发明的所述微生物。
在一些实施方式中，本发明提供了具有反映大气中碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14的比率的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体。在一些这类实施方式中，该摄取源是CO2。在一些实施方式中，本发明提供了具有反映石油基碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14的比率的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体。在一些实施方式中，本发明提供了具有碳-12、碳-13和碳-14的比率的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体，所述比率通过将大气中的碳摄取源与石油基摄取源相结合而获得。摄取源的这种组合是碳-12、碳-13和碳-14的比率可以变化的一种手段。
除了如上文以及此处的那些示例性的可再生的原料，本发明所述的甲基丙烯酸甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯微生物也可以修改为将合成气作为其碳源进行培育。在这个特定的实施方式中，在生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物中表达一种或多种蛋白质或酶，以提供用于利用合成气或其他气态碳源的代谢途径。
合成气体（也称为合成气或者发生炉煤气）是煤炭和碳质材料（如包括农作物和农业剩余物的生物质材料）气化的主要产物。合成气是一种主要含H2和CO的混合物以及可以通过气化任何有机原料（包括但不仅限于煤炭、煤油、天然气、生物质以及有机废物）获得。一般地，在高燃料/氧气比的条件下进行气化。虽然大部分含H2和CO，合成气还可以包括少量的CO2和其他气体。因此，合成气体提供了有成本效益的气体碳源，如CO以及另外地，CO2。
Wood-Ljungdahl途径催化从CO和H2到乙酰基-CoA和其他产物（如乙酸）的转化。能够利用CO和合成气的生物一般地也具有通过该Wood-Ljungdahl途径包含的相同的基本酶和转化组利用CO2和CO2/H2混合物的能力。通过微生物依赖H2的从CO2到乙酸的转化得到公认很长时间之后，显示，CO也可以被相同的生物采用以及涉及的途径也相同。已有显示，许多产乙酸菌在CO2的存在下生长，以及只要存在氢以提供必需的还原当量，便生产化合物，如乙酸（见例如，Drake,Acetogenesis,pp.3-60Chapmanand Hall,New York,(1994))。这可以概括为如下的反应式：
2CO2+4H2+n ADP+n Pi→CH3COOH+2H2O+n ATP。
因此，具有该Wood-Ljungdahl途径的非天然存在的微生物也可以利用CO2和H2混合物来生产乙酰基-CoA和其他所需的产品。
该Wood-Ljungdahl途径为本领域熟知以及由12个反应组成，所述反应可以分为两个支路：(1)甲基支路和(2)羰基支路。该甲基支路将合成气转化为甲基-四氢叶酸（甲基-THF）而该羰基支路将甲基-THF转化为乙酰基-CoA。依次通过如下酶或者蛋白质催化该甲基支路中的反应：铁氧还蛋白氧化还原酶、甲酸脱氢酶、甲酰基四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化脱水酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。依次通过如下酶或者蛋白质催化在该羰基支路中的反应：甲基四氢叶酸：类咕啉蛋白质甲基转移酶（例如AcsE）、钴铁硫蛋白质、镍-蛋白质装配蛋白质（例如AcsF）、铁氧还蛋白、乙酰基-CoA合酶、一氧化碳脱氢酶和镍-蛋白质装配蛋白质（例如CooC）。遵循本文提供的关于引入足够数量的编码核酸以生成甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的教诲和指导，本领域的技术人员会理解，关于至少引入编码宿主生物中缺少的Wood-Ljungdahl酶或者蛋白质的核酸，也可以进行相同的工程设计。因此，将一种或者多种编码核酸引入本发明的微生物使得修饰的生物包含完整的Wood-Ljungdahl途径，这将获得合成气利用能力。
另外，还原（逆向）三羧酸循环用于和/或氢化酶活性也可以用于CO、CO2和/或H2到乙酰基-CoA和其他产物（如乙酸）的转化。能够经由还原TCA途径来固定碳的生物可以利用一种或者多种如下酶：ATP柠檬酸-裂解酶、柠檬酸裂解酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸：铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、NAD(P)H：铁氧还蛋白氧化还原酶、一氧化碳脱氢酶以及氢化酶。具体地，将通过一氧化碳脱氢酶和氢化酶从CO和/或H2萃取得到的还原当量用于经由还原TCA循环将CO2固定入乙酰基-CoA或者乙酸。乙酸可以通过酶（如乙酰基-CoA转移酶、乙酸激酶/磷酸转乙酰酶以及乙酰基-CoA合成酶）转化为乙酰基-CoA。乙酰基-CoA可以通过丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶以糖原异生酶，转化为甲基丙烯酸前体、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯（例如，甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸以及丙酮酸）。遵循本文提供的关于引入足够数量的编码核酸以生成甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的教诲和指导，本领域的技术人员会理解，关于至少引入编码宿主生物中缺少的还原TCA途径酶或者蛋白质的核酸，也可以进行相同的工程设计。因此，将一种或者多种编码核酸引入本发明的微生物使得修饰的生物包含完整的还原TCA途径，这将获得合成气利用能力。
因此，考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员会理解，可以生产一种非天然存在的微生物，该微生物当在碳源（如碳水化合物）上培养时分泌本发明的生物合成的化合物。这类化合物包括，例如，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯以及在甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中的任何中间体代谢产物。所有需要的是在一种或多种所需的酶或蛋白质活性中进行设计，以实现所需化合物或中间体（包括，例如部分或全部所述甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成途径的包涵物）的生物合成。因此，本发明提供了一种非天然存在的微生物，所述微生物当培育在碳水化合物或其他碳源上时生产和/或分泌甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯以及当培育在碳水化合物或其他碳源上时分泌甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中所示的任何中间体代谢产物。本发明的所述生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的微生物可以启动始自中间体（例如，柠苹酰-CoA、衣康酰-CoA、衣康酸、柠苹酸、中康酸或柠康酸）的合成。
利用本领域熟知的方法如本文所示范构建本发明所述的非天然存在的微生物，以以足够的量外源性表达编码甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径酶的至少一种核酸，以生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯。理解的是，在足以生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的条件下培养本发明的所述微生物。遵循本文提供的教诲和指导，本发明所述的非天然存在的微生物可以实现甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成，产生在约0.1-200mM或更多之间的细胞内浓度。一般地，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的细胞内浓度在约3-150mM或更多之间，特别地在约5-125mM或更多之间以及更特别地在约8-100mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或更多。也可以从本发明的所述非天然存在的微生物获得这些示例性范围的每个之间和以上的细胞内浓度。
在一些实施方式中，培养条件包括厌氧或基本上厌氧培育或维持条件。示例性的厌氧条件已有先前描述并为本领域所熟知。用于发酵过程的示例性的厌氧条件的描述见于本文以及，例如2007年8月10日提交的美国专利申请号US2009/0047719。任何这些条件可以与所述非天然存在的微生物以及本领域熟知的其他厌氧条件一起使用。在这种厌氧或基本上厌氧的条件下，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生产者可以合成细胞内浓度为5-10mM或更多以及本文示例性的所有其他浓度的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯。理解的是，虽然上文的描述指细胞内浓度,生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的微生物可以在细胞内生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯和/或分泌产物到培养基内。
除本文披露的培养和发酵条件之外，用于实现甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成的培育条件可以包括将渗透保护剂添加到培养条件中。在某些实施方式中，可以在渗透保护剂的存在下如本文所述维持、培养或者发酵本发明所述的非天然存在的微生物。简言之，渗透保护剂指作为渗透物起作用以及帮助如本文所述的微生物经受得住渗透应力的化合物。渗透保护剂包括但不仅限于甜菜碱、氨基酸以及海藻糖。这类渗透保护剂的非限制性的实施例是甘油酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基锍基丙酸（dimethylslfoniopropionate）、3-二甲基锍基-2-甲基丙酸、哌可酸、二甲基锍基乙酸、胆碱、L-肉毒碱和四氢嘧啶。在一个方面，该渗透保护剂是甘油酸甜菜碱。本领域的任一普通技术人员理解的是，适于保护本文所述的微生物不受渗透应力影响的渗透保护剂的量和类型将取决于所用的微生物。在培养条件下的渗透保护剂的量可以是例如，不多于约0.1mM、不多于约0.5mM、不多于约1.0mM、不多于约1.5mM、不多于约2.0mM、不多于约2.5mM、不多于约3.0mM、不多于约5.0mM、不多于约7.0mM、不多于约10mM、不多于约50mM、不多于约100mM或者不多于约500mM。
在一些实施方式中，可以选择碳原料和其他细胞摄取源，例如磷酸盐、氨、硫酸盐、氯化物和其他卤素来改变甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或任何甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中间体中存在的原子的同位素分布。上面列举的各种碳原料和其他摄取源在本文中将被统称为“摄取源”。摄取源可以为产品甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中间体或者为从甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径岔开的反应中生成的副产品中存在的任何原子提供同位素富集。可以针对任何靶原子（包括，例如碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯化物或其他卤素）实现同位素富集。
在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变碳-12、碳-13和碳-14的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变氧-16、氧-17和氧-18的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变氢、氘和氚的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变氮-14和氮-15的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变硫-32、硫-33、硫-34和硫-35的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变磷-31、磷-32和磷-33的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变氯-35、氯-36和氯-37的比率。
在一些实施方式中，靶原子的同位素比率可以通过选择一种或多种吸收源变化为所需的比率。摄取源可以来自天然源（如发现于自然界）或来自人造源，以及本领域技术人员可以选择天然源、人造源或其组合，以实现靶原子的所需同位素比率。人造的摄取源的一个例子包括，例如，至少部分地来自化学反应合成的吸收源。这种同位素富集的摄取源可以从市场上购得或在实验室内制备得到和/或可选地与摄取源的天然源混合以实现所需的同位素比率。在一些实施方式中，通过选择摄取源在自然界中发现所需来源可以获得该摄取源的靶原子同位素比率。例如，如本文所讨论的，天然源可以是衍生自生物或通过生物而合成的生物基源；或诸如基于石油的产品的源；或大气。在一些这样的实施方式中，例如，碳源可以选自衍生自化石燃料的碳源（其碳-14可能贫化）；或环境或大气碳源，如CO2（其与其衍生自石油的对应物相比，可能具有更大量的碳-14）。
不稳定的碳同位素碳-14或放射性碳组成地球大气层中碳原子的大约1/1012以及其具有的半衰期约为5700年。碳储备在上层大气中通过涉及宇宙射线和普通氮（14N）的核反应得以补充。化石燃料中不含碳-14，因为其腐烂发生在很久以前。燃烧化石燃料降低大气中的碳-14组分，即所谓的“休斯效应”。
测定化合物中原子的同位素比率的方法是本领域的技术人员众所周知的。利用本领域已知的技术，如加速质谱（AMS）、稳定同位素比质谱（SIRMS）和点特异性天然同位素分馏核磁共振（SNIF-NMR），通过质谱法很容易对同位素富集进行评估。这种质谱技术可以结合分离技术，如液相色谱（LC）、高效液相色谱法（HPLC）和/或气相色谱法等。
在碳的情况下，在美国，美国材料试验国际协会（ASTM International）开发了ASTM D6866作为用于使用放射性碳测年法测定固体、液体和气体样品的生物基含量的标准化分析方法。该标准基于使用放射性碳测年法测定产品生物基含量。ASTM D6866首次公开于2004年，以及该标准的当前有效版本是ASTM D6866-11（2011年4月1日起生效）。放射性碳测年法（包括本文所述的那些）为本领域的技术人员所熟知。
通过碳-14（14C）与碳-12（12C）的比率估算化合物的生物基含量。具体而言，该现代组分（Fm）根据如下表达式计算：Fm=(S-B)/(M-B)，其中B、S和M分别代表空白对照、样品和现代参考物的14C/12C比率。现代组分是样品相对于“现代”的14C/12C比率偏差的量度。现代被定义为被归一化为δ13CVPDB=-19‰的，国家标准局（NBS）草酸I（即标准参考物质（SRM）4990b）的放射性碳浓度（公元1950年）的95%（Olsson,The use of Oxalic acidas a Standard。见Radiocarbon Variations and Absolute Chronology,NobelSymposium,12th Proc.,John Wiley&Sons,New York(1970))。使用国际上通用的关于被归一化为δ13CVPDB=-19‰的NBS草酸I（SRM4990b）的比活度的0.95倍的定义，例如通过ASM测量，算得质谱法结果。这相当于1.176±0.010×10-12的绝对（公元1950年）14C/12C比率(Karlen等人,Arkiv Geofysik,4:465-471(1968))。标准计算考虑到同位素彼此间的差分摄取情况，例如，在生物***中优先摄取C12，然后C13，然后C14，以及这些修正被反映成校正为δ13的Fm。
草酸标准物（SRM4990b或者HOx1）从1955年的甜菜作物中制得。虽然当时制有1000磅，但是这种草酸标准物已经不能从市场上购得了。草酸II标准物（HOx2；N.I.S.T名称为SRM4990C）从1977年法国的甜菜糖蜜作物中制得。在20世纪80年代初，一组12个实验室测量了这两个标准的比率。草酸II与1的活性比率为1.293±0.001（加权平均）。HOx II的同位素比率是-17.8‰。ASTM D6866-11建议将可用草酸II标准SRM4990C（HOx2）用作现代标准物（见Mann,Radiocarbon,25(2):519-527(1983)中关于原来与目前可用的草酸标准物的对比讨论）。Fm=0%表示材料中完全没有碳-14原子，从而表明是化石（例如石油基）碳源。Fm=100%（针对1950年后核弹测试向大气中注入碳-14的现象校正之后）表明是完全现代的碳源。正如本文所述，这样的“现代”源包括生物基源。
如ASTM D6866中所述，现代碳百分数（pMC）可能大于100%，这是由于20世纪50年代核试验方案的持续但递减的效果，这导致如ASTMD6866-11中所述的，大气中有相当大量的碳-14富集。因为所有样品碳-14活性参考“炸弹前”（pre-bomb）标准，而因为几乎所有新的生物基产品在后炸弹环境（post-bomb environment）中生产，所以所有的pMC值（同位素组分校正后）必须乘以0.95（自2010年起），以更好地反映样品真实的生物基含量。大于103%的生物基含量表明，要么发生了分析错误，要么生物基碳的来源有些年头。
ASTM D6866相对材料的总有机物含量对生物基含量进行量化，并不考虑存在的无机碳及其他非含碳物质。例如，基于ASTM D6866，具有50%淀粉基材料和50%水的产品将被认为具有的生物基含量=100%（50%有机物含量是100%生物基的）。在另一个实例中，具有50%淀粉基材料、25%石油基材料和25%水的产品将具有生物基含量=66.7%（该产品的75%有机物含量，但只有50%是生物基的）。在另一例子中，具有50%有机碳且作为石油基产品的产品将被认为具有的生物基含量=0%（50%有机碳但来自化石源）。因此，基于用于测定化合物或材料的生物基含量的公知方法和公知标准，本领域的技术人员可以很容易地测定生物基含量和/或利用具有所需的生物基含量的本发明所制备的下游产品。
碳-14测年技术在量化材料生物基含量方面的应用为本领域已知(Currie等人,Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B,172:281-287(2000))。例如，碳-14测年法已被用来量化含对苯二甲酸盐的材料的生物基含量(Colonna等人,Green Chemistry,13:2543-2548(2011))。值得注意的是，衍生自可再生的1,3-丙二醇的聚对苯二甲酸丙二醇酯（PPT）聚合物和衍生自石油的对苯二甲酸产生了接近30%的Fm值（即，由于3/11的聚合物碳衍生自可再生的1,3-丙二醇以及8/11衍生自化石端元（end member）对苯二甲酸）(Currie等人，同上文，2000)。与此相反，衍生自可再生的1,4-丁二醇和可再生的对苯二甲酸的聚对苯二甲酸丁二醇酯聚合物产生了超过90%的生物基含量(Colonna等人，同上文，2011)。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了具有反映大气碳（也成为环境碳）摄取源的碳-12、碳-13和碳-14的比率的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径中间体。例如，在一些方面，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体可以具有至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或高达100%的Fm值。在一些这类实施方式中，该摄取源是CO2。在一些实施方式中，本发明提供了具有反映石油基碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14的比率的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体。在这方面，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体可以具有小于95%、小于90%、小于85%、小于80%、小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于55%、小于50%、小于45%、小于40%、小于35%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于2%或小于1%的Fm值。在一些实施方式中，本发明提供了具有碳-12、碳-13和碳-14的比率的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体，所述比率通过将大气中的碳摄取源与石油基摄取源相结合而获得。利用摄取源的这种组合是碳-12、碳-13和碳-14的比率可以变化的一种途径，以及各自的比率将反映摄取源的比例。
进一步，本发明涉及如本文所披露的生物生产的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体，以及涉及从中衍生得到的产物，其中该甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体与环境中存在的CO2具有差不多相同数值的碳-12、碳-13以及碳-14同位素比率。例如，在某些方面，本发明提供生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体，其与环境中存在的CO2具有差不多相同数值的碳-12对碳-13对碳-14同位素比率或本文披露的任何其他比率。理解的是，如本文所披露，产物可以与环境中存在的CO2具有差不多相同数值的碳-12对碳-13对碳-14同位素比率或本文披露的任何比率，其中产物生成自本文披露的生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体，其中生物衍生的产物经化学改性生成最终产品。如本文所述，将甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或其中间体的生物衍生的产物进行化学改性以生成所需产物的方法为本领域的技术人员熟知。本发明进一步提供与环境中存在的CO2具有差不多相同数值的碳-12对碳-13对碳-14同位素比率的聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、丙烯酸塑料以及共聚物（如甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS））等等，其中该聚合物（包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸塑料以及甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS））直接生成自或结合本文披露的生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体。
甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯是在商业以及工业应用中使用的化学品。这类应用的非限制性例子包括生产聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）（也称为丙烯酸玻璃、LuciteTM或PlexiglasTM）、丙烯酸塑料以及共聚物（如甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS））。而且，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯还被用作原料，用于生产各种各样的产品，包括聚合物（包括聚甲基丙烯酸、甲酯丙烯酸塑料以及甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS））。因此，在某些实施方式中，本发明提供生物基聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸塑料以及共聚物（包括甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS）），包含由本发明的非天然存在的微生物生产的或利用本文披露的方法生产的一种或多种生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体。包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸塑料以及共聚物（包括甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯）的这类聚合物可以具有如上文所述的所需比率的生物衍生的前体和石油基前体的混合物。
如本文所用，术语“生物衍生的”指衍生自或合成自生物以及可以被认为是一种可再生资源，因为它可以由生物生成。这样一种生物，尤其是本文披露的本发明的微生物，可以利用原料或生物质，例如，从农业源、植物源、细菌源或动物源获得的糖类或碳水化合物。替代性地，该生物可以利用大气碳。如本文所用，术语“生物基”指全部或部分地由本发明的生物衍生的化合物组成的如上所述的产物。与生物基或生物衍生的产物形成对照的是石油源产物，其中这样一种产物衍生自或合成自石油或石化原料。
在某些实施方式中，本发明提供聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸塑料以及甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS），包含生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体，其中该生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体包括在聚合物生产中所用的全部或部分甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体，包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸塑料以及甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS）。因此，在某些方面，本发明提供生物基聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸塑料以及甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS），其包含本文披露的至少2%、至少3%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100%生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体。另外地，在某些方面，本发明提供生物基聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸塑料以及甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS），其中在其生产中所用的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体是生物衍生的以及石油源的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体的组合。例如，包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸塑料以及甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS）的生物基聚合物可以利用50%生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯以及50%石油源的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类（如甲基丙烯酸甲酯）、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或其他所需比率（如60%/40%、70%/30%、80%/20%、90%/10%、95%/5%、100%/0%、40%/60%、30%/70%、20%/80%、10%/90%）的生物衍生的/石油源的前体得以生产，只要产物的至少部分包含由本文披露的微生物所生产的生物衍生的产物。可理解的是，用于利用本发明的生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯或生物衍生的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯中间体来生产包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸塑料以及甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物（MBS）的聚合物的方法是本领域熟知的。
培养条件可以包括，例如液体培养程序以及发酵和其他大规模培养程序。如本文所描述，在厌氧或基本上厌氧的培养条件下可以获得本发明生物合成产物的特别有用的收率。
如本文所描述，一种用于实现甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生物合成的示例性培育条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方式中，本发明的所述非天然存在的微生物可以在厌氧或基本上厌氧的条件下维持、培养或发酵。简言之，厌氧条件指缺乏氧的环境。基本上厌氧的条件包括，例如培养菌分批发酵或连续发酵以便培养基中溶解的氧浓度保持在0和10%的饱和度之间。基本上厌氧的条件还包括在保持在小于1%的氧气氛中的密封室内部的液体培养基中或固体琼脂上培育或静置细胞。可以通过，例如用N2/CO2混合物或一种或多种其他合适的非氧气体喷射培养菌来保持氧的百分比。
本文所述的培养条件可以按比例扩大并连续增长，以用于生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯。示例性的培养程序包括，例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或者连续发酵和连续分离。所有这些过程都为本领域所熟知。发酵程序对于工业规模的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成生产是特别有用的。一般地以及与非连续培养程序一样，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的连续和/或接近连续的生产将包括在足够的营养物和培养基中培养本发明的生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的非天然存在的生物，以维持和/或接近维持指数期的生长。这种条件下的连续培养可以包括，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多。此外，连续培养可以包括1周、2周、3周、4周或5周或更多周乃至数月。替代性地，如果适于具体的应用，本发明的生物可以培养数小时。理解的是，连续和/或接近连续培养的条件还可以包括这些示例性周期之间的所有的时间间隔。进一步理解的是，本发明的所述微生物的培养时间是足以生产足够量的用于所需目的的产品的时间段。
发酵程序为本领域所熟知。简言之，可以以，例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或连续发酵和连续分离的方式利用用于甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生物合成生产的发酵。分批和连续发酵程序的例子为本领域所熟知。
除了上文将本发明的所述甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯、3-羟基异丁酸酯、2-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生产者用于相当数量的甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯、3-羟基异丁酸酯、2-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的连续的生产的发酵程序，生产者还可以，例如同时经受化学合成程序，以将产物转化为其他化合物，或者产物可以从发酵培养物中分离以及后续经受化学或酶催转化，以将产物转化为其他化合物（如有需要）。例如，在某些实施方式中，本发明提供3-羟基异丁酸酯（如甲基-3-羟基异丁酸酯）或2-羟基异丁酸酯（如甲基-2-羟基异丁酸酯）到甲基丙烯酸酯类（如甲基丙烯酸甲酯）的化学脱水。可理解的是，用于催化这类化合物脱水的方法以及化学化合物为本领域所熟知。
随着甲基丙烯酸酯类的形成，3-羟基异丁酸酯和2-羟基异丁酸酯可以进行化学脱水，始自从发酵溶液中分离的纯3-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸酯或始自发酵溶液的后处理中分离的3-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸酯的水性或有机溶液。3-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸酯的这类溶液还可以在脱水步骤前，可选地在合适的夹带剂存在时，例如通过蒸馏进行浓缩。
脱水反应可以在液相或气相中完成。脱水反应可以在存在催化剂时完成，采用的催化剂性质取决于气相或液相反应是否完成。
合适的脱水催化剂包括酸性催化剂和碱性催化剂。具体地，酸性催化剂可以表现出较低的形成低聚物的倾向。采用的脱水催化剂可以是均相催化剂、非均相催化剂或其组合。非均相催化剂可结合合适的载体材料使用。这种载体本身可以是酸性或碱性并提供酸性或碱性脱水催化剂；或催化剂可以应用到惰性载体上。
作为脱水催化剂的合适载体包括天然的或合成的硅酸盐，如丝光沸石、蒙脱石、酸性沸石；涂有一元、二元或多元无机酸（如磷酸）或涂有无机酸的酸性盐（例如氧化物或硅酸盐，如Al2O3、TiO2）的载体；氧化物和混合氧化物（如杂多酸的γ-Al2O3和ZnO—Al2O3的混合氧化物）。既作为脱水催化剂又作为载体载体材料起作用的碱性物质包括作为其氧化物的碱、碱土、镧、镧系元素或其组合。可以实现脱水的又一类材料是可以以碱性或酸性的形式使用的离子交换剂。
合适的均相脱水催化剂包括无机酸，例如含磷的酸（如磷酸）。无机酸可以通过浸没或浸渍固定在载体材料上。
在一些实施方式中，使用本领域中已知的常规装置，例如管式反应器、管壳式换热器和包括热板作为热交换器的反应器，在气相中进行脱水反应。在一些实施方式中，气相脱水可以利用分离的3-羟基异丁酸酯或该酯的溶液，将该酯引入到具有固定床催化剂的反应器中。在液相中，可以在200℃和350℃之间，在一些实施方式中，在250和300℃之间的温度范围内进行热脱水。
为生成更好的生产者，可以利用代谢建模优化培育条件。建模还可被用以设计另外优化途径应用的基因敲除（参见，例如美国专利公布US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654和US2004/0009466；以及美国专利号7,127,379）。建模分析允许对偏移代谢对细胞生长的影响进行可靠的预测，以便更高效地生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯。
一种用于识别和设计支持所需产品的生物合成的代谢改变的计算方法是OptKnock计算框架(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。OptKnock是一种代谢建模和模拟程序，该程序提出基因删除或者中断策略，其产生从基因方面来说稳定的微生物，该微生物超过定额地生产靶产品。具体而言，该框架检查微生物的完整的代谢和/或生化网络，以便提出迫使所需的生化品变为细胞生长的专性副产品的基因操作。通过战略性放置的基因缺失或其他功能基因中断把生化生产与细胞生长耦合起来，在生物反应器中长时间之后，施加至设计菌株的生长选择压力由于结合强制性生长的生化生产引起效能改善。最后，当基因缺失被构建时，由于OptKnock选择的基因将从基因组完全去除，设计菌株回复到其野生型状态的可能性可以忽略不计。因此，该计算方法可用以识别导致所需产品生物合成的替代性途径或与所述非天然存在的微生物结合用于所需产品生物合成的进一步优化。
简言之，术语OptKnock在本文用以指用于建模细胞代谢的计算方法和***。OptKnock方案涉及将具体的约束因素引入通量平衡分析（FBA）模型的模型和方法的框架。这些约束因素包括，例如定性动力信息、定性调节信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock还通过，例如收紧通过通量平衡模型导出的通量边界以及随后在基因添加或删除的存在下探测代谢网络的效能极限来计算各种代谢问题的解。OptKnock计算框架允许使代谢网络的效能极限的有效质询可行的模型表述的构建以及提供用于解决引起的混合整数线性规划问题的方法。本文称为OptKnock的代谢建模和模拟方法的描述见于，例如2002年1月10日提交的美国公布2002/0168654、2002年1月10日提交的国际专利号PCT/US02/00660以及2007年8月10日提交的美国公布2009/0047719。
另一种用于识别和设计支持产品的生物合成生产的代谢改变的计算方法是一种代谢建模和模拟***，称为该计算方法和***的描述见于，例如2002年6月14日提交的美国公布2003/0233218以及见于2003年6月13日提交的PCT/US03/18838。是一种计算***，该***可用以产生硅内网络模型并用以通过生物***的化学反应模拟质量、能量或电荷的通量，以限定包含该***中化学反应的任何以及所有可能的函数的解空间，从而确定该生物***一系列的允许活性。这种方法称为基于约束因素的建模，因为该解空间由约束因素限定，如所包含的反应的已知的化学计量以及通过反应与最大通量关联的反应热动力和能力约束因素。可以询问这些约束因素限定的空间，以确定该生物***或其生化部件的显型能力和行为。
这些计算方法与生物现实一致，因为生物***具有灵活性并可以许多不同的方式达到相同的结果。生物***已经通过由所有生物***必须面对的基本的约束因素限制的进化机制加以设计。因此，基于约束因素的建模策略包括这些一般现实。进一步地，通过约束因素收紧向网络模型连续施加进一步的限制的能力导致解空间的尺寸变小，从而提升生理效能或显型可预测的精确性。
考虑到本文提供的教诲和指导，本领域的技术人员将能够应用各种用于代谢模型和模拟的计算框架，以在宿主微生物中设计和实施所需化合物的生物合成。这种代谢建模和模拟方法包括，例如上文示范为和OptKnock的计算***。为了说明本发明，本文描述一些关于用于建模和模拟的OptKnock计算框架的方法。本领域的技术人员会了解如何利用OptKnock将代谢改变的识别、设计和实施应用于为本领域所熟知的任何这类其他代谢模型和模拟计算框架和方法。
上文描述的方法将提供待中断的一组代谢反应。该组或代谢修饰内每个反应的消除可以在生物的培育期期间产生作为专性产品的所需产品。由于反应已知，双层OptKnock问题的解也将提供编码一种或多种催化该组反应内每个反应的酶的有关基因。一组反应及其相应的编码参与每个反应的酶的基因的识别通常是自动化过程，通过将反应与具有酶和编码基因之间的关系的反应数据库相关联得以完成。
一旦确定，通过至少一个编码该组反应内每个代谢反应的基因的功能中断在靶细胞或生物内实施该组反应，该组反应待中断以便实现所需产品的生产。一种实现该反应组的功能中断的特别有用的手段是通过删除每个编码基因。然而，在某些情况下，通过其他的遗传畸变（包括，例如调节区域如启动子或针对调节因子的顺式结合位点的突变、删除或者通过大量位置的任意处编码序列的截断）中断该反应可能是有利的。这些导致基因组不完全删除的后者畸变可能是有用的，例如，当需要产物耦合的快速评估或当不太可能发生遗传回复变异时。
为识别上文描述的导致进一步的中断反应组或可以导致生物合成（包括所需产品的生长耦合的生物合成）的代谢修饰的双层OptKnock问题的其他的富有成效的解，可以实施一种优化方法，称为整数切割。该方法通过在每次迭代时纳入被称为整数切割的另一约束因素迭代地解决上文示例性的OptKnock问题而进行下去。整数切割约束因素有效地阻止解程序选择在任何先前的强制耦合产品生物合成至生长的迭代中确定的恰好相同的反应组。例如，如果先前确定的耦合生长的代谢修饰指定反应1、2和3进行中断，则接下来的约束因素阻止相同的反应被同时考虑在后续解中。该整数切割方法为本领域所熟知以及可以发现其被描述于，例如Burgard等人,Biotechnol.Prog.17:791-797(2001)。与本文关于其结合用于代谢模型和模拟的OptKnock计算框架的用途所述的所有方法一样，减少迭代计算分析中的冗余的整数切割方法还可以与本领域所熟知的其他计算框架（包括，例如一起应用。
本文示例性的方法允许生物合成地生产所需产品的细胞和生物的构建，包括靶生化产品的生产与被设计包括所识别的基因改变的细胞或生物生长的强制耦合。因此，本文所述的计算方法允许通过选自OptKnock或的硅内方法识别的代谢修饰的识别和实施。代谢修饰组可包括，例如一种或多种生物合成途径酶的添加和/或一种或多种代谢反应的功能中断（包括，例如通过基因删除中断）。
如上文所讨论，该OptKnock方法的开发前提是当遭受长期的生长选择时突变微生物网络可以朝向其计算地预测最大生长显型进化。换言之，该方法利用生物在选择压力下的自优化能力。该OptKnock框架允许有基于网络化学计量强迫形成生化生产和细胞生长之间的耦合的基因删除组合的穷尽枚举（exhaustive enumeration）。最佳基因/反应敲除的确认需要双层优化问题的解，所述解选择活性反应组以便所得网络的最佳生长解超过定额地生产相关生化品(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。
大肠杆菌代谢的硅内化学计量模型可用以识别代谢途径必需的基因，如先前示范以及描述，见于，例如美国专利公布US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654和US2004/0009466以及见于美国专利号7,127,379。如本文所披露，OptKnock数学框架可用以精确地定位基因删除，导致所需产品的耦合生长的生产。进一步地，双层OptKnock问题的解仅提供一组删除。要枚举所有有意义的解，即导致耦合生长的生产的形成的所有敲除组，可以实施优化技术，称为整数切割。这必伴有通过在每次迭代时纳入被称为整数切割的另一约束因素迭代地解决该OptKnock问题，如上文所讨论。
如本文所披露，可将编码甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径的所需活性的核酸引入宿主生物。在某些情况下，修饰甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径酶或者蛋白质的活性以提高甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的生产，这会是可取的。例如，可将增加蛋白质或者酶的活性的已知突变引入编码核酸分子。另外，可以采用优化方法来提高酶或者蛋白质的活性和/或降低抑制活性，例如，降低负调节因子的活性。
一种这类的优化方法是定向进化。定向进化是一种涉及引入靶向特异性基因的突变以改善和/或改变酶的特性的强有力的方法。可以通过开发和实施允许许多酶变体（如>104）的自动筛选的敏感性高通量筛选测定确定改善和/或改变的酶。通常进行迭代轮的诱变和筛选，以使酶具有优化的特性。可有助于识别进行诱变的基因区域的计算算法也已经被开发并可以显著地减少需要生成和筛选的酶变体的数目。已经开发了大量的定向进化技术(参阅Hibbert等人,Biomol.Eng22:11-19(2005)；Huisman和Lalonde,InBiocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs.717-742(2007),Patel(ed.),CRC Press；Otten和Quax.Biomol.Eng22:1-9(2005).；以及Sen等人,Appl Biochem.Biotechnol143:212-223(2007))以有效地创建多样化变体库并且这些方法已被成功地应用于许多酶等级范围内各种特性的改善。通过定向进化技术改善和/或改变的酶特性包括，例如选择性/特异性-针对非自然底物的转化；温度稳定性-针对鲁棒高温处理；pH值稳定性-针对较低或较高pH值条件下的生物工艺；底物或产物容忍性（tolerence）–以便可以实现高产物滴度；结合性(Km)-扩大底物结合以包括非自然底物；抑制性(Ki)–以通过产物、底物或关键的中间体去除抑制；活性(kcat)-提高酶催反应速率，以获得所需通量；表达水平-增加蛋白质收率和整个途径通量；氧稳定性-针对在有氧条件下空气敏感性酶的操作；以及厌氧活性-针对缺氧条件下需氧酶的操作。
下文对示例性的方法进行更详细的描述，所述示例性的方法已经被开发用于基因的诱变和多样化以靶向特异性酶的所需特性。这类方法为本领域的技术人员所熟知。任何这些方法可用以改变和/或优化甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯途径酶或者蛋白质的活性。
EpPCR(Pritchard等人,J Theor.Biol.234:497-509(2005))通过添加Mn2+离子降低PCR反应中DNA聚合酶的保真度、通过加偏压于dNTP浓度或通过其他条件性的改变引入随机点突变。将诱变局限于相关靶基因的五步骤克隆过程涉及：1)相关基因的易错PCR扩增；2)限制酶切；3)所需DNA片段的凝胶纯化；4)连接入载体；5)基因变体至合适的宿主的转化以及为改善效能进行的库筛选。该方法可以同时在单个基因中产生多个突变，所述突变可用于筛选更大量的具有所需活性的潜在变体。通过EpPCR可以生成大量的突变体，因此高通量筛选测定或选择方法（例如，利用机器人）对于识别那些具有所需特性的突变体是有用的。
易错滚环扩增(epRCA)(Fujii等人,Nucleic Acids Res.32:e145(2004)；以及Fujii等人,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006))具有许多与epPCR相同的要素，除了整个环状质粒被用作模板以及在最后2个核苷酸上具有核酸外切酶抗性硫代磷酸酯键的随机6-引物被用以扩增该质粒，接着转化至细胞，在那里该质粒以串联反复被再环化。调整Mn2+浓度可以稍微改变突变率。该技术利用一种简易的易错、单步骤方法以3-4突变/kbp创建质粒的完整副本。无需限制酶消化或特异性引物。此外，该方法通常以可购得的试剂盒的形式被利用。
DNA或家族改组(Stemmer,Proc Natl Acad Sci USA91:10747-10751(1994))；以及Stemmer,Nature370:389-391(1994))通常涉及以核酸酶（如脱氧核糖核酸酶I或核酸内切酶V）消化两种或两种以上的变体基因，以生成随机片段池，所述随机片段在DNA聚合酶的存在下通过退火和扩展循环进行重装，以创建嵌合基因库。片段相互作为引物以及当一个副本作为另一副本的引物（模板切换）时发生重组。该方法可以与>lkbp的DNA序列一起使用。除了片段重装（fragment reassembly）创建的突变重组，该方法以与易错PCR类似的速率在扩展步骤引入点突变。该方法可用以去除有害的、随机的以及中性的突变。
交错延伸(StEP)(Zhao等人,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))必伴有模板引物，接着是以变性和持续非常短（短似5秒）的退火/延伸进行的2步PCR的重复循环。成长的片段退火至不同的模板并进一步延伸，这被重复直至形成完整长度的序列。模板切换意味着多数所得的片段具有多个亲本。低保真度聚合酶（Taq和Mutazyme）的组合由于相反的突变谱减少易错偏差。
在随机引物重组（RPR）中，随机序列引物被用以生成许多与不同的模板段互补的短DNA片段(Shao等人,Nucleic Acids Res26:681-683(1998))。通过epPCR的碱的错误掺入和错引物（mispriming）带来点突变。基于同源性，短的DNA片段相互作为引物以及通过重复热循环被重组并重装成完整长度。该步骤之前的模板去除保证了低亲本重组。与多数其他方法类似，该方法进行多重迭代，以逐步得到不同的特性。该技术避免了序列偏差，不依赖于基因长度并且施用需要亲本DNA少之又少。
在异源双链重组中，线性质粒DNA被用以形成通过错配修复得以修复的异源双链(Volkov等人,Nucleic Acids Res.27:e18(1999)；以及Volkov等人,Methods Enzymol.328:456-463(2000))。错配修复步骤至少是有点诱变的。异源双链的转化比线性同源双链较为高效。这种方法适于大基因和整体操纵子。
临时模板随机嵌合生长(RACHITT)(Coco等人,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))采用单链DNA的脱氧核糖核酸酶I断裂和大小分级。在缺少聚合酶的条件下将同源片段杂交至互补单链DNA支架。通过外核酸酶修整任何重叠的未杂交片段端。填充片段之间的空隙，然后连接以提供完整长度的多样化链池，所述链杂交至包含U以阻止扩增的支架。然后破坏所述支架并通过PCR扩增取代以与所述多样化链互补的新链。该方法涉及仅来自一个亲本的一个链（支架）而引物片段则来自其他基因，以及相对选择亲本支架。因此，不会有亲本片段的重退火发生。用核酸外切酶修整重叠的片段。在其他方面，这类似于DNA改组和StEP。因此，应该没有亲子（sibling）、几乎没有灭活物以及没有未改组的亲本。这项技术的优势在于几乎没有或没有亲本基因产生以及相对于标准的DNA改组可以产生许多更多的交叉（crossover）。
截短状模板重组延伸（RETT）必伴有在单向单链DNA片段作为模板池的存在下自引物单向生长的链的模板切换(Lee等人,J.Molec.Catalysis26:119-129(2003))。不使用DNA核酸内切酶。通过带有随机引物的DNA聚合酶或利用核酸外切酶的连续删除（serial deletion）生成单向单链DNA。单向单链DNA仅仅是模板而非引物。随机引物和核酸外切酶不引入如同DNA改组/RACHITT的酶催断裂的序列偏差。RETT的优化可以比StEP更容易，因为其利用正常的PCR条件而非非常短的扩展。重组作为PCR步骤的部分发生，即无直接改组。这种方法由于无停顿也可以比StEP更随机。
在简并寡核苷酸基因改组（DOGS）中，简并引物被用以控制分子之间的重组；(Bergquist和Gibbs,Methods Mol.Biol352:191-204(2007);Bergquist等人,Biomol.Eng22:63-72(2005);Gibbs等人,Gene271:13-20(2001))这可用以控制其他方法（如DNA改组）再简并亲本基因的趋势。这种方法可以结合选择基因区段的随机诱变（epPCR）。这会是一个良好的阻碍亲本序列再形成的方法。不需要核酸内切酶。通过调整所得区段的输入浓度，可以偏向所需的骨架。这种方法允许自不相关亲本的DNA改组，而无限制酶消化并允许选择随机诱变方法。
渐进式切割产生杂合酶（ITCHY）创建带有相关基因或基因片段的1碱基对删除的组合库(Ostermeier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:3562-3567(1999)；以及Ostermeier等人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999))。以相反的方向将切割物引入至2个不同的基因片上。将这些连接在一起并克隆融合。该技术不需要2个亲本基因之间的同源性。当ITCHY结合DNA改组时，该***被称为SCRATCHY（见下文）。两者主要的优势是无需亲本基因之间的同源性；例如，通过ITCHY创建大肠杆菌和人基因之间的功能融合。当ITCHY文库形成，捕捉所有可能的交换。
除了硫代磷酸dNTP被用以产生切割物，硫代渐进式切割产生杂合酶（THIO-ITCHY）与ITCHY相似(Lutz等人,Nucleic Acids Res29:E16(2001))。相比于ITCHY，THIO-ITCHY可以更易优化、提供更多的再现性和可调性。
SCRATCHY结合两种用于重组基因的方法ITCHY和DNA改组(Lutz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:11248-11253(2001))。SCRATCHY兼具ITCHY和DNA改组的最好特性。首先，ITCHY被用来以不依赖DNA同源性的方式创建一套全面的基因片段之间的融合。然后，对该人造的家族执行DNA改组步骤，以增加交叉的数量。计算预测法可以在优化中使用。当序列一致性低于80%时，SCRATCHY比DNA改组更有效。
在随机漂变诱变（RNDM）中，通过epPCR进行突变，接着对保留有用活性的那些进行筛选/选择(Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63-72(2005))。然后，这些被用于DOGS，以产生具有多个活性突变体之间或活性突变体和其他一些所需的亲本之间的融合的重组体。设计以促进中性突变的隔离；其目的是对保留的催化活性进行这种活性是高于还是低于原始基因中的活性的筛选。当筛选能够检测背景（background）上的活性时，RNDM在高通量测定中是有用的。在产生多样性方面，RNDM已被用作DOGS的前端。该技术提出改组或其他后续步骤之前的活性要求；中性漂变文库被指出相比更小的文库产生更高/更快的活性改善。虽然公布利用epPCR，这可应用于其他大规模诱变方法。
序列饱和诱变（SeSaM）是一种随机诱变方法，该方法:1)利用硫代磷酸核苷酸的随机掺入和断裂生成随机长度片段池；该池被用作模板，以2)在“通用”碱（如肌苷）的存在下延伸；3)包含肌苷的补体的复制提供随机碱掺入以及因此提供诱变(Wong等人,Biotechnol.J.3:74-82(2008)；Wong等人,Nucleic Acids Res.32:e26(2004)；以及Wong等人,Anal.Biochem.341:187-189(2005))。利用这种技术，采用简易的方法在2天到3天内产生突变体的大型文库是可能的。较之于DNA聚合酶的突变偏向，这是不定向的。这种方法的差异使得该技术是epPCR的补充（或者替代性选择）。
在合成改组中，重叠的寡核苷酸被设计以编码“靶中所有的遗传多样性”并允许改组的后代有非常高的多样性(Ness,等人,Nat.Biotechnol.20:1251-1255(2002))。在这种技术中，可以将片段设计为被改组。这有助于提高后代所得的多样性。可以设计序列/密码子偏差，以使得更远缘的相关序列以与更密切相关的序列所遵循的速率接近的速率重组。另外，该技术不需要物质上占有模板基因。
核苷酸交换和切除技术（NexT）利用dUTP掺入组合，继之以用尿嘧啶DNA糖基化酶然后哌啶进行处理，以执行端点DNA断裂(Muller等人,Nucleic Acids Res.33:e117(2005))。利用内部PCR引物扩展以校正聚合酶重装基因。利用变化的dUPT::dTTP比率，改组的大小是直接可控的。这种是一种利用尿嘧啶掺入和断裂的简易方法的端点反应。对于这种方法，可以使用其他的核苷酸类似物，如8-氧代-鸟嘌呤。此外，该技术对于非常短的片段（86bp）效果良好并具有低的出错率。该项技术中所用的DNA的化学断裂导致几乎没有未改组的克隆。
在不依赖序列同源性的蛋白质重组（SHIPREC）中，接头被用以促进两个远缘/不相关的基因之间的融合。核酸酶处理被用以在这两个基因之间产生一系列嵌合体。这些融合产生单交叉文库(Sieber等人.Nat.Biotechnol.19:456-460(2001))。这产生有限类型的改组以及诱变需要一个单独的过程。此外，因为不需要同源性，这项技术可以用两个不相关的亲本基因的每个的变化分数创建嵌合体文库。通过细菌CP450的血红素结合区域融合至哺乳动物CP450的N末端区域对SHIPREC进行了测试；这在更具可溶性的酶中产生了哺乳动物活性。
在基因位点饱和诱变TM（GSSMTM）中，起始材料是在所需的突变位点包含***和两个引物简并的超螺旋双链DNA质粒(Kretz等人,MethodsEnzymol.388:3-11(2004))。带有相关突变的引物为DNA相对链上的相同序列退火。突变通常在引物的中间以及位于每边上正确序列的大约20个核苷酸的侧面。引物中的序列是NNN或NNK（编码）和MNN（未编码）（N=全部4、K=G,T,M=A,C）。延伸后，DpnⅠ被用以消化dam-甲基化DNA，以消除野生型模板。这项技术探索了给定位点（即一个密码子）的所有可能的氨基酸替代。该技术便于产生没有无意义密码子的单个位点上所有可能的取代以及导致最可能的等位基因的相等或近乎相等的表现。该项技术不需要靶酶的结构、作用机理或区域的现有知识。如果随后是改组或基因重装，这项技术创建包含所有可能的组合的单位点向上突变的重组体的多样化文库。这项技术组合的实用性已被证明用于超过50个不同的酶的成功进化以及用于给定酶中一个以上的特性。
组合式盒式诱变（CCM）涉及短寡核苷酸盒以大量可能的氨基酸序列改变取代有限区域的用途(Reidhaar-Olson等人,Methods Enzymol.208:564-586(1991)；以及Reidhaar-Olson等人,Science241:53-57(1988))。利用这项技术在两个或三个位点进行同时替代是可能的。此外，该方法测试有限范围的位点上大量可能的序列改变。这项技术已被用于探索λ抑制子DNA结合区域的信息内容。
组合式多重盒式诱变（CMCM）在本质上与CCM相似，除了其被作为更大方案的部分所采用：1)以高突变速率使用epPCR，以2)确认热点和热区域，然后3)通过CMCM延伸，以覆盖蛋白质序列空间的限定区域(Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589-3591(2001))。与CCM一样，这种技术实际上可以测试靶区域上所有可能的改变。如果与产生随机突变和改组基因的方法一起使用，其提供了一种极好的生成多样的、改组的蛋白质的手段。这种方法成功地将酶的对映选择性提高了51倍。
在致突变菌株技术中，附条件的ts致突变质粒允许选择期间随机和自然突变频率增加20到4000倍以及当无需选择时，允许阻碍有害突变的堆积(Selifonova等人,Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649(2001))。这项技术基于质粒衍生mutD5基因，其编码DNA聚合酶III的突变亚基。该亚基结合至内源性DNA聚合酶III并危害任何包含该质粒的菌株中聚合酶III的校正能力。范围广泛的碱替代和移码突变发生。为了有效地使用，一旦实现所需的显型，该致突变质粒应被去除；其通过复制的温度敏感性（ts）起点完成，这允许在41℃下消除质粒。应注意的是，致突变菌株已得到长时间的探究(参见Low等人,J.Mol Biol.260:359-3680(1996))。在这项技术中，观察到非常高的自发突变速率。附条件的特性使非所需的本底突变最小化。这项技术可以结合适应性进化，以提高诱变速率并更迅速地获得所需的显型。
精确诱变(LTM)是一种评估和优化选择氨基酸的组合突变的多维诱变方法(Rajpal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:8466-8471(2005))。不是用所有可能的氨基酸改变使每个位点饱和，而是选择一组九个以覆盖氨基酸R基化学品的范围。每个位点的较少改变允许多个位点遭受这种类型的诱变。已通过这种方法实现针对抗体的从低纳摩尔到皮可摩尔的结合亲和性的>800倍增加。这是一种合理的最小化随机组合数目的方法以及这能够通过极大地减少待筛选克隆的数目提高发现改善的性状的能力。这已被用于抗体工程，尤其是提高结合亲和性和/或减少解离。该技术可以结合筛选或选择。
基因重装是一种DNA改组方法，该方法可以一次应用于多个基因或应用于创建单基因的大型嵌合体（多重突变）文库(由Verenium Corporation提供的可调基因重装TM(TGRTM))。通常这项技术与超高通量的筛选结合使用，以质询用于所需改善的所表示的序列空间。这项技术允许不依赖于同源性的多个基因重组。可以利用通过生物信息学分析设计的片段预先确定交叉事件的确切数目和位置。这项技术导致非常高水平的多样性而实际上无亲本基因再形成以及低水平的灭活基因。与GSSMTM结合，可以对大范围的突变进行改善活性测试。该方法允许DNA改组的“混合”和“微调”，例如可以优化密码子用法。
计算机模拟的蛋白质设计自动化（PDA）是一种优化算法，所述算法固定具有特定折叠子的结构上限定的蛋白质骨架，以及为可以稳固该折叠子和整个蛋白质能量的氨基酸替代寻找序列空间(Hayes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:15926-15931(2002))。这项技术利用计算机模拟的基于结构的熵预测，以便寻求对于蛋白质氨基酸变化的结构容忍性。统计力学被用以计算每个位置上的耦合相互作用。对于氨基酸替代的结构容忍性是耦合的量度。最后，这项技术被设计以取得蛋白质特性的所需修饰同时保持结构特性的完整性。该方法计算地评估并允许非常大量的可能的序列变体（1050）的过滤。待测序列变体的选择与基于最适合的热力学预测相关。明显地，只有稳定性或与稳定性相联系的特性可以用这项技术有效地解决。该方法已被成功地用于一些医用蛋白质，特别用于工程免疫球蛋白。计算机模拟的预测避免测试异常大量的潜在变体。基于现有三维结构的预测比基于假拟结构的预测更有可能成功。这项技术可以很容易地预测和允许多重同时突变的靶向筛选，由于数目的指数增加这在简单的实验技术是不可能的事情。
迭代饱和诱变（ISM）涉及：1)利用结构/功能的知识选择用于酶改善的适当的位点；2)利用诱变方法，如Stratagene QuikChange(Stratagene;SanDiego CA)在选定的位点进行饱和诱变；3)筛选/选择所需的特性；以及4)利用改善的克隆，在另一位点重新开始并持续重复，直至实现所需的活性(Reetz等人,Nat.Protoc.2:891-903(2007)；以及Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745-7751(2006))。这是一种被证明的操作法，其确保在给定位置所有可能的取代有助于筛选/选择。
前述的用于诱变的任何方法可以单独或以任何组合使用。此外，所述定向进化方法的任何一个或组合可以结合适应性进化技术使用，如本文所述。
实施例I
示例性甲基丙烯酸途径酶
本实施例描述了用于生产甲基丙烯酸的示例性途径。
图1描绘了经由中间体柠苹酸从乙酰基-CoA以及丙酮酸到MAA的示例性途径。还显示从乌头酸到MAA的途径。在一个途径中，乙酰基-CoA以及丙酮酸首先通过柠苹酸合酶转化为柠苹酸。柠苹酸脱水可以出产柠康酸（步骤B）或中康酸（步骤C）。在步骤G中，中康酸以及柠康酸通过顺式/反式异构酶相互转化。中康酸（步骤H）或柠康酸（步骤C）脱羧出产MAA。在替代性途径中，柠苹酸在步骤D和E中经由柠苹酰-CoA中间体形成自乙酰基-CoA以及丙酮酸，通过柠苹酰-CoA裂解酶以及柠苹酰-CoA水解酶、转移酶或合成酶催化。
还示范了从乌头酸到MAA的途径。在一个途径中，乌头酸首先通过乌头酸脱羧酶脱羧为衣康酸（步骤I）。然后，衣康酸通过衣康酸Δ-异构酶（步骤J）异构化为柠康酸。柠康酸到MAA的转化直接通过脱羧或间接经由中康酸进行。在替代性途径中，衣康酸中间体首先通过CoA转移酶或合成酶转化为衣康酰-CoA（步骤L）。衣康酰-CoA经水合作用出产柠苹酰-CoA，其如上文所述以及如图1所示，然后可以转化为MAA。
表1示出了可以执行图1中所描绘的步骤的酶类。下文进一步详述了示例性酶。
表1.用于图1中所示酶的酶类.
标记 功能 步骤
2.3.1.a 合酶 A
2.8.3.a Co酶-A转移酶 E，L
3.1.2.a 硫羟酸酯水解酶（CoA特异性） E
4.1.1.a 脱羧酶 C，H，J
4.1.3.a 裂解酶 D
4.2.1.a 脱水酶 B，F，K
5.2.1.a 顺式/反式异构酶 G
5.3.3.a Δ-异构酶 I
6.2.1.a 酸-硫醇连接酶 E，L
EC2.3.1.a合酶（步骤A）.柠苹酸合酶（EC2.3.1.182）催化乙酰基-CoA以及丙酮酸到柠苹酸以及辅酶A的转化。该酶参与发现于古生菌（如詹氏甲烷球菌）(Howell等人,J Bacteriol.181:331-333(1999))、问号钩体(Xu等人,J Bacteriol.186:5400-5409(2004))以及硫还原地杆菌(Risso等人,JBacteriol.190:2266-2274(2008))中的异亮氨酸生物合成的不依赖苏氨酸的途径。这种酶在活体内按合成方向运行，对作为底物的丙酮酸具有高度特异性，以及通常受异亮氨酸的抑制。来自通过定向进化发育的詹氏甲烷球菌的重组柠苹酸合酶具有高活性以及缺乏异亮氨酸的抑制(Atsumi等人,Appl Environ Microbiol74:7802-7808(2008))。柠苹酸合酶活性还在深红红螺菌的柠苹酸循环醋酸同化途径中得到证实，虽然与这种活性相关的基因尚未确定(Berg等人,Mikrobiologiia78:22-31(2009))。
基因 GenBank GI号 生物
CimA Q58787.1 2492795 詹氏甲烷球菌
CimA ABK13749.1 116664671 问号钩体
CimA ADI84633.1 298505910 硫还原地杆菌
EC2.8.3.a CoA转移酶（步骤E）.CoA转移酶催化CoA部分从一个分子到另一个分子的可逆转移。图1中的两种转换利用CoA转移酶：柠苹酰-CoA到柠苹酸的转化（步骤E）以及衣康酸到衣康酰-CoA的活化（步骤L）。图1步骤E中柠苹酰-CoA转移酶（EC2.8.3.7以及2.8.3.11）将CoA部分从柠苹酰-CoA转移到供体。柠苹酸:琥珀酰-CoA转移酶在乙醛酸同化的3-羟基丙酸循环中具有活性。该酶由橙色绿屈挠菌中的sst编码，其中它位于编码柠苹酰-CoA裂解酶的基因的上游(Friedmann等人,J Bacteriol.188:6460-6468(2006))。这种酶被克隆、异源表达以及表征于大肠杆菌。该酶还有作为衣康酸:琥珀酰-CoA转移酶的活性。通过与柠苹酰-CoA裂解酶基因的序列一致性以及近似性，在玫瑰弯菌属RS-1以及绿曲挠丝状菌中发现类似酶。表征于假单胞菌属B2aba的CoA转移酶表现出柠苹酰-CoA转移酶以及衣康酰-CoA转移酶活性，允许生物在衣康酸以及柠苹酸上生长(Cooper等人,Biochem.J91:82-91(1964))。与这种酶相关的基因尚未确定。柠苹酰-CoA转移酶活性还在氧化木糖无色杆菌的细胞提取物中被检测到，其有效地将衣康酸转化为柠苹酸(He等人,J Biosci Bioeng.89:388-391(2000))。相关的基因未知，但是该基因具有最高的蛋白质序列相似性Sst。
基因 GenBank GI号 生物
Sst YP_001635864.1 163847820 橙色绿屈挠菌
RoseRS_0050 YP_001274443.1 148654238 玫瑰弯菌属RS-1
Cagg_3093 YP_002464387.1 219849954 绿曲挠丝状菌
AXYL_05983 YP_003981992.1 311109139 氧化木糖无色杆菌
用于催化这些转换的附加候选酶包括克鲁佛氏梭菌的cat1、cat2以及cat3的基因产物，其已经显示分别具有琥珀酰-CoA、4-羟基丁酰基-CoA以及丁酰基-CoA转移酶活性(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA105:2128-2133(2008);Sohling等人,J Bacteriol.178:871-880(1996))。类似的CoA转移酶活性还存在于***滴虫(van Grinsven等人,J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008))以及布氏锥虫(Riviere等人,J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004))中。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
cat1 P38946.1 729048 克鲁佛氏梭菌
cat2 P38942.2 172046066 克鲁佛氏梭菌
cat3 EDK35586.1 146349050 克鲁佛氏梭菌
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 ***滴虫G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 布氏锥虫
来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的戊烯二酰基-CoA-转移酶（EC2.8.3.12）与在结构上与2,3-脱氢已二酰基-CoA类似的底物戊烯二酰基-CoA以及3-丁烯酰基-CoA反应(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。编码这种酶的基因是gctA以及gctB。这种酶对其他CoA衍生物（包括戊二酰基-CoA、2-羟基戊二酰基-CoA、已二酰基-CoA、巴豆酰基-CoA以及丙烯酰基-CoA）具有降低的但是可检测到的活性(Buckel等人,Eur.J Biochem.118:315-321(1981))。该酶已被克隆以及表达于大肠杆菌(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。戊烯二酸CoA-转移酶活性也已经在球孢梭菌以及共生梭菌中检测到。附加的戊烯二酸CoA-转移酶可以通过与发酵氨基酸球菌蛋白质序列的同源性得到推断。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
gctA CAA57199.1 559392 发酵氨基酸球菌
gctB CAA57200.1 559393 发酵氨基酸球菌
gctA ACJ24333.1 212292816 共生梭菌
gctB ACJ24326.1 212292808 共生梭菌
gctA NP_603109.1 19703547 具核梭杆菌
gctB NP_603110.1 19703548 具核梭杆菌
可以将乙酰基-CoA用作CoA供体的CoA转移酶是由大肠杆菌atoA（α亚基）和atoD（β亚基）基因编码的乙酰乙酰基-CoA转移酶(Korolev等人,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.58:2116-2121(2002);Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))。这种酶具有广泛的底物范围(Sramek等人,Arch.Biochem.Biophys.171:14-26(1975))以及已经显示将CoA部分从各种支链和直链酰基-CoA底物转移至醋酸，包括异丁酸(Matthies等人,Appl Environ.Microbiol58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))和丁酸酯(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))。在转录水平时，这种酶由乙酰醋酸诱导，因此调节控制的改性可以用于将这种酶设计入途径(Pauli等人,Eur.J Biochem.29:553-562(1972))。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Duncan等人,Appl.Environ.Microbiol68:5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人,Appl.Environ.Microbiol56:1576-1583(1990);Wiesenborn等人,Appl.Environ.Microbiol55:323-329(1989))以及糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))。
基因 登录号 GI号 生物
atoA P76459.1 2492994 大肠杆菌
atoD P76458.1 2492990 大肠杆菌
actA YP_226809.1 62391407 谷氨酸棒杆菌
cg0592 YP_224801.1 62389399 谷氨酸棒杆菌
ctfA NP_149326.1 15004866 丙酮丁醇梭菌
ctfB NP_149327.1 15004867 丙酮丁醇梭菌
ctfA AAP42564.1 31075384 糖乙酸多丁醇梭菌
ctfB AAP42565.1 31075385 糖乙酸多丁醇梭菌
EC3.2.1.a CoA水解酶（步骤E）.3.1.2家族中的酶将酰基-CoA分子水解为其对应的酸。具有广泛底物范围的几种CoA水解酶是适于表现柠苹酰-CoA水解酶活性的候选酶。例如，由来自褐鼠脑的acot12编码的酶(Robinson等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959-965(1976))可以与丁酰基-CoA、己酰基-CoA以及丙二酰基-CoA反应。由acot8编码的人二羧酸硫酯酶表现出对戊二酰基-CoA、已二酰基-CoA、环庚基-CoA、癸二酰基-CoA和癸基二酰基-CoA的活性(Westin等人,J.Biol.Chem.280:38125-38132(2005))。这种酶的最接近的大肠杆菌同系物tesB还可以水解各种CoA硫羟酸酯(Naggert等人,J Biol Chem266:11044-11050(1991))。类似的酶也已经表征于大鼠肝脏(Deana R.,Biochem Int26:767-773(1992))。大肠杆菌中具有水解酶活性的附加酶包括ybgC、paaI以及ybdB(Kuznetsova等人,FEMSMicrobiol Rev,2005,29(2):263-279;Song等人,J Biol Chem,2006,281(16):11028-38)。虽然尚未有关于其序列的报告，来自豌豆叶子的线粒体的酶具有广泛的底物特异性，其对乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、丁酰基-CoA、棕榈酰基-CoA、油酰基-CoA、琥珀酰-CoA以及巴豆酰基-CoA的活性已得到证实(Zeiher等人,Plant.Physiol.94:20-27(1990))。来自酿酒酵母的乙酰基-CoA水解酶ACH1代表另一候选水解酶(Buu等人,J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003))。
基因名称 GenBank ID GI号 生物
acot12 NP_570103.1 18543355 褐鼠
tesB NP_414986 16128437 大肠杆菌
acot8 CAA15502 3191970 智人
acot8 NP_570112 51036669 褐鼠
tesA NP_415027 16128478 大肠杆菌
ybgC NP_415264 16128711 大肠杆菌
paaI NP_415914 16129357 大肠杆菌
ybdB NP_415129 16128580 大肠杆菌
ACH1 NP_009538 6319456 酿酒酵母
仍然另一候选水解酶是来自发酵氨基酸球菌的戊烯二酸CoA-转移酶。这种酶通过定点诱变被转化成对戊二酰基-CoA、乙酰基-CoA和3-丁烯酰基-CoA具有活性的酰基-CoA水解酶(Mack等人,FEBS.Lett.405:209-212(1997))。这表明，编码琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA转移酶和乙酰乙酰基-CoA：乙酰基-CoA转移酶的酶也可以用作用于这种反应步骤的候选酶，如上所述，引入合适的突变以改变它们的功能。
基因 GenBank GI号 生物
gctA CAA57199 559392 发酵氨基酸球菌
gctB CAA57200 559393 发酵氨基酸球菌
EC4.1.1.a脱羧酶（步骤C、H、J）.图1中MAA的最终步骤是中康酸或柠康酸的脱羧。虽然具有柠康酸或中康酸脱羧酶活性的酶至今尚未确定，合适的候选酶包括催化乌头酸转化为衣康酸的乌头酸脱羧酶（EC4.1.1.6）、催化4-草酰巴豆酸酯转化为2-氧代戊烯酸酯的4-草酰巴豆酸酯脱羧酶（EC4.1.1.77）以及肉桂酸脱羧酶家族中的酶（EC4.1.1.-）。乌头酸脱羧酶（EC4.1.1.6）催化假丝酵母菌株以及还有丝状真菌土曲霉中衣康酸生物合成的最终步骤(Bonnarme等人.J Bacteriol.177:3573-3578(1995);Willke and Vorlop,Appl Microbiol.Biotechnol56:289-295(2001))。顺式乌头酸脱羧酶（CAD）（EC4.1.16）已被纯化以及表征于土曲霉(Dwiarti等人,J.Biosci.Bioeng.94(1):29-33(2002))。最近，该基因已被克隆和功能表征(Kanamasa等人,Appl.Microbiol Biotechnol 80:223-229 (2008))和(WO/2009/014437)。CAD的几种接近的同系物如下所列（EP2017344A1；WO2009/014437A1）。CAD的基因和蛋白质序列已有先前报道（EP2017344A1；WO2009/014437A1），以及几种接近的同系物如下所列。
基因 GenBank GI号 生物
CAD XP_001209273 115385453 土曲霉
XP_001217495 115402837 土曲霉
XP_001209946 115386810 土曲霉
BAE66063 83775944 米曲霉
XP_001393934 145242722 黑曲霉
XP_391316 46139251 玉米赤霉
XP_001389415 145230213 黑曲霉
XP_001383451 126133853 树干毕赤酵母
YP_891060 118473159 ***垢分支杆菌
NP_961187 41408351 鸟型分枝杆菌亚种类结核
YP_880968 118466464 鸟型分枝杆菌
ZP_01648681 119882410 稀有海洋放线菌
4-草酰巴豆酸脱羧酶催化4-草酰巴豆酸酯脱羧为2-氧代戊酸。这种酶已从众多生物中分离并得以表征。编码这种酶的基因包括假单胞菌属（菌株600）中的dmpH和dmpE(Shingler等人,174:711-724(1992))、来自恶臭假单胞菌的xylII和xylIII(Kato等人,Arch.Microbiol168:457-463(1997);Stanley等人,Biochemistry39:3514(2000);Lian等人,J.Am.Chem.Soc.116:10403-10411(1994))以及来自富养罗尔斯通氏菌JMP134的Reut_B5691和Reut_B5692(Hughes等人,158:79-83(1984))。来自假单胞菌属（菌株600）的编码该酶的基因已被克隆并表达于大肠杆菌(Shingler等人,J.Bacteriol.174:711-724(1992))。由恶臭假单胞菌中的xylI编码的4-草酰巴豆酸酯脱羧酶在与乙烯丙酮酸水合酶的复合体中起作用。缺乏水合酶活性并保留野生型脱羧酶活性的这种酶的重组体形式已得到表征(Stanley等人,Biochem.39:718-26(2000))。类似的酶发现于皮氏罗尔斯通氏菌（旧称皮氏假单胞菌）(Kukor等人,JBacteriol.173:4587-94(1991))。
基因 GenBank GI号 生物
dmpH CAA43228.1 45685 假单胞菌属CF600
dmpE CAA43225.1 45682 假单胞菌属CF600
xylII YP_709328.1 111116444 恶臭假单胞菌
xylIII YP_709353.1 111116469 恶臭假单胞菌
Reut_B5691 YP_299880.1 73539513 富养罗尔斯通氏菌JMP134
Reut_B5692 YP_299881.1 73539514 富养罗尔斯通氏菌JMP134
xylI P49155.1 1351446 恶臭假单胞菌
tbuI YP_002983475.1 241665116 皮氏罗尔斯通氏菌
最后，催化肉桂酸（苯基丙烯酸）和被取代的肉桂酸衍生物转化为其对应的苯乙烯衍生物的一类脱羧酶已被表征。这些酶常见于各种生物和编码已被克隆并表达于大肠杆菌的这些酶的基因中，包括：来自酿酒酵母的pad1(Clausen等人,Gene142:107-112(1994))、来自植物乳杆菌的pdc(Barthelmebs等人,67:1063-1069(2001);Qi等人,Metab Eng9:268-276(2007);Rodriguez等人,J.Agric.Food Chem.56:3068-3072(2008))、来自产酸克雷伯氏菌的pofK（pad）(Uchiyama等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.72:116-123(2008);Hashidoko等人,Biosci.Biotech.Biochem.58:217-218(1994))、来自戊糖片球菌的pad(Barthelmebs等人,67:1063-1069(2001))以及来自枯草芽孢杆菌以及短小芽孢杆菌的padC(Shingler等人,174:711-724(1992))。来自荧光假单胞菌的阿魏酸脱羧酶也已被纯化以及表征(Huang等人,J.Bacteriol.176:5912-5918(1994))。这种类别的酶是稳定的以及不需要外源性或内部结合的辅因子，因此使得这些酶理想地适于生物转换(Sariaslani,Annu.Rev.Microbiol.61:51-69(2007))。
基因名称 GenBankID GI号 生物
pad1 BAG32372.1 188496949 酿酒酵母
pdc AAC45282.1 1762616 植物乳杆菌
pofK(pad) BAF65031.1 149941607 产酸克雷伯氏菌
padC AAC46254.1 2394282 枯草芽孢杆菌
pad CAC16793.1 11322457 戊糖片球菌
pad CAC18719.1 11691810 短小芽孢杆菌
将山梨酸转化为1,3-戊二烯的另一合适的酶是山梨酸脱羧酶。通过黑曲霉的山梨酸脱羧需要三种基因：padA1、ohbA1以及sdrA(Plumridge等人Fung.Genet.Bio,47:683-692(2010)。PadA1被释为苯基丙烯酸脱羧酶，ohbA1是推定的4-羟基苯甲酸脱羧酶，以及sdrA是山梨酸脱羧酶调节子。附加的属种也已经显示将山梨酸脱羧，包括几种真菌和酵母物种(Kinderlerler和Hatton,Food Addit Contam.,7(5):657-69(1990);Casas等人,Int J Food Micro.,94(1):93-96(2004);Pinches和Apps,Int.J.Food Microbiol.116:182–185(2007))。例如，米曲霉和费希新萨托菌（Neosartorya fischeri）已经显示将山梨酸脱羧以及具有接近padA1、ohbA1和sdrA的同系物。
基因名称 GenBankID GI号 生物
padA1 XP_001390532.1 145235767 黑曲霉
ohbA1 XP_001390534.1 145235771 黑曲霉
sdrA XP_001390533.1 145235769 黑曲霉
padA1 XP_001818651.1 169768362 米曲霉
ohbA1 XP_001818650.1 169768360 米曲霉
sdrA XP_001818649.1 169768358 米曲霉
padA1 XP_001261423.1 119482790 费希新萨托菌
ohbA1 XP_001261424.1 119482792 费希新萨托菌
sdrA XP_001261422.1 119482788 费希新萨托菌
如上所列的脱羧酶的每一种表示一种可能适用于中康酸或柠康酸脱羧的酶。如果在所需的转化中没有观察到该酶的所需活性或生产力，可以利用已知的蛋白质设计方法进化脱羧酶以实现所需的性能。重要的是，通过利用嵌合酶显示，脱羧酶的C-末端区看起来对底物特异性负有责任(Barthelmebs等人,AEM67,1063-1069(2001))。因此，为了获得对中康酸或柠康酸的活性而扩大脱羧酶特异性的定向进化实验可以集中在这些酶的C-末端区。
EC4.1.3.a裂解酶（步骤D）.如图1的步骤D显示，柠苹酰-CoA裂解酶（EC4.1.3.25）将乙酰基-CoA以及丙酮酸转化为柠苹酰-CoA。这种酶参与乙醛酸同化的3-羟基丙酸（3-HP）循环，其中它按柠苹酰-CoA降解方向起作用。该酶由绿色非硫光养细菌橙色绿屈挠菌中的ccl基因编码(Friedmann等人,J Bacteriol.189:2906-2914(2007))，其中它位于编码柠苹酰-CoA转移酶的基因的下游。该ccl基因被克隆以及异源表达于大肠杆菌。类似的基因簇发现于玫瑰弯菌属RS-1以及绿曲挠丝状菌，虽然该酶至今还未得以表征。该3-HP循环在类球红细菌（其基因组编码与ccl基因产物具有高度序列相似性的蛋白质）中也有活性(Filatova等人,Mikrobiologiia74:319-328(2005))。来自芽孢杆菌属的柠苹酰-CoA裂解酶显示是可逆的，虽然相关的基因至今尚未确定(Sasaki等人,J Biochem.73:599-608(1973))。
基因 GenBank GI号 生物
Caur_2265 YP_001635863.1 163847819 橙色绿屈挠菌
RoseRS_0049 YP_001274442.1 148654237 玫瑰弯菌属RS-1
Cagg_3093 YP_002464386.1 219849953 绿曲挠丝状菌
Rsph17029_1172 YP_001043054.1 126461940 类球红细菌
EC4.2.1.a脱水酶（步骤B、F）.图1的步骤B中柠苹酸脱水为柠康酸是通过具有柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）活性的酶（EC4.2.1.35）催化的。这种酶，连同柠苹酸合酶，参与表征于詹氏甲烷球菌以及问号钩体的不依赖苏氨酸的异亮氨酸生物合成途径。这些生物中柠苹酸的脱水通过异丙基苹果酸异构酶（IPMI）催化，所述酶既催化柠苹酸脱水为柠康酸，又催化后续的水到柠康酸的反式加成以形成甲基苹果酸(Xu等人,J Bacteriol.186:5400-5409(2004);Drevland等人,J Bacteriol.189:4391-4400(2007))。由hacAB编码的詹氏甲烷球菌高乌头酸酶（EC4.2.1.114）也是合适的候选酶，以及具有改变的底物特异性和异丙基苹果酸异构酶活性的这种酶的突变体已被表征(Jeyakanthan等人,Biochemistry49:2687-2696(2010))。该问号钩体IPMI基因被克隆入大肠杆菌，其中当一起表达时，它们能够补充缺乏原生乌头酸酶活性的菌株(Xu等人,J Bacteriol.186:5400-5409(2004))。柠苹酸脱水酶也已经表征于恶臭假单胞菌，其中它参与3,5-二甲苯酚降解。编码这种途径的酶（包括柠苹酸脱水酶）的基因位于可传递的质粒pRA500上，以及它们已被克隆入大肠杆菌(Jain,Appl.Microbiol.Biotechnol.,45:502-508(1996))。柠康酸也是由LEU1编码的酿酒酵母3-异丙基苹果酸脱水酶（EC4.2.1.33）的底物(Kohlhaw,Methods Enzymol.166:423-429(1988))。麦芽糖假丝酵母的3-异丙基苹果酸脱水酶LEU1表现出比原生底物更高的对柠康酸的活性(Bode,R.和Birnbaum,D.,J.Basic Microbiol.31:21-26(1991))。可能需要柠康酸到甲基苹果酸水合活性的减弱或选择性抑制，以增加柠康酸中间体的累积。
基因 GenBank GI号 生物
LeuC P81291.1 3219823 詹氏甲烷球菌
LeuD Q58673.1 3122345 詹氏甲烷球菌
hacA Q58409.1 3122347 詹氏甲烷球菌
hacB Q58667.1 3122344 詹氏甲烷球菌
LeuC NP_712276.1 24214795 问号钩体
LeuD NP_712277.1 24214796 问号钩体
LEU1 AAB19612.1 234318 酿酒酵母
cmLEU1 AAB03335.1 1399939 麦芽糖假丝酵母
另一合适的候选柠苹酸脱水酶是形成顺式2-甲基乌头酸（EC4.2.1.79）以及反式2-甲基乌头酸（EC4.2.1.117）的2-甲基柠檬酸脱水酶。由prpD编码的大肠杆菌的2-甲基柠檬酸顺式脱水酶作为底物对柠苹酸具有活性(Blank等人,Microbiology148:133-146(2002))。柠康酸或中康酸均没有作为底物的活性，这表明严格来讲，PrpD是脱水酶而非异构酶。鼠伤寒沙门氏菌的PrpD酶也已经被表征，但是对柠苹酸的活性还未得到证实(Horswill等人,Biochemistry40:4703-4713(2001))。由acnB和acnD编码的奥奈达湖希瓦氏菌的2-甲基柠檬酸脱水酶也是候选酶(Grimek等人,J Bacteriol.186:454-462(2004))。AcnD酶需要由prpF编码的辅因子以在活体内起作用。对与乌头酸的复合体中PrpF的晶体结构研究显示，该酶作为顺式/反式异构酶起作用，将乌头酸和2-甲基乌头酸的顺式/反式异构体相互转化(Garvey等人,Protein Sci16:1274-1284(2007))。来自奥奈达湖希瓦氏菌的另外的候选酶是预测的由leuCD编码的异丙基苹果酸异构酶。
基因 GenBank GI号 生物
prpD AAC73437.1 1786528 大肠杆菌
prpD AAC44816.1 1648968 鼠伤寒沙门氏菌
acnB NP_716069.1 24372027 奥奈达湖希瓦氏菌
acnD AAN53428.1 24345782 奥奈达湖希瓦氏菌
prpF AAN53427.1 24345781 奥奈达湖希瓦氏菌
leuC NP_719761.1 24375718 奥奈达湖希瓦氏菌
leuD NP_719760.1 24375717 奥奈达湖希瓦氏菌
步骤F中柠苹酸脱水为中康酸通过柠苹酸脱水酶（中康酸形成，EC4.2.1.34），也称为2-甲基苹果酸脱水酶或中康酸酶（mesaconase）催化。这种酶已被仅仅部分地表征于假破伤风梭菌，以及候选基因至今尚不可得。该活性也已经在深红红螺菌的细胞提取物中得到证实，其中它参与利用醋酸的柠苹酸循环(Berg和Ivanovskii,Mikrobiologiia78:22-31(2009))，虽然相关的基因尚未确定。
衣康酰-CoA通过衣康酰-CoA水合酶（EC4.2.1.56）转化为柠苹酰-CoA（图1步骤K），该衣康酰-CoA水合酶参与生物，如假单胞菌属B2aba(Cooper和Kornberg,Biochem.J91:82-91(1964))、氧化木糖无色杆菌(He等人,J Biosci Bioeng.89:388-391(2000))以及荧光假单胞菌(Nagai,J.,J.Biochem,53:181-7(1963))中的衣康酸同化途径。这种酶活性至今尚未与基因相关。
EC5.2.1.a顺式/反式异构酶（步骤G）.中康酸以及柠康酸的顺式/反式异构化通过具有柠康酸异构酶活性的酶催化。合适的候选酶包括乌头酸异构酶（EC5.3.3.7）；马来酸顺式、反式异构酶（EC5.2.1.1）；马来酰基丙酮顺式、反式异构酶；以及不饱和脂肪酸（Cti）的顺式、反式异构酶。
乌头酸异构酶将顺式和反式乌头酸相互转化。由prpF编码的奥奈达湖希瓦氏菌的乌头酸异构酶将乌头酸以及2-甲基乌头酸的顺式/反式异构体相互转化(Garvey等人,Protein Sci16:1274-1284(2007))。这种酶在与甲基柠檬酸脱水酶AcnD的复合体中运行。乌头酸异构酶活性在许多革兰阴性细菌（包括荧光假单胞菌以及恶臭假单胞菌）中，但没有在革兰阳性细菌中被检测到(Watanabe等人,Curr Microbiol35:97-102(1997))。来自恶臭假单胞菌的纯化酶已被表征(Klinman等人,Biochemistry10:2253-2259(1971))。也已经对植物中的乌头酸异构酶进行了研究，但是基因至今尚未确定(Thompson等人,Anal.Biochem.184:39-47(1990))。与prpF蛋白质具有高度序列同源性的一些预测蛋白质如下所列。
基因 GenBank GI号 生物
prpF AAN53427.1 24345781 奥奈达湖希瓦氏菌
prpF PP_2337 26989061 恶臭假单胞菌
Pfl01_1767 YP_347499.1 77457994 荧光假单胞菌
Reut_A1811 YP_296020.1 73541500 富养罗尔斯通氏菌
因此，顺式、反式异构酶的加成可能有助于改善对苯二甲酸的收率。用于类似异构体转化的酶包括马来酸顺式、反式异构酶（EC5.2.1.1）；马来酰基丙酮顺式反式异构酶（EC5.2.1.2）；以及不饱和的脂肪酸（Cti）的顺式、反式异构酶。
马来酸顺式、反式异构酶（EC5.2.1.1）催化顺式结构的马来酸到反式结构的富马酸的转化(Scher等人,J Biol.Chem.244:1878-1882(1969))。粪产碱杆菌maiA基因产物已被克隆以及表征(Hatakeyama等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.239:74-79(1997))。其他马来酸顺式、反式异构酶在粘质沙雷氏菌(Hatakeyama等人,Biosci.Biotechnol Biochem.64:1477-1485(2000))、富养罗尔斯通氏菌以及嗜热脂肪地芽孢杆菌中可得。
基因 GenBank GI号 生物
maiA BAA23002 2575787 粪产碱杆菌
maiA YP_725437 113866948 富养罗尔斯通氏菌H16
maiA BAA77296 4760466 嗜热脂肪地芽孢杆菌
maiA BAA96747.1 8570038 粘质沙雷氏菌
马来酰基丙酮顺式、反式异构酶（EC5.2.1.2）催化4-马来酰基-乙酰醋酸到4-富马酰-乙酰醋酸的转化，顺式到反式的转化。这种酶由绿脓假单胞菌(Fernandez-Canon等人,J Biol.Chem.273:329-337(1998))以及霍乱弧菌(Seltzer,J Biol.Chem.248:215-222(1973))中的maiA编码。通过序列同源性在大肠杆菌O157中确认了类似酶。
基因 GenBank GI号 生物
maiA NP_250697 15597203 绿脓假单胞菌
maiA NP_230991 15641359 霍乱弧菌
maiA EDU73766 189355347 大肠杆菌O157
cti基因产物催化顺式不饱和的脂肪酸（UFA）到反式UFA的转化。该酶已被表征于恶臭假单胞菌(Junker等人,J Bacteriol.181:5693-5700(1999))。类似酶发现于希瓦氏菌属MR-4以及霍乱弧菌。
基因 GenBank GI号 生物
cti AAD41252 5257178 恶臭假单胞菌
cti YP_732637 113968844 希瓦氏菌属MR-4
cti ZP_04395785 229506276 霍乱弧菌
EC5.3.3.aΔ-异构酶（步骤I）.衣康酸到柠康酸的转化通过衣康酸Δ-异构酶催化。具有这种活性的酶是巴克氏真杆菌的甲基衣康酸Δ-异构酶（EC5.3.3.6）(Velarde等人,J Mol Biol391:609-620(2009))。这种酶被异源表达以及表征于大肠杆菌。具有高度蛋白质序列相似性的同系物如下所列。
基因 GenBank GI号 生物
mii Q0QLE6.1 122953534 巴克氏真杆菌
FMAG_01516 ZP_04567526.1 237737045 死亡梭杆菌
BACCAP_02290 ZP_02036679.1 154498301 多毛拟杆菌
CLJU_c30450 YP_003781195.1 300856211 扬氏梭菌
BMD_3790 YP_003598973.1 295705898 巨大芽孢杆菌
EFER_3666 YP_002384731.1 218550940 弗格森埃希氏菌
EC6.2.1CoA合成酶（步骤E）.柠苹酰-CoA到柠苹酸（图1，步骤E）以及衣康酸到衣康酰-CoA（图1，步骤L）的转化可以通过酶6.2.1家族的CoA酸-硫醇连接酶或CoA合成酶催化。具有衣康酰-CoA合成酶（EC6.2.1.4）活性的琥珀酰-CoA合成酶被表征于假单胞菌属B2aba，但是基因尚未确定(Cooper和Kornberg,Biochem.J 91:82-91(1964))。附加的CoA连接酶候选酶包括琥珀酰-CoA合成酶（EC6.3.1.4）、乙酰基-CoA合成酶（EC6.2.1.13）、酰基-CoA连接酶以及丙二酰基-CoA合成酶（EC 6.3.4.9）。具有广泛底物范围的几种酶用已在文献中被描述。形成ADP的乙酰基-CoA合成酶（ACD，EC6.2.1.13）是将酰基-CoA酯类到其对应的酸的转化耦合于伴随的ATP合成的酶。由AF1211编码的来自闪烁古生球菌的ACDI显示对各种直链和支链底物（包括异丁酸、异戊酸以及富马酸）起作用(Musfeldt等人,JBacteriol.184:636-644(2002))。由AF1983编码的闪烁古生球菌中第二可逆ACD还显示具有对环状化合物苯基醋酸和吲哚醋酸具有高活性的广泛底物范围(Musfeldt和Schonheit,J Bacteriol.184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的酶（释为琥珀酰-CoA合成酶）接受丙酸、丁酸以及支链酸（异戊酸和异丁酸）作为底物，以及显示按向前和逆向方向运行(Brasen等人,Arch.Microbiol 182:277-287(2004))。由来自超嗜热泉古菌耐超高温热棒菌的PAE3250编码的ACD显示所有被表征的ACD的最广泛的底物范围，与乙酰基-CoA、异丁酰基-CoA（优选的底物）以及苯基乙酰基-CoA反应(Brasen和Schonheit, Arch.Microbiol182:277-287(2004))。定向进化或工程可以用于改性这种酶以于宿主生物的生理温度下运行。来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌以及耐超高温热棒菌的酶均已被克隆，功能表达以及表征于大肠杆菌(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol 182:277-287(2004);Musfeldt和Schonheit,J Bacteriol.184:636-644(2002))。来自恶臭假单胞菌由paaF编码的酰基-CoA连接酶已证实对几种脂肪族底物（包括醋酸、丙酸、丁酸、戊酸、已酸、庚酸和辛酸）以及对芳香族化合物（如苯基醋酸和苯氧基醋酸）起作用(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。来自豌豆根瘤菌的相关的酶丙二酰基CoA合成酶（6.3.4.9）可以将几种二酸，即乙基丙二酸、丙基丙二酸、烯丙基丙二酸、异丙基丙二酸、二甲基丙二酸、环丙基丙二酸、环丙基亚甲基丙二酸、环丁基丙二酸以及苯甲基丙二酸转化为其对应的一硫代酯(Pohl等人,J.Am.Chem.Soc.123:5822-5823(2001))。附加的候选酶是由大肠杆菌中的sucCD以及酿酒酵母中的LSC12编码的琥珀酰-CoA合成酶，其在活体内可逆的反应中，自然地催化琥珀酸形成琥珀酰-CoA并伴随消耗一份ATP(Buck等人,Biochemistry24:6245-6252(1985))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古生球菌
scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌
PAE3250 NP_560604.1 18313937 耐超高温热棒菌菌株IM2
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
matB AAC83455.1 3982573 豌豆根瘤菌
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
LSC1 NP_014785 6324716 酿酒酵母
LSC2 NP_011760 6321683 酿酒酵母
实施例II
具有乙酰基CoA到MAA途径的生产MAA的微生物的制备
本实施例描述了能够从乙酰基-CoA以及丙酮酸生产MAA的微生物的生成。这种示例性途径如图1的步骤A/B/C所显示。
大肠杆菌被用作目标生物，以设计图1的步骤A、B和C所显示的从乙酰基-CoA以及丙酮酸到MAA的生产途径。大肠杆菌提供用于生成能够生产MAA的非天然存在的微生物的良好宿主。大肠杆菌能经受遗传操纵以及已知能够在厌氧或微氧的条件下有效地生产各种产物，如乙醇、醋酸、甲酸、乳酸、琥珀酸和1,4-丁二醇。
为生成经设计以从乙酰基-CoA生产MAA的大肠杆菌菌株，利用熟知的分子生物技术将如前所述，编码在图1的途径中使用的酶的核酸表达在大肠杆菌中（参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第3版(2001);Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1999))。具体地，大肠杆菌菌株经设计以经由图1（步骤A/B/C）中概述的路径从乙酰基-CoA生产MAA。编码酶以将乙酰基-CoA转换为MAA的基因被组装到载体之上。具体地，分别编码柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶以及柠康酸脱羧酶的基因cimA（Q58787.1）、leuCD（P81291.1以及Q58673.1）以及cad（XP_001209273）在PA1/lacO启动子的控制下被克隆入pZE13载体（德国吕尔茨海姆的Expressys）。然后，质粒被转换进入包含lacIQ的宿主菌株大肠杆菌MG1655，这允许通过添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导型表达。所得的菌株表达从乙酰基-CoA合成MAA所需的蛋白质和酶。
遵循本领域熟知的程序在包含培养基的葡萄糖中培养所得的遗传工程生物（参见，例如，Sambrook等人，同上，2001）。利用本领域熟知的用于测定多肽表达或酶活性的方法（包括，例如，Northern印迹法、mRNA PCR和免疫印迹法）确证MAA途径基因的表达。利用对个体活性具有特异性的测定证实被表达的酶的酶活性。利用HPLC、气相色谱-质谱（GCMS）或液相色谱-质谱（LCMS）证实经设计的大肠杆菌菌株生产MAA的能力。
通过优化进一步增强经设计有功能性MAA合成途径的微生物菌株，以高效地利用该途径。简要地说，对经设计的菌株进行评估，以确定任何外源基因是否以速率限制水平进行表达。针对以可以限制通过该途径的通量的低水平表达的任何酶，通过，例如，引入额外的基因拷贝数或密码子优化增加表达。策略，如突变和/或定向进化，也适用于改变MAA途径酶的活性、调节和/或的表达。
为生成更好的生产者，利用代谢建模优化培育条件。建模还被用以设计另外优化途径应用的可选基因敲除（参见，例如美国专利公布US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654和US2004/0009466；以及美国专利号7,127,379）。建模分析允许对偏移代谢对细胞生长的影响进行可靠的预测，以便更高效地生产MAA。建模分析允许可靠地预测对将新陈代谢朝MAA更高效的生产进行转移的细胞培育的影响。一种建模方法是双层优化方法OptKnock(Burgard等人,Biotechnol.Bioengineer.84:647-657(2003))，其适用于选择总体说来导致MAA更好的生产的“基因敲除”。适应性进化也可以被用来产生，例如，柠康酸酯的中间体或MAA产品的更好的生产者。执行适应进化以提高耐受性、生长和生产特性(Fong和Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004);Alper等人,Science314:1565-1568(2006))。基于该成果，随后的几轮建模、基因工程和适应性进化可以被应用到MAA生产者以进一步提高产量。
为了大规模生产MAA，使用本领域已知的培养基在发酵罐中培养上述含MAA途径的生物，以支持厌氧条件下该微生物的生长。以分批、补料分批或连续的方式进行发酵。厌氧条件可以通过首先用氮喷射该培养基，然后密封培养容器（例如，可以用垫片和钳口盖密封烧瓶）来保持。也可以通过提供小孔以进行有限通气的方式利用微氧条件。通过加入酸（如H2SO4）将培养基的pH值保持为pH值7。通过利用分光光度计（600nm）测量光密度确定生长速率，以及通过监测随着时间的推移碳源的消耗确定葡萄糖摄取速率。可以使用葡萄糖和醇折射率检测器以及有机酸UV检测器，通过具有HPX-087柱（BioRad）的HPLC（Shimadzu）对副产物，如不希望的醇类、有机酸和残余葡萄糖定量Lin等人,Biotechnol.Bioeng.,775-779(2005)。
实施例III
用于从甲基丙烯酸酯以及醇类形成甲基丙烯酸酯类的示例性酶
本实施例描述了用于生产甲基丙烯酸酯类的示例性途径的酶。
图2描绘了从MAA以及醇类到甲基丙烯酸酯类的示例性途径。异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA转移酶可以被应用以从甲基丙烯酸酯形成异丁烯酰基-CoA。具有醇转移酶活性的酶可以被应用以从异丁烯酰基-CoA以及醇类形成甲基丙烯酸酯类。
甲基丙烯酸酯到异丁烯酰基-CoA的转化可以通过酶6.2.1家族中CoA酸-硫醇连接酶或CoA合成酶催化。具有这种活性的示例性酶在实施例I中提供。替代性地，甲基丙烯酸酯到异丁烯酰基-CoA的转化可以通过酶2.8.3家族中的转移酶催化。CoA转移酶催化CoA部分从一个分子到另一个分子的转移。具有这种活性的示例性酶在实施例I中提供。
从异丁烯酰基-CoA以及醇类到甲基丙烯酸酯类的形成通过具有醇转移酶活性的酶催化。具有醇转移酶活性的几种酶在美国专利号7,901,915的实施例1-10中得到证实。这些酶包括Novozyme435（来自南极假丝酵母的固定化的脂肪酶B，Sigma）、来自柱状假丝酵母的脂肪酶C2（Αmerix Ltd）、来自荧光假单胞菌的脂肪酶（Αmerix Ltd）、来自曲霉属的L-氨基酰基酶以及来自米曲霉的蛋白酶。这类酶显示分别从丙烯酰基-CoA以及甲醇或乙醇形成甲基丙烯酸以及乙基丙烯酸。这类转移酶可以因此用以形成甲基丙烯酸酯类。
其他合适的酶包括由来自南极假丝酵母的calB(Efe等人,Biotechnol.Bioeng.99:1392-1406(2008))以及来自荧光假单胞菌的EstF1酯酶(Khalameyzer等人,Appl.Environ.Microbiol.65:477-482(1999))编码的脂肪酶。由来自荧光假单胞菌的lipB以及来自枯草芽孢杆菌的estA编码的脂肪酶也可以催化这种转换。枯草芽孢杆菌以及荧光假单胞菌基因编码已被克隆并表征于大肠杆菌的三酰基甘油脂肪酶(Dartois等人,Biochim.Biophys.Acta1131:253-260(1992);Tan等人,Appl.Environ.Microbiol.58:1402-1407(1992))。
基因 登录号 GI号 生物
calB P41365.1 1170790 南极假丝酵母
EstF1 AAC36352.1 3641341 荧光假单胞菌
lipB P41773.1 1170792 荧光假单胞菌
estA P37957.1 7676155 枯草芽孢杆菌
编码用于从异丁烯酰基-CoA以及醇类形成甲基丙烯酸酯类的酶的附加候选基因包括编码具有蜡酯合酶（WS）和酰基-CoA:二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）活性的双功能的酶的不动细菌属ADPl atfA(Kalscheuer等人.AJBiol Chem2003,278:8075-8082.)；编码希蒙得木种子中蜡的累积所需的酶的加州希蒙得木基因AAD38041(Lardizabal等人.Plant Physiology2000,122:645-655.)；编码双功能的WS/DGAT酶的泊库岛食烷菌atfAl和atfA2(Kalscheuer等人.J Bacteriol2007,189:918-928.)；编码醇乙酰基转移酶的来自凤梨草莓AAT的ths(Noichinda等人.FoodSci Technol Res1999,5:239-242.)；编码醇乙酰基转移酶的杂交栽培玫瑰AATl(Guterman等人.PlantMoI Biol2006,60:555-563.)；编码醇乙酰基转移酶的酿酒酵母ATFl和ATF2(Mason等人.Yeast2000,16:1287-1298.)；以及来自除烃海杆菌的Ws1和Ws2(Holtzapple,E.和Schmidt-Dannert,C.,J.Bacteriol.189(10),3804-3812,2007)。由estA编码的来自乳酸乳球菌的羧基酯酶催化从乙酰基-CoA以及醇类（如乙醇和甲硫醇）到酯类的形成(Nardi等人.J.Appl.Microbiol.93:994-1002(2002))。来自葡萄汁酵母的醇O-乙酰基转移酶将各种各样的醇底物（包括支链醇类）转化为其对应的醋酸酯类(Yoshioka和Hashimoto,Agricul and Biol Chem,45:2183-2191(1981)。由这些基因编码的酶的蛋白质序列提供如下。
基因 GenBank ID GI号 生物
atfA Q8GGG1 81478805 不动细菌属ADP1
AF149919.1:13..1071 AAD38041 5020219 加州希蒙得木
atfAl YP694462 110835603 泊库岛食烷菌SK2
atfA2 YP693524 110834665 泊库岛食烷菌SK2
AAT AAG13130.1 10121328 凤梨草莓
AATl Q5I6B5 75105208 杂交栽培玫瑰
ATFl P40353 2506980 酿酒酵母
ATF2 P53296 1723729 酿酒酵母
Ws2 ABO21021.1 126567232 除烃海杆菌
Ws1 ABO21020.1 126567230 除烃海杆菌
EstA AAF62859.1 7453516 乳酸乳球菌
实施例IV
用于从甲基丙烯酸酯以及醇类形成甲基丙烯酸酯类的示例性酶
本实施例描述了用于生产甲基丙烯酸酯类的示例性途径的酶。
图2描绘了从MAA以及醇类到甲基丙烯酸酯类的示例性途径。甲基丙烯酸酯类可以通过化学方式，例如,通过存在脱水剂（如酸催化剂）时，存在一种醇或多种醇时加热甲基丙烯酸酯的方式进行生产。具有甲基丙烯酸酯类形成活性的酶也可以应用以直接从甲基丙烯酸酯以及醇类形成甲基丙烯酸酯类。编码这类酶的基因可以被表达于包含甲基丙烯酸酯合成途径的生物中。包含甲基丙烯酸酯合成途径的几种这类生物被披露于本文以及WO/2009/135074中。可以将甲基丙烯酸酯类形成酶靶向细胞溶质以实现醇类以及甲基丙烯酸酯到甲基丙烯酸酯类的细胞内转化。替代性地，可以将甲基丙烯酸酯类形成酶分泌入发酵培养基以实现醇类以及甲基丙烯酸酯到甲基丙烯酸酯类的细胞内转化。另一选择是将甲基丙烯酸酯类形成酶添加到包含甲基丙烯酸酯和醇类的混合物，如发酵肉汤。具有甲基丙烯酸酯类形成活性的几种酶如下文所述。
来自短杆菌属R312的酰胺酶（EC3.5.1.4）是一种具有甲基丙烯酸酯类形成活性的合适酶。这种酶显示水解乙基丙烯酸(Thiery等人,J.Gen.Microbiol.,132:2205-8,1986;Soubrier等人,Gene,116:99-104,1992)。来自褐鼠的微粒体环氧化物水解酶（EC3.3.2.9）具有水解缩水甘油基甲基丙烯酸酯的活性以及是另一种合适的酶（Guengerich等人,Rev.Biochem.Toxicol.4:5-30,1982）。这些基因的蛋白质序列提供如下。
基因 GenBank ID GI号 生物
amiE JC1174 98711 短杆菌属
Eph-1 P07687.1 123928 褐鼠
编码潜力甲基丙烯酸酯类形成酶的附加基因包括编码具有蜡酯合酶（WS）以及酰基-CoA:二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）活性的双功能酶的不动细菌属ADPl atfA(Kalscheuer等人.AJ Biol Chem2003,278:8075-8082.)；编码希蒙得木种子中蜡的累积所需的酶的加州希蒙得木基因AAD38041(Lardizabal等人.Plant Physiology2000,122:645-655)；编码双功能的WS/DGAT酶的泊库岛食烷菌atfAl和atfA2(Kalscheuer等人.JBacteriol2007,189:918-928.)；编码醇乙酰基转移酶的来自凤梨草莓AAT的ths(Noichinda等人.FoodSci Technol Res1999,5:239-242.)；编码醇乙酰基转移酶的杂交栽培玫瑰AATl(Guterman等人.Plant MoI Biol2006,60:555-563.)；编码醇乙酰基转移酶的酿酒酵母ATFl和ATF2(Mason等人.Yeast2000,16:1287-1298.)；以及来自除烃海杆菌的Ws1和Ws2(Holtzapple,E.和Schmidt-Dannert,C.,J.Bacteriol.189(10),3804-3812,2007)。由estA编码的来自乳酸乳球菌的羧基酯酶催化从乙酰基-CoA以及醇类（如乙醇和甲硫醇）到酯类的形成(Nardi等人.J.Appl.Microbiol.93:994-1002(2002))。来自葡萄汁酵母的醇O-乙酰基转移酶将各种各样的醇底物（包括支链醇类）转化为其对应的醋酸酯类(Yoshioka和Hashimoto,Agricul and Biol Chem,45:2183-2191(1981)。与这种活性相关的基因至今尚未确定。由这些基因编码的酶的蛋白质序列提供如下。
基因 GenBank ID GI号 生物
atfA Q8GGG1 81478805 不动细菌属ADP1
AF149919.1:13..1071 AAD38041 5020219 加州希蒙得木
atfAl YP694462 110835603 泊库岛食烷菌SK2
atfA2 YP693524 110834665 泊库岛食烷菌SK2
AAT AAG13130.1 10121328 凤梨草莓
AATl Q5I6B5 75105208 杂交栽培玫瑰
ATFl P40353 2506980 酿酒酵母
ATF2 P53296 1723729 酿酒酵母
Ws2 ABO21021.1 126567232 除烃海杆菌
Ws1 ABO21020.1 126567230 除烃海杆菌
EstA AAF62859.1 7453516 乳酸乳球菌
智人对氧磷酶PON1-PON1（G3C9）以及PON3（EC3.1.8.1）具有芳基酯酶和有机磷酸酶活性以及还可以具有甲基丙烯酸酯类形成活性。PON1在192位残基上具有共同的多态位点，导致性质上的差异的谷氨酰胺（R）或精氨酸。例如，R同工酶比S同工酶对GBL具有更高的酯酶活性(Billecke等人,Drug Metab Dispos.28:1335-1342(2000))。在智人细胞中，PON1位于高密度脂蛋白（HDL）颗粒之上，以及其活性和稳定性需要这种环境。野生型和重组PON1酶已被功能表达于其他生物(Rochu等人,Biochem.Soc.Trans.35:1616-1620(2007);Martin等人,Appl.Environ.Microbiol.(2009))。在大肠杆菌中，对PON1的定向进化研究获得了具有改善的溶解度和催化性质的几种突变体酶（核苷酸登录号AY499188-AY499199）(Aharoni等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A101:482-487(2004))。来自该项研究的一种重组变体G3C9(Aharoni等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A101:482-487(2004))最近被用于整体生物工艺中，该工艺被用于从乙酰丙酸到4-戊内酯的依赖pH的生产(Martin等人,Appl.Environ.Microbiol.(2009))。人PON3也是可能具有甲基丙烯酸酯类形成活性的另一种合适的酶(Draganov等人,J.Lipid Res.46:1239-1247(2005))。
基因 登录号 GI号 生物
PON1 NP_000437.3 19923106 智人
PON1(G3C9) AAR95986.1 40850544 合成变体
PON3 NP_000931.1 29788996 智人
另外地，南极假丝酵母脂肪酶B是具有甲基丙烯酸酯类形成活性的另一种合适的候选酶(Efe等人,Biotechnol.Bioeng.99:1392-1406(2008))。由EstF1编码的来自荧光假单胞菌的酯酶也是另一种合适的酶(Khalameyzer等人,Appl.Environ.Microbiol.65:477-482(1999))。来自诸如荧光假单胞菌以及枯草芽孢杆菌的生物的其他脂肪酶也可以催化这种转换。枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌基因编码已被克隆并表征于大肠杆菌的三酰基甘油脂肪酶(Dartois等人,Biochim.Biophys.Acta1131:253-260(1992);Tan等人,Appl.Environ.Microbiol.58:1402-1407(1992))。
基因 登录号 GI号 生物
calB P41365.1 1170790 南极假丝酵母
EstF1 AAC36352.1 3641341 荧光假单胞菌
lipB P41773.1 1170792 荧光假单胞菌
estA P37957.1 7676155 枯草芽孢杆菌
甲基丙烯酸酯类的形成还可以由3.1.1家族中对用于环内酯和开链羟基羧酸之间的相互转化的羧酸酯结合分子起作用的的酶催化。来自层出镰孢菌ECU2002的L-内酯酶表现出对各种内酯底物的内酯酶和酯酶活性(Zhang等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.75:1087-1094(2007))。1,4-内酯羟基酰基水解酶（EC3.1.1.25）（也称为1,4-内酯酶或γ-内酯酶）对具有4-8个碳原子的1,4-内酯具有特异性。对人血液和大鼠肝脏微粒体中的γ内酯酶进行纯化(Fishbein等人,J Biol Chem241:4835-4841(1966))以及通过钙离子活化并稳定内酯酶活性(Fishbein等人,J Biol Chem241:4842-4847(1966))。pH6.0时观察到最佳内酯酶活性，而高pH导致水解活性(Fishbein和Bessman,J BiolChem241:4842-4847(1966))。来自野油菜黄单胞菌、黑曲霉和尖孢镰刀菌的基因已被释为1,4-内酯酶以及可以被用于催化4-羟基丁酸到GBL的转换(Zhang等人,Appl Microbiol Biotechnol75:1087-1094(2007))。
基因 登录号 GI号 生物
EU596535.1:1..1206 ACC61057.1 183238971 层出镰孢菌
xccb100_2516 YP_001903921.1 188991911 野油菜黄单胞菌
An16g06620 CAK46996.1 134083519 黑曲霉
BAA34062 BAA34062.1 3810873 尖孢镰刀菌
实施例V
用于经由3-羟基异丁酸酯从琥珀酰-CoA到MAA的转化的途径
本实施例描述了经由3-羟基异丁酸酯从琥珀酰-CoA到甲基丙烯酸的示例性MAA合成途径。
用于MAA合成的一个示例性途径从琥珀酰-CoA开始（见图3）。这种途径使用至少三个以及至多五个酶步骤以从琥珀酰-CoA形成MAA。在这种途径（见图3）中，琥珀酰-CoA首先转化为(R)-甲基丙二酰基-CoA，其可能通过表异构酶转化为(S)-甲基丙二酰基-CoA。甲基丙二酰基-CoA的(R)-或(S)-立体异构体然后通过表现出酰基-CoA还原酶以及醇脱氢酶活性的一对酶（如图3中所示）或单个酶分别还原为(R)-或(S)-3-羟基异丁酸酯。从琥珀酰-CoA到3-羟基异丁酸酯的途径也已被描述于WO2007/141208中。在最后的步骤中，3-羟基异丁酸酯经脱水形成MAA。
成功地设计这种途径涉及确认具有足够活性和特异性的合适酶组。这伴有确认合适酶组，将其对应的基因克隆入生产宿主，优化发酵条件，以及测定发酵后的产物形成情况。为设计用于生产甲基丙烯酸的生产宿主，在微生物中表达一种或多种外源性DNA序列。另外，该微生物可以功能删除内源性基因。这些改变允许利用可再生原料生产甲基丙烯酸。
下文以及此处描述了许多生物化学表征的候选基因，该基因能够编码催化所需途径的每个步骤的酶。虽然通过将大肠杆菌作为宿主生物来设计途径进行描述，基本上可以使用任何合适的宿主生物。具体地列出了对大肠杆菌来说是原生的基因以及其他生物中当进行合适的克隆和表达时可以被应用来催化合适转换的基因。
参见图3，步骤1涉及甲基丙二酰基-Co变位酶（EC5.4.99.2）。在第一步骤中，琥珀酰-CoA通过甲基丙二酰基-CoA变位酶（MCM）转化为甲基丙二酰基-CoA。甲基丙二酰基-CoA变位酶是将琥珀酰-CoA转化为甲基丙二酰基-CoA的依赖钴胺素的酶。在大肠杆菌中，可逆的依赖腺苷基钴胺素的变位酶参与使琥珀酸转化为丙酸的三步骤途径(Haller等人,Biochemistry39:4622-4629(2000))。MCM候选基因的过表达以及YgfG的删除可用以防止甲基丙二酰基-CoA脱羧为丙酰基-CoA以及使可用于MAA合成的甲基丙二酰基-CoA最大化。MCM由大肠杆菌中的基因scpA(Bobik和Rasche,Anal.Bioanal.Chem.375:344-349(2003);Haller等人,Biochemistry39:4622-4629(2000))以及智人中的mutA(Padovani和Banerjee,Biochemistry45:9300-9306(2006))编码。在几种其他生物中，MCM包含α和β亚基以及由两种基因编码。编码两种亚基蛋白质的示例性候选基因是费氏丙酸杆菌属（freudenreichii）谢氏亚种mutA以及mutB(Korotkova和Lidstrom,J.Biol.Chem.279:13652-13658(2004))，扭脱甲基杆菌mcmA以及mcmB（Korotkova和Lidstrom，同上，2004）以及富养罗尔斯通氏菌sbm1和sbm2(Peplinski等人,Appl.Microbiol.Biotech.88:1145-59(2010))。基于与大肠杆菌spcA基因产物的高度同源性而确认的附加候选酶还如下所列。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
scpA NP_417392.1 16130818 大肠杆菌K12
mutA P22033.3 67469281 智人
mutA P11652.3 127549 费氏丙酸杆菌属谢氏亚种
mutB P11653.3 127550 费氏丙酸杆菌属谢氏亚种
mcmA Q84FZ1 75486201 扭脱甲基杆菌
mcmB Q6TMA2 75493131 扭脱甲基杆菌
Sbm1 YP_724799.1 113866310 富养罗尔斯通氏菌H16
Sbm2 YP_726418.1 113867929 富养罗尔斯通氏菌H16
sbm NP_838397.1 30064226 弗氏志贺氏菌
SARI_04585 ABX24358.1 160867735 肠沙门氏菌
YfreA_01000861 ZP_00830776.1 77975240 弗氏耶尔森氏菌
这些序列可以用来通过序列相似性搜索（例如BLASTp）在GenBank或其他数据库中确认同系蛋白质。所得的同系蛋白质以及其对应的基因序列提供附加外源性DNA序列，用于转换进入大肠杆菌或其他合适的宿主微生物以生成生产宿主。附加候选基因包括基于与大肠杆菌spcA基因产物的高度同源性而确认的如下基因。
进一步存在证据表明，邻接甲基丙二酰基-CoA变位酶催化基因的基因有助于最大活性。例如，已得到证实的是，来自扭脱甲基杆菌的meaB基因形成与甲基丙二酰基-CoA变位酶的复合体，刺激活体外变位酶活性，以及可能保护其免受不可逆的灭活作用(Korotkova和Lidstrom,J.Biol.Chem.279:13652-13658(2004))。扭脱甲基杆菌meaB基因产物与染色体上邻接scpA的大肠杆菌argK基因的产物高度类似（BLASTp：45%一致性，e值：4e-67）。GenBank目录中没有费氏丙酸杆菌属meaB同系物的序列。然而，疮疱丙酸杆菌KPA171202基因产物YP_055310.1具有与扭脱甲基杆菌meaB蛋白质51%的一致性以及其基因还邻接染色体上的甲基丙二酰基-CoA变位酶基因。类似的基因由富养罗尔斯通氏菌H16的H16_B1839编码。
基因 GenBank ID GI号 生物
argK AAC75955.1 1789285 大肠杆菌K12
PPA0597 YP_055310.1 50842083 疮疱丙酸杆菌
KPA171202 2QM8_B 158430328 扭脱甲基杆菌
H16_B1839 YP_841351.1 116695775 富养罗尔斯通氏菌H16
仅仅当提供有中间体钴啉醇酰胺或钴胺素时，大肠杆菌才可以合成腺苷基钴胺素，该反应必需的一种辅因子用于这种(Lawrence和Roth.J.Bacteriol.177:6371-6380(1995);Lawrence和Roth,Genetics142:11-24(1996))。替代性地，异源性基因表达后，从新合成钴胺素的能力已被赋予大肠杆菌(Raux等人,J.Bacteriol.178:753-767(1996))。
参见图3，步骤2涉及甲基丙二酰基-CoA表异构酶（EC5.1.99.1）。途径中的第二酶甲基丙二酰基-CoA表异构酶（MMCE）将(R)-甲基丙二酰基-CoA以及(S)-甲基丙二酰基-CoA相互转化。MMCE是使奇数脂肪酸以及氨基酸缬氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸断裂的基本酶。甲基丙二酰基-CoA表异构酶活性不被认为是在大肠杆菌基因组中进行(Boynton等人,J.Bacteriol.178:3015-3024(1996))，但是存在于其他生物中，如智人（YqjC）(Fuller和Leadlay,.Biochem.J.213:643-650(1983))、褐鼠（Mcee）(Bobik和Rasche,J.Biol.Chem.276:37194-37198(2001))、谢氏丙酸杆菌（AF454511）(Fuller和Leadlay,Biochem.J.213:643-650(1983);Haller等人,Biochemistry39:4622-4629(2000);McCarthy等人,.Structure9:637-646.2001))以及秀丽隐杆线虫（mmce）(Kuhnl等人,FEBS J.272:1465-1477(2005))。蜡样芽胞杆菌中的附加候选基因AE016877具有与其他表征酶的高度序列同源性到。依据用于甲基丙二酰基-CoA到3-羟基异丁酸酯的转化的一种或多种酶（图3步骤3-4）的立体特异性，这种酶步骤可以是必要或不必要的。这些基因/蛋白质如下所述。
基因 GenBank ID GI号 生物
YqjC NP_390273 255767522 枯草芽孢杆菌
MCEE Q96PE7.1 50401130 智人
Mcee_predicted NP_001099811.1 157821869 褐鼠
AF454511 AAL57846.1 18042135 费氏丙酸杆菌属谢氏亚种
mmce AAT92095.1 51011368 秀丽隐杆线虫
AE016877 AAP08811.1 29895524 蜡样芽孢杆菌ATCC14579
参见图3，步骤3涉及甲基丙二酰基-CoA还原酶（EC1.2.1.-）。如图3中所示，甲基丙二酰基-CoA到其对应的醇-3-羟基异丁酸酯的还原可以通过两个酶步骤进行。第一步骤-甲基丙二酰基-CoA到甲基丙二酸半醛的转化由依赖CoA的醛脱氢酶完成。由来自硫化叶菌（Sulfolobus tokodaii）的丙二酰基-CoA还原酶基因编码的酶(Alber等人,J.Bacteriol.188(24):8551–8559(2006))已经显示催化甲基丙二酰基-CoA到其对应的醛的转化（WO2007141208）。类似的酶存在于勤奋生金球菌中(Alber等人,J.Bacteriol.188(24):8551–8559(2006))。几种附加的CoA脱氢酶也能够将酰基-CoA还原为其对应的醛。甲基丙二酰基-CoA到其对应的醛-甲基丙二酸半醛的还原通过依赖CoA的醛脱氢酶催化。示例性酶包括脂肪酰基-CoA还原酶、琥珀酰-CoA还原酶（EC1.2.1.76）、乙酰基-CoA还原酶和丁酰基-CoA还原酶。示例性脂肪酰基-CoA还原酶由乙酸钙不动杆菌的acr1(Reiser和Somerville.J.Bacteriol.179:2969-2975(1997))以及不动细菌属M-1脂肪酰基-CoA还原酶(Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002))编码。也已知的是由克鲁佛氏梭菌的sucD基因(Sohling and Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996);Sohling and Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996))以及牙龈红棕色单胞菌的sucD(Takahashi,J.Bacteriol182:4704-4710(2000))编码的依赖CoA以及依赖NADP的琥珀酸半醛脱氢酶（也称为琥珀酰-CoA还原酶）。附加的琥珀酰-CoA还原酶参与包括勤奋生金球菌(Berg等人,Science318:1782-1786(2007))以及嗜中性热变形菌(Ramos-Vera等人,J Bacteriol,191:4286-4297(2009))的嗜热古生菌的3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环。由Msed_0709编码的勤奋生金球菌酶严格地将是依赖NADPH的以及还具有丙二酰基-CoA还原酶活性。嗜中性热变形菌酶对NADPH和NADH均有活性。由bphG编码的假单胞菌属中将乙醛脱氢酶酰基化的酶也是良好的候选酶，因为它已被证实可将乙醛、丙醛、丁醛、甲醛以及支链化合物异丁醛氧化并酰基化(Powlowski等人,J.Bacteriol.175:377-385(1993))。除了将乙酰基-CoA还原为乙醇，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰基-CoA(Kazahaya,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972);以及Koo等人,BiotechnolLett.27:505-510(2005))。丁醛脱氢酶催化生溶剂性生物（solventogenicorganism），如糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人,Biosci Biotechnol Biochem.,71:58-68(2007))中的类似反应，丁酰基-CoA到丁醛的转化。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
acr1 YP_047869.1 50086359 乙酸钙不动杆菌
acr1 AAC45217 1684886 贝氏不动杆菌
acr1 BAB85476.1 18857901 不动杆菌属种菌株M-1
MSED_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋生金球菌
Tneu_0421 嗜中性热变形菌
sucD P38947.1 172046062 克鲁佛氏梭菌
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈红棕色单胞菌
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
bld AAP42563.1 31075383 糖乙酸多丁醇梭菌
其他的将酰基-CoA转化为其相应的醛的酶型是将丙二酰基-CoA转化为丙二酸半醛的丙二酰基-CoA还原酶。丙二酰基-CoA还原酶是在嗜热酸古生细菌中通过3-羟基丙酸循环的自养碳固定中的关键酶(Berg,Science318:1782-1786(2007);以及Thauer,Science318:1732-1733(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子并已经表征在生金球菌属和硫化叶菌菌种中(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006);以及Hugler,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。该酶由勤奋生金球菌中的Msed_0709编码(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006);以及Berg,Science318:1782-1786(2007))。来自硫化叶菌tokodaii的编码丙二酰基-CoA还原酶的基因被克隆并异源表达在大肠杆菌中(Alber等人,J.Bacteriol188:8551-8559(2006))。该酶也已显示催化甲基丙二酰基-CoA到其相应的醛的转化（WO2007141208(2007)）。虽然这些酶的醛脱氢酶功能性与来自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢酶相似，但是几乎没有序列相似性。两种丙二酰基-CoA还原酶具有相对于天冬氨酸半醛脱氢酶（一种催化天冬氨酰基-4-磷酸到天冬氨酸半醛的还原和同时发生的脱磷酸作用）的高度序列相似性。其他的候选基因可以通过蛋白质序列同源性发现于其他的生物中，包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌，以及已被列入下文。CoA-酰基化醛脱氢酶的仍然另一候选酶是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。已有报告称，这种酶将乙酰基-CoA和丁酰-CoA还原为它们相应的醛。这种基因非常类似于编码鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。
基因 GenBank ID GI号 生物
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋生金球菌
mcr NP_378167.1 15922498 硫化叶菌
asd-2 NP_343563.1 15898958 硫磺矿硫化叶菌
Saci_2370 YP_256941.1 70608071 嗜酸热硫化叶菌
Ald AAT66436 49473535 拜氏梭菌
eutE AAA80209 687645 鼠伤寒沙门氏菌
eutE P77445 2498347 大肠杆菌
具有酰基-CoA还原酶以及醇脱氢酶活性的双功能酶可以直接将甲基丙二酰基-CoA转化为3-羟基异丁酸酯。将酰基-CoA转化为醇的示例性双功能氧化还原酶包括那些转换底物的酶：如将乙酰基-CoA转换为乙醇的酶，例如来自大肠杆菌的adhE(Kessler等人,FEBS.Lett.281:59-63(1991))；以及将丁酰基-CoA转换为丁醇的酶，例如，来自丙酮丁醇梭菌的adhE2(Fontaine等人,J.Bacteriol.184:821-830(2002))。由bdh I以及bdh II编码的丙酮丁醇梭菌酶(Walter,等人,J.Bacteriol.174:7149-7158(1992))将乙酰基-CoA以及丁酰基-CoA分别还原为乙醇以及丁醇。除了将乙酰基-CoA还原为乙醇，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰基-CoA(Kazahaya,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972);以及Koo等人,Biotechnol Lett.27:505-510(2005))。另一示例性的酶可以将丙二酰基-CoA转化为3-HP。具有这种活性的依赖NADPH的酶已经表征在橙色绿屈挠菌中，其中它参与3-羟基丙酸循环(Hugler等人,J Bacteriol,184:2404-2410(2002);Strauss等人,Eur J Biochem,215:633-643(1993))。这种酶（具有300kDa的量）具有高底物特异性并显示与其他已知的氧化还原酶几乎没有序列相似性(Hugler等人，同上)。在其他生物中没有显示为催化这一特异性反应的酶；然而存在其他生物可以具有相似途径的生物信息证据(Klatt等人,Env Microbiol,9:2067-2078(2007))。可以通过序列相似性推断在其他生物（包括Roseiflexus castenholzii、赤细菌属种NAP1和海洋γ-蛋白质菌HTCC2080）中的候选酶。
参见图3，步骤4涉及3-羟基异丁酸酯脱氢酶（EC1.1.1.31）。3-羟基异丁酸酯脱氢酶催化3-羟基异丁酸酯到甲基丙二酸半醛的可逆氧化反应。甲基丙二酸半醛到3-羟基异丁酸酯的还原反应通过甲基丙二酸半醛还原酶或3-羟基异丁酸酯脱氢酶催化。这种酶参与缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸降解反应以及已在细菌、真核生物以及哺乳动物中得到确认。由来自嗜热栖热菌HB8的P84067编码的酶已进行结构征(Lokanath等人,J.Mol.Biol.352:905-917(2005))。利用同位素标记的底物证实了人3-羟基异丁酸酯脱氢酶的可逆性(Manning和Pollitt,Biochem.J.231:481-484(1985))。编码这种酶的附加基因包括智人(Hawes等人,Methods Enzymol.324:218-228(2000))和穴兔(Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.60:2043-2047(1996);Hawes等人,Methods Enzymol.324:218-228(2000))中的3hidh，绿脓假单胞菌中的mmsb，以及恶臭假单胞菌(Aberhart和Hsu..J Chem.Soc.[Perkin1]6:1404-1406(1979);Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.67:438-441(2003);Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.60:2043-2047(1996))中的dhat。几种3-羟基异丁酸酯脱氢酶已按还原方向进行表征，包括来自绿脓假单胞菌的mmsB（Gokarn等人，美国专利7,393,676（2008））以及来自恶臭假单胞菌的mmsB。
蛋白质 GENBANK ID GI号 生物
P84067 P84067 75345323 嗜热栖热菌
3hidh P31937.2 12643395 智人
3hidh P32185.1 416872 穴兔
mmsB NP_746775.1 26991350 恶臭假单胞菌
mmsB P28811.1 127211 绿脓假单胞菌
dhat Q59477.1 2842618 恶臭假单胞菌
参见图3，作为一种选择，步骤3和4可以涉及复合的醇/醛脱氢酶（EC1.2.1.-）。在一个步骤中，通过具有双重酰基-CoA还原酶和醇脱氢酶活性的多功能酶可以将甲基丙二酰基-CoA还原为3-羟基异丁酸酯。虽然尚未有关于甲基丙二酰基-CoA到3-羟基异丁酸酯的直接转化的报道，这种反应类似于通过具有醇和醛脱氢酶活性的依赖CoA的酶催化的常见转化，如乙酰基-CoA到乙醇以及丁酰基-CoA到丁醇的转化。候选基因包括可以将乙酰基-CoA以及丁酰基-CoA分别还原为乙醇以及丁醇的大肠杆菌adhE(Kessler等人,FEBS Lett.281:59-63(1991))以及丙酮丁醇梭菌bdh I和bdh II(Walter,等人,J.Bacteriol.174:7149-7158(1992))。除了将乙酰基-CoA还原为乙醇，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰基-CoA(Kazahaya,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972);Koo等人,Biotechnol Lett.27:505-510(2005))。用于将甲基丙二酰基-CoA直接转化为3-羟基异丁酸酯的附加候选酶由来自橙色绿屈挠菌的丙二酰基-CoA还原酶编码(Hügler,等人,J.Bacteriol.184(9):2404-2410(2002)。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
mcr YP_001636209.1 163848165 橙色绿屈挠菌
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
bdh I NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
bdh II NP_349891.1 15896542 丙酮丁醇梭菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
参见图3，步骤5涉及3-羟基异丁酸酯脱水酶（EC4.2.1.-）。最后的步骤涉及3-羟基异丁酸酯脱水为甲基丙烯酸。3-羟基异丁酸酯脱水为甲基丙烯酸通过具有3-羟基异丁酸酯脱水酶活性的酶催化。虽然尚未确认关于这种特异性酶催转换的直接证据，大多数脱水酶催化水的α,β-消除，这涉及通过吸电子的羰基、羧酸或CoA-硫羟酸酯基团对α-氢的活化以及β-位置除去羟基基团(Buckel和Barker,J Bacteriol.117:1248-1260(1974);Martins等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:15645-15649(2004))。这是针对甲基丙烯酸酯途径中最后步骤提出的确切类型的转换。另外，该提出的转换与可以催化2-羟基甲基戊二酸到2-亚甲基戊二酸的转化的巴克氏真杆菌的2-(羟基甲基)戊二酸脱水酶高度类似。这种酶已在烟酸分解代谢的背景下被研究以及由hmd编码(Alhapel等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:12341-12346(2006))。具有用高度序列同源性的类似酶发现于多毛拟杆菌、Anaerotruncuscolihominis以及Natranaerobius thermophilius中。几种酶已知催化羟基基团的α，β消除。示例性酶包括2-(羟基甲基)戊二酸脱水酶（EC4.2.1.-）、富马酸酶（EC4.2.1.2）、2-酮-4-戊烯酸酯脱水酶（EC4.2.1.80）、柠苹酸水解酶以及二甲基马来酸水合酶。
2-(羟基甲基)戊二酸脱水酶是将2-(羟基甲基)戊二酸脱水为2-亚甲基-戊二酸的包含[4Fe-4S]的酶，其在巴克氏真杆菌（旧称为巴克氏梭菌）中的作用已得到研究(Alhapel等人,Proc Natl Acad Sci USA103:12341-12346(2006))。具有高度序列同源性的类似酶发现于多毛拟杆菌、Anaerotruncuscolihominis以及Natranaerobius thermophilius中。这些酶与包含[4Fe-4S]的细菌丝氨酸脱水酶（例如，由tdcG、sdhB以及sdaA编码的大肠杆菌酶）的α亚基和β亚基也是同源的。巴克氏真杆菌中具有类似功能的酶是二甲基马来酸水合酶，乌头酸酶家族中将马来酸二甲酯水合以形成(2R,3S)-2,3-二甲基苹果酸的一种可逆的依赖Fe2+的以及对氧灵敏的酶。这种酶由dmdAB编码(Alhapel等人,Proc Natl Acad Sci USA103:12341-6(2006);Kollmann-Koch等人,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847-857(1984))。
富马酸水合酶自然地催化富马酸到苹果酸的可逆水合作用。虽然尚未有关于富马酸水合酶作用于具有作为底物的3-氧代丁醇的支链底物的能力的描述，但是可得到关于这种酶的大量结构信息以及其他研究人员已经成功地设计该酶以改变活性、抑制以及定位(Weaver,Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.61:1395-1401(2005))。大肠杆菌具有三种通过培育条件进行调节的富马酸酶：FumA、FumB以及FumC。FumB对氧灵敏以及仅仅在厌氧条件下有活性。FumA在微厌氧条件下有活性，以及FumC是仅仅在有氧培育中有活性的酶(Tseng等人,J.Bacteriol.183:461-467(2001);Woods等人,Biochm.Biophys.Acta954:14-26(1988);Guest等人,J Gen Microbiol131:2971-2984(1985))。示例性候选酶包括那些由来自大肠杆菌的fumC编码的酶(Estevez等人,Protein Sci.11:1552-1557(2002);Hong和Lee,Biotechnol.Bioprocess Eng.9:252-255(2004);Rose和Weaver,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:3393-3397(2004))，以及发现于空肠弯曲杆菌(Smith等人,Int.J.Biochem.Cell Biol.31:961-975(1999))、嗜热栖热菌(Mizobata等人,Arch.Biochem.Biophys.355:49-55(1998))以及褐鼠(Kobayashi等人,J.Biochem.89:1923-1931(1981))中的酶。具有高度序列同源性的类似酶包括来自拟南芥的fum1以及来自谷氨酸棒杆菌的fumC。来自Pelotomaculumthermopropionicum的MmcBC富马酸酶是具有两种亚基的另一类的富马酸酶(Shimoyama等人,FEMS Microbiol Lett.270:207-213(2007))。
4-羟基-2-氧代戊酸到2-氧代戊烯酸酯的脱水通过4-羟基-2-氧代戊酸水合酶（EC4.2.1.80）催化。这种酶参与芳香族降解途径以及通常用编码具有4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶活性的酶的基因共转录。示例性基因产物由大肠杆菌的mhpD(Ferrandez等人,J Bacteriol.179:2573-2581(1997);Pollard等人,Eur J Biochem.251:98-106(1998))、恶臭假单胞菌的todG和cmtF(Lau等人,Gene146:7-13(1994);Eaton,J Bacteriol.178:1351-1362(1996))、丛毛单胞菌属CNB-1的cnbE(Ma等人,Appl Environ Microbiol73:4477-4483(2007))以及伯克霍尔德氏菌xenovorans的mhpD(Wang等人,FEBS J272:966-974(2005))编码。紧密相关的酶2-氧代七-4-烯-1,7-二酸酯水合酶参与4-羟基苯基醋酸降解，其中它利用镁作为辅因子将2-氧代-七-4-烯-1,7-二酸酯（OHED）转化为2-氧代-4-羟基-七-1,7-二酸酯(Burks等人,J.Am.Chem.Soc.120:(1998))。候选OHED水合酶已被确认以及表征于大肠杆菌C(Roper等人,Gene156:47-51(1995);Izumi等人,J Mol.Biol.370:899-911(2007))以及大肠杆菌W(Prieto等人,J Bacteriol.178:111-120(1996))。序列比较揭示了各种细菌、植物和动物中的同系物。除此之外，具有高度类似序列的酶包含在肺炎克雷伯氏菌（91%一致性，e值=2e-138）以及肠沙门氏菌（91%一致性，e值=4e-138）中。
基因 GenBank登录号 GI号 生物
mhpD AAC73453.2 87081722 大肠杆菌
cmtF AAB62293.1 1263188 恶臭假单胞菌
todG AAA61942.1 485738 恶臭假单胞菌
cnbE YP_001967714.1 190572008 丛毛单胞菌属CNB-1
mhpD Q13VU0 123358582 伯克霍尔德氏菌xenovorans
hpcG CAA57202.1 556840 大肠杆菌C
hpaH CAA86044.1 757830 大肠杆菌W
hpaH ABR80130.1 150958100 肺炎克雷伯氏菌
Sari_01896 ABX21779.1 160865156 肠沙门氏菌
另一候选酶是柠苹酸水解酶（EC4.2.1.34），一种将2-甲基苹果酸自然地脱水为中康酸的酶。已在丙酮酸到2-氧代丁酸酯的途径的背景下对詹氏甲烷球菌中的这种酶进行了研究，其中它已经显示具有广泛的底物特异性(Drevland等人,J Bacteriol.189:4391-4400(2007))。在假破伤风梭菌、摩氏摩根氏菌、非丙二酸柠檬酸杆菌中也检测到这种酶活性，其中认为它参与谷氨酸降解(Kato等人,Arch.Microbiol168:457-463(1997))。詹氏甲烷球菌蛋白质序列不具有与这些生物中的基因显著的同源性。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
leuD Q58673.1 3122345 詹氏甲烷球菌
二甲基马来酸水合酶（EC4.2.1.85）是乌头酸酶家族中将马来酸二甲酯水合以形成(2R,3S)-2,3-二甲基苹果酸的一种可逆的依赖Fe2+的以及对氧灵敏的酶。这种酶由巴克氏真杆菌中的dmdAB编码(Alhapel等人,同上;Kollmann-Koch等人,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847-857(1984))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
dmdA ABC88408 86278276 巴克氏真杆菌
dmdB ABC88409.1 86278277 巴克氏真杆菌
本实施例描述了用于从琥珀酰-CoA生产MMA的生物合成途径。
实施例VI
用于经由3-氨基-2-丙酸甲酯从琥珀酰-CoA转化为MAA的途径
本实施例描述了经由3-氨基-丙酸甲酯从琥珀酰-CoA到MAA的示例性MAA合成途径。
另一MAA生物合成的示例性途径从琥珀酰-CoA到3-氨基-2-丙酸甲酯进行（见图4）。这种途径的前三个步骤（涉及琥珀酰-CoA到甲基丙二酸半醛的转化）与实施例V所述的琥珀酰-CoA到MAA的途径相同（见图3）。该途径在步骤4岔开，其中甲基丙二酸半醛通过转氨酶转化为3-氨基-2-甲基丙酸。最后的途径步骤伴有3-氨基-2-甲基丙酸到甲基丙烯酸的脱氨基作用。
用于催化前三个途径步骤的候选酶和基因如实施例V中所述。用于步骤4和5的候选基因在下文中讨论。
参见图4，步骤4涉及3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶（EC2.6.1.22）。3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶催化从甲基丙二酸半醛到3-氨基-2-甲基丙酸的转换。表征于褐鼠和野猪以及由Abat编码的酶已经显示按相关方向催化该途径中的这种转换(Kakimoto等人,Biochim.Biophys.Acta156:374-380(1968);Tamaki等人,Methods Enzymol.324:376-389(2000))。在具有与3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶高度序列同源性的其他生物中的候选酶包括秀丽隐杆线虫中的Gta-1以及枯草芽孢杆菌中的gabT。另外地，由基因gabT编码的大肠杆菌中的原生GABA氨基转移酶的一种已经显示具有广泛的底物特异性以及可以利用3-氨基-2-甲基丙酸作为底物(Liu等人,Biochemistry43:10896-10905(2004);Schulz等人,Appl.Environ.Microbiol.56:1-6(1990))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
Abat P50554.3 122065191 褐鼠
Abat P80147.2 120968 野猪
Gta-1 Q21217.1 6016091 秀丽隐杆线虫
gabT P94427.1 6016090 枯草芽孢杆菌
gabT P22256.1 16130576 大肠杆菌K12
参见图4，步骤5涉及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶（EC4.3.1.-）。在这种途径的最后步骤中，3-氨基-2-甲基丙酸经脱氨基成为甲基丙烯酸。催化这种确切转换的酶尚未得到实验证实；然而原生大肠杆菌酶-天冬氨酸氨裂解酶（EC4.3.1.1）也许能够催化这种反应。由大肠杆菌中的aspA编码的天冬氨酸氨裂解酶将天冬氨酸脱氨基以形成富马酸但是也可以与替换性底物天冬氨酸苯基甲基酯、天冬酰胺、苯甲基-天冬氨酸以及苹果酸反应(Ma等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.672:60-65(1992))。在另一项研究中，已经对这种酶采用定向进化以改变底物特异性(Asano等人,Biomol.Eng.22:95-101(2005))。其他生物中编码天冬氨酸酶的基因包括枯草芽孢杆菌中的ansB(Sjostrom等人,Biochim.Biophys.Acta1324:182-190(1997))以及荧光假单胞菌(Takagi等人,J.Biochem.96:545-552(1984);Takagi等人,J.Biochem.100:697-705(1986))和粘质沙雷氏菌(Takagi等人,J.Bacteriol.161:1-6(1985))中的aspA。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
aspA P0AC38.1 90111690 大肠杆菌K12
ansB P26899.1 251757243 枯草芽孢杆菌
aspA P07346.1 114273 荧光假单胞菌
aspA P33109.1 416661 粘质沙雷氏菌
本实施例描述了从琥珀酰-CoA到MAA的生物合成途径。
实施例VII
用于4-羟基丁酰基-CoA到3-羟基异丁酸或MAA的转化的途径
本实施例描述了从4-羟基丁酰基-CoA到3-羟基异丁酸或MAA的示例性合成途径。
附加的示例性途径伴有4HB-CoA到MAA的转化（见图5）。在第一步骤中，4HB-CoA通过甲基变位酶转化为3-羟基异丁酰基-CoA（3-Hib-CoA）。然后，3-Hib-CoA可以通过CoA水解酶、合酶或转移酶转化为3-羟基异丁酸酯。3-羟基异丁酸酯可以在甲基丙烯酸生产中作为产物或作为最后步骤被分泌以及回收。3-羟基丁酸可以经脱水以形成甲基丙烯酸。替代性地，3-Hib-CoA可以经脱水成为异丁烯酰基-CoA，其然后通过水解酶、合酶或转移酶转化为MAA。关于将三羧酸循环中间体α-酮戊二酸、琥珀酸或琥珀酰-CoA转化成为4HB-CoA所需的酶的资料齐全(Burk等人,美国申请序列号12/049,256,提交于2008年3月14日;Lutke-Eversloh和Steinbuchel.FEMS Microbiol.Lett.181:63-71(1999);Sohling和Gottschalk,Eur.J.Biochem.212:121-127(1993);Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996);Valentin等人,Eur.J.Biochem.227:43-60(1995);Wolff和Kenealy,Protein Expr.Purif.6:206-212.(1995))。
参见图5，步骤1涉及4-羟基丁酰基-CoA变位酶（EC5.4.99.-）。4HB-CoA到3-羟基异丁酰基-CoA的转化还有待实验证实。然而，考虑到其对应底物的结构相似性，催化类似反应的两种甲基变位酶，即异丁酰基-CoA变位酶（ICM）和甲基丙二酰基-CoA变位酶（MCM）是良好的候选酶。甲基丙二酰基-CoA变位酶是将琥珀酰-CoA转化为甲基丙二酰基-CoA的依赖钴胺素的酶。讨论了琥珀酰-CoA到MAA途径中的这种酶和合适的候选基因（见实施例V）。
替代性地，异丁酰基-CoA（ICM，EC5.4.99.13）可以催化提议的转换。ICM是MCM家族中以可逆的方式将丁酰基-CoA的碳骨架重排为异丁酰基-CoA的依赖钴胺素的甲基变位酶(Ratnatilleke等人,J.Biol.Chem.274:31679-31685(1999))。关于甲基菌属petroleiphilum中新颖ICM的最近研究以及之前的工作提供的证据表明，改变临近活性位点的单个氨基酸改变酶的底物特异性(Ratnatilleke等人,J.Biol.Chem.274:31679-31685(1999);Rohwerder等人,Appl.Environ.Microbiol.72:4128-4135.(2006))。这表明，如果原生酶不能催化或表现出对于4HB-CoA到3HIB-CoA的转化的低活性，该酶可以经合理设计以增加这种活性。编码同型二聚酶的示例性ICM基因包括天蓝色链霉菌A3中的icmA(Alhapel等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:12341-12346(2006))以及甲基菌属petroleiphilum PM1中的Mpe_B0541(Ratnatilleke等人,J.Biol.Chem.274:31679-31685(1999);Rohwerder等人,Appl.Environ.Microbiol.72:4128-4135(2006))。编码异型二聚酶的基因包括肉桂地链霉菌中的icm以及icmB(Ratnatilleke等人,J.Biol.Chem.274:31679-31685(1999);Vrijbloed等人,J.Bacteriol.181:5600-5605.(1999);Zerbe-Burkhardt等人,J.Biol.Chem.273:6508-6517(1998))。由除虫链霉菌MA-4680中的icmA以及icmB基因编码的酶显示与已知的ICM的高度序列相似性。这些基因/蛋白质确认如下。
基因 GenBank ID GI号 生物
icmA CAB40912.1 4585853 天蓝色链霉菌A3(2）
Mpe_B0541 YP_001023546.1 124263076 甲基菌属petroleiphilum PM1
icm AAC08713.1 3002492 肉桂地链霉菌
icmB CAB59633.1 6137077 肉桂地链霉菌
icmA NP_824008.1 29829374 除虫链霉菌
icmB NP_824637.1 29830003 除虫链霉菌
参见图5，步骤2涉及3-羟基异丁酰基-CoA水解酶（EC3.1.2.4）、合成酶（EC6.2.1.-）或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶（EC2.8.3.-）。步骤5涉及异丁烯酰基-CoA水解酶、合成酶或转移酶。这些转换可以通过包括CoA水解酶（EC3.1.2.-）、CoA转移酶（EC2.8.3.-）以及CoA合成酶（EC6.1.2.-）的不同类别的酶执行。如前所述，如果采用CoA转移酶或CoA合成酶完成这种转换（表1），则途径能量学是最有利的。
在CoA-转移酶家族中，大肠杆菌酶酰基-CoA:醋酸-CoA转移酶（也称为醋酸-CoA转移酶（EC2.8.3.8））已经显示将CoA部分从各种支链和直链酰基-CoA底物（包括异丁酸(Matthies和Schink,Appl.Environ.Microbiol.58:1435-1439(1992))，戊酸(Vanderwinkel等人,.Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))和丁酸酯(Vanderwinkel等人.同上,1968)）转移到醋酸。这种酶由大肠杆菌属K12中的atoA（α亚基）和atoD（β亚基）(Korolev等人,Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.58:2116-2121(2002);Vanderwinkel等人,同上,1968))以及谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的actA和cg0592(Duncan等人,Appl.Environ.Microbiol.68:5186-5190(2002))编码以及代表催化如图5步骤2和5中所示，所需3-羟基异丁酰基-CoA转移酶或异丁烯酰基-CoA转移酶生物转换的理想的候选酶。通过序列同源性的候选基因包括大肠杆菌UT189中的atoD以及atoA。类似酶还存在于丙酮丁醇梭菌以及糖乙酸多丁醇梭菌中。
基因 GenBank ID GI号 生物
atoA P76459.1 2492994 大肠杆菌K12
atoD P76458.1 2492990 大肠杆菌K12
actA YP_226809.1 62391407 谷氨酸棒杆菌ATCC13032
cg0592 YP_224801.1 62389399 谷氨酸棒杆菌ATCC13032
atoA ABE07971.1 91073090 大肠杆菌UT189
atoD ABE07970.1 91073089 大肠杆菌UT189
ctfA NP_149326.1 15004866 丙酮丁醇梭菌
ctfB NP_149327.1 15004867 丙酮丁醇梭菌
ctfA AAP42564.1 31075384 糖乙酸多丁醇梭菌
ctfB AAP42565.1 31075385 糖乙酸多丁醇梭菌
附加示例性转移酶转换通过克鲁佛氏梭菌cat1、cat2和cat3的基因产物催化，所述产物已经分别显示具有琥珀酰-CoA、4-羟基丁酰基-CoA以及丁酰基-CoA乙酰基转移酶活性(Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178(3):871-880(1996);Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105(6):2128-2133(2008))。
基因 GenBank ID GI号 生物
cat1 P38946.1 729048 克鲁佛氏梭菌
cat2 P38942.2 172046066 克鲁佛氏梭菌
cat3 EDK35586.1 146349050 克鲁佛氏梭菌
来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的酶-戊烯二酸-CoA-转移酶（EC2.8.3.12）与二酸戊烯二酰基-CoA和3-丁烯酰基-CoA反应(Mack和Buckel,FEBS Lett.405:209-212(1997))。编码这种酶的基因是gctA以及gctB。这种酶对于其他CoA衍生物（包括戊二酰基-CoA、2-羟基戊二酰基-CoA、已二酰基-CoA以及丙烯酰基-CoA）具有减少的但可检测到的活性(Buckel等人,Eur.J.Biochem.118:315-321(1981))。该酶已被克隆以及表达于大肠杆菌(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。
基因 GenBank ID GI号 生物
gctA CAA57199.1 559392 发酵氨基酸球菌
gctB CAA57200.1 559393 发酵氨基酸球菌
附加候选酶包括将琥珀酸用作CoA受体的琥珀酰-CoA:3-酮酸CoA转移酶。示例性琥珀酰-CoA:3:酮酸-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌(Corthesy-Theulaz等人,J.Biol.Chem.272:25659-25667(1997))以及枯草芽孢杆菌(Stols等人,Protein Expr.Purif.53:396-403(2007))中。
基因 GenBank ID GI号 生物
HPAG1_0676 YP_627417 108563101 幽门螺杆菌
HPAG1_0677 YP_627418 108563102 幽门螺杆菌
ScoA NP_391778 16080950 枯草芽孢杆菌
ScoB NP_391777 16080949 枯草芽孢杆菌
候选ATP合酶是形成ADP的乙酰基-CoA合成酶（ACD，EC6.2.1.13），一种将酰基-CoA酯类到其对应酸的转化与同时的ATP合成结合的酶。虽然这种酶尚未显示与作为底物的3-羟基异丁酰基-CoA或异丁烯酰基-CoA反应，具有广泛的底物特异性的几种酶已在文献中被描述。由AF1211编码的来自闪烁古生球菌的ACD I显示对各种直链和支链底物（包括异丁酸、异戊酸以及富马酸）起作用(Musfeldt和Schonheit,.J.Bacteriol.184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的酶（释为琥珀酰-CoA合成酶）接受丙酸、丁酸以及支链酸（异戊酸和异丁酸）作为底物，以及显示按向前和逆向方向运行(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol.182:277-287(2004))。由来自超嗜热泉古菌耐超高温热棒菌的PAE3250编码的ACD显示所有被表征的ACD的最广泛的底物范围，与乙酰基-CoA、异丁酰基-CoA（优选的底物）以及苯基乙酰基-CoA反应(Brasen和Schonheit,同上,2004)。然而，定向进化或工程可以用于改性这种酶以于宿主生物的生理温度下运行。来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌以及耐超高温热棒菌的酶均已被克隆，功能表达以及表征于大肠杆菌(Brasen和Schonheit,同上,2004;Musfeldt和Schonheit,J.Bacteriol.184:636-644(2002))。
基因 GenBank ID GI号 生物
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌DSM4304
scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌ATCC43049
PAE3250 NP_560604.1 18313937 耐超高温热棒菌菌株IM2
在CoA水解酶家族中，酶3-羟基异丁酰基-CoA水解酶对3-HIBCoA具有特异性以及已被描述，有效地催化缬氨酸降解过程中所需的转换(Shimomura等人,J.Biol.Chem.269:14248-14253(1994))。编码这种酶的基因包括褐鼠(Shimomura等人,J.Biol.Chem.269:14248-14253(1994);Shimomura等人,Methods Enzymol.324:229-240(2000))以及智人（Shimomura等人，同上，2000）的hibch。通过序列同源性的候选基因包括酿酒酵母的hibch以及蜡样芽胞杆菌的BC_2292。
基因 GenBank ID GI号 生物
hibch Q5XIE6.2 146324906 褐鼠
hibch Q6NVY1.2 146324905 智人
hibch P28817.2 2506374 酿酒酵母
BC_2292 Q81DR3 29895975 蜡样芽胞杆菌
参见图5，步骤3涉及3-羟基异丁酸酯脱水酶（EC4.2.1.-）。这伴有通过3-羟基异丁酸酯脱水酶从3-羟基异丁酸酯到MAA的脱水。用于这种酶的候选基因被描述于琥珀酰-CoA到MAA的途径中（见实施例V）。还参见图5，步骤4涉及3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶（EC4.2.1.-）。3-羟基异丁酰基-CoA到异丁烯酰基-CoA的脱水可以通过可逆的3-羟基酰基-CoA脱水酶，如巴豆酸酶（也称为3-羟基丁酰基-CoA脱水酶，EC4.2.1.55）或烯酰基-CoA水合酶（也称为3-羟基酰基-CoA脱水酶，EC4.2.1.17）完成。这些酶一般地是可逆的(Moskowitz和Merrick,Biochemistry8:2748-2755(1969);Durre等人,FEMS Microbiol.Rev.17:251-262(1995))。编码巴豆酸酶的示例性基因可以发现于丙酮丁醇梭菌(Boynton,等人,J.Bacteriol.178(11):3015-3024(1996))、克鲁佛氏梭菌(Hillmer和Gottschalk,FEBS Lett.21(3):351-354(1972))以及勤奋生金球菌(Berg等人,Science318(5857)1782-1786(2007))中，虽然后者基因的序列未知。脂肪酸β-氧化和/或各种氨基酸的新陈代谢中所涉及的烯酰基-CoA水合酶也可以催化巴豆酰基-CoA的水合作用以形成3-羟基丁酰基-CoA(Agnihotri和Liu,Bioorg.Med.Chem.11(1):9-20(2003);Roberts等人,Arch.Microbiol.117(1):99-108(1978);Conrad等人,J.Bacteriol.118(1):103-111(1974))。恶臭假单胞菌的烯酰基-CoA水合酶phaA以及phaB被认为执行苯基醋酸分解代谢过程中双键的羟基化(Olivera等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6419-6424(1998))。来自荧光假单胞菌的paaA以及paaB催化类似的转换（Olivera等人，同上，1998）。最后，许多大肠杆菌基因已经显示具有烯酰基-CoA水合酶功能，包括maoC(Park和Lee,J.Bacteriol.185:5391-5397(2003))、paaF(Ismail等人,Eur.J.Biochem.270:3047-3054(2003);Park和Lee,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:335-346(2004);Park和Yup,Biotechnol.Bioeng.86:681-686.(2004))以及paaG(Ismail等人,Eur.J.Biochem.270:3047-3054(2003);Park和Lee,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:335-346(2004);Park和Yup,Biotechnol.Bioeng.86:681-686(2004))。
基因 GenBank ID GI号 生物
crt NP_349318.1 15895969 丙酮丁醇梭菌
crt1 YP_001393856 153953091 克鲁佛氏梭菌DSM555
paaA NP_745427.1 26990002 荧光假单胞菌
paaB NP_745426.1 26990001 荧光假单胞菌
phaA ABF82233.1 106636093 恶臭假单胞菌
phaB ABF82234.1 106636094 恶臭假单胞菌
maoC NP_415905.1 16129348 大肠杆菌
paaF NP_415911.1 16129354 大肠杆菌
paaG NP_415912.1 16129355 大肠杆菌
本实施例描述了用于从4-羟基丁酰基-CoA生产3-羟基异丁酸或甲基丙烯酸的生物合成途径。
实施例VIII
用于经由苏-3-甲基天冬氨酸将α-酮戊二酸转化为MAA的途径
本实施例描述了从α-酮戊二酸到苏-3-甲基天冬氨酸的示例性MAA合成途径。
用于MAA生物合成的另一示例性途径通过α-酮戊二酸（TCA循环中生产的大肠杆菌中的一种代谢物）进行（见图6）。
通过酶天冬氨酸氨基转移酶催化的该途径第一步骤将氨基从天冬氨酸转移到α-酮戊二酸，形成谷氨酸以及草酰乙酸。后续的两个步骤包括碳骨架的重排以及后续的脱氨基以形成中康酸。催化这些转化的酶发现于谷氨酸土壤梭菌属以及其他能够发酵氨基酸的生物中产出能量的发酵中(Buckel和Barker,J.Bacteriol.117:1248-1260(1974))。这些生物中途径的方向性与生物途径中MAA合成所需的方向一致。最后的途径步骤伴有中康酸的脱羧以产出甲基丙烯酸。
参见图6，步骤1涉及天冬氨酸氨基转移酶（EC2.6.1.1）。该途径的第一步骤将氨基从天冬氨酸转移到α-酮戊二酸，形成谷氨酸以及草酰乙酸。来自大肠杆菌的基因aspC(Yagi等人,FEBS Lett.100:81-84(1979);Yagi等人,Methods Enzymol.113:83-89(1985))，来自酿酒酵母的AAT2(Yagi等人,J.Biochem.92:35-43(1982))以及来自拟南芥的ASP5(de la Torre等人,Plant J.46:414-425(2006);Kwok和Hanson,J.Exp.Bot.55:595-604(2004);Wilkie和Warren,Protein Expr.Purif.12:381-389(1998))编码催化这种转化的酶-天冬氨酸氨基转移酶。
基因 GenBank ID GI号 生物
基因 GenBank ID GI号 生物
aspC NP_415448.1 16128895 大肠杆菌
AAT2 P23542.3 1703040 酿酒酵母
ASP5 P46248.2 20532373 拟南芥
参见图6，步骤2涉及谷氨酸变位酶（EC5.4.99.1）。在步骤2中，谷氨酸的碳直链被重排为苏-3-甲基天冬氨酸的支链结构。这种转换通过谷氨酸变位酶（一种由两种亚基组成的依赖钴胺素的酶）催化。来自匙形梭菌以及假破伤风梭菌的两种谷氨酸变位酶已被克隆以及功能表达于大肠杆菌(Holloway和Marsh,J.Biol.Chem.269:20425-20430(1994);Reitzer等人,Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.54:1039-1042(1998))。编码这种由两种亚基组成的亚基蛋白质的基因是来自匙形梭菌的glmE和glmS、来自假破伤风梭菌的mamA和glmE以及来自破伤风梭菌的mutE和mutS(Switzer,Glutamate mutase,pp.289-305Wiley,New York(1982))。
基因 GenBank ID GI号 生物
glmE P80077.2 2507035 匙形梭菌
glmS P80078.2 17865765 匙形梭菌
mamA Q05488.1 729588 假破伤风梭菌
glmE Q05509.1 729586 假破伤风梭菌
mutE NP_783086.1 28212142 破伤风梭菌E88
mutS NP_783088.1 28212144 破伤风梭菌E88
参见图6，步骤3涉及3-甲基天冬氨酸酶（EC4.3.1.2）。3-甲基天冬氨酸酶（也称为β-甲基天冬氨酸酶或3-甲基天冬氨酸氨-裂解酶）催化苏-3-甲基天冬氨酸到中康酸的脱氨基作用。来自假破伤风梭菌的3-甲基天冬氨酸酶已被克隆、功能表达于大肠杆菌，以及结晶(Asuncion等人,ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.57:731-733(2001);Asuncion等人,J.Biol.Chem.277:8306-8311(2002);Botting等人,Biochemistry27:2953-2955(1988);Goda等人,Biochemistry31:10747-10756(1992))。在非丙二酸柠檬酸杆菌中，这种酶由BAA28709编码(Kato和Asano,Arch.Microbiol.168:457-463(1997))。也已经从大肠杆菌YG1002中结晶得到3-甲基天冬氨酸酶(Asano和Kato,FEMS Microbiol.Lett.118:255-258(1994))，虽然蛋白质序列未列入公共数据库（如GenBank）。序列同源性可用以确认附加候选基因，包括破伤风梭菌中的CTC02563以及大肠杆菌O157:H7中的ECs0761。
基因 GenBank ID GI号 生物
MAL AAB24070.1 259429 假破伤风梭菌
BAA28709 BAA28709.1 3184397 非丙二酸柠檬酸杆菌
CTC_02563 NP_783085.1 28212141 破伤风梭菌
基因 GenBank ID GI号 生物
ECs0761 BAB34184.1 13360220 大肠杆菌O157:H7菌株Sakai
参见图6，步骤4涉及中康酸脱羧酶（EC4.1.1.-）。该途径的最后步骤伴有中康酸到甲基丙烯酸的脱羧。催化这种确切反应的酶还未得到实验证实。然而，存在催化高度类似反应的几种酶。具有紧密相关的功能的一种酶是乌头酸脱羧酶。这种酶催化假丝酵母菌株以及丝状真菌土曲霉中衣康酸生物合成的最后步骤(Bonnarme等人,J.Bacteriol.177:3573-3578(1995);Willke和Vorlop,Appl.Microbiol.Biotechnol.56:289-295(2001))。虽然衣康酸是有关生物技术的化合物，但是迄今尚未有确认或克隆乌头酸脱羧酶基因的努力。
具有类似功能的第二种酶是4-草酰巴豆酸脱羧酶。这种酶常见于各种生物中以及编码来自假单胞菌属（菌株600）的酶的基因已被克隆以及表达于大肠杆菌(Shingler等人,J.Bacteriol.174:711-724(1992))。中康酸中的甲基基团可以导致空间位阻，但是用定向进化或蛋白质工程可能可以克服这种问题。4-草酰巴豆酸脱羧酶由两种亚基组成。编码这种酶的基因包括假单胞菌属（菌株600）中的dmpH和dmpE(Shingler等人,J.Bacteriol.174:711-724(1992))、来自恶臭假单胞菌的xylII和xylIII(Kato和Asano,Arch.Microbiol.168:457-463(1997);Stanley等人,Biochemistry39:718-726(2000))以及来自富养罗尔斯通氏菌JMP134的Reut_B5691和Reut_B5692(Hughes等人,J.Bacteriol.158:79-83(1984))。
基因 GenBank ID GI号 生物
dmpH CAA43228.1 45685 假单胞菌属CF600
dmpE CAA43225.1 45682 假单胞菌属CF600
xylII YP_709328.1 111116444 恶臭假单胞菌
xylIII YP_709353.1 111116469 恶臭假单胞菌
Reut_B5691 YP_299880.1 73539513 富养罗尔斯通氏菌JMP134
Reut_B5692 YP_299881.1 73539514 富养罗尔斯通氏菌JMP134
本实施例描述了用于从α-酮戊二酸生产MMA的生物合成途径。
实施例IX
用于经由2-羟基戊二酸从α-酮戊二酸到MAA的转化的途径
本实施例描述了经由2-羟基戊二酸从α-酮戊二酸到MAA的示例性MAA合成途径。
用于MAA生物合成的另一示例性途径具有类似于实施例VIII中所述的途径的方案，但是它通过羟基化的中间体2-羟基戊二酸以及3-甲基苹果酸（见图7），而非胺-取代的中间体（见图6）。
参见图7，步骤1涉及α-酮戊二酸还原酶（EC1.1.99.2）。这种途径的第一步骤伴有通过原生酶α-酮戊二酸还原酶的从α-酮戊二酸到2-羟基戊二酸的还原作用。这种酶由serA编码，一种还催化中央新陈代谢中3-磷酸甘油酸的还原的多功能酶(Zhao和Winkler,J.Bacteriol.178:232-239(1996))。智人中的基因L2HGDH(Jansen和Wanders,Biochim.Biophys.Acta1225:53-56(1993))、具核梭杆菌中的FN0487L2hgdh(Hayashi等人,J.NihonUniv.Sch.Dent.28:12-21(1986))以及褐鼠中的L2hgdh_预测(Jansen和Wanders,Biochim.Biophys.Acta1225:53-56(1993))编码这种酶。具有高度序列同源性的候选基因包括小家鼠中的L2hgdh和牛中的L2HGDH。高浓度下，2-羟基戊二酸已经显示通过竞争性抑制反馈α-酮戊二酸还原酶活性(Zhao和Winkler,J.Bacteriol.178:232-239.(1996))。
基因 GenBank ID GI号 生物
serA CAA01762.1 1247677 大肠杆菌
L2HGDH Q9H9P8.3 317373422 智人
L2hgdh NP_663418.1 21703884 小家鼠
L2hgdh_预测 NP_001101498.1 157820173 褐鼠
L2HGDH NP_001094560.1 155371911 牛
FN0487 Q8RG31 81763568 具核梭杆菌亚种具核菌
参见图7，步骤2涉及2-羟基谷氨酸变位酶（EC5.4.99.-）。在该途径的第二步骤中，碳骨架经受通过谷氨酸变位酶的重排。由这样一种酶催化的最常见的反应是图6步骤2中所示的谷氨酸到苏-3-甲基天冬氨酸的转化。来自匙形梭菌的依赖腺苷基钴胺素的谷氨酸变位酶也已经显示与作为替换性底物的2-羟基戊二酸反应(Roymoulik等人,Biochemistry39:10340-10346(2000))，虽然相比于与原生底物谷氨酸的速率，这种与2-羟基戊二酸的反应速率低两个数量级。该酶的定向进化可以用以增加谷氨酸变位酶对2-羟基戊二酸的亲合力。编码谷氨酸变位酶的蛋白质序列的GenBank登录号发现于该途径步骤2的实施例VIII中。
参见图7，步骤3涉及3-甲基苹果酸脱水酶（EC4.2.1.-）。在第三步骤中，3-甲基苹果酸经脱水形成中康酸。虽然尚未有文献描述催化这种确切转换的酶，几种酶能够催化类似反应。一种这类酶是将2-甲基苹果酸转化为中康酸的2-甲基苹果酸脱水酶，也称为柠苹酸水解酶。2-甲基苹果酸以及3-甲基苹果酸紧密相关，唯一的区别在于结构-羟基基团的位置。在谷氨酸降解VI途径的背景下，2-甲基苹果酸脱水酶活性在假破伤风梭菌、摩氏摩根氏菌、非丙二酸柠檬酸杆菌中被检测到(Kato和Asano,Arch.Microbiol.168:457-463(1997))；然而至今没有编码这种酶的基因的序列。
第二种候选酶是催化苹果酸到富马酸的脱水的富马酸水合酶。如实施例V（步骤5）中所述，可得到关于这种酶的大量结构信息以及其他研究已经成功地设计该酶以改变活性、抑制以及定位(Weaver,Acta Crystallogr.DBiol.Crystallogr.61:1395-1401(2005))。实施例V的途径步骤5中对候选基因做了讨论。
参见图7，步骤4涉及中康酸脱羧酶（EC4.1.1.-）。最后的途径步骤涉及中康酸到甲基丙烯酸的脱羧。这种反应与实施例VIII中所述的途径的最后步骤相同。
本实施例描述了用于从α-酮戊二酸生产MMA的生物合成途径。
实施例X
用于乙酰基-CoA到2-羟基异丁酸或MAA的转化的途径
本实施例描述了从乙酰基-CoA到2-羟基异丁酸或MAA示例性的合成途径。
MAA生物合成可以以最少的五个酶步骤始于乙酰基-CoA（见图8）。在这种途径中，乙酰基-CoA的两个分子结合以形成乙酰乙酰基-coA，其然后还原为3-羟基丁酰基-CoA。替代性地，4-羟基丁酰基-CoA可以通过4-羟基丁酰基-CoA脱水酶以及巴豆酸酶转化为3-羟基丁酰基-CoA(Martins等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(44)15645-15649(2004);Jones和Woods,Microbiol.Rev.50:484-524(1986);Berg等人,Science318(5857)1782-1786(2007))。甲基变位酶然后将3-羟基丁酰基-CoA的碳骨架重排为2-羟基异丁酰基-CoA，2-羟基异丁酰基-CoA然后脱水以形成异丁烯酰基-CoA。替代性地，2-羟基异丁酰基-CoA可以转化为2-羟基异丁酸酯，作为产物分泌以及回收。将异丁烯酰基-CoA转化为MAA的最后步骤可以通过单个酶（如图8中所示）或一系列酶执行。
参见图8，步骤1涉及乙酰乙酰基-CoA硫解酶（EC2.3.1.9）。从两种乙酰基-CoA亚基形成乙酰乙酰基-CoA由乙酰基-CoA硫解酶催化。这种酶对大肠杆菌来说是原生的，由基因atoB编码，以及通常在脂肪酸氧化过程中按乙酰醋酸降解方向运行(Duncombe和Frerman,Arch.Biochem.Biophys.176:159-170(1976);Frerman和Duncombe,Biochim.Biophys.Acta580:289-297(1979))。来自丙酮丁醇梭菌的基因thlA被设计入大肠杆菌的生产异丙醇的菌株(Hanai等人,Appl.Environ.Microbiol.73:7814-7818(2007);Stim-Herndon等人,Gene154:81-85(1995))。附加候选基因包括来自巴斯德氏梭菌的thl(Meng和Li.Cloning,Biotechnol.Lett.28:1227-1232(2006))以及来自酿酒酵母的ERG10(Hiser等人,J Biol Chem269:31383-89(1994))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
atoB NP_416728 16130161 大肠杆菌
thlA NP_349476.1 15896127 丙酮丁醇梭菌
thlB NP_149242.1 15004782 丙酮丁醇梭菌
thl ABA18857.1 75315385 巴斯德氏梭菌
ERG10 NP_015297 6325229 酿酒酵母
参见图8，步骤2涉及乙酰乙酰基-CoA还原酶（EC#:1.1.1.35）。第二步骤伴有通过乙酰乙酰基-CoA还原酶的乙酰乙酰基-CoA到3-羟基丁酰基-CoA的还原。这种酶参与梭菌属几个属种的乙酰基-CoA到丁酸的发酵途径以及已被详尽地研究(Jones和Woods,Microbiol.Rev.50:484-524(1986))。由hbd编码的来自丙酮丁醇梭菌的酶已被克隆以及功能表达于大肠杆菌(Youngleson等人,J.Bacteriol.171:6800-6807(1989))。另外地，由fadB和fadJ编码的大肠杆菌中两种脂肪酸氧化复合体的亚基作为3-羟基酰基-CoA脱氢酶起作用(Binstock和Schulz,Methods Enzymol.71Pt C:403-411(1981))。被证实将乙酰乙酰基-CoA还原为3-羟基丁酰基-CoA的仍然其他基因是来自生枝动胶菌的phbB(Ploux等人,Eur.J Biochem.174:177-182(1988))以及来自类球红细菌的phaB(Alber等人,Mol.Microbiol61:297-309(2006))。前一种基因是依赖NADPH的，其核苷酸序列已被测定(Peoples等人,Mol.Microbiol3:349-357(1989))以及该基因已被表达于大肠杆菌。关于该基因的底物特异性研究得到的结论是，除了乙酰乙酰基-CoA之外，它还可以接受3-氧代丙酰基-CoA作为底物(Ploux等人,Eur.J Biochem.174:177-182(1988))。附加候选基因包括克鲁佛氏梭菌中的Hbd1（C-末端域）和Hbd2（N-末端域）(Hillmer和Gottschalk,Biochim.Biophys.Acta3334:12-23(1974))以及牛中的HSD17B10(Wakil等人,J.Biol.Chem.207:631-638(1954))。来自脱氮副球菌的酶已被功能表达以及表征于大肠杆菌(Yabutani等人,FEMSMicrobiol Lett.133:85-90(1995))。许多类似酶已被发现于梭菌属的其他属种以及勤奋生金球菌中(Berg等人,Science.318:1782-1786(2007))。来自热带假丝酵母的酶是过氧化物酶体脂肪酸β-氧化多功能酶型2（MFE-2）的组成部分。这种蛋白质的脱氢酶B域对乙酰乙酰基-CoA具有催化活性。该域已被功能表达于大肠杆菌，晶体结构是可得的，以及该催化机制得到了很好的理解(Ylianttila等人,Biochem Biophys Res Commun324:25-30(2004);Ylianttila等人,J Mol Biol358:1286-1295(2006))。
蛋白质 GENBANK ID GI号 生物
fadB P21177.2 119811 大肠杆菌
fadJ P77399.1 3334437 大肠杆菌
Hbd2 EDK34807.1 146348271 克鲁佛氏梭菌
Hbd1 EDK32512.1 146345976 克鲁佛氏梭菌
HSD17B10 O02691.3 3183024 牛
phbB P23238.1 130017 生枝动胶菌
phaB YP_353825.1 77464321 类球红细菌
phaB BAA08358 675524 脱氮副球菌
Hbd NP_349314.1 15895965 丙酮丁醇梭菌
Hbd AAM14586.1 20162442 拜氏梭菌
Msed_1423 YP_001191505 146304189 勤奋生金球菌
Msed_0399 YP_001190500 146303184 勤奋生金球菌
Msed_0389 YP_001190490 146303174 勤奋生金球菌
Msed_1993 YP_001192057 146304741 勤奋生金球菌
Fox2 Q02207 399508 热带假丝酵母
参见图8，步骤3涉及3-羟基丁酰基-CoA变位酶（EC5.4.99.-）。在下一步骤中，通过3-羟基丁酰基-CoA变位酶将3-羟基丁酰基-CoA重排以形成2-羟基异丁酰基-CoA（2-HIBCoA）。这种酶是最近发现以及表征于甲基菌属petroleiphilum的新颖ICM样甲基变位酶(Ratnatilleke等人,J.Biol. Chem.274:31679-31685(1999);Rohwerder等人,Appl.Environ.Microbiol.72:4128-4135(2006))。这种酶由甲基菌属petroleiphilum PM1中的Mpe_B0541编码，具有与其他生物（包括类球红细菌中的Rsph17029_3657以及自养黄色杆菌中的Xaut_5021）中的甲基丙二酰基-CoA变位酶的大型亚基相比的高度序列同源性。如实施例VII（步骤1）中所讨论，对活性位点附近的单个氨基酸的改变改变了该酶的底物特异性(Ratnatilleke等人，同上，1999；Rohwerder等人，同上，2006），因此这种位点类似酶（例如，前文所述的甲基丙二酰基-CoA变位酶或异丁酰基-CoA变位酶）的定向设计可用以实现所需的反应性
参见图8，步骤4涉及2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶。2-羟基酰基-CoA（如2-羟基异丁酰基-CoA）的脱水可以通过经由游离基机理使2-羟基酰基-CoA衍生物脱水的特殊类别的对氧灵敏的酶催化(Buckel和Golding,Annu.Rev.Microbiol.60:27-49(2006);Buckel等人,Curr.Opin.Chem.Biol.8:462-467(2004);Buckel等人,Biol.Chem.386:951-959(2005);Kim等人,FEBS J.272:550-561(2005);Kim等人,FEMS Microbiol.Rev.28:455-468(2004);Zhang等人,Microbiology145(Pt9):2323-2334(1999))。这样一种酶的例子是来自丙酸梭菌的乳酰基-CoA脱水酶，其催化乳酰基-CoA的脱水以形成丙烯醛基-CoA(Kuchta和Abeles,J.Biol.Chem.260:13181-13189(1985);Hofmeister和Buckel,Eur.J.Biochem.206:547-552(1992))。附加例子是由来自发酵氨基酸球菌的hgdABC编码的2-羟基戊二酰基-CoA脱水酶(和Buckel,Eur.J.Biochem.230:698-704(1995);Schweiger等人,Eur.J.Biochem.169:441-448(1987))。仍然另一例子是由hadBC催化以及由hadI活化的来自艰难梭菌的2-羟基异己酰基-CoA脱水酶(Darley等人,FEBS J.272:550–61(2005))。可发现的发酵氨基酸球菌和艰难梭菌的对应序列如下所列。完整丙酸梭菌乳酰基-CoA脱水酶的序列尚未列入公开提供的数据库中。然而，β-亚基的序列对应GenBank登录号AJ276553(Selmer等人,Eur JBiochem,269:372-80(2002))。
基因 GenBank登录号 GI号 生物
hgdA P11569 296439332 发酵氨基酸球菌
hgdB P11570 296439333 发酵氨基酸球菌
hgdC P11568 2506909 发酵氨基酸球菌
hadB YP_001086863 126697966 艰难梭菌
hadC YP_001086864 126697967 艰难梭菌
hadI YP_001086862 126697965 艰难梭菌
lcdB AJ276553 7242547 丙酸梭菌
参见图8，步骤5或6涉及分别对甲基丙烯酸或2-羟基异丁酸具有活性的转移酶（EC2.8.3.-）、水解酶（EC3.1.2.-）或合成酶（EC6.2.1.-）。异丁烯酰基-CoA到MAA或2-羟基异丁酰基-CoA到2-羟基异丁酸的直接转化可以通过CoA转移酶、合成酶或水解酶完成。如实施例VII中所讨论，如果采用CoA转移酶或CoA合成酶完成这种转换，则途径能量学是最有利的。在转移酶家族中，酶酰基-CoA:醋酸-CoA转移酶（也称为醋酸-CoA转移酶）因为其广泛的底物特异性（包括支链酰基-CoA底物），是催化所需的2-羟基异丁酰基-CoA或甲基丙烯醛基-CoA转移酶活性的合适的候选酶(Matthies和Schink,Appl.Environ.Microbiol.58:1435-1439(1992);Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))。形成ADP的乙酰基-CoA合成酶（ACD）是CoA合成酶家族中有望对结构类似的支链化合物起作用的酶(Brasen和Schonheit,Arch..Microbiol.182:277-287(2004);Musfeldt和Schonheit,J.Bacteriol.184:636-644(2002))。在CoA-水解酶家族中，酶3-羟基异丁酰基-CoA水解酶已经显示作用于各种支链酰基-CoA底物，包括3-羟基异丁酰基-CoA、甲基丙二酰基-CoA以及3-羟基-2-甲基丁酰基-CoA(Hawes等人,Methods Enzymol.324:218-228(2000);Hawes等人,J.Biol.Chem.271:26430-26434(1996);Shimomura等人,J.Biol.Chem.269:14248-14253(1994))。CoA转移酶、合成酶以及水解酶的附加示例性候选基因如实施例VII（步骤2和5）中所讨论。
参见图8，替代性步骤5涉及间接转化为MAA。作为MAA-CoA到MAA的直接转化的替代性选择，用于将异丁烯酰基-CoA转化为MAA的替换性策略伴有多步骤的工艺，其中MAA-CoA经由3-羟基异丁酸酯转化为MAA。通过这种工艺，如实施例VII中所述，MAA-CoA首先转化为3-羟基异丁酰基-CoA，其后续可以转化为MAA。
这种间接路径的第一步骤伴有通过烯酰基-CoA水合酶（EC4.2.1.17以及4.2.1.74）的从MAA-CoA到3-羟基异丁酰基-CoA（3HIB-CoA）的转化。在大肠杆菌中，fadA以及fadB的基因产物编码脂肪酸氧化中涉及的表现出烯酰基-CoA水合酶活性的多酶复合体(Nakahigashi和Inokuchi,NucleicAcids Research18:4937(1990);Yang,J.Bacteriol.173:7405-7406(1991);Yang等人,J.Biol.Chem.265:10424-10429(1990);Yang等人,Biochemistry30:6788-6795(1991))。可以利用敲出由fadR编码的负调节子来活化fadB基因产物(Sato等人,J.Biosci.Bioengineer.103:38-44(2007))。fadI以及fadJ基因编码类似功能以及被自然地表达于厌氧条件下(Campbell等人,Mol.Microbiol.47:793-805(2003))。
基因 GenBank登录号 GI号 生物
fadA YP_026272.1 49176430 大肠杆菌
fadB NP_418288.1 16131692 大肠杆菌
fadI NP_416844.1 16130275 大肠杆菌
fadJ NP_416843.1 16130274 大肠杆菌
fadR NP_415705.1 16129150 大肠杆菌
编码烯酰基-CoA水合酶的附加原生候选基因包括maoC(Park和Lee,J.Bacteriol.185:5391-5397(2003))、paaF(Ismail等人,Eur.J.Biochem.270:3047-3054(2003);Park和Lee,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:335-346(2004);Park和Yup,Biotechnol.Bioeng.86:681-686.(2004))以及paaG(Ismail等人,Eur.J.Biochem.270:3047-3054(2003);Park和Lee,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:335-346(2004);Park和Yup,Biotechnol.Bioeng.86:681-686(2004))。其他候选基因包括来自恶臭假单胞菌(Olivera等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6419-6424(1998))以及荧光假单胞菌(DiGennaro等人,Arch.Microbiol.188:117-125(2007))的paaA、paaB和paaN。丙酮丁醇梭菌的基因产物是另一候选基因(Atsumi等人,Metab.Eng.epubSep14,2007;Boynton等人,J.Bacteriol.178:3015-3024(1996))。由ech编码的恶臭假单胞菌的烯酰基-CoA水合酶催化3-羟基丁酰基-CoA到巴豆酰基-CoA的转化(Roberts等人,Arch.Microbiol117:99-108(1978))。这种转换还由丙酮丁醇梭菌的crt基因产物、克鲁佛氏梭菌的crt1基因产物以及其他梭菌属生物催化(Atsumi等人,Metab Eng10:305-311(2008);Boynton等人,JBacteriol.178:3015-3024(1996);Hillmer等人,FEBS Lett.21:351-354(1972))。附加烯酰基-CoA水合酶候选基因是恶臭假单胞菌的phaA和phaB以及荧光假单胞菌的paaA和paaB(Olivera等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A95:6419-6424(1998))。
基因 GenBank登录号 GI号 生物
maoC NP_415905.1 16129348 大肠杆菌
paaF NP_415911.1 16129354 大肠杆菌
paaG NP_415912.1 16129355 大肠杆菌
paaN(phaL) NP_745413.1 26989988 恶臭假单胞菌
paaN ABF82246.1 106636106 荧光假单胞菌
ech NP_745498.1 26990073 恶臭假单胞菌
crt NP_349318.1 15895969 丙酮丁醇梭菌
crt1 YP_001393856 153953091 克鲁佛氏梭菌
phaA NP_745427.1 26990002 恶臭假单胞菌
phaB NP_745426.1 26990001 恶臭假单胞菌
paaA ABF82233.1 106636093 荧光假单胞菌
paaB ABF82234.1 106636094 荧光假单胞菌
本实施例描述了用于从乙酰基-CoA生产2-羟基异丁酸酯或MAA的生物合成途径。
实施例XI
用于经由巴豆酰基-CoA从乙酰基-CoA到MAA的转化的途径
本实施例描述了经由巴豆酰基-CoA从乙酰基-CoA到MAA的示例性合成途径。
对最少七个酶步骤的用于将乙酰基-CoA转化为MAA的另一路径进行了描述（见图9）。在有氧以及厌氧条件下这种途径的收率与实施例X中所述的途径的收率类似。
该途径的前两个步骤与实施例X中所述途径的步骤1和2相同。在第三步骤中，3-HBCoA通过巴豆酸酶（EC#:4.2.1.55）经脱水形成巴豆酰基-CoA。巴豆酰基-CoA中的双键通过丁酰基-CoA脱氢酶（EC#:1.3.99.2）还原。这两种酶，正如乙酰乙酰基-CoA还原酶，是梭菌属中从乙酰基-CoA到丁酸的发酵途径的一部分(Jones和Woods,Microbiol.Rev.50:484-524(1986))。在后续的步骤中，丁酰基-CoA通过异丁酰基-CoA变位酶（5.4.99.12）（一种可以可逆地将丁酰基-CoA转化为异丁酰基-CoA的酶）转化为异丁酰基-CoA。这种酶已从肉桂地链霉菌中克隆并测序得到，以及重组酶已被表征于大肠杆菌(Ratnatilleke等人,J.Biol.Chem.274:31679-31685(1999))。该途径的下一步骤伴有经由2-甲基-酰基CoA脱氢酶（EC#:1.3.99.12）的从异丁酰基-CoA到异丁烯酰基-CoA的转化。这种朝向异丁烯酰基-CoA的转换已在链霉菌属中被观察到，以及该相关的酶已被分离以及表达于大肠杆菌(Youngleson等人,J.Bacteriol.171:6800-6807(1989))。在最后步骤中，异丁烯酰基-CoA通过实施例X（步骤5）中所述的单个酶或一系列酶转化为MAA。
本实施例描述了用于从乙酰基-CoA生产MAA的生物合成途径。
实施例XII
用于将丙烯酰基-CoA转化为MAA的途径
本实施例描述了从丙烯酰基-CoA到MAA的示例性合成途径。
高收率of MAA可以通过丙烯酰基-CoA途径获得（见图10）。这种途径需要将乳酸活化为乳酰基-CoA，然后是五个或可选地六个、更多步骤以将这种活化的CoA分子转化为MAA。利用这种途径从葡萄糖到MAA的收率是1.28mol/mol葡萄糖以及获得这些收率需要氧摄取。缺少氧的情况下，期望的收率从1.28mol/mol消耗的葡萄糖下降到1.09mol/mol消耗的葡萄糖。最大MAA收率情况下，有氧途径以及厌氧途径皆是能量受限的以及不生成任何ATP。
通过丙烯酰基-CoA途径的MAA生物合成首先需要经由乳酸脱氢酶（EC1.1.1.28）（一种对于大肠杆菌以及许多其他生物来说是原生的酶）的从丙酮酸到乳酸的转化。将乳酸转化为丙酰基-CoA的三个后续的步骤由几种不相关的细菌（如丙酸梭菌以及埃尔登氏巨球形菌（MetaCyc））中丙酮酸发酵途径中的酶催化。乳酸-CoA转移酶（EC2.8.3.1）（也称为丙酸-CoA转移酶）将乳酸转化为乳酰基-CoA以及可以将丙酸和乳酸用作底物。这种酶已被纯化以及表征(Schweiger等人,Eur.J.Biochem.169:441-448(1987))。利用乳酰基-CoA脱水酶（EC4.2.1.54）（已是众多研究主题的一种酶）将乳酰基-CoA脱水为丙烯酰基-CoA(Hofmeister和Buckel,Eur.J.Biochem.206:547-552.(1992);Kuchta和Abeles,J.Biol.Chem.260:13181-13189(1985))。接着，利用丙烯酰基-CoA还原酶（EC1.3.2.2，以前是1.3.99.3）将丙烯酰基-CoA还原为丙酰基-CoA(Hetzel等人,Eur.J Biochem.270:902-910(2003);Kuchta和Abeles,同上,1985)。
参见图10，在步骤5中，丙酰基-CoA通过丙酰基-CoA羧化酶（6.4.1.3）转化为S-甲基丙二酰基-CoA。丙酰基-CoA羧化酶已从大鼠肝脏中纯化得到(Browner等人,J.Biol.Chem.264:12680-12685(1989);Kraus等人,J.Biol.Chem.258:7245-7248(1983))以及也已从人肝脏中分离以及表征得到(Kalousek等人,J.Biol.Chem.255:60-65(1980))。已经将经由这种酶将丙酰基-CoA羧基化为琥珀酰-CoA确认为大肠杆菌中丙酸新陈代谢机制的一种(Evans等人,Biochem.J.291(Pt3):927-932(1993))，但是关于该途径的遗传学知之甚少。
该途径的最后步骤伴有甲基丙二酰基-CoA到MAA的转化（图10中的集中反应）。催化这些反应的酶如实施例V中所述。
本实施例描述了用于从丙酮酸生产MAA的生物合成途径。
实施例XIII
用于将2-酮异戊酸转化为MAA的途径
本实施例描述了从2-酮异戊酸到MAA的示例性合成途径。
该途径（见图11）利用几种生物（包括枯草芽孢杆菌、拟南芥以及几个假单胞菌属种）中所述的，但是不知是否存在于大肠杆菌或存在于酿酒酵母中的缬氨酸降解路径的多个步骤。在该缬氨酸降解途径的第一步骤中，缬氨酸通过支链氨基酸氨基转移酶（EC2.6.1.24）（对于大肠杆菌来说也是原生的一种酶）转化为2-酮异戊酸(Matthies和Schink,Appl.Environ.Microbiol.58:1435-1439(1992);Rudman和Meister,J.Biol.Chem.200:591-604(1953))。后续的由支链酮-酸脱氢酶复合体（EC1.2.1.25）催化的2-酮异戊酸到异丁酰基-CoA的转化是经由这种路径生物合成MAA所涉及的步骤。接下来，异丁酰基-CoA经由异丁酰基-CoA脱氢酶（EC1.3.99.12）转化为异丁烯酰基-CoA。该步骤的细节如实施例XI中所述。在最后步骤中，MAA-CoA到MAA的转化如实施例V中所述。
本实施例描述了用于从2-酮异戊酸生产MMA的生物合成途径。
实施例XIV
用于经由2-羟基异丁酰基-CoA从4-羟基丁酰基-CoA到2-羟基异丁酸酯或
MAA的转化的途径
本实施例描述了始于4-羟基丁酰基-CoA通过2-羟基异丁酰基-CoA的示例性2-羟基异丁酸酯或MAA合成途径。
该途径首先伴有4-羟基丁酰基-CoA到乙烯乙酰基-CoA的脱水，乙烯乙酰基-CoA后续经异构化为巴豆酰基-CoA。巴豆酰基-CoA经水合形成3-羟基丁酰基-CoA，3-羟基丁酰基-CoA被重排为2-羟基异丁酰基-CoA。2-羟基异丁酸酯途径的最后步骤涉及从2-羟基异丁酰基-CoA消除CoA官能团。MAA合成中的最后步骤涉及2-羟基异丁酰基-CoA的脱水，继之以从异丁烯酰基-CoA去除CoA官能团。用于图8的前三个途径步骤-步骤7、8和9的候选基因如下所述。用于图8的步骤3、4、5和6的候选基因如实施例X中所讨论。
参见图8，步骤7和8通过4-羟基丁酰基-CoA脱水酶完成。来自氨基丁酸梭菌以及克鲁佛氏梭菌的酶催化4-羟基丁酰基-CoA到巴豆酰基-CoA的可逆转化以及还具有固有的乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶活性(Scherf和Buckel,Eur.J.Biochem.215:421-429(1993);Scherf等人,Arch.Microbiol.161:239-245(1994))。两种原生酶已被纯化以及表征，包括N-末端氨基酸序列（Scherf和Buckel，同上，1993；Scherf等人，同上，1994）。来自氨基丁酸梭菌以及克鲁佛氏梭菌的abfD基因与这些N-末端氨基酸序列精确匹配，因而编码4-羟基丁酰基-CoA脱水酶/乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶。另外，来自牙龈红棕色单胞菌ATCC33277的abfD是可以通过同源性确认的另一示例性4-羟基丁酰基-CoA脱水酶。来自牙龈红棕色单胞菌的abfD基因产物以及来自勤奋生金球菌的Msed_1220基因产物通过序列同源性与梭菌属基因产物紧密相关。
图8的步骤9通过巴豆酸酶完成。这类酶为某些生物，尤其是梭菌属中正丁醇的形成所需，以及还包含嗜热酸古生菌属硫化叶菌属、酸菌属以及生金球菌属中3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环的一个步骤。编码巴豆酸酶的示例性基因可以发现于丙酮丁醇梭菌(Boynton,等人,J.Bacteriol.178(11):3015-3024(1996))、克鲁佛氏梭菌(Hillmer和Gottschalk,FEBS Lett.21(3):351-354(1972))以及勤奋生金球菌(Berg等人,Science318(5857):1782-1786(2007))中，虽然后者基因的序列未知。脂肪酸β-氧化和/或各种氨基酸的新陈代谢中涉及的烯酰基-CoA水合酶还可以催化巴豆酰基-CoA的水合作用以形成3-羟基丁酰基-CoA(Agnihotri和Liu,Bioorg.Med.Chem.11(1):9-20(2003);Roberts等人,Arch.Microbiol.117(1):99-108(1978);Conrad等人,J.Bacteriol.118(1);103-11(1974))。恶臭假单胞菌的烯酰基-CoA水合酶phaA以及phaB被认为执行苯基醋酸分解代谢过程中双键的羟基化(Olivera等人,Proc Natl Acad Sci USA95(11):6419-6424(1998))。来自荧光假单胞菌的paaA以及paaB催化类似的转换（Olivera等人，同上，1998）。最后，许多大肠杆菌基因已经显示具有烯酰基-CoA水合酶功能，包括maoC(Park和Lee,J.Bacteriol.185(18):5391-5397(2003))、paaF(Park和Lee,Biotechnol.Bioeng.86(6):681-686(2004a));Park和Lee,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:335-346(2004b));Ismail等人Eur.J.Biochem.270(14):3047-3054(2003))以及paaG(Park和Lee,同上,2004;Park和Lee,同上,2004b;Ismail等人,同上,2003)。
基因 GenBank登录号 GI号 生物
crt NP_349318.1 15895969 丙酮丁醇梭菌
crt1 YP_001393856 153953091 克鲁佛氏梭菌DSM555
phaA NP_745427.1 26990002 恶臭假单胞菌
phaB NP_745426.1 26990001 恶臭假单胞菌
paaA ABF82233.1 106636093 荧光假单胞菌
paaB ABF82234.1 106636094 荧光假单胞菌
maoC NP_415905.1 16129348 大肠杆菌
paaF NP_415911.1 16129354 大肠杆菌
paaG NP_415912.1 16129355 大肠杆菌
本实施例描述了用于从4-羟基丁酰基-CoA到2-羟基异丁酸酯或甲基丙烯酸的生物合成途径。
实施例XV
用于从合成气中提取还原当量的示例性氢化酶和CO脱氢酶以及示例性还
原TCA循环酶
用于本发明的非天然存在的微生物的还原TCA循环的酶包括ATP-柠檬酸裂解酶和三种CO2固定酶（异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶）的一种或多种。ATP-柠檬酸裂解酶或柠檬酸裂解酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的存在表明生物中活性还原TCA循环的存在。用于还原TCA循环的每个步骤的酶如下文所示以及此处所述。
ATP-柠檬酸裂解酶（ACL，EC2.3.3.8）（也称为ATP柠檬酸合酶）催化柠檬酸到草酰乙酸以及乙酰基-CoA的依赖ATP的裂解。ACL是RTCA循环的一种酶，其已在绿硫细菌泥生绿菌以及绿硫菌中得到研究。来自泥生绿菌的α(4)β(4)杂聚酶被克隆以及表征于大肠杆菌(Kanao等人,Eur.J.Biochem.269:3409-3416(2002)。由aclAB编码的泥生绿菌酶是不可逆的以及该酶的活性通过ADP/ATP比率调节。在阐明α和β亚基在催化机制中的作用的一项研究中，来自绿硫菌的重组ACL还表达于大肠杆菌中以及全酶在活体外重组(Kim和Tabita,J.Bacteriol.188:6544-6552(2006)。ACL酶也已经在Balnearium lithotrophicum、Sulfurihydrogenibium subterraneum以及细菌门产水菌的其他成员中得到确认(Hugler等人,Environ.Microbiol.9:81-92(2007))。这种活性也已被报道在某些真菌中。示例性生物包括粪壳属macrospora(Nowrousian等人,Curr.Genet.37:189-93(2000)、构巢曲霉、解脂耶氏酵母(Hynes和Murray,Eukaryotic Cell,July:1039-1048,(2010))以及黑曲霉(Meijer等人J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36:1275-1280(2009))。其他候选酶可以基于序列同源性发现。与这些酶相关的信息制表如下：
在某些生物中，柠檬酸到草酰乙酸以及乙酰基-CoA的转化通过柠檬酰基-CoA中间体进行以及由两种单独的酶（柠檬酰基-CoA合成酶（EC6.2.1.18）以及柠檬酰基-CoA裂解酶（EC4.1.3.34））催化(Aoshima,M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.75:249-255(2007))。柠檬酰基-CoA合成酶催化柠檬酸到柠檬酰基-CoA的活化。嗜热氢杆菌酶由分别由ccsA和ccsB编码的大小亚基组成(Aoshima等人,Mol.Micrbiol.52:751-761(2004))。产水菌属aeolicus的柠檬酰基-CoA合成酶由α和β亚基（由sucC1和sucD1编码）组成(Hugler等人,Environ.Microbiol.9:81-92(2007))。柠檬酰基-CoA裂解酶将柠檬酰基-CoA裂解为草酰乙酸以及乙酰基-CoA。这种酶是由嗜热氢杆菌中的ccl(Aoshima等人,Mol.Microbiol.52:763-770(2004))以及产水菌属aeolicus中的aq_150(Hugler等人,同上(2007))编码的同源三体。据近期报道，用于将柠檬酸转化为草酰乙酸以及柠檬酰基-CoA的这种机制的基因也已经被发现于绿硫菌(Eisen等人,PNAS99(14):9509-14(2002))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
ccsA BAD17844.1 46849514 嗜热氢杆菌
ccsB BAD17846.1 46849517 嗜热氢杆菌
sucC1 AAC07285 2983723 产水菌属aeolicus
sucD1 AAC07686 2984152 产水菌属aeolicus
ccl BAD17841.1 46849510 嗜热氢杆菌
aq_150 AAC06486 2982866 产水菌属aeolicus
CT0380 NP_661284 21673219 绿硫菌
CT0269 NP_661173.1 21673108 绿硫菌
CT1834 AAM73055.1 21647851 绿硫菌
草酰乙酸通过苹果酸脱氢酶（EC1.1.1.37）（按向前和逆向方向起作用的一种酶）转化为苹果酸。酿酒酵母具有苹果酸脱氢酶的三个副本MDH1(McAlister-Henn和Thompson,J.Bacteriol.169:5157-5166(1987))、MDH2(Minard和McAlister-Henn,Mol.Cell.Biol.11:370-380(1991);Gibson和McAlister-Henn,J.Biol.Chem.278:25628-25636(2003))以及MDH3(Steffan和McAlister-Henn,J.Biol.Chem.267:24708-24715(1992))，其分别定位至线粒体、细胞溶质以及过氧物酶体。大肠杆菌已知具有由mdh编码的活性苹果酸脱氢酶。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
MDH1 NP_012838 6322765 酿酒酵母
MDH2 NP_014515 116006499 酿酒酵母
MDH3 NP_010205 6320125 酿酒酵母
Mdh NP_417703.1 16131126 大肠杆菌
富马酸水合酶（EC4.2.1.2）催化富马酸到苹果酸的可逆水合作用。在不同的氧可用性条件下调节大肠杆菌由fumA、fumB和fumC编码的三种富马酸酶。FumB对氧灵敏以及在厌氧条件下具有活性。FumA在微厌氧条件下具有活性，以及FumC在有氧的生长条件下具有活性(Tseng等人,J.Bacteriol.183:461-467(2001);Woods等人,Biochim.Biophys.Acta954:14-26(1988);Guest等人,J.Gen.Microbiol.131:2971-2984(1985))。酿酒酵母包含编码富马酸酶的基因的一个副本FUM1，其产物固定到细胞溶质以及线粒体(Sass等人,J.Biol.Chem.278:45109-45116(2003))。附加的富马酸酶发现于空肠弯曲杆菌(Smith等人,Int.J.Biochem.Cell.Biol.31:961-975(1999))、嗜热栖热菌(Mizobata等人,Arch.Biochem.Biophys.355:49-55(1998))以及褐鼠(Kobayashi等人,J.Biochem.89:1923-1931(1981))。具有高度序列同源性的类似酶包括来自拟南芥的fum1以及来自谷氨酸棒杆菌的fumC。来自Pelotomaculum thermopropionicum的MmcBC富马酸酶是具有两种亚基的另一类别的富马酸酶(Shimoyama等人,FEMS Microbiol.Lett.270:207-213(2007))。
富马酸还原酶催化富马酸还原为琥珀酸。大肠杆菌的由四种亚基（由frdABCD编码）组成的富马酸还原酶是膜结合的以及在厌氧条件下具有活性。用于这种反应的电子供体是甲基萘醌类以及这种反应中产生的两种质子并不有助于质子梯度(Iverson等人,Science284:1961-1966(1999))。酵母基因组编码由FRDS1(Enomoto等人,DNA Res.3:263-267(1996))以及FRDS2(Muratsubaki等人,Arch.Biochem.Biophys.352:175-181(1998))编码的两种可溶富马酸还原酶同工酶，该同工酶分别固定到细胞溶质和原线粒体）以及被用于葡萄糖上的厌氧培育期间(Arikawa等人,FEMS Microbiol.Lett.165:111-116(1998)).
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
FRDS1 P32614 418423 酿酒酵母
FRDS2 NP_012585 6322511 酿酒酵母
frdA NP_418578.1 16131979 大肠杆菌
frdB NP_418577.1 16131978 大肠杆菌
frdC NP_418576.1 16131977 大肠杆菌
frdD NP_418475.1 16131877 大肠杆菌
从琥珀酸到琥珀酰-CoA的依赖ATP的酰基化由琥珀酰-CoA合成酶（EC6.2.1.5）催化。酿酒酵母LSC1和LSC2基因以及大肠杆菌的sucC和sucD基因的产物自然地形成琥珀酰-CoA合成酶复合体，该复合体在活体内可逆的反应中，自然地催化琥珀酸形成琥珀酰-CoA并伴随消耗一份ATP(Buck等人,Biochemistry24:6245-6252(1985))。这些蛋白质确认如下：
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
LSC1 NP_014785 6324716 酿酒酵母
LSC2 NP_011760 6321683 酿酒酵母
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（EC1.2.7.3）（也称为2-氧代戊二酸合酶或2-氧代戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（OFOR））从CO2以及琥珀酰-CoA形成α-酮戊二酸，同时消耗两份被还原的铁氧还蛋白当量。OFOR和丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）是将硫胺焦磷酸素、CoA和铁硫簇作为辅因子以及将铁氧还蛋白、黄素氧化还原蛋白以及FAD作为电子载体的2-氧代酸:铁氧还蛋白（黄素氧化还原蛋白）氧化还原酶的多样家族的成员(Adams等人,Archaea.Adv.Protein Chem.48:101-180(1996))。这种类别的酶是可逆的以及在通过RTCA循环固定碳的生物（如嗜热氢杆菌、嗜水脱硫菌以及绿菌属）中按羧基化方向起作用(Shiba等人1985;Evans等人,Proc.Natl.Acad.ScI.U.S.A.55:92934(1966);Buchanan,1971)。由korAB编码的来自嗜热氢杆菌的由两种亚基组成的酶已被克隆以及表达于大肠杆菌(Yun等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.282:589-594(2001))。来自相同生物的，由forDABGE编码的对琥珀酰-CoA具有严格底物特异性的五亚基OFOR最近被确认以及表达于大肠杆菌（Yun等人，2002）。两种嗜热氢杆菌OFOR酶的CO2固定动力学已被表征(Yamamoto等人,Extremophiles14:79-85(2010))。来自嗜硫代硫酸盐绿菌的CO2固定OFOR已被纯化以及表征，但是编码这种酶的基因至今尚未确定。绿菌属中的候选酶可以通过与嗜热氢杆菌基因的序列相似性推断得到。例如，泥生绿菌基因组编码两种类似蛋白质。据预测，产乙酸菌（如热醋穆尔氏菌）编码两种OFOR酶。据预测，由Moth_0034编码的酶按CO2同化方向起作用。与这种酶相关的基因Moth_0034至今尚未得到实验证实，但是可以通过与已知OFOR酶的序列相似性推断得到。
在生理条件下按脱羧方向起作用的OFOR酶还可以催化逆向反应。由ST2300编码的来自嗜热酸古生菌硫化叶菌属菌株7的OFOR已被广泛地研究（Zhang等人，1996）。已经开发基于质粒的表达***，用于有效地表达大肠杆菌中的这种蛋白质(Fukuda等人,Eur.J.Biochem.268:5639-5646(2001))，以及确定了底物特异性中所涉及的残基(Fukuda和Wakagi,Biochim.Biophys.Acta1597:74-80(2002))。由来自Aeropyrum pernix菌株K1的Ape1472/Ape1473编码的OFOR最近被克隆入大肠杆菌，表征，以及发现与2-氧代戊二酸以及广泛范围的2-氧代酸反应(Nishizawa等人,FEBS Lett.579:2319-2322(2005))。另一示例性OFOR由幽门螺杆菌中的oorDABC编码（Hughes等人，1998）。对α-酮戊二酸具有特异性的酶已被报道于芳香索氏菌中(Dorner和Boll,J,Bacteriol.184(14),3975-83(2002))。类似酶可以通过序列同源性发现于深红红螺菌。由两种亚基组成的酶也已被确认于绿硫菌中(Eisen等人,PNAS99(14):9509-14(2002))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
korA BAB21494 12583691 嗜热氢杆菌
korB BAB21495 12583692 嗜热氢杆菌
forD BAB62132.1 14970994 嗜热氢杆菌
forA BAB62133.1 14970995 嗜热氢杆菌
forB BAB62134.1 14970996 嗜热氢杆菌
forG BAB62135.1 14970997 嗜热氢杆菌
forE BAB62136.1 14970998 嗜热氢杆菌
Clim_0204 ACD89303.1 189339900 泥生绿菌
Clim_0205 ACD89302.1 189339899 泥生绿菌
Clim_1123 ACD90192.1 189340789 泥生绿菌
Clim_1124 ACD90193.1 189340790 泥生绿菌
Moth_1984 YP_430825.1 83590816 热醋穆尔氏菌
Moth_1985 YP_430826.1 83590817 热醋穆尔氏菌
Moth_0034 YP_428917.1 83588908 热醋穆尔氏菌
ST2300 NP_378302.1 15922633 硫化叶菌属菌株7
Ape1472 BAA80470.1 5105156 Aeropyrum pernix
Ape1473 BAA80471.2 116062794 Aeropyrum pernix
oorD NP_207383.1 15645213 幽门螺杆菌
oorA NP_207384.1 15645214 幽门螺杆菌
oorB NP_207385.1 15645215 幽门螺杆菌
oorC NP_207386.1 15645216 幽门螺杆菌
CT0163 NP_661069.1 21673004 绿硫菌
CT0162 NP_661068.1 21673003 绿硫菌
korA CAA12243.2 19571179 芳香索氏菌
korB CAD27440.1 19571178 芳香索氏菌
Rru_A2721 YP_427805.1 83594053 深红红螺菌
Rru_A2722 YP_427806.1 83594054 深红红螺菌
异柠檬酸脱氢酶催化耦合NAD(P)+还原作用的异柠檬酸到2-氧代戊二酸的可逆脱羧作用。酿酒酵母以及大肠杆菌中的IDH酶分别由IDP1以及icd编码(Haselbeck和McAlister-Henn,J.Biol.Chem.266:2339-2345(1991);Nimmo,H.G.,Biochem.J.234:317-2332(1986))。还原TCA循环中的逆向反应2-氧代戊二酸到异柠檬酸的还原羧基化由来自泥生绿菌的依赖NADPH的CO2固定IDH支持以及功能表达于大肠杆菌中(Kanao等人,Eur.J.Biochem.269:1926-1931(2002))。除了如下所列的一些其他候选者之外，具有95%序列一致性的类似酶还发现于绿硫菌基因组。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
Icd ACI84720.1 209772816 大肠杆菌
IDP1 AAA34703.1 171749 酿酒酵母
Idh BAC00856.1 21396513 泥生绿菌
Icd AAM71597.1 21646271 绿硫菌
icd NP_952516.1 39996565 硫还原地杆菌
icd YP_393560. 78777245 Sulfurimonas denitrificans
在嗜热氢杆菌中，2-氧代戊二酸到异柠檬酸的还原羧基化通过两种酶催化：2-氧代戊二酸羧化酶以及草酰琥珀酸还原酶。2-氧代戊二酸羧化酶（EC6.4.1.7）催化α-酮戊二酸到草酰琥珀酸的依赖ATP的羧基化(Aoshima和Igarashi,Mol.Microbiol.62:748-759(2006))。这种酶是由两种亚基组成的大型复合体。大型（A）亚基的生物素酰化为酶功能所需(Aoshima等人,Mol.Microbiol.51:791-798(2004))。草酰琥珀酸还原酶（EC1.1.1.-）催化草酰琥珀酸到D-苏-异柠檬酸的依赖NAD的转化。该酶是由嗜热氢杆菌中的icd编码的同源双体。这种酶的动力学参数表明与其他生物中异柠檬酸脱氢酶形成对照，该酶在活体内仅仅按还原羧基化方向运行(Aoshima和Igarashi,J.Bacteriol.190:2050-2055(2008))。基于序列同源性，候选基因也已经发现于脱氮硫杆菌以及Thermocrinis albus。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
cfiA BAF34932.1 116234991 嗜热氢杆菌
cifB BAF34931.1 116234990 嗜热氢杆菌
Icd BAD02487.1 38602676 嗜热氢杆菌
Tbd_1556 YP_315314 74317574 脱氮硫杆菌
Tbd_1555 YP_315313 74317573 脱氮硫杆菌
Tbd_0854 YP_314612 74316872 脱氮硫杆菌
Thal_0268 YP_003473030 289548042 Thermocrinis albus
Thal_0267 YP_003473029 289548041 Thermocrinis albus
Thal_0646 YP_003473406 289548418 Thermocrinis albus
乌头酸酶（EC4.2.1.3）是一种包含铁硫的蛋白质，其经由中间体顺式乌头酸催化柠檬酸以及异-柠檬酸的可逆异构化。在大肠杆菌基因组中，两种乌头酸酶由acnA以及acnB编码。AcnB是主要的分解代谢酶，而AcnA更加稳定以及似乎在氧化或酸应力条件下具有活性(Cunningham等人,Microbiology143(Pt12):3795-3805(1997))。鼠伤寒沙门氏菌中，乌头酸酶的两种同工酶由acnA以及acnB编码(Horswill和Escalante-Semerena,Biochemistry40:4703-4713(2001))。由ACO1编码的酿酒酵母乌头酸酶被固定到线粒体，在那里，它参与TCA循环(Gangloff等人,Mol.Cell.Biol.10:3551-3561(1990))以及被固定到细胞溶质，在那里，它参与乙醛酸分路(Regev-Rudzki等人,Mol.Biol.Cell.16:4163-4171(2005))。
丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）催化丙酮酸的可逆氧化作用，以形成乙酰基-CoA。来自非洲脱硫弧菌的PFOR已被克隆以及表达于大肠杆菌，产生当存在氧时保持数日稳定的活性重组酶(Pieulle等人,J.Bacteriol.179:5684-5692(1997))。PFOR中氧稳定性比较少见以及认为，氧稳定性的赋予通过非洲脱硫弧菌酶的多肽链中的60残基延伸而实现。这种酶中的两种半胱氨酸残基形成保护其免受氧形式下的灭活的二硫键。这种二硫键以及存在氧时的稳定性也已被发现于其他脱硫弧菌属(Vita等人,Biochemistry,47:957-64(2008))。热醋穆尔氏菌也被很好地表征(Menon和Ragsdale,Biochemistry36:8484-8494(1997))以及显示在自养生长期间在丙酮酸合成的方向上具有高活性(Furdui和Ragsdale,J.Biol.Chem.275:28494-28499(2000))。进一步，大肠杆菌具有未表征的开放阅读框架ydbK，其编码与热醋穆尔氏菌PFOR具有51%一致性的蛋白质。已经对大肠杆菌中丙酮酸氧化还原酶活性的证据进行描述(Blaschkowski等人,Eur.J.Biochem.123:563-569(1982))。PFOR也已经被描述于其他生物中，包括荚膜红细菌(Yakunin和Hallenbeck,Biochimica et Biophysica Acta1409(1998)39-49(1998))以及绿硫菌(Eisen等人,PNAS99(14):9509-14(2002))。来自嗜热氢杆菌的，由porEDABG编码的五亚基PFOR被克隆入大肠杆菌以及显示在脱羧化以及CO2同化方向上均起作用(Ikeda等人2006;Yamamoto等人,Extremophiles14:79-85(2010))。同系物还存在于梭菌属carboxidivorans P7中。几种附加PFOR酶如以下评论中所述(Ragsdale,S.W.,Chem.Rev.103:2333-2346(2003))。最后，黄素氧化还原蛋白还原酶（例如，来自幽门螺杆菌或空肠弯曲杆菌的fqrB）(St Maurice等人,J.Bacteriol.189:4764-4773(2007))或Rnf型蛋白质(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:2128-2133(2008);以及Herrmann,J.Bacteriol190:784-791(2008))提供了一种从PFOR生成的被还原的铁氧还蛋白生成NADH或NADPH的手段。这些蛋白质确认如下。
丙酮酸到乙酰基-CoA的转化可以通过几种其他的酶或其组合催化。例如，丙酮酸脱氢酶可以将丙酮酸转换为乙酰基-CoA，并伴随NAD分子还原为NADH。它是催化一系列部分反应的多酶复合体，这导致丙酮酸的氧化脱羧酰基化。该酶包含三种亚基：丙酮酸脱羧酶（E1）、二氢硫辛酰胺酰基转移酶（E2）和二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3）。这种酶自然地存在于几种生物（包括大肠杆菌和酿酒酵母）中。在大肠杆菌酶中，E1组分中的具体残基对底物特异性负责(Bisswanger,H.,J.Biol.Chem.256:815-82(1981);Bremer,J.,Eur.J.Biochem.8:535-540(1969);Gong等人,J.Biol.Chem.275:13645-13653(2000))。酶工程努力已经改善了厌氧条件下的大肠杆菌PDH酶活性(Kim等人,J.Bacteriol.190:3851-3858(2008);Kim等人,Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007);Zhou等人,Biotechnol.Lett.30:335-342(2008))。与大肠杆菌PDH形成对照，枯草芽孢杆菌复合体具有活性并为厌氧条件下的培育所需(Nakano等人,J.Bacteriol.179:6749-6755(1997))。在甘油上培育期间表征的肺炎克雷伯氏菌PDH在厌氧条件下也具有活性（5）。来自牛肾（18）的酶复合体的晶体结构以及来自维涅兰德固氮菌的E2催化域是可得的（4）。可以催化这种转化的仍然另一种酶是丙酮酸甲酸裂解酶。这种酶催化丙酮酸和CoA到乙酰基-CoA以及甲酸的转化。丙酮酸甲酸裂解酶是原核生物中用以有助于调节厌氧氧化还原平衡的常见酶。示例性酶可以发现于由pflB编码的大肠杆菌(Knappe和Sawers,FEMS.Microbiol Rev.6:383-398(1990))、乳酸乳球菌(Melchiorsen等人,ApplMicrobiol Biotechnol58:338-344(2002))以及变异链球菌(Takahashi-Abbe等人,Oral.Microbiol Immunol.18:293-297(2003))。大肠杆菌具有分别催化丙酮酸或2-氧代丁酸酯到乙酰基-CoA或丙酰基-CoA的转化，由tdcE编码的附加丙酮酸甲酸裂解酶(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477-492(1998))。来自大肠杆菌的pflB和tdcE需要由pflA编码的丙酮酸甲酸裂解酶活化酶的存在。进一步地，由大肠杆菌中的yfiD编码的短蛋白质可以相关于以及恢复对氧裂解的丙酮酸甲酸裂解酶的活性(Vey等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:16137-16141(2008))。注意，如WO/2008/080124]中所述，来自大肠杆菌的pflA和pflB作为增加用于丁醇生产的的细胞溶质乙酰基-CoA的手段被表达于酿酒酵母。分别由pfl和act编码的附加丙酮酸甲酸裂解酶以及活化候选酶发现于巴斯德氏梭菌中(Weidner等人,J Bacteriol.178:2440-2444(1996))。
进一步地，不同的酶可以联合用以将丙酮酸转化为乙酰基-CoA。例如，在酿酒酵母中，通过首先将丙酮酸脱羧形成乙醛而在细胞溶质中获得乙酰基-CoA；后者通过乙醛脱氢酶被氧化为醋酸以及后续被活化以通过乙酰基-CoA合成酶形成乙酰基-CoA。在几种其他生物（包括大肠杆菌(Kumari等人,J.Bacteriol.177:2878-2886(1995))、肠沙门氏菌(Starai等人,Microbiology151:3793-3801(2005)以及热醋穆尔氏菌（已经进行描述））中，乙酰基-CoA合成酶是原生酶。替代性地，醋酸可以通过醋酸激酶以及磷酸转乙酰基酶活化以形成乙酰基-CoA。醋酸激酶首先将醋酸转化为乙酰基-磷酸，伴随着使用ATP分子。乙酰基-磷酸以及CoA接着被转化为乙酰基-CoA并通过磷酸转乙酰基酶释放一种磷酸。在几种梭菌属以及嗜热甲烷八叠球菌中，醋酸激酶以及磷酸转乙酰基酶是得到很好研究的酶。
将丙酮酸转化为乙酰基-CoA的仍然另一途径是经由丙酮酸氧化酶。丙酮酸氧化酶将泛醌作为电子受体，将丙酮酸转化为醋酸。在大肠杆菌中，这种活性由poxB编码。PoxB与酿酒酵母以及运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶相似。该酶具有硫胺焦磷酸辅因子(Koland和Gennis,Biochemistry21:4438-4442(1982));O'Brien等人,Biochemistry16:3105-3109(1977);O'Brien和Gennis,J.Biol.Chem.255:3302-3307(1980))以及黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子。如前面所述，醋酸然后可以通过乙酰基-CoA合成酶或通过醋酸激酶和磷酸转乙酰基酶被转化为乙酰基-CoA。这些酶的一些还可以催化从乙酰基-CoA到丙酮酸的逆向反应。
对于使用NADH或NADPH形式的还原当量的酶，这些被还原的载体可以通过将电子从被还原的铁氧还蛋白中转移而生成。两种酶催化电子从被还原的铁氧还蛋白到NAD(P)+、铁氧还蛋白:NAD+氧化还原酶（EC1.18.1.3）以及铁氧还蛋白:NADP+氧化还原酶（FNR，EC1.18.1.2）的可逆转移。铁氧还蛋白:NADP+氧化还原酶（FNR，EC1.18.1.2）具有便于将电子从NADPH可逆转移到低电位受体，如铁氧还蛋白或黄素氧化还原蛋白的非共价结合的FAD辅因子(Blaschkowski等人,Eur.J.Biochem.123:563-569(1982);Fujii等人,1977)。由HP1164（fqrB）编码的幽门螺杆菌FNR与丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）的活性耦合，导致依赖丙酮酸的NADPH的生产（St等人，2007）。类似的酶发现于空肠弯曲杆菌（St等人，2007）。大肠杆菌基因组中，铁氧还蛋白:NADP+氧化还原酶由fpr编码（Bianchi等人，1993）。铁氧还蛋白:NAD+氧化还原酶利用被还原的铁氧还蛋白以从NAD+生成NADH。在几种生物（包括大肠杆菌）中，这种酶是多功能双加氧酶酶复合体的组分。由hcaD编码的大肠杆菌的铁氧还蛋白:NAD+氧化还原酶是芳香族酸利用中所涉及的3-苯基丙酸双加氧酶***的组分（Diaz等人，1998）。在嗜热氢杆菌菌株TK-6的细胞提取物中检测到NADH:铁氧还蛋白还原酶活性，虽然具有这种活性的基因尚未表明（Yoon等人，2006）。最后，节能膜相关的Rnf型蛋白质(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:2128-2133(2008);Herrmann等人,J.Bacteriol.190:784-791(2008))提供从被还原的铁氧还蛋白生成NADH或NADPH的手段。已在梭菌属carboxydivorans P7中注释附加的铁氧还蛋白:NAD(P)+氧化还原酶。
铁氧还蛋白是包含作为具有低还原电位的细胞内电子载体起作用的一种或多种铁硫簇的小型酸性蛋白质。被还原的铁氧还蛋白供应电子到依赖Fe的酶，如铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）以及2-氧代戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（OFOR）。嗜热氢杆菌基因fdx1编码分别通过OFOR和PFOR进行的2-氧代戊二酸以及丙酮酸的可逆羧基化所需的[4Fe-4S]型铁氧还蛋白(Yamamoto等人,Extremophiles14:79-85(2010))。与硫磺矿硫化叶菌2-氧代酸:铁氧还蛋白还原酶相关的铁氧还蛋白是单体二簇[3Fe-4S][4Fe-4S]型铁氧还蛋白（Park等人，2006）。虽然与这种蛋白质相关的基因尚未完全测序，N-末端域具有与来自嗜酸热硫化叶菌的zfx铁氧还蛋白的93%同源性。大肠杆菌基因组编码生理功能未知的可溶铁氧还蛋白fdx。某些证据表明，这种蛋白质可以在铁硫簇装配体中起作用（Takahashi和Nakamura，1999）。附加的铁氧还蛋白蛋白质已被表征于幽门螺杆菌（Mukhopadhyay等人，2003）以及空肠弯曲杆菌（van Vliet等人，2001）。来自巴斯德氏梭菌的2Fe-2S铁氧还蛋白已被克隆以及表达于大肠杆菌(Fujinaga和Meyer,Biochemical andBiophysical Research Communications,192(3):(1993))。据预测，产乙酸菌，如热醋穆尔氏菌、梭菌属carboxidivorans P7以及深红红螺菌编码如下所列的几种铁氧还蛋白。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
fer AAC83945.1 1146198 枯草芽孢杆菌
fdx1 NP_249053.1 15595559 绿脓假单胞菌PA01
yfhL AP_003148.1 89109368 大肠杆菌K-12
琥珀酰-CoA转移酶催化琥珀酰-CoA到琥珀酸的转化同时将CoA部分转移到CoA受体分子。许多转移酶具有广泛的特异性以及可以将CoA受体用作多样酸，尤其用作醋酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、2-甲基乙酰醋酸、3-酮己酸、3-酮戊酸、戊酸、巴豆酸、3-巯基丙酸、丙酸、乙烯醋酸以及丁酸。
琥珀酸到琥珀酰-CoA的转化可以通过转移酶进行，这无需直接消耗ATP或GTP。这种类型的反应常见于许多生物中。琥珀酸到琥珀酰-CoA的转化还可以通过琥珀酰-CoA:乙酰基-CoA转移酶催化。克鲁佛氏梭菌的cat1的基因产物已经显示具有琥珀酰-CoA:乙酰基-CoA转移酶活性(Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996))。另外，该活性存在于***滴虫（van Grinsven等人，2008）以及布氏锥虫（Riviere等人，2004）。在变体TCA循环中，由aarC编码的来自醋化醋杆菌的琥珀酰-CoA:醋酸CoA-转移酶替代琥珀酰-CoA合成酶（Mullins等人，2008）。类似的琥珀酰-CoA转移酶活性还存在于***滴虫（van Grinsven等人，2008）、布氏锥虫（Riviere等人，2004）以及克鲁佛氏梭菌（Sohling和Gottschalk，1996c）中。由恶臭假单胞菌中的pcaI以及pcaJ编码的β-酮已二酸:琥珀酰-CoA转移酶仍是另一种候选酶（Kaschabek等人，2002）。上述蛋白质确认如下。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
cat1 P38946.1 729048 克鲁佛氏梭菌
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 ***滴虫G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 布氏锥虫
pcaI AAN69545.1 24985644 恶臭假单胞菌
pcaJ NP_746082.1 26990657 恶臭假单胞菌
aarC ACD85596.1 189233555 醋化醋杆菌
将琥珀酸转化为琥珀酰-CoA同时将3-酮酰基-CoA转化为3-酮酸的附加示例性转移酶是琥珀酰-CoA:3:酮酸-CoA转移酶（EC2.8.3.5）。示例性琥珀酰-CoA:3:酮酸-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌（Corthesy-Theulaz等人，1997）、枯草芽孢杆菌以及智人（Fukao等人，2000；Tanaka等人，2002）中。上述蛋白质确认如下。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
HPAG1_0676 YP_627417 108563101 幽门螺杆菌
HPAG1_0677 YP_627418 108563102 幽门螺杆菌
ScoA NP_391778 16080950 枯草芽孢杆菌
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
ScoB NP_391777 16080949 枯草芽孢杆菌
OXCT1 NP_000427 4557817 智人
OXCT2 NP_071403 11545841 智人
通过琥珀酰-CoA:3:酮酸-CoA转移酶的从琥珀酸到琥珀酰-CoA的转化需要3-酮酰基-CoA（如乙酰乙酰基-CoA）到3-酮酸（如乙酰醋酸）的同时转化。3-酮酸转化回3-酮酰基-CoA可以通过乙酰乙酰基-CoA:醋酸:CoA转移酶催化。乙酰乙酰基-CoA:醋酸:CoA转移酶转化乙酰乙酰基-CoA和醋酸到乙酰醋酸和乙酰基-CoA或进行相反转化。示例性酶包括来自大肠杆菌的atoAD(Hanai等人,Appl Environ Microbiol73:7814-7818(2007))、来自丙酮丁醇梭菌的ctfAB(Jojima等人,Appl Microbiol Biotechnol77:1219-1224(2008))以及来自糖乙酸多丁醇梭菌的ctfAB(Kosaka等人,Biosci.BiotechnolBiochem.71:58-68(2007))的基因产物，如下所示。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
AtoA NP_416726.1 2492994 大肠杆菌
AtoD NP_416725.1 2492990 大肠杆菌
CtfA NP_149326.1 15004866 丙酮丁醇梭菌
CtfB NP_149327.1 15004867 丙酮丁醇梭菌
CtfA AAP42564.1 31075384 糖乙酸多丁醇梭菌
CtfB AAP42565.1 31075385 糖乙酸多丁醇梭菌
仍然另一可能的CoA受体是苯甲基琥珀酸。在生物（如芳香索氏菌(Leutwein和Heider,J.Bact.183(14)4288-4295(2001)))中，琥珀酰-CoA:(R)-苯甲基琥珀酸CoA-转移酶作为甲苯厌氧降解途径的一部分起作用。同系物可以发现于固氮弧菌属T、Aromatoleum aromaticum EbN1以及金属还原地杆菌GS-15。上述蛋白质确认如下。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
bbsE AAF89840 9622535 芳香索氏菌
Bbsf AAF89841 9622536 芳香索氏菌
bbsE AAU45405.1 52421824 固氮弧菌属T
bbsF AAU45406.1 52421825 固氮弧菌属T
bbsE YP_158075.1 56476486 Aromatoleum aromaticum EbN1
bbsF YP_158074.1 56476485 Aromatoleum aromaticum EbN1
Gmet_1521 YP_384480.1 78222733 金属还原地杆菌GS-15
Gmet_1522 YP_384481.1 78222734 金属还原地杆菌GS-15
另外地，在大肠杆菌中，ygfH编码丙酰基CoA:琥珀酸CoA转移酶(Haller等人,Biochemistry,39(16)4622-4629)。接近的同系物可以发现于，例如杨氏柠檬酸杆菌ATCC29220、肠沙门氏菌亚种arizonae serovar以及中间耶尔森氏菌ATCC29909中。上述蛋白质确认如下。
柠檬酸裂解酶（EC4.1.3.6）催化一系列导致柠檬酸裂解为醋酸和草酰乙酸的反应。该酶在厌氧条件下具有活性以及由三种亚基组成：酰基-载体蛋白质（ACP，γ）、ACP转移酶（α）以及酰基裂解酶（β）。酶活化采用结构上与乙酰基-CoA类似的不寻常辅基2’-(5”-磷酸核糖基）-3-‘-脱磷-CoA的共价结合以及乙酰基化。酰基化通过CitC（一种柠檬酸裂解酶合成酶）催化。两种附加蛋白质CitG以及CitX被用于将脱辅基酶转化为活性全酶(Schneider等人,Biochemistry39:9438-9450(2000))。野生型大肠杆菌不具有柠檬酸裂解酶活性；然而，缺乏钼辅因子合成的突变体具有活性柠檬酸裂解酶(Clark,FEMS Microbiol.Lett.55:245-249(1990))。大肠杆菌酶由citEFD编码以及柠檬酸裂解酶合成酶由citC编码(Nilekani和SivaRaman,Biochemistry22:4657-4663(1983))。肠膜明串珠菌柠檬酸裂解酶已被克隆，表征以及表达于大肠杆菌(Bekal等人,J.Bacteriol.180:647-654(1998))。柠檬酸裂解酶也已经被确认于将柠檬酸作为碳以及能量来源的肠细菌中，包括鼠伤寒沙门氏菌以及肺炎克雷伯氏菌(Bott,Arch.Microbiol.167:78-88(1997);Bott和Dimroth,Mol.Microbiol.14:347-356(1994))。上述蛋白质制表如下。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
citF AAC73716.1 1786832 大肠杆菌
Cite AAC73717.2 87081764 大肠杆菌
citD AAC73718.1 1786834 大肠杆菌
citC AAC73719.2 87081765 大肠杆菌
citG AAC73714.1 1786830 大肠杆菌
citX AAC73715.1 1786831 大肠杆菌
citF CAA71633.1 2842397 肠膜明串珠菌
Cite CAA71632.1 2842396 肠膜明串珠菌
citD CAA71635.1 2842395 肠膜明串珠菌
citC CAA71636.1 3413797 肠膜明串珠菌
citG CAA71634.1 2842398 肠膜明串珠菌
citX CAA71634.1 2842398 肠膜明串珠菌
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
citF NP_459613.1 16763998 鼠伤寒沙门氏菌
cite AAL19573.1 16419133 鼠伤寒沙门氏菌
citD NP_459064.1 16763449 鼠伤寒沙门氏菌
citC NP_459616.1 16764001 鼠伤寒沙门氏菌
citG NP_459611.1 16763996 鼠伤寒沙门氏菌
citX NP_459612.1 16763997 鼠伤寒沙门氏菌
citF CAA56217.1 565619 肺炎克雷伯氏菌
cite CAA56216.1 565618 肺炎克雷伯氏菌
citD CAA56215.1 565617 肺炎克雷伯氏菌
citC BAH66541.1 238774045 肺炎克雷伯氏菌
citG CAA56218.1 565620 肺炎克雷伯氏菌
citX AAL60463.1 18140907 肺炎克雷伯氏菌
醋酸激酶（EC2.7.2.1）催化醋酸到乙酰基磷酸的可逆依赖的ATP的磷酸化。示例性醋酸激酶已被表征于许多生物，包括大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌以及嗜热甲烷八叠球菌(Ingram-Smith等人,J.Bacteriol.187:2386-2394(2005);Fox和Roseman,J.Biol.Chem.261:13487-13497(1986);Winzer等人,Microbioloy143(Pt10):3279-3286(1997))。醋酸激酶活性也已经在大肠杆菌purT的基因产物中得到证实(Marolewski等人,Biochemistry33:2531-2537(1994))。一些丁酸激酶（EC2.7.2.7），例如来自丙酮丁醇梭菌的buk1以及buk2还接受醋酸作为底物(Hartmanis,M.G.,J.Biol.Chem.262:617-621(1987))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
ackA NP_416799.1 16130231 大肠杆菌
Ack AAB18301.1 1491790 丙酮丁醇梭菌
Ack AAA72042.1 349834 嗜热甲烷八叠球菌
purT AAC74919.1 1788155 大肠杆菌
buk1 NP_349675 15896326 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q97II1 20137415 丙酮丁醇梭菌
从乙酰基磷酸到乙酰基-CoA的形成通过磷酸转乙酰基酶（EC2.3.1.8）催化。来自大肠杆菌的pta基因编码可逆地转化乙酰基-CoA到乙酰基-磷酸的酶(Suzuki,T.,Biochim.Biophys.Acta191:559-569(969))。附加的乙酰基转移酶已被表征于枯草芽孢杆菌(Rado and Hoch,Biochim.Biophys.Acta321:114-125(1973))、克鲁佛氏梭菌(Stadtman,E.,Methods Enzymol.1:5896-599(1955))以及海栖热袍菌(Bock等人,J.Bacteriol.181:1861-1867(1999))。这种反应还通过一些磷酸转丁酰基酶（EC2.3.1.19）（包括来自丙酮丁醇梭菌的ptb基因产物）催化(Wiesenborn等人,App.Environ.Microbiol.55:317-322(1989);Walter等人,Gene134:107-111(1993))。附加的ptb基因发现于产丁酸细菌L2-50(Louis等人,J.Bacteriol.186:2099-2106(2004))以及巨大芽孢杆菌(Vazquez等人,Curr.Microbiol.42:345-349(2001))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
Pta NP_416800.1 71152910 大肠杆菌
Pta P39646 730415 枯草芽孢杆菌
Pta A5N801 146346896 克鲁佛氏梭菌
Pta Q9X0L4 6685776 海栖热袍菌
Ptb NP_349676 34540484 丙酮丁醇梭菌
Ptb AAR19757.1 38425288 产丁酸细菌L2-50
Ptb CAC07932.1 10046659 巨大芽孢杆菌
醋酸到乙酰基-CoA的酰基化通过具有乙酰基-CoA合成酶活性的酶催化。催化这种反应的两种酶是形成AMP的乙酰基-CoA合成酶（EC6.2.1.1）以及形成ADP的乙酰基-CoA合成酶（EC6.2.1.13）。形成AMP的乙酰基-CoA合成酶（ACS）是用于将醋酸活化为乙酰基-CoA的主导酶。示例性ACS酶发现于大肠杆菌(Brown等人,J.Gen.Microbiol.102:327-336(1977))、富养罗尔斯通氏菌(Priefert和Steinbuchel,J.Bacteriol.174:6590-6599(1992))、热自养甲烷杆菌(Ingram-Smith和Smith,Archaea2:95-107(2007))、肠沙门氏菌(Gulick等人,Biochemistry42:2866-2873(2003))以及酿酒酵母(Jogl和Tong,Biochemistry43:1425-1431(2004))。形成ADP的乙酰基-CoA合成酶是具有一般广泛底物范围的可逆酶(Musfeldt和Schonheit,J.Bacteriol.184:636-644(2002))。在闪烁古生球菌基因组中，形成ADP的乙酰基-CoA合成酶的两种同工酶由AF1211以及AF1983编码（Musfeldt以及Schonheit，同上（2002））。来自死海盐盒菌的酶（释为琥珀酰-CoA合成酶）还接受醋酸作为底物以及该酶的可逆性得到证实(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol.182:277-287(2004))。由来自超嗜热泉古菌的耐超高温热棒菌的PAE3250编码的ACD显示所有被表征的ACD的最广泛的底物范围，与醋酸、异丁酰基-CoA（优选的底物）以及苯基乙酰基-CoA反应（Brasen以及Schonheit，同上（2004））。定向进化或工程可用以改性这种酶以于宿主生物的生理温度下运行。来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌以及耐超高温热棒菌的酶均已被克隆，功能表达以及表征于大肠杆菌(Brasen和Schonheit,同上2004;Musfeldt和Schonheit,J.Bacteriol.184:636-644(2002))。附加的候选酶包括由大肠杆菌的sucCD编码的琥珀酰-CoA合成酶(Buck等人,Biochemistry24:6245-6252(1985))以及来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA连接酶(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。上述蛋白质列表如下。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
acs AAC77039.1 1790505 大肠杆菌
acoE AAA21945.1 141890 富养罗尔斯通氏菌
acs1 ABC87079.1 86169671 热自养甲烷杆菌
acs1 AAL23099.1 16422835 肠沙门氏菌
ACS1 Q01574.2 257050994 酿酒酵母
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古生球菌
scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌
PAE3250 NP_560604.1 18313937 耐超高温热棒菌菌株IM2
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
合成被还原的发酵产物（如甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯）的微生物细胞的每C-mol底物的产物收率受碳水化合物原料中不足还原当量的限制。还原当量或电子可以分别利用一氧化碳脱氢酶（CODH）以及氢化酶提取自合成气体组分（如CO和H2）。该还原当量然后被传送到受体，如被氧化的铁氧还蛋白、被氧化的醌类、被氧化的细胞色素、NAD(P)+、水或过氧化氢，以分别形成被还原的铁氧还蛋白、被还原的醌类、被还原的细胞色素、NAD(P)H、H2或水。被还原的铁氧还蛋白和NAD(P)H是特别有用的，因为它们可以作为用于各种Wood-Ljungdahl途径以及还原TCA循环酶的氧化还原载体。
CO和/或H2的附加氧化还原可用性可以改善被还原的产物（如甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯）的收率。在有氧条件下经由本文披露的途径从葡萄糖生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的最大理论收率是1.33molMAA/mol葡萄糖：
C6H12O6→1.33C4H6O2+0.67CO2+2H2O
当糖和合成气的原料均可得时，可以通过采用氢化酶以及CO脱氢酶利用合成气组分CO和H2生成还原当量。将利用生成自合成气组分的还原当量驱动葡萄糖到甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生产途径。从理论上讲，葡萄糖中的所有碳将被保存，从而如本文所述，在有氧的或厌氧条件下按2mol甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯/mol葡萄糖的最大理论收率从葡萄糖生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯。
C6H12O6+2CO2+6H2→2C4H6O2+6H2O
或者
1C6H12O6+2CO+4H2→2C4H6O2+4H2O
如上述实施例中所示，其中合成气结合基于糖的原料或其他碳底物的联合原料策略可以极大地改善理论收率。在这种共投料（co-feeding）方法中，可以通过氢化酶以及CO脱氢酶利用合成气组分H2和CO以生成可用以驱动化学生产途径的还原当量，其中来自糖或其他碳底物的碳将被最大程度地保存以及理论收率得以改善。在从葡萄糖或糖生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的情况下，理论收率从1.33mol甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯/mol葡萄糖改善到2mol甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯/mol葡萄糖。这类改善提供环境和经济益处以及极大地提高了可持续性化学生产。
本文描述了用于从合成气组分提取氧化还原剂的酶以及对应的基因。CODH是在消耗或获取电子的情况下执行CO和CO2相互转化的可逆酶。CODH在ACS/CODH复合体中的自然生理作用是将CO2转化为CO以通过乙酰基-CoA合酶并入乙酰基-CoA。然而，这类CODH酶适于从CO提取还原当量，因为这类酶具有可逆性。不存在ACS时表达这类CODH酶使得它们能够按与其自然生理作用相反的方向运行（即CO氧化）。
在热醋穆尔氏菌、生氢氧化碳嗜热菌、梭菌属carboxidivorans P7以及几种其他生物中，附加的CODH编码基因位于ACS/CODH操纵子的外部。这些酶提供用于从一氧化碳到二氧化碳的转化中提取电子（或还原当量）的手段。热醋穆尔氏菌基因（Genbank登录号:YP_430813）通过自身表达于操纵子中以及被认为，在“乒乓”反应中将电子从CO转移到外部介体，像铁氧还蛋白。该被还原的介体然后耦合其他被还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD(P)H)载体或依赖铁氧还蛋白的细胞过程(Ragsdale,Annalsof the New York Academy of Sciences1125:129–136(2008))。编码生氢氧化碳嗜热菌CODH-II以及CooF（一种邻接蛋白质）的基因被克隆以及测序(Gonzalez和Robb,FEMS Microbiol Lett.191:243-247(2000))。所得的复合体是膜结合的，虽然CODH-II的细胞质组分显示催化表明具有合成代谢作用的NADPH的形成(Svetlitchnyi等人,J Bacteriol.183:5134-5144(2001))。CODH-II的晶体结构也是可得的(Dobbek等人,Science293:1281-1285(2001))。类似不含ACS的CODH酶可以发现于各种大量的生物中，包括金属还原地杆菌GS-15、褐杆状绿菌DSM266、解纤维素梭菌H10、脱硫脱硫弧菌亚种脱硫菌株ATCC27774、暗杆菌属carbinolicus DSM2380以及曲形弯曲杆菌525.92。
在某些情况下，编码氢化酶的基因的位置邻接CODH。在深红红螺菌中，经编码的CODH/氢化酶蛋白质形成膜结合的酶复合体，该复合体已表明是这样的位点，其中质子梯度形式的能量从CO和H2O到CO2和H2的转化中生成(Fox等人,J Bacteriol.178:6200-6208(1996))。生氢氧化碳嗜热菌的CODH-I及其邻接基因已被提议基于它们与深红红螺菌CODH/氢化酶基因簇的相似性催化类似的功能作用(Wu等人,PLoS Genet.1:e65(2005))。生氢氧化碳嗜热菌CODH-I还显示当连接到电极时具有强烈的CO氧化和CO2还原活性(Parkin等人,J Am.Chem.Soc.129:10328-10329(2007))。示例性CODH以及氢化酶基因的蛋白质序列可以通过如下的GenBank登录号确认。
编码高达四种氢化酶的多种基因对大肠杆菌以及其他肠细菌来说是原生的(Sawers,G.,Antonie Van Leeuwenhoek66:57-88(1994);Sawers等人,JBacteriol.164:1324-1331(1985);Sawers和Boxer,Eur.J Biochem.156:265-275(1986);Sawers等人,J Bacteriol.168:398-404(1986))。考虑到酶活性的多样性，大肠杆菌或另一宿主生物可以提供足以裂解进入的分子氢以及还原对应受体的氢化酶活性。大肠杆菌具有分别由hyaABCDEF以及hybOABCDEFG基因簇编码的两种摄取氢化酶Hyd-1和Hyd-2(Lukey等人,How E.coli is equipped to oxidize hydrogen under different redox conditions,JBiol Chem在线公开,2009年11月16日)。Hyd-1是耐氧的，不可逆的，以及经由hyaC细胞色素耦合到醌还原。Hyd-2对O2灵敏，是可逆的，以及将电子转移到周质铁氧还蛋白hybA，其反过来经由hybB完整的膜蛋白质还原醌。被还原的醌类可以用作TCA循环的还原分支中富马酸还原酶的电子来源。被还原的铁氧还蛋白可以通过酶（如NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶）被用以生成NADPH或NADH。它们可以替代性地被用作反应的电子供体，如丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶、AKG铁氧还蛋白氧化还原酶以及5,10-亚甲基-H4叶酸还原酶。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
HyaA AAC74057.1 1787206 大肠杆菌
HyaB AAC74058.1 1787207 大肠杆菌
HyaC AAC74059.1 1787208 大肠杆菌
HyaD AAC74060.1 1787209 大肠杆菌
HyaE AAC74061.1 1787210 大肠杆菌
HyaF AAC74062.1 1787211 大肠杆菌
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
HybO AAC76033.1 1789371 大肠杆菌
HybA AAC76032.1 1789370 大肠杆菌
HybB AAC76031.1 2367183 大肠杆菌
HybC AAC76030.1 1789368 大肠杆菌
HybD AAC76029.1 1789367 大肠杆菌
HybE AAC76028.1 1789366 大肠杆菌
HybF AAC76027.1 1789365 大肠杆菌
HybG AAC76026.1 1789364 大肠杆菌
大肠杆菌的氢-裂解酶***包括氢化酶3，一种将铁氧还蛋白用作受体的膜结合的酶复合体；以及氢化酶4，其还使用铁氧还蛋白受体。氢化酶3以及氢化酶4分别由hyc以及hyf基因簇编码。氢化酶3已经显示是可逆的酶(Maeda等人,Appl Microbiol Biotechnol76(5):1035-42(2007))。大肠杆菌中的氢化酶活性还依赖于hyp基因的表达，该基因的对应蛋白质在氢化酶复合体的装配体中被涉及(Jacobi等人,Arch.Microbiol158:444-451(1992);Rangarajan等人,J.Bacteriol.190:1447-1458(2008))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
HycA NP_417205 16130632 大肠杆菌
HycB NP_417204 16130631 大肠杆菌
HycC NP_417203 16130630 大肠杆菌
HycD NP_417202 16130629 大肠杆菌
HycE NP_417201 16130628 大肠杆菌
HycF NP_417200 16130627 大肠杆菌
HycG NP_417199 16130626 大肠杆菌
HycH NP_417198 16130625 大肠杆菌
HycI NP_417197 16130624 大肠杆菌
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
HyfA NP_416976 90111444 大肠杆菌
HyfB NP_416977 16130407 大肠杆菌
HyfC NP_416978 90111445 大肠杆菌
HyfD NP_416979 16130409 大肠杆菌
HyfE NP_416980 16130410 大肠杆菌
HyfF NP_416981 16130411 大肠杆菌
HyfG NP_416982 16130412 大肠杆菌
HyfH NP_416983 16130413 大肠杆菌
HyfI NP_416984 16130414 大肠杆菌
HyfJ NP_416985 90111446 大肠杆菌
HyfR NP_416986 90111447 大肠杆菌
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
HypA NP_417206 16130633 大肠杆菌
HypB NP_417207 16130634 大肠杆菌
HypC NP_417208 16130635 大肠杆菌
HypD NP_417209 16130636 大肠杆菌
HypE NP_417210 226524740 大肠杆菌
HypF NP_417192 16130619 大肠杆菌
热醋穆尔氏菌氢化酶适用于缺乏足够内源性氢化酶活性的宿主。热醋穆尔氏菌可以将CO2作为唯一碳源而生长，这表明还原当量从H2中提取以经由Wood-Ljungdahl途径实现乙酰基-CoA合成(Drake,H.L.,J.Bacteriol.150:702-709(1982);Drake和Daniel,Res.Microbiol.155:869-883(2004);Kellum和Drake,J.Bacteriol.160:466-469(1984))（见图12和图13）。热醋穆尔氏菌具有来自大肠杆菌的几种hyp、hyc以及hyf基因的同系物。通过如下GenBank登录号确认由这些基因编码的蛋白质序列。
热醋穆尔氏菌中，其基因与大肠杆菌hyp基因同源的蛋白质显示如下。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
Moth_2175 YP_431007 83590998 热醋穆尔氏菌
Moth_2176 YP_431008 83590999 热醋穆尔氏菌
Moth_2177 YP_431009 83591000 热醋穆尔氏菌
Moth_2178 YP_431010 83591001 热醋穆尔氏菌
Moth_2179 YP_431011 83591002 热醋穆尔氏菌
Moth_2180 YP_431012 83591003 热醋穆尔氏菌
Moth_2181 YP_431013 83591004 热醋穆尔氏菌
热醋穆尔氏菌中，与大肠杆菌氢化酶3和/或4蛋白质同源的蛋白质如下所列。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
Moth_2182 YP_431014 83591005 热醋穆尔氏菌
Moth_2183 YP_431015 83591006 热醋穆尔氏菌
Moth_2184 YP_431016 83591007 热醋穆尔氏菌
Moth_2185 YP_431017 83591008 热醋穆尔氏菌
Moth_2186 YP_431018 83591009 热醋穆尔氏菌
Moth_2187 YP_431019 83591010 热醋穆尔氏菌
Moth_2188 YP_431020 83591011 热醋穆尔氏菌
Moth_2189 YP_431021 83591012 热醋穆尔氏菌
Moth_2190 YP_431022 83591013 热醋穆尔氏菌
Moth_2191 YP_431023 83591014 热醋穆尔氏菌
Moth_2192 YP_431024 83591015 热醋穆尔氏菌
另外，编码氢化酶功能的几种基因簇存在于热醋穆尔氏菌及其对应的蛋白质序列提供如下。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
Moth_0439 YP_429313 83589304 热醋穆尔氏菌
Moth_0440 YP_429314 83589305 热醋穆尔氏菌
Moth_0441 YP_429315 83589306 热醋穆尔氏菌
Moth_0442 YP_429316 83589307 热醋穆尔氏菌
Moth_0809 YP_429670 83589661 热醋穆尔氏菌
Moth_0810 YP_429671 83589662 热醋穆尔氏菌
Moth_0811 YP_429672 83589663 热醋穆尔氏菌
Moth_0812 YP_429673 83589664 热醋穆尔氏菌
Moth_0814 YP_429674 83589665 热醋穆尔氏菌
Moth_0815 YP_429675 83589666 热醋穆尔氏菌
Moth_0816 YP_429676 83589667 热醋穆尔氏菌
Moth_1193 YP_430050 83590041 热醋穆尔氏菌
Moth_1194 YP_430051 83590042 热醋穆尔氏菌
Moth_1195 YP_430052 83590043 热醋穆尔氏菌
Moth_1196 YP_430053 83590044 热醋穆尔氏菌
Moth_1717 YP_430562 83590553 热醋穆尔氏菌
Moth_1718 YP_430563 83590554 热醋穆尔氏菌
Moth_1719 YP_430564 83590555 热醋穆尔氏菌
Moth_1883 YP_430726 83590717 热醋穆尔氏菌
Moth_1884 YP_430727 83590718 热醋穆尔氏菌
Moth_1885 YP_430728 83590719 热醋穆尔氏菌
Moth_1886 YP_430729 83590720 热醋穆尔氏菌
Moth_1887 YP_430730 83590721 热醋穆尔氏菌
Moth_1888 YP_430731 83590722 热醋穆尔氏菌
Moth_1452 YP_430305 83590296 热醋穆尔氏菌
Moth_1453 YP_430306 83590297 热醋穆尔氏菌
Moth_1454 YP_430307 83590298 热醋穆尔氏菌
富养罗尔斯通氏菌H16将氢作为能量源，将氧作为末端电子受体。其膜结合的摄取[NiFe]-氢化酶是周质朝向的以及经由b型细胞色素连接到呼吸链(Schink和Schlegel,Biochim.Biophys.Acta,567,315-324(1979);Bernhard等人,Eur.J.Biochem.248,179–186(1997))的“耐O2”的氢化酶(Cracknell,等人Proc Nat Acad Sci,106(49)20681-20686(2009))。富养罗尔斯通氏菌还包含由Hox操纵子编码的作为细胞质并直接消耗氢而还原NAD+的耐O2的可溶氢化酶(Schneider和Schlegel,Biochim.Biophys.Acta452,66–80(1976);Burgdorf,J.Bact.187(9)3122-3132(2005))。此外，可溶氢化酶存在于几种其他生物中，包括硫还原地杆菌(Coppi,Microbiology151,1239–1254(2005))、集胞蓝细菌属菌株PCC6803(Germer,J.Biol.Chem.,284(52),36462–36472(2009))以及桃红荚硫菌(Rakhely,Appl.Environ.Microbiol.70(2)722–728(2004))。集胞蓝细菌属酶能够从氢生成NADPH。来自集胞蓝细菌属菌株PCC6803的Hox操纵子以及由来自念珠蓝细菌属PCC7120的Hyp操纵子编码的附加基因的过表达导致仅与Hox基因的表达相比，氢化酶活性得以增加(Germer,J.Biol.Chem.284(52),36462–36472(2009))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
HoxF NP_942727.1 38637753 富养罗尔斯通氏菌H16
HoxU NP_942728.1 38637754 富养罗尔斯通氏菌H16
HoxY NP_942729.1 38637755 富养罗尔斯通氏菌H16
HoxH NP_942730.1 38637756 富养罗尔斯通氏菌H16
HoxW NP_942731.1 38637757 富养罗尔斯通氏菌H16
HoxI NP_942732.1 38637758 富养罗尔斯通氏菌H16
HoxE NP_953767.1 39997816 硫还原地杆菌
HoxF NP_953766.1 39997815 硫还原地杆菌
HoxU NP_953765.1 39997814 硫还原地杆菌
HoxY NP_953764.1 39997813 硫还原地杆菌
HoxH NP_953763.1 39997812 硫还原地杆菌
GSU2717 NP_953762.1 39997811 硫还原地杆菌
HoxE NP_441418.1 16330690 集胞蓝细菌属菌株PCC6803
HoxF NP_441417.1 16330689 集胞蓝细菌属菌株PCC6803
功能未知 NP_441416.1 16330688 集胞蓝细菌属菌株PCC6803
HoxU NP_441415.1 16330687 集胞蓝细菌属菌株PCC6803
HoxY NP_441414.1 16330686 集胞蓝细菌属菌株PCC6803
功能未知 NP_441413.1 16330685 集胞蓝细菌属菌株PCC6803
功能未知 NP_441412.1 16330684 集胞蓝细菌属菌株PCC6803
HoxH NP_441411.1 16330683 集胞蓝细菌属菌株PCC6803
HypF NP_484737.1 17228189 念珠蓝细菌属PCC7120
HypC NP_484738.1 17228190 念珠蓝细菌属PCC7120
HypD NP_484739.1 17228191 念珠蓝细菌属PCC7120
功能未知 NP_484740.1 17228192 念珠蓝细菌属PCC7120
HypE NP_484741.1 17228193 念珠蓝细菌属PCC7120
HypA NP_484742.1 17228194 念珠蓝细菌属PCC7120
HypB NP_484743.1 17228195 念珠蓝细菌属PCC7120
Hox1E AAP50519.1 37787351 桃红荚硫菌
Hox1F AAP50520.1 37787352 桃红荚硫菌
Hox1U AAP50521.1 37787353 桃红荚硫菌
Hox1Y AAP50522.1 37787354 桃红荚硫菌
Hox1H AAP50523.1 37787355 桃红荚硫菌
下文描述了几种用于固定二氧化碳到丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸以形成TCA循环中间体草酰乙酸或苹果酸的几种酶以及对应的基因。
磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸的羧基化通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化。示例性PEP羧化酶由大肠杆菌中的ppc(Kai等人,Arch.Biochem.Biophys.414:170-179(2003))、扭脱甲基杆菌AM1中的ppcA(Arps等人,J.Bacteriol.175:3776-3783(1993))以及谷氨酸棒杆菌中的ppc(Eikmanns等人,Mol.Gen.Genet.218:330-339(1989))编码。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
Ppc NP_418391 16131794 大肠杆菌
ppcA AAB58883 28572162 扭脱甲基杆菌
Ppc ABB53270 80973080 谷氨酸棒杆菌
用于将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的替代性酶是PEP羧激酶，其在羧基化PEP的同时形成ATP。在大多数生物中，PEP羧激酶起葡萄糖异生的功能以及将草酰乙酸转化为PEP并消耗一份ATP。酿酒酵母是一种这样的生物，其原生PEP羧激酶PCK1起葡萄糖异生作用(Valdes-Hevia等人,FEBS Lett.258:313-316(1989))。大肠杆菌是另一种这样的生物，因为PEP羧激酶在生产草酰乙酸中的作用被认为相比于不形成ATP的PEP羧化酶是次要的，这可能是由于PEP羧激酶碳酸氢钠的Km较高(Kim等人,Appl.Environ.Microbiol.70:1238-1241(2004))。然而，原生大肠杆菌PEP羧激酶从PEP到草酰乙酸的活性最近已在大肠杆菌K-12的ppc突变体中得到证实(Kwon等人,J.Microbiol.Biotechnol.16:1448-1452(2006))。这些菌株表现出没有生长缺陷以及已经以高NaHCO3浓度提高了琥珀酸产量。适应性进化后，大肠杆菌的突变株可以采用Pck作为主导CO2固定酶（Zhang等人，2009）。在某些生物，尤其是瘤胃细菌中，PEP羧激酶在从PEP到草酰乙酸的生产以及ATP的生成中非常有效。已被克隆进入大肠杆菌的PEP羧激酶基因的例子包括那些来自产琥珀酸曼氏杆菌(Lee等人,Biotechnol.Bioprocess Eng.7:95-99(2002))，产琥珀酸厌氧螺菌(Laivenieks等人,Appl.Environ.Microbiol.63:2273-2280(1997))以及琥珀酸放线杆菌（Kim等人.同上）的例子。由流感嗜血杆菌编码的PEP羧激酶在从PEP到草酰乙酸的形成中有效。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
PCK1 NP_013023 6322950 酿酒酵母
pck NP_417862.1 16131280 大肠杆菌
pckA YP_089485.1 52426348 产琥珀酸曼氏杆菌
pckA O09460.1 3122621 产琥珀酸厌氧螺菌
pckA Q6W6X5 75440571 琥珀酸放线杆菌
pckA P43923.1 1172573 流感嗜血杆菌
丙酮酸羧化酶（EC6.4.1.1）直接将丙酮酸转化为草酰乙酸并消耗一份ATP。丙酮酸羧化酶由酿酒酵母中的PYC1(Walker等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.176:1210-1217(1991))和PYC2（Walker等人，同上），以及***垢分支杆菌中的pyc(Mukhopadhyay和Purwantini,Biochim.Biophys.Acta1475:191-206(2000))编码。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
PYC1 NP_011453 6321376 酿酒酵母
PYC2 NP_009777 6319695 酿酒酵母
Pyc YP_890857.1 118470447 ***垢分支杆菌
苹果酸酶可以应用于将CO2以及丙酮酸转化为苹果酸并消耗一份还原当量。用于此目的的苹果酸酶可以包括但不仅限于苹果酸酶（依赖NAD的）以及苹果酸酶（依赖NADP的）。例如，大肠杆菌苹果酸酶的一种(Takeo,J.Biochem.66:379-387(1969))或具有较高活性的类似酶可以被表达以实现丙酮酸以及CO2到苹果酸的转化。通过将碳固定到与PEP相对的丙酮酸，苹果酸酶使得来自PEP的高能量磷酸键能够通过丙酮酸激酶得以保存，从而在丙酮酸的形成中或通过用于葡萄糖转运的磷酸转移酶***生成ATP。虽然通常认为苹果酸酶按从苹果酸形成丙酮酸的方向运行，由maeA编码的依赖NAD的酶的过表达已被证实提高大肠杆菌中琥珀酸产量，同时通过按碳固定方向运行在厌氧条件下恢复致死的Δpfl-ΔldhA表型(Stols和Donnelly,Appl.Environ.Microbiol.63(7)2695-2701(1997))。对来自猪蛔虫的苹果酸酶在大肠杆菌中的过表达进行类似的观察(Stols等人,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65(1),153-158(1997))。由maeB编码的第二大肠杆菌苹果酸酶是依赖NADP的以及还对草酰乙酸以及其他α-酮酸脱羧(Iwakura等人,J.Biochem.85(5):1355-65(1979))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
maeA NP_415996 90111281 大肠杆菌
maeB NP_416958 16130388 大肠杆菌
NAD-ME P27443 126732 猪蛔虫
用于经由TCA循环的还原分支将草酰乙酸（形成自，例如，PEP羧化酶、PEP羧激酶或丙酮酸羧化酶）或苹果酸（形成自，例如，苹果酸酶或苹果酸脱氢酶）转化为琥珀酰-CoA的酶是苹果酸脱氢酶、富马酸脱水酶（富马酸酶）、富马酸还原酶以及琥珀酰-CoA转移酶。针对每种所述酶的基因如上文所述。
用于将从琥珀酰-CoA到各种产物的途径设计入微生物的酶、基因以及方法目前为本领域已知。如本文所披露，当利用基于碳水化合物的原料时，从CO和/或H2中获得的附加还原当量改善甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的收率。例如，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯可以产生自琥珀酰-CoA（见附图）。用于琥珀酰-CoA到甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的转化的示例性酶包括本文披露的酶。
用于将从糖酵解中间体到各种产物的途径设计入微生物的酶、基因以及方法为本领域已知。如本文所述，从CO和/或H2中获得的附加还原当量改善碳水化合物上所有这些产物的收率。例如，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯可以产生自糖酵解中间体琥珀酸。用于琥珀酸到MAA的转化的示例性酶包括琥珀酰-CoA转移酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA还原酶（醛形成）、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰基酶、琥珀酸还原酶、琥珀酰-CoA还原酶（醇形成）、4-羟基丁酰基-CoA合成酶、4-羟基丁酰基-CoA转移酶、4-羟基丁酰基-CoA变位酶、3-羟基异丁酰基-CoA合成酶、3-羟基异丁酰基-CoA转移酶、3-羟基异丁酰基-CoA水解酶、3-羟基异丁酸酯脱水酶、3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶、异丁烯酰基-CoA合成酶、异丁烯酰基-CoA转移酶以及异丁烯酰基-CoA水解酶。
实施例XVI
用于处理CO以及厌氧培养的方法
本实施例描述了处理CO以及厌氧培养中所用的方法。
A.用于测定和小规模培养的少量CO的处理.CO是一种无臭、无色且无味的毒性气体。因此，利用CO的培养和测定需要特殊处理。一些测定（包括CO氧化、乙酰基-CoA合成、利用肌红蛋白的CO浓度、小批量培养中的CO耐受/利用）需要在通风橱内进行分配和处理的少量CO气体。生化分析需要用CO使极少量的（<2mL）生化测定培养基或缓冲液饱和，然后进行测定。所有的CO处理步骤在具有适当高度的窗扇设定以及打开鼓风机的通风橱中进行；CO从与Schlenk线连接的压缩气瓶和调节器中分配。后者保证等浓度的CO被分配到几种可能的比色杯或小瓶中的每一个。设立的Schlenk线在输入侧含有氧洗涤器以及在另一侧含有油压释放鼓泡器和通风孔。测定比色杯是厌氧，也是含CO的。因此，用橡皮塞密封测定比色杯以及使用不透气的针头和注射器添加或移除试剂。其次，在密塞的血清小瓶中CO饱和的条件下培育少量（约50mL）培养物。与生化分析一样，在使用Schlenk线设置的通风橱中平衡CO饱和的微生物培养。生化分析和微生物培养均在便携、密封的容器中以及是小批量的，有助于通风橱外部的安全处理。压缩的CO罐与通风橱相邻。
通常情况下，Schlenk线被用于分配CO到比色杯，每根线皆通风。用19或20量计的一次性注射器针头刺穿比色杯上的橡皮塞并用相同器具通风。油鼓泡器与CO罐和氧洗涤器一起使用。玻璃或石英分光光度计比色杯的顶部有圆孔，其中安装有Kontes塞套Sz7774250-0007。将CO检测器单元置于通风橱的近端。
B.投入大规模培养的大量CO的处理.在发酵生产中，CO或CO和H2的混合物被投入发酵培养，以模拟作为原料的合成气。因此，量在1升到几升范围的细胞可以包括被加入以增加介质中CO的溶解浓度的CO气体。在这些情况下，向培养物中添加连续施用的相当大量的CO气体。在不同的点，收获培养物或除去样品。替代性地，用作为发酵罐一部分的集成连续流离心机收获细胞。
在厌氧条件下进行发酵过程。在某些情况下，将氧气或空气泵入发酵罐来确保有足够的氧饱和度，以提供呼吸环境是不经济的。另外，厌氧发酵过程中生成的还原力可能为产物的形成而非呼吸所需。此外，用于不同途径的许多酶都在不同程度上对氧灵敏。经典的产乙酸菌（如热醋穆尔氏菌）是专性厌氧菌以及Wood-Ljungdahl途径中的酶对通过分子氧的不可逆灭活作用是高度敏感。虽然有耐氧产乙酸菌，Wood-Ljungdahl途径中酶的所有组成成分在氧气的存在下可能是不配伍的，因为大多数是金属酶，关键组分是铁氧还蛋白，以及调节可以使新陈代谢远离Wood-Ljungdahl途径以使能量采集最大化。同时，培养物中的细胞作为氧清除剂起作用，该氧清除剂缓和存在大型细胞培育时对极端措施的需要。
C.厌氧培养室和条件。示例性厌氧培养室可以从市场上购得（见，例如，加利福尼亚州霍桑的Vacuum Atmospheres Company；马萨诸塞州纽伯里波特的MBraun）。条件包括1ppm或以下的O2浓度和1个大气压的纯N2。在一个实施例中，使用了3个氧洗涤器/催化剂再生器，以及该培养室包括O2电极（如加利福尼亚州工业市的Teledyne）。几乎所有的项目和试剂都在该培养室的气锁中循环四次，然后打开内室门。在引入该培养室之前，用纯N2对体积>5mL的试剂鼓泡。手套更换频率为2次/年，以及当该培养室显示出对氧含量的变化反应越来越迟钝时，定期回收催化剂容器。通过螺线管启动的单向阀控制该培养室的压力。此结构元件允许以高于周围环境的水平设置室压以允许非常小的管转移通过排压阀。
厌氧培养室达到了一贯非常低的以及对氧高度灵敏的厌氧条件所需的O2含量。然而，细胞的生长和处理通常并不需要这样的预防措施。在替代性厌氧培养室配置中，可以将铂或钯作为在混合物中需要一些氢气的催化剂。可以通过鼓泡器，而不使用螺线管阀控制压力释放。不使用基于仪器的O2监测，转而可以使用测试条。
D.厌氧微生物学.如上所述对小型培养进行CO处理。具体地，血清或培养基瓶配有厚厚的橡皮塞以及用铝钳口盖密封瓶子。以常规方式制作培养基（如Terrific Broth）并分装到大小适当的血清瓶中。用氮气喷射瓶子～30分钟进行中度鼓泡。这从培养基中除去大部分的氧，并且在此步骤之后，用橡皮塞（如新泽西州瓦恩兰Bellco公司的Bellco20mm垫片塞）和钳口密封盖（Bellco20mm）盖好每个瓶子。然后，利用慢速（液体）排气周期对培养基的瓶子高压灭菌。至少有时，可以用针戳穿塞子以在高压灭菌过程中实现排气；从高压灭菌器中取出后，需要立即除去所述针。通过注射器和针将剩余的培养基成组分（例如缓冲液或抗生素）加入无菌培养基。加入还原剂之前，用氮气（或取决于用途，用CO）平衡瓶子30-60分钟。添加还原剂，如100×150mM硫化钠，200mM的半胱氨酸-HCl。这通过如下制作：称取硫化钠放入干燥的烧杯中并称取半胱氨酸放入血清瓶中，将所述烧杯和血清瓶放入厌氧培养室，将硫化钠溶解于厌氧水，然后将其加入血清瓶中的半胱氨酸中。当硫化钠溶液接触半胱氨酸后生成硫化氢气体时立即塞好瓶子。当注入培养物时，用注射器式滤器来消毒溶液。通过注射器针头添加其他组分，如B12（10μM氰钴胺素）、氯化镍（在培养室厌氧水中通过40mM原液制作成20μM最终浓度并通过高压灭菌或在注入培养物后通过使用注射器式滤器灭菌的NiCl2）和硫酸亚铁铵（所需最终浓度为100μM—在培养室厌氧水中作为100-1000x的原液制作并通过高压灭菌或在注入培养物后通过使用注射器式滤器灭菌）。用厌氧条件下培育的50mL预培养物接种1L的瓶子，以便在厌氧条件下更快地培育。通过添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至最终浓度0.2mM对载体中的pA1-lacO1启动子进行诱导约3小时。
可以使用连续加气同时鼓泡而在较大的瓶中进行大规模培养物培育。带有金属鼓泡器的橡皮塞在培养基添加之后被置于瓶内并用氮气喷射30分钟或更长时间，然后设置瓶子的其余部分。将所有的瓶子放在一起，以便无菌滤器会对鼓泡的气体消毒以及瓶子上的软管可用小的C形进行压缩。用磁搅拌棒搅拌培养基和细胞。一旦添加了所有的培养基组分和细胞，在室内空气中（但向瓶子中持续喷射氮）于孵化器中孵育瓶子。
实施例XVIII
CO氧化（CODH）测定
本实施例描述了用于测量CO氧化（CO脱氢酶；CODH）的测定方法。
热醋穆尔氏菌的7基因CODH/ACS操纵子被克隆入大肠杆菌表达载体。完整的～10kbp DNA片段被克隆，以及很可能的是，这一区域的一些基因表达自其自身的内源性启动子以及都含有内源性核糖体结合位点。使用定量测量CODH活性的测定法对这些克隆体进行CO氧化测定。热醋穆尔氏菌基因产物的抗血清被用于Western印迹法以估算比活度。热醋穆尔氏菌是革兰氏阳性的，以及预期，核糖体结合位点元素在大肠杆菌中起良好作用。这种活度在下文进行更详细的描述，估计为热醋穆尔氏菌比活度的～1/50。可能的是，重组大肠杆菌细胞的CODH活性受热醋穆尔氏菌酶具有的最佳温度约为55℃这个事实的限制。因此，嗜常温的CODH/ACS途径可能是有利的，如穆尔氏菌属嗜常温的以及确实具有显然完整的CODH/ACS操纵子和Wood-Ljungdahl途径的近亲苛本哈根脱亚硫酸菌（Desulfitobacterium hafniense）。作为潜在宿主生物的产乙酸菌属包括，但不仅限于，深红红螺菌、热醋穆尔氏菌和苛本哈根脱亚硫酸菌。
CO氧化是CODH/ACS测定中最敏感和最强大的。很可能的是，使用基于大肠杆菌的合成气的***将最终需要与梭菌（即穆尔氏菌）***差不多一样厌氧（特别针对最大活性的情况）。CODH的改进应该是可能的，但最终将受限于CO气体在水中的溶解度。
最初，将各基因分别克隆入表达载体中。生成用于多个亚基/1个复合体的联合表达单元。测定大肠杆菌中蛋白质水平的表达。制成联合热醋穆尔氏菌CODH/ACS操纵子和单个表达克隆体采用。
CO氧化测定.这种测定是测定Wood-Ljungdahl途径内酶活性的简单、可靠且更具多功能的方法之一以及测试CODH(Seravalli等人,Biochemistry43:3944-3955(2004))。热醋穆尔氏菌CODH比活度的典型活度是55℃时500U或25℃时～60U。本测定采用在CO的存在下还原甲基紫精。这在厌氧塞好的玻璃比色杯中578nm处测量。
更详细地，先在去离子水中将比色杯清洗四次以及用丙酮清洗一次后便备好玻璃橡皮塞好的比色杯。将少量的真空润滑脂涂在橡胶垫圈顶部。用CO为比色杯充气，用22Ga.针加上排气针干燥10分钟。使用22Ga.针，加上排气针，添加体积为0.98mlL的反应缓冲液（50mM Hepes，pH值8.5，2mM二硫苏糖醇（DTT）），以及100％CO.甲基紫精（CH3紫精）原液是含于水的1M。每次测定将20mL用于20mM的最终浓度。当添加甲基紫精时，将18Ga针（局部）用作外壳以方便使用Hamilton注射器取出CH3紫精。将4-5份等分试样吸出并丢弃以清洗并气体平衡注射器。当补给CH3紫精原液以轻轻还原CH3紫精时，加入少量的连二亚硫酸钠（0.1M原液）。在加热的Olis分光光度计（Bogart GA）中将温度平衡至55℃。先运行空白反应（blank reaction）（CH3紫精+缓冲液）以测量CH3紫精还原的基准速率。大肠杆菌细胞粗提物是ACS90和ACS91（分别具有和不具有第一cooC的热醋穆尔氏菌的CODH-ACS操纵子）。10μL提取物被一次性加入，混合并测定。还原的CH3紫精变成紫色。测定的结果示于表2。
表2.粗提物CO氧化活性
ACS90 7.7mg/ml ACS91 11.8mg/ml
Mta98 9.8mg/ml Mta99 11.2mg/ml
提取物 体积 OD/ U/ml U/mg
ACS90 10μL 0.073 0.376 0.049
ACS91 10μL 0.096 0.494 0.042
Mta99 10μL 0.0031 0.016 0.0014
ACS90 10μL 0.099 0.51 0.066
Mta99 25μL 0.012 0.025 0.0022
ACS91 25μL 0.215 0.443 0.037
Mta98 25μL 0.019 0.039 0.004
ACS91 10μL 0.129 0.66 0.056
平均
ACS90 0.057U/mg
ACS91 0.045U/mg
Mta99 0.0018U/mg
Mta98/Mta99是表达来自热醋穆尔氏菌的醇甲基转移酶基因的大肠杆菌MG1655菌株，因此对包含热醋穆尔氏菌CODH操纵子的ACS90ACS91大肠杆菌菌株来说是阴性对照物。
如果细胞蛋白质的～1%是CODH，则这些数据将比纯热醋穆尔氏菌CODH的500U/mg活度小大约100X。基于Western印迹法的实际估算值是细胞蛋白质的0.5%，因此活度比热醋穆尔氏菌CODH的小大约50X。然而，该项实验证实了重组大肠杆菌中的CO氧化活度，而阴性对照物中的量则小得多。阴性对照物中所见的少量CO氧化（CH3紫精还原）表明，大肠杆菌可能具有有限的还原CH3紫精的能力。
为评价CODH以及Mtr蛋白质的最终浓度，Western印迹分析之后，对CO氧化、ACS、甲基转移酶以及类咕啉Fe-S测定中所用的相同细胞提取物执行SDS-PAGE。所用的抗血清源于经纯化的热醋穆尔氏菌CODH-ACS和Mtr蛋白质的多克隆以及利用连接有碱性磷酸酶的山羊抗兔第二抗体显影。执行Western印迹法，结果如图14所示。与对照物泳道比较，ACS90以及ACS91中CODH的量估算为50ng。经由Western印迹分析确认包括2个CODH亚基的CODH-ACS操纵子基因的表达和甲基转移酶。因此，重组大肠杆菌细胞表达7基因操纵子的多个组分。另外，在相同的重组大肠杆菌细胞中，甲基转移酶以及类咕啉铁硫蛋白质具有活性。这些蛋白质是被克隆入相同细胞的相同操纵子的一部分。
将热醋穆尔氏菌细胞的提取物用作阳性对照物而重复CO氧化测定。虽然大肠杆菌ACS90以及ACS91中的CODH活度是可测量的，但是与热醋穆尔氏菌对照物相比，其低约130–150X。该测定的结果如图15所示。简言之，如上所述，培育了细胞（具有CODH/ACS操纵子的热醋穆尔氏菌或大肠杆菌；ACS90或ACS91或空载体:pZA33S）以及制备了提取物。如上所述，在制备提取物当天的不同时间，在55℃执行测定。随后，在120sec时间过程后，在578nm处甲基紫精还原。
这些结果描述了CO氧化（CODH）测定以及结果。如通过甲基紫精还原测定所测量，重组大肠杆菌细胞表达了CO氧化活性。
实施例XVIII
大肠杆菌CO耐受性实验以及CO浓度测定（肌红蛋白测定）
本实施例描述了大肠杆菌对高浓度CO的耐受性。
为了测试大肠杆菌是否可在存在饱和量CO的厌氧条件下生长，如上所述，将培养物设定在具有50ml Terrific Broth培养基（加上还原溶液、NiCl2、Fe(II)NH4SO4、氰钴胺、IPTG和氯霉素）的120ml血清瓶中，以小体积进行厌氧微生物学处理。用氮气平衡这些瓶子的一半达30分钟，以及用CO气体平衡另一半达30分钟。将空载体（pZA33）用作对照物，以及用N2和CO测试ACS90和ACS91。全部进行接种并于37℃振荡（250rpm）培育36h。36h期间尾声，对***检查显示全部大量生长。所观察到的生长的大部分在长时间的耽搁后过夜发生。
鉴于所有的培养物看起来在CO的存在下生长良好，确认了最终CO浓度。这通过使用肌红蛋白暴露至CO的谱移测定法进行。用连二亚硫酸钠还原的肌红蛋白在435nm处具有吸收峰；用CO将该峰转移到423nm处。由于低波长需要记录从300nm乃至以上的整个光谱，必须使用石英比色杯。CO浓度对比标准曲线测量并取决于20℃和1个大气压条件下等于970μm的CO最大水溶度的亨利定律常数。
针对CO浓度的肌红蛋白测试，如同CODH测定，比色杯用水清洗10X，用丙酮清洗1X，然后塞好。将N2吹入比色杯达～10分钟。用Hamilton注射器向空白（未用CO平衡）中加入体积为1ml的厌氧缓冲液（HEPES，pH值8.0，2mM DTT）。加入10μL肌红蛋白（～1mM—可以变化，只是需要相当大的量）和1μL连二亚硫酸钠（20mM原液）。按1μL增量添加的CO饱和缓冲液制作CO标准曲线。为每个增量记录峰值高度和漂移。测试的培养物是pZA33/CO、ACS90/CO和ACS91/CO。按1μL增量将这些培养物的每种加入相同的比色杯中。在实验中途设置并使用第二比色杯。结果示于表3。
表3.36小时一氧化碳浓度
菌株和生长条件 最终CO浓度（微摩尔）
pZA33-CO 930
ACS90-CO 638
494
734
883
平均 687
SD 164
ACS91-CO 728
812
760
611
平均 728
SD 85
表3中所示的结果表明，在CO存在下培养物或菌株是否生长。这些结果表明，大肠杆菌可以耐受在厌氧条件下暴露于CO以及表达CODH-ACS操纵子的大肠杆菌细胞可以使一些CO新陈代谢。
这些结果证明，不论是否表达CODH/ACS，大肠杆菌细胞均能够在存在饱和量CO时生长。此外，这些细胞与代替CO的氮气中的对照物同样生长良好。此实验证明，大肠杆菌的实验室菌株对在正常大气压下进行的合成气项目中可实现的水平的CO不敏感。此外，初步的实验表明，表达CODH/ACS的重组大肠杆菌细胞可能通过氧化为二氧化碳而实际消耗了一些CO。
实施例XVIX
用于经由甲基丙二酰基-CoA从琥珀酸生产MAA以及3-羟基异丁酸的途径
当利用基于碳水化合物的原料时，还原TCA循环改善甲基丙烯酸（MAA）的收率。可以通过图16A中显示的途径在重组生物中实现MAA生产。
例如，如图16A中所示，MAA和/或3-羟基异丁酸可以经由甲基丙二酰基-CoA中间体生产自琥珀酸。用于通过这种路径的从琥珀酸到MAA或3-羟基异丁酸的转化的示例性酶包括琥珀酰-CoA转移酶、琥珀酰-CoA合成酶、甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、甲基丙二酸半醛还原酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶。
在这种途径中，中央新陈代谢中间体首先被引入（channeled into）琥珀酸。对于琥珀酸的形成，磷酸烯醇丙酮酸（PEP）经由PEP羧激酶或PEP羧化酶转化为草酰乙酸。替代性地，PEP首先通过丙酮酸激酶转化为丙酮酸，然后通过甲基丙二酰基-CoA羧基转移酶或丙酮酸羧化酶转化为草酰乙酸。然后，草酰乙酸通过还原TCA循环转化为琥珀酸。
然后，琥珀酸通过琥珀酰-CoA转移酶或合成酶活化为琥珀酰-CoA。然后，甲基丙二酰基-CoA变位酶从琥珀酰-CoA形成甲基丙二酰基-CoA。然后，甲基丙二酰基-CoA还原为甲基丙二酸半醛。甲基丙二酸半醛的进一步还原产出3-羟基异丁酸，3-羟基异丁酸可以作为产物被分泌或经由脱水进一步转换为MAA。
图16A中显示的用于转换的示例性候选酶如下文所述。琥珀酰-CoA转移酶以及合成酶如前文实施例XV（RTCA循环）中所述。
甲基丙二酰基-CoA变位酶.甲基丙二酰基-CoA变位酶是将琥珀酰-CoA转化为甲基丙二酰基-CoA的依赖钴胺素的酶。在大肠杆菌中，可逆的依赖腺苷基钴胺素的变位酶参与三步骤途径，导致琥珀酸到丙酸的转化。示例性MCM酶如实施例V中所述。
替代性地，异丁酰基-CoA变位酶（ICM）可以催化所提议的转换。ICM是MCM家族中可逆地将丁酰基-CoA的碳骨架重排为异丁酰基-CoA的依赖钴胺素的甲基变位酶(Ratnatilleke,J Biol Chem.274:31679-31685(1999))。示例性ICM酶如实施例VII中所述。
甲基丙二酰基-CoA表异构酶.甲基丙二酰基-CoA表异构酶（MMCE）是使(R)-甲基丙二酰基-CoA以及(S)-甲基丙二酰基-CoA相互转化的酶。MMCE是使奇数脂肪酸以及氨基酸缬氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸断裂的基本酶。示例性MMCE酶如实施例V中所述。
甲基丙二酰基-CoA还原酶.甲基丙二酰基-CoA还原为其对应的醛甲基丙二酸半醛通过依赖CoA的醛脱氢酶催化。示例性酶如实施例V中所述。
甲基丙二酸半醛还原酶.甲基丙二酸半醛到3-羟基异丁酸酯的还原反应通过甲基丙二酸半醛还原酶或3-羟基异丁酸酯脱氢酶催化。这种酶参与缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸降解反应以及已在细菌、真核生物以及哺乳动物中得到确认。示例性甲基丙二酸半醛还原酶如实施例V中所述。
3-羟基异丁酸酯脱水酶。3-羟基异丁酸酯脱水为甲基丙烯酸通过具有3-羟基异丁酸酯脱水酶活性的酶催化。示例性3-羟基异丁酸酯脱水酶如实施例V中所述。
如图17的示例性途径中所示，活性还原TCA循环改善衍生自乙酰基-CoA的产物甲基丙烯酸（MAA）的收率。本文描述了还原TCA循环的途径以及琥珀酰-CoA到甲基丙烯酸的转化（还参见图3和图16A以及实施例V）。图17A和图17B显示示例性途径。酶催转换通过所示的酶完成。图17A示出了利用该还原TCA循环将CO2固定到琥珀酰-CoA的途径。图17B示出了从琥珀酰-CoA生物合成3-羟基异丁酸以及甲基丙烯酸的示例性途径；显示的酶催转换通过如下酶完成：A.甲基丙二酰基-CoA变位酶；B.甲基丙二酰基-CoA表异构酶；C.甲基丙二酰基-CoA还原酶；D.甲基丙二酸半醛还原酶；E.3-羟基异丁酸酯脱水酶。
实施例XX
用于经由4-羟基丁酰基-CoA从琥珀酸生产MAA以及3-羟基异丁酸的途径
当利用基于碳水化合物的原料时，还原TCA循环改善甲基丙烯酸（MAA）的收率。可以通过图16B中显示的途径在重组生物中实现MAA生产。
例如，MAA和/或3-羟基异丁酸可以通过图16B中所描绘的多个替换性路径经由4-羟基丁酰基-CoA中间体生产自琥珀酸。用于这些路径的示例性酶包括：琥珀酰-CoA转移酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA还原酶（醛形成）、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰基酶、琥珀酸还原酶、琥珀酰-CoA还原酶（醇形成）、4-羟基丁酰基-CoA合成酶、4-羟基丁酰基-CoA转移酶、4-羟基丁酰基-CoA变位酶、3-羟基异丁酰基-CoA合成酶、3-羟基异丁酰基-CoA转移酶、3-羟基异丁酰基-CoA水解酶、3-羟基异丁酸酯脱水酶、3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶、异丁烯酰基-CoA合成酶、异丁烯酰基-CoA转移酶以及异丁烯酰基-CoA水解酶。
从琥珀酸形成4-羟基丁酰基-CoA中间体通过图16B中所描绘的几种路径进行。琥珀酸首先通过CoA转移酶或合成酶转化为琥珀酰-CoA。琥珀酰-CoA然后通过依赖CoA的醛脱氢酶转化为琥珀酸半醛。或者，琥珀酸通过酸还原酶直接转化为琥珀酸半醛。琥珀酸半醛中间体通过4-羟基丁酸脱氢酶还原为4-羟基丁酸（4-HB）。双功能的醛脱氢酶/醇脱氢酶将琥珀酰-CoA直接转化为4-HB。4-HB到其酰基-CoA的活化通过CoA转移酶或合成酶催化。替代性地，4-HB可以转化为4-羟基丁酰基-磷酸中间体以及后续通过磷酸转-4-羟基丁酰基酶转换为4-HB-CoA。
4-羟基丁酰基-CoA到3-羟基异丁酰基-CoA的异构化通过4-HB-CoA甲基变位酶催化。除去3-羟基异丁酰基-CoA的CoA部分出产3-羟基异丁酸酯，其可以作为产物分泌或通过脱水进一步转换为MAA。3-羟基异丁酰基-CoA脱水为异丁烯酰基-CoA，然后通过CoA水解酶、转移酶或合成酶除去CoA部分是用于MAA形成的另一路径。
图16A和图16B中所显示的用于转换的示例性候选酶如下文所述。琥珀酰-CoA转移酶以及合成酶如前文实施例I（RTCA循环）中所述。甲基丙二酰基-CoA变位酶以及甲基丙二酰基-CoA表异构酶如实施例III中所述。候选的3-羟基异丁酸酯脱水酶如实施例III中所述。
表4示出了可以执行图16B中所描绘的步骤的酶类别。下文进一步详述了示例性酶。
表4.执行图16B中的步骤的示例性酶.
标记 功能 步骤
1.1.1.a 氧化还原酶（氧代到醇） 5
1.1.1.c CoA还原酶（醇形成） 9
1.2.1.b CoA还原酶（醛形成） 4
1.2.1.e 氧化还原酶（酸到醛） 8
2.3.1.a 磷酸转酰基酶 7
2.7.2.a 激酶 6
2.8.3.a 辅酶-A转移酶 3、10、12、15
3.1.2.a 硫羟酸酯水解酶（CoA特异性） 12、15
4.2.1.a 脱水酶 13、14
5.4.99.a 甲基变位酶 11
6.2.1.a 酸-硫醇连接酶/CoA合成酶 3、10、12、15
1.1.1.a.表现出4-羟基丁酸脱氢酶活性的酶（EC1.1.1.61）将琥珀酸半醛还原为4-羟基丁酸（图16B的步骤5）。这类酶已被表征于富养罗尔斯通氏菌(Bravo等人,J Forens Sci,49:379-387(2004))，克鲁佛氏梭菌(Wolff等人,Protein Expr.Purif.6:206-212(1995))以及拟南芥(Breitkreuz等人,JBiol Chem,278:41552-41556(2003))。拟南芥酶被克隆以及表征于酵母(Breitkreuz等人,J.Biol.Chem.278:41552-41556(2003))。仍然另一基因是来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌的醇脱氢酶adhI(Jeon等人,J Biotechnol135:127-133(2008))。
蛋白质 GENBANK ID GI号 生物
4hbd YP_726053.1 113867564 富养罗尔斯通氏菌H16
4hbd L21902.1 146348486 克鲁佛氏梭菌DSM555
4hbd Q94B07 75249805 拟南芥
adhI AAR91477.1 40795502 热葡糖苷酶地芽孢杆菌
1.1.1.c.具有酰基-CoA还原酶以及醇脱氢酶活性的双功能酶可以直接将琥珀酰-CoA转化为4-羟基丁酸。将酰基-CoA转化为醇的示例性双功能氧化还原酶包括那些转换底物的酶：如将乙酰基-CoA转换为乙醇的酶（例如，来自大肠杆菌的adhE(Kessler等人,FEBS.Lett.281:59-63(1991)))、将丁酰基-CoA转换为丁醇的酶（例如，来自丙酮丁醇梭菌的adhE2(Fontaine等人,J.Bacteriol.184:821-830(2002)))。由bdh I以及bdh II编码的丙酮丁醇梭菌酶(Walter,等人,J.Bacteriol.174:7149-7158(1992))将乙酰基-CoA以及丁酰基-CoA分别还原为乙醇以及丁醇。除了还原乙酰基-CoA到乙醇，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰基-CoA(Kazahaya等人,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972);Koo等人,Biotechnol Lett,27:505-510(2005))。另一示例性的酶可以将丙二酰基-CoA转化为3-HP。具有这种活性的依赖NADPH的酶已经表征于橙色绿屈挠菌，其中它参与3-羟基丙酸循环(Hugler等人,J Bacteriol,184:2404-2410(2002);Strauss等人,Eur J Biochem,215:633-643(1993))。这种酶（具有300kDa的量）具有高底物特异性并显示与其他已知的氧化还原酶几乎没有序列相似性(Hugler等人，同上)。在其他生物中没有显示为催化这一特异性反应的酶；然而存在其他生物可以具有相似途径的生物信息证据(Klatt等人,EnvMicrobiol,9:2067-2078(2007))。可以通过序列相似性推断在其他生物（包括Roseiflexus castenholzii、赤细菌属种NAP1和海洋γ-蛋白质菌HTCC2080）中的候选酶。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
bdh I NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
bdh II NP_349891.1 15896542 丙酮丁醇梭菌
蛋白质 GenBankID GI号 生物
mcr AAS20429.1 42561982 橙色绿屈挠菌
Rcas_2929 YP_001433009.1 156742880 Roseiflexus castenholzii
NAP1_02720 ZP_01039179.1 85708113 赤细菌属种NAP1
MGP2080_00535 ZP_01626393.1 119504313 海洋γ-蛋白质菌HTCC2080
较长链的酰基-CoA分子可以通过酶，如编码醇-形成脂肪酰基-CoA还原酶的荷荷巴（加州希蒙得木）FAR被还原其对应的醇类。其在大肠杆菌中的过表达导致FAR活性和脂肪醇的堆积(Metz等人,Plant Physiol,122:635-644(2000))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
FAR AAD38039.1 5020215 加州希蒙得木
1.2.1.b.琥珀酰-CoA还原为其对应的醛琥珀酸半醛通过琥珀酰-CoA还原酶（醛形成）催化。示例性酶包括琥珀酰-CoA还原酶（EC1.2.1.76）、乙酰基-CoA还原酶、丁酰基-CoA还原酶以及脂肪酰基-CoA还原酶。具有琥珀酰-CoA还原酶活性的酶由克鲁佛氏梭菌的sucD(Sohling,J.Bacteriol.178:871-880(1996))以及牙龈红棕色单胞菌的sucD(Takahashi,J.Bacteriol182:4704-4710(2000))编码。附加的琥珀酰-CoA还原酶参与包括勤奋生金球菌(Berg等人,Science318:1782-1786(2007))以及嗜中性热变形菌(Ramos-Vera等人,JBacteriol,191:4286-4297(2009))的嗜热古生菌的3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环。由Msed_0709编码的勤奋生金球菌酶严格地将是依赖NADPH的以及还具有丙二酰基-CoA还原酶活性。嗜中性热变形菌酶对NADPH和NADH均有活性。由bphG编码的假单胞菌属中将乙醛脱氢酶酰基化的酶仍是另一酶，因为它已被证实可将乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛以及甲醛氧化并酰基化(Powlowski等人,J.Bacteriol.175:377-385(1993))。除了将乙酰基-CoA还原为乙醇，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰基-CoA(Kazahaya,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972);以及Koo等人,BiotechnolLett.27:505-510(2005))。丁醛脱氢酶催化生溶剂性生物，如糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人,Biosci BiotechnolBiochem.,71:58-68(2007))中的类似反应，丁酰基-CoA到丁醛的转化。示例性脂肪酰基-CoA还原酶由乙酸钙不动杆菌的acr1(Reiser,Journal of Bacteriology 179:2969-2975(1997))以及不动细菌属M-1(Ishige等人, Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002))编码。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
MSED_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋生金球菌
Tneu_0421 嗜中性热变形菌
sucD P38947.1 172046062 克鲁佛氏梭菌
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈红棕色单胞菌
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
bld AAP42563.1 31075383 糖乙酸多丁醇梭菌
acr1 YP_047869.1 50086359 乙酸钙不动杆菌
acr1 AAC45217 1684886 贝氏不动杆菌
acr1 BAB85476.1 18857901 不动杆菌属种菌株M-1
1.2.1.e.琥珀酸到琥珀酸半醛的直接转化由通过羧酸还原酶催化。示例性酶包括羧酸还原酶、α-氨基已二酸还原酶以及视黄酸还原酶。发现于艾瓦诺卡氏菌的羧酸还原酶（CAR）催化羧酸到其对应醛的依赖镁、ATP和NADPH的还原反应(Venkitasubramanian等人,J Biol.Chem.282:478-485(2007))。这种酶的天然底物是苯甲酸以及该酶表现出对芳香族底物（包括对甲苯酸）的广泛接受性(Venkitasubramanian等人,Biocatalysis inPharmaceutical and Biotechnology Industries.CRC press(2006))。由car编码的来自艾瓦诺卡氏菌的酶被克隆以及功能表达于大肠杆菌(Venkitasubramanian等人,J Biol.Chem.282:478-485(2007))。CAR需要通过将钝化脱辅基酶转化为活性全酶的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（PPTase）进行的翻译后活化(Hansen等人,Appl.Environ.Microbiol75:2765-2774(2009))。编码具体PPTase的npt基因产物的表达改善了该酶的活性。发现于灰色链霉菌的另一种候选酶由griC和griD基因编码。认为，这种酶将3-氨基-4-羟基苯甲酸转化为3-氨基-4-羟基苯甲醛，因为griC或者griD的删除导致细胞外3-乙酰基氨基-4-羟基苯甲酸（3-氨基-4-羟基苯甲酸代谢的一种分路产物）的堆积(Suzuki,等人,J.Antibiot.60(6):380-387(2007))。griC和griD与SGR_665（一种在序列上类似于艾瓦诺卡氏菌npt的酶）的共表达会是有益处的。
基因 GenBank登录号 GI号 生物
car AAR91681.1 40796035 艾瓦诺卡氏菌
npt ABI83656.1 114848891 艾瓦诺卡氏菌
griC YP_001825755.1 182438036 灰色链霉菌
griD YP_001825756.1 182438037 灰色链霉菌
其他的car和npt基因可以基于序列同源性得到确认。
一种具有类似特性的酶α-氨基己二酸还原酶（AAR,EC1.2.1.31）参与一些真菌物种中的赖氨酸生物合成途径。这种酶自然地将α-氨基己二酸还原为α-氨基己二酸半醛。首先通过依赖ATP的腺苷酸形成活化羧基基团，然后通过NAD(P)H还原所述腺苷酸以收获醛和AMP。如同CAR，这种酶利用镁并需要通过PPTase进行活化。用于AAR及其相应的PPTase的候选酶发现于酿酒酵母(Morris等人,Gene98:141-145(1991))、白色念珠菌(Guo等人,Mol.Genet.Genomics269:271-279(2003))以及人体酵母菌探针(Ford等人,Curr.Genet.28:131-137(1995))中。来自人体酵母菌探针的AAR当表达于大肠杆菌中时显示出显著的活性(Guo等人,Yeast21:1279-1288(2004))。来自产黄青霉的AAR接受S-羧基甲基-L-半胱氨酸作为替代性底物，但是不与己二酸、L-谷氨酸或者二氨基庚二酸反应(Hijarrubia等人,JBiol.Chem.278:8250-8256(2003))。迄今为止还未确认编码产黄青霉PPTase的基因以及通过序列比较同源性搜索未确认高置信符合（high-confidencehits）。
基因 GenBank登录号 GI号 生物
LYS2 AAA34747.1 171867 酿酒酵母
LYS5 P50113.1 1708896 酿酒酵母
LYS2 AAC02241.1 2853226 白色念珠菌
LYS5 AAO26020.1 28136195 白色念珠菌
Lys1p P40976.3 13124791 人体酵母菌探针
Lys7p Q10474.1 1723561 人体酵母菌探针
Lys2 CAA74300.1 3282044 产黄青霉
2.3.1.a.具有磷酸转-4-羟基丁酰基酶活性的酶为4-羟基丁酰基-磷酸到4-羟基丁酰基-CoA的转化所需。示例性磷酸-转移酰基转移酶包括磷酸转乙酰基酶（EC2.3.1.8）以及磷酸转丁酰基酶（EC2.3.1.19）。来自大肠杆菌的pta基因编码可逆地转化乙酰基-CoA到乙酰基-磷酸的酶(Suzuki,Biochim.Biophys.Acta191:559-569(1969))。这种酶还可以将丙酰基-CoA作为底物，在工艺中形成丙酸(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477-492(1998))。对丙酰基-CoA表现出活性的其他磷酸乙酰基转移酶发现于枯草芽孢杆菌(Rado等人,Biochim.Biophys.Acta321:114-125(1973))，克鲁佛氏梭菌(Stadtman,Methods Enzymol1:596-599(1955))以及海栖热袍菌(Bock等人,JBacteriol.181:1861-1867(1999))。类似地，来自丙酮丁醇梭菌的ptb基因编码磷酸转丁酰基酶（一种可逆地转化丁酰基-CoA到丁酰基-磷酸的酶）(Wiesenborn等人,Appl Environ.Microbiol55:317-322(1989);Walter等人,Gene134:107-111(1993))。附加的ptb基因发现于产丁酸细菌L2-50(Louis等人,J.Bacteriol.186:2099-2106(2004))以及巨大芽孢杆菌(Vazquez等人,Curr.Microbiol42:345-349(2001))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
pta NP_416800.1 71152910 大肠杆菌
pta P39646 730415 枯草芽孢杆菌
pta A5N801 146346896 克鲁佛氏梭菌
pta Q9X0L4 6685776 海栖热袍菌
ptb NP_349676 34540484 丙酮丁醇梭菌
ptb AAR19757.1 38425288 产丁酸细菌L2-50
ptb CAC07932.1 10046659 巨大芽孢杆菌
2.7.2.a.EC类别2.7.2中的酶-激酶或磷酸转移酶将羧酸转换为磷酸，同时水解一份ATP。示例性候选4-羟基丁酸激酶包括丁酸激酶（EC2.7.2.7）、异丁酸激酶（EC2.7.2.14）、天冬氨酸激酶（EC2.7.2.4）、醋酸激酶（EC2.7.2.1）以及γ-谷氨酰基激酶（EC2.7.2.11）。在梭菌属中的生酸期间，丁酸激酶催化丁酰基-磷酸到丁酸的可逆转化(Cary等人,Appl Environ Microbiol56:1576-1583(1990))。丙酮丁醇梭菌酶由两种buk基因产物的任何一种编码(Huang等人,J Mol.Microbiol Biotechnol2:33-38(2000))。其他丁酸激酶发现于丁基梭菌以及假破伤风梭菌(Twarog等人,J Bacteriol.86:112-117(1963))。相关的酶，来自海栖热袍菌的异丁酸激酶，表达于大肠杆菌并结晶(Diao等人,J Bacteriol.191:2521-2529(2009);Diao等人,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1100-1102(2003))。天冬氨酸激酶催化天冬氨酸的依赖ATP的磷酸化并参与几种氨基酸的合成。大肠杆菌中由lysC编码的天冬氨酸激酶III酶具有广泛的底物范围以及底物特异性中涉及的催化残基已被阐明(Keng等人,Arch Biochem Biophys335:73-81(1996))。大肠杆菌中的两种附加激酶还有醋酸激酶以及γ-谷氨酰基激酶。由ackA编码的大肠杆菌醋酸激酶(Skarstedt等人,J.Biol.Chem.251:6775-6783(1976))除了使醋酸，还使丙酸磷酸化(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477-492(1998))。由proB编码的大肠杆菌γ-谷氨酰基激酶(Smith等人,J.Bacteriol.157:545-551(1984))使谷氨酸的γ碳酸基团磷酸化。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
buk1 NP_349675 15896326 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q97II1 20137415 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q9X278.1 6685256 海栖热袍菌
lysC NP_418448.1 16131850 大肠杆菌
ackA NP_416799.1 16130231 大肠杆菌
proB NP_414777.1 16128228 大肠杆菌
2.8.3.a.CoA转移酶催化CoA部分从一个分子到另一个分子的可逆转移。图16B中的几种转换需要CoA转移酶活性：琥珀酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰基-CoA转移酶、3-羟基异丁酰基-CoA转移酶以及异丁烯酰基-CoA转移酶。琥珀酰-CoA转移酶的候选酶已在本申请前文中进行描述以及也适用于这种途径。附加的示例性CoA转移酶包括克鲁佛氏梭菌的cat1、cat2以及cat3的基因产物，其已经显示分别具有琥珀酰-CoA、4-羟基丁酰基-CoA以及丁酰基-CoA转移酶活性(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A105:2128-2133(2008);Sohling等人,J Bacteriol.178:871-880(1996))。类似的CoA转移酶活性还存在于***滴虫(van Grinsven等人,J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008))以及布氏锥虫(Riviere等人,J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004))中。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
cat1 P38946.1 729048 克鲁佛氏梭菌
cat2 P38942.2 172046066 克鲁佛氏梭菌
cat3 EDK35586.1 146349050 克鲁佛氏梭菌
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 ***滴虫G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 布氏锥虫
来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的戊烯二酰基-CoA-转移酶（EC2.8.3.12）与在结构上与2,3-脱氢已二酰基-CoA类似的底物戊烯二酰基-CoA以及3-丁烯酰基-CoA反应(Mack等人,226:41-51(1994))。编码这种酶的基因是gctA以及gctB。这种酶对其他CoA衍生物（包括戊二酰基-CoA、2-羟基戊二酰基-CoA、已二酰基-CoA、巴豆酰基-CoA以及丙烯酰基-CoA）具有降低的但是可检测到的活性(Buckel等人,Eur.J Biochem.118:315-321(1981))。该酶已被克隆以及表达于大肠杆菌(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。戊烯二酸CoA-转移酶活性也已经在球孢梭菌以及共生梭菌中检测到。附加的戊烯二酸CoA-转移酶可以通过与发酵氨基酸球菌蛋白质序列的同源性得到推断。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
gctA CAA57199.1 559392 发酵氨基酸球菌
gctB CAA57200.1 559393 发酵氨基酸球菌
gctA ACJ24333.1 212292816 共生梭菌
gctB ACJ24326.1 212292808 共生梭菌
gctA NP_603109.1 19703547 具核梭杆菌
gctB NP_603110.1 19703548 具核梭杆菌
可以将乙酰基-CoA用作CoA供体的CoA转移酶是由大肠杆菌atoA（α亚基）和atoD（β亚基）基因编码的乙酰乙酰基-CoA转移酶(Korolev等人,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.58:2116-2121(2002);Vanderwinkel等人,33:902-908(1968))。这种酶具有广泛的底物范围(Sramek等人,ArchBiochem Biophys171:14-26(1975))以及已经显示将CoA部分从各种支链和直链酰基-CoA底物转移至醋酸，包括异丁酸(Matthies等人,ApplEnviron.Microbiol58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))和丁酸酯(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))。在转录水平时，这种酶由乙酰醋酸诱导，因此调节控制的改性可能为将这种酶设计入途径所需(Pauli等人,Eur.J Biochem.29:553-562(1972))。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Duncan等人,68:5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人,Appl Environ Microbiol56:1576-1583(1990);Wiesenborn等人,ApplEnviron Microbiol55:323-329(1989))以及糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))。
基因 GI# 登录号 生物
atoA 2492994 P76459.1 大肠杆菌
atoD 2492990 P76458.1 大肠杆菌
actA 62391407 YP_226809.1 谷氨酸棒杆菌
cg0592 62389399 YP_224801.1 谷氨酸棒杆菌
ctfA 15004866 NP_149326.1 丙酮丁醇梭菌
ctfB 15004867 NP_149327.1 丙酮丁醇梭菌
ctfA 31075384 AAP42564.1 糖乙酸多丁醇梭菌
ctfB 31075385 AAP42565.1 糖乙酸多丁醇梭菌
3.1.2.a.3-羟基异丁酰基-CoA水解酶催化3-羟基异丁酰基-CoA到3-羟基异丁酸酯的转化。这种酶参与缬氨酸降解途径(Shimomura等人,J BiolChem.269:14248-14253(1994))。编码这种酶的基因包括褐鼠(Shimomura等人,Methods Enzymol.324:229-240(2000))以及智人（Shimomura等人，同上）的hibch。类似候选基因还可以通过序列同源性确认，包括酿酒酵母的hibch以及蜡样芽胞杆菌的BC_2292。
基因名称 GenBank登录# GI# 生物
hibch Q5XIE6.2 146324906 褐鼠
hibch Q6NVY1.2 146324905 智人
hibch P28817.2 2506374 酿酒酵母
BC_2292 AP09256 29895975 蜡样芽胞杆菌
甲基丙二酰基-CoA通过甲基丙二酰基-CoA水解酶（EC3.1.2.7）转化为甲基丙二酸。从褐鼠肝脏中分离出的这种酶还对作为替代性底物的丙二酰基-CoA以及丙酰基-CoA具有活性(Kovachy等人,J.Biol.Chem.,258:11415-11421(1983))。与这种酶相关的基因至今尚未确定。具有广泛底物范围的示例性CoA水解酶，如上文所述的3-HIB-CoA水解酶是合适的候选酶。由来自褐鼠脑的acot12编码的酶(Robinson等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959-965(1976))可以与丁酰基-CoA、己酰基-CoA以及丙二酰基-CoA反应。由acot8编码的人二羧酸硫酯酶表现出对戊二酰基-CoA、已二酰基-CoA、环庚基-CoA、癸二酰基-CoA和癸基二酰基-CoA的活性(Westin等人,J.Biol.Chem.280:38125-38132(2005))。这种酶的最接近的大肠杆菌同系物tesB还可以水解各种CoA硫羟酸酯(Naggert等人,J Biol Chem266:11044-11050(1991))。类似的酶也已经表征于大鼠肝脏(Deana R.,Biochem Int26:767-773(1992))。大肠杆菌中具有水解酶活性的附加酶包括ybgC、paaI以及ybdB(Kuznetsova,等人,FEMS Microbiol Rev,2005,29(2):263-279;Song等人,J Biol Chem,2006,281(16):11028-38)。虽然尚未有关于其序列的报告，来自豌豆叶子的线粒体的酶具有广泛的底物特异性，其对乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、丁酰基-CoA、棕榈酰基-CoA、油酰基-CoA、琥珀酰-CoA以及巴豆酰基-CoA的活性已得到证实(Zeiher等人,Plant.Physiol.94:20-27(1990))。来自酿酒酵母的乙酰基-CoA水解酶ACH1代表另一候选水解酶(Buu等人,J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003))。
基因名称 GenBank登录# GI# 生物
acot12 NP_570103.1 18543355 褐鼠
tesB NP_414986 16128437 大肠杆菌
acot8 CAA15502 3191970 智人
acot8 NP_570112 51036669 褐鼠
tesA NP_415027 16128478 大肠杆菌
ybgC NP_415264 16128711 大肠杆菌
paaI NP_415914 16129357 大肠杆菌
ybdB NP_415129 16128580 大肠杆菌
ACH1 NP_009538 6319456 酿酒酵母
仍然另一候选水解酶是来自发酵氨基酸球菌的戊烯二酸CoA-转移酶。这种酶通过定点诱变被转化成对戊二酰基-CoA、乙酰基-CoA和3-丁烯酰基-CoA具有活性的酰基-CoA水解酶(Mack等人,FEBS.Lett.405:209-212(1997))。这表明，编码琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA转移酶和乙酰乙酰基-CoA：乙酰基-CoA转移酶的酶也可以用作用于这种反应步骤的候选酶，如上所述，引入合适的突变以改变它们的功能。
基因名称 GenBank登录# GI# 生物
gctA CAA57199 559392 发酵氨基酸球菌
gctB CAA57200 559393 发酵氨基酸球菌
4.2.1.a.图16B中的两种转换需要脱水酶。3-羟基异丁酸酯脱水为MAA由3-羟基异丁酸酯催化。用于这种转换的候选酶如实施例VII中所述。3-羟基异丁酰基-CoA脱水为异丁烯酰基-CoA由具有3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶活性的酶催化。示例性酶包括烯酰基-CoA水合酶以及巴豆酸酶。
烯酰基-CoA水合酶（EC4.2.1.17）催化各种3-羟基酰基-CoA底物的脱水(Roberts等人,Arch.Microbiol117:99-108(1978);Agnihotri等人,Bioorg.Med.Chem.11:9-20(2003);Conrad等人,J Bacteriol.118:103-111(1974))。由ech编码的恶臭假单胞菌的烯酰基-CoA水合酶催化3-羟基丁酰基-CoA到巴豆酰基-CoA的转化(Roberts等人,Arch.Microbiol117:99-108(1978))。这种转换还由丙酮丁醇梭菌的crt基因产物、克鲁佛氏梭菌的crt1基因产物以及其他梭菌属生物催化(Atsumi等人,Metab Eng10:305-311(2008);Boynton等人,J Bacteriol.178:3015-3024(1996);Hillmer等人,FEBSLett.21:351-354(1972))。附加烯酰基-CoA水合酶候选基因是恶臭假单胞菌的phaA和phaB以及荧光假单胞菌的paaA和paaB(Olivera等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A95:6419-6424(1998))。预测，沼泽红假单胞菌中pimF的基因产物编码参与庚二酰-CoA降解的烯酰基-CoA水合酶(Harrison等人,Microbiology151:727-736(2005))。最后，许多大肠杆菌基因已经显示具有烯酰基-CoA水合酶功能，包括maoC(Park等人,J Bacteriol.185:5391-5397(2003))、paaF(Ismail等人,Eur.J Biochem.270:3047-3054(2003);Park等人,Appl.Biochem.Biotechnol113-116:335-346(2004);Park等人,Biotechnol Bioeng86:681-686(2004))以及paaG(Ismail等人,Eur.JBiochem.270:3047-3054(2003);Park和Lee,Appl.Biochem.Biotechnol113-116:335-346(2004);Park和Yup,Biotechnol Bioeng86:681-686(2004))。
基因 GenBank登录号 GI号 生物
ech NP_745498.1 26990073 恶臭假单胞菌
crt NP_349318.1 15895969 丙酮丁醇梭菌
crt1 YP_001393856 153953091 克鲁佛氏梭菌
phaA NP_745427.1 26990002 恶臭假单胞菌
phaB NP_745426.1 26990001 恶臭假单胞菌
paaA ABF82233.1 106636093 荧光假单胞菌
paaB ABF82234.1 106636094 荧光假单胞菌
maoC NP_415905.1 16129348 大肠杆菌
paaF NP_415911.1 16129354 大肠杆菌
paaG NP_415912.1 16129355 大肠杆菌
替代性地，fadA以及fadB的大肠杆菌基因产物编码脂肪酸氧化中涉及的表现出烯酰基-CoA水合酶活性的多酶复合体(Yang等人,Biochemistry30:6788-6795(1991);Yang,J Bacteriol.173:7405-7406(1991);Nakahigashi等人,Nucleic Acids Res.18:4937(1990))。可以利用敲出由fadR编码的负调节子来活化fadB基因产物(Sato等人,J Biosci.Bioeng103:38-44(2007))。fadI以及fadJ基因编码类似功能以及被自然地表达于厌氧条件下(Campbell等人,Mol.Microbiol47:793-805(2003))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
fadA YP_026272.1 49176430 大肠杆菌
fadB NP_418288.1 16131692 大肠杆菌
fadI NP_416844.1 16130275 大肠杆菌
fadJ NP_416843.1 16130274 大肠杆菌
fadR NP_415705.1 16129150 大肠杆菌
5.4.99.a.4-羟基丁酰基-CoA通过具有4-羟基丁酰基-CoA变位酶活性的酶重排以形成3-羟基异丁酰基-CoA。这种活性至今尚未得到证实。甲基丙二酰基-CoA变位酶以及异丁酰基-CoA变位酶催化类似转换。示例性甲基丙二酰基-CoA变位酶以及异丁酰基-CoA变位酶候选如实施例V和实施例VII中所述。
6.2.1.a.酰基-CoA底物到其酸产物的转化可以通过6.2.1酶家族中的CoA酸-硫醇连接酶或CoA合成酶催化。图16B中这种类别的酶包括琥珀酰-CoA合成酶、4-羟基丁酰基-CoA合成酶、3-羟基异丁酰基-CoA合成酶以及异丁烯酰基-CoA合成酶。候选琥珀酰-CoA合成酶如前所述。用于催化4-羟基丁酰基-CoA合成酶、3-羟基异丁酰基-CoA合成酶以及异丁烯酰基-CoA合成酶活性的示例性酶如此处以及下文所述。形成ADP的乙酰基-CoA合成酶（ACD，EC6.2.1.13）是将酰基-CoA酯类到其对应的酸的转化耦合于伴随的ATP合成的酶。由AF1211编码的来自闪烁古生球菌的ACD I显示对各种直链和支链底物（包括异丁酸、异戊酸以及富马酸）起作用(Musfeldt等人,J Bacteriol.184:636-644(2002))。由AF1983编码的闪烁古生球菌中第二可逆ACD还显示具有对环状化合物苯基醋酸和吲哚醋酸具有高活性的广泛底物范围(Musfeldt和Schonheit,J Bacteriol.184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的酶（释为琥珀酰-CoA合成酶）接受丙酸、丁酸以及支链酸（异戊酸和异丁酸）作为底物，以及显示按向前和逆向方向运行(Brasen等人,Arch Microbiol182:277-287(2004))。由来自超嗜热泉古菌耐超高温热棒菌的PAE3250编码的ACD显示所有被表征的ACD的最广泛的底物范围，与乙酰基-CoA、异丁酰基-CoA（优选的底物）以及苯基乙酰基-CoA反应（Brasen等人，同上）。定向进化或工程可以用于改性这种酶以于宿主生物的生理温度下运行。来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌以及耐超高温热棒菌的酶均已被克隆，功能表达以及表征于大肠杆菌(Brasen和Schonheit,同上;Musfeldt和Schonheit,J Bacteriol.184:636-644(2002))。附加的候选酶是由大肠杆菌的sucCD以及酿酒酵母的LSC1和LSC2基因编码的琥珀酰-CoA合成酶。这些酶在活体内可逆的反应中，催化琥珀酸形成琥珀酰-CoA并伴随消耗一份ATP(Buck等人,Biochemistry24:6245-6252(1985))。来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA连接酶已证实对几种脂肪族底物（包括醋酸、丙酸、丁酸、戊酸、已酸、庚酸和辛酸）以及对芳香族化合物（如苯基醋酸和苯氧基醋酸）起作用(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。来自豌豆根瘤菌的相关的酶丙二酰基CoA合成酶（6.3.4.9）可以将几种二酸，即乙基丙二酸、丙基丙二酸、烯丙基丙二酸、异丙基丙二酸、二甲基丙二酸、环丙基丙二酸、环丙基亚甲基丙二酸、环丁基丙二酸以及苯甲基丙二酸转化为其对应的一硫代酯(Pohl等人,J.Am.Chem.Soc.123:5822-5823(2001))。
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古生球菌
蛋白质 GenBank ID GI号 生物
scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌
PAE3250 NP_560604.1 18313937 耐超高温热棒菌菌株IM2
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
LSC1 NP_014785 6324716 酿酒酵母
LSC2 NP_011760 6321683 酿酒酵母
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
matB AAC83455.1 3982573 豌豆根瘤菌
如图18的示例性途径中所示，活性还原TCA循环改善衍生自乙酰基-CoA的产物甲基丙烯酸（MAA）的收率。本文描述了还原TCA循环的途径以及琥珀酸到4-羟基丁酰基-CoA以及甲基丙烯酸的转化（还参见图5和图16B以及实施例VII）。图18A和图18B显示示例性途径。酶催转换通过所示的酶完成。图18A示出了利用该还原TCA循环将CO2固定到琥珀酸的途径。图18B示出了从琥珀酸生物合成3-羟基异丁酸以及甲基丙烯酸的示例性途径；显示的酶催转换通过如下酶完成：A.3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；B.异丁烯酰基-CoA合成酶、转移酶或水解酶；C.琥珀酰-CoA转移酶或合成酶；D.琥珀酰-CoA还原酶（醛形成）；E.4-羟基丁酸脱氢酶；F.4-羟基丁酸激酶；G.磷酸转-4-羟基丁酰基酶；H.琥珀酸还原酶；I.琥珀酰-CoA还原酶（醇形成）；J.4-羟基丁酰基-CoA合成酶或转移酶；K.4-羟基丁酰基-CoA变位酶；L.3-羟基异丁酰基-CoA合成酶、转移酶或水解酶；M.3-羟基异丁酸酯脱水酶。
实施例XXI
用于从乙酰基-CoA生产MAA以及2-羟基异丁酸的途径
如图16C的通量分布中所示，活性还原TCA循环改善衍生自乙酰基-CoA的产物甲基丙烯酸（MAA）的收率。在这种途径中，按五个酶步骤从乙酰基-CoA生产MAA。在第一步骤中，乙酰基-CoA的两个分子结合形成乙酰乙酰基-CoA。乙酰乙酰基-CoA后续还原为3-羟基丁酰基-CoA。然后，甲基变位酶将3-羟基丁酰基-CoA的碳骨架重排为2-羟基异丁酰基-CoA，2-羟基异丁酰基-CoA然后脱水以形成异丁烯酰基-CoA。替代性地，2-羟基异丁酰基-CoA可以转化为2-羟基异丁酸酯，作为产物分泌以及回收。将异丁烯酰基-CoA转化为MAA的最后步骤可以通过单个酶或一系列酶执行。用于将异丁烯酰基-CoA转化为MAA的替换性策略伴有多步骤工艺，其中MAA-CoA经由3-羟基异丁酸酯转化为MAA。通过这种工艺，MAA-CoA首先转化为3-羟基异丁酰基-CoA，3-羟基异丁酰基-CoA可以通过3-羟基异丁酰基-CoA转移酶、合成酶或水解酶后续转化为3-羟基异丁酸酯。3-羟基异丁酸酯然后可以经由3-羟基异丁酸酯脱水酶以生物催化方式转化为MAA或分泌以及通过化学脱水转化为MAA。
用于每个途径步骤的候选酶如本文所述。催化异丁烯酰基-CoA到MAA的转化的CoA转移酶、合成酶和水解酶如上文实施例VII中所述。描述异丁烯酰基-CoA到3-羟基异丁酸酯以及甲基丙烯酸的间接转化的酶也如上文所述。
乙酰乙酰基-CoA硫解酶.通过乙酰基-CoA硫解酶催化两个乙酰基-CoA单元形成乙酰乙酰基-CoA。示例性酶如实施例X中所述。
实施例XXII
用于从丙酮酸以及乙酰基-CoA生产MAA的途径
活性还原TCA循环改善衍生自乙酰基-CoA的产物甲基丙烯酸（MAA）的收率。显示这种改善收率的通量分布如图16D中所示。
图16E（还参见图1以及实施例I）描绘了经由中间体柠苹酸从乙酰基-CoA以及丙酮酸到MAA的示例性途径。还显示从乌头酸到MAA的途径。在一个途径中，乙酰基-CoA以及丙酮酸通过柠苹酸合酶转化为柠苹酸。柠苹酸脱水可以出产柠康酸或中康酸。中康酸以及柠康酸通过顺式/反式异构酶相互转化。中康酸或柠康酸的脱羧出产MAA。在替代性途径中，通过柠苹酰-CoA裂解酶以及柠苹酰-CoA水解酶、转移酶或合成酶催化，经由柠苹酰-CoA中间体从乙酰基-CoA以及丙酮酸形成柠苹酸。还显示从乌头酸到MAA的途径。在一个途径中，乌头酸首先通过乌头酸脱羧酶脱羧为衣康酸。衣康酸然后通过衣康酸Δ-异构酶异构化为柠康酸。柠康酸到MAA的转化直接通过脱羧或间接经由中康酸进行。在替代性途径中，衣康酸中间体首先通过CoA转移酶或合成酶转化为衣康酰-CoA。衣康酰-CoA的水合作用出产柠苹酰-CoA，柠苹酰-CoA然后可以如前所述转化为MAA。
实施例I中所提供的表1显示可以执行图16E中所描绘的步骤的酶类。示例性酶如下文所述以及在实施例I中进一步详述。
EC2.3.1.a合酶.柠苹酸合酶（EC2.3.1.182）催化乙酰基-CoA以及丙酮酸到柠苹酸以及辅酶A的转化。示例性酶如实施例I中所述。
EC2.8.3.a CoA转移酶（步骤E）.CoA转移酶催化CoA部分从一个分子到另一个分子的可逆转移。图16E中的两种转换利用CoA转移酶：柠苹酰-CoA到柠苹酸的转化以及衣康酸到衣康酰-CoA的活化。柠苹酰-CoA转移酶（EC2.8.3.7以及2.8.3.11）将CoA部分从柠苹酰-CoA转移到供体。柠苹酸:琥珀酰-CoA转移酶在乙醛酸同化的3-羟基丙酸循环中具有活性。示例性酶如实施例I中所述。
EC3.2.1.a CoA水解酶.3.1.2家族中的酶将酰基-CoA分子水解为其对应的酸。具有广泛底物范围的几种CoA水解酶是表现出柠苹酰-CoA水解酶活性的合适候选酶。示例性酶如实施例I中所述。
EC4.1.1.a脱羧酶.图16E中MAA合成的最后步骤是中康酸或柠康酸的脱羧。示例性酶如实施例I中所述。
EC4.1.3.a裂解酶.柠苹酰-CoA裂解酶（EC4.1.3.25）将乙酰基-CoA以及丙酮酸转化为柠苹酰-CoA。这种酶参与乙醛酸同化的3-羟基丙酸（3-HP）循环，其中它按柠苹酰-CoA降解方向起作用。示例性酶如实施例I中所述。
EC4.2.1.a脱水酶。柠苹酸脱水为柠康酸是通过具有柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）活性的酶（EC4.2.1.35）催化的。这种酶，连同柠苹酸合酶，参与表征于詹氏甲烷球菌以及问号钩体的不依赖苏氨酸的异亮氨酸生物合成途径。这些生物中柠苹酸的脱水通过异丙基苹果酸异构酶（IPMI）催化，所述酶既催化柠苹酸脱水为柠康酸，又催化后续的水到柠康酸的反式加成以形成甲基苹果酸(Xu等人,J Bacteriol.186:5400-5409(2004);Drevland等人,J Bacteriol.189:4391-4400(2007))。示例性酶如实施例I中所述。
EC5.2.1.a顺式/反式异构酶.中康酸以及柠康酸的顺式/反式异构化通过具有柠康酸异构酶活性的酶催化。合适的候选酶包括乌头酸异构酶（EC5.3.3.7）；马来酸顺式、反式异构酶（EC5.2.1.1）；马来酰基丙酮顺式、反式异构酶；以及不饱和脂肪酸（Cti）的顺式、反式异构酶。乌头酸异构酶将顺式以及反式乌头酸相互转化。示例性酶如实施例I中所述。
EC5.3.3.aΔ-异构酶.衣康酸到柠康酸的转化通过衣康酸Δ-异构酶催化。示例性酶如实施例I中所述。
EC6.2.1CoA合成酶。柠苹酰-CoA到柠苹酸以及衣康酸到衣康酰-CoA的转化可以通过酶6.2.1家族中的CoA酸-硫醇连接酶或CoA合成酶催化。示例性酶如实施例I中所述。
如图19的示例性途径中所示，活性还原TCA循环改善衍生自乙酰基-CoA的产物甲基丙烯酸（MAA）的收率。本文描述了还原TCA循环的途径以及经由中间体柠苹酸从乙酰基-CoA和/或丙酮酸到甲基丙烯酸的转化（还参见图1和图16E以及实施例I）。图19A以及19B显示示例性途径。图19A示出了利用还原TCA循环将CO2固定到乙酰基-CoA以及丙酮酸的途径。图19B示出了用于从乙酰基-CoA以及丙酮酸生物合成甲基丙烯酸酯类的示例性途径；显示的酶催转换通过如下酶完成：1.柠苹酸合酶；2.柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；3.柠康酸脱羧酶；4.柠苹酰-CoA裂解酶；5.柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；6.柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；7.柠康酸异构酶；8.中康酸脱羧酶；9.乌头酸脱羧酶；10.衣康酸异构酶；11.衣康酰-CoA转移酶或合成酶；12.衣康酰-CoA水合酶。
如图20的示例性途径中所示，活性还原TCA循环改善衍生自乙酰基-CoA的产物甲基丙烯酸（MAA）的收率。本文描述了还原TCA循环的途径以及乙酰基-CoA到甲基丙烯酸或2-羟基异丁酸的转化（还参见图8以及实施例X）。图20A和图20B显示示例性途径。图20A显示利用还原TCA循环将CO2固定到乙酰基-CoA的途径。图20B显示用于从乙酰基-CoA生物合成甲基丙烯酸和2-羟基异丁酸的示例性途径。
如图21的示例性途径中所示，活性还原TCA循环改善衍生自乙酰基-CoA的产物甲基丙烯酸（MAA）的收率。本文描述了还原TCA循环的途径以及经由中间体3-羟基异丁酰基-CoA从乙酰基-CoA到甲基丙烯酸的转化（还参见图5、图8和图9以及实施例VII、X、XI和XIV）。图21A和图21B显示示例性途径。图21A显示利用还原TCA循环将CO2固定到乙酰基-CoA的途径。图21B显示从乙酰基-CoA生物合成甲基丙烯酸和3-羟基异丁酸的示例性途径；显示的酶催转换通过如下酶完成：1）乙酰乙酰基-CoA硫解酶（AtoB）；2）3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶（Hbd）；3）巴豆酸酶（Crt）；4）巴豆酰基-CoA水合酶（4-Budh）；5）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；6）3-羟基异丁酰基-CoA水解酶、合成酶或转移酶；7）3-羟基异丁酸脱水酶；8）3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；9）异丁烯酰基-CoA水解酶、合成酶或转移酶。巴豆酰基-CoA水合酶形成4-羟基丁酰基-CoA是4-羟基丁酰基-CoA脱水酶（其催化4-羟基丁酰基-CoA到巴豆酰基-CoA的可逆转化）的逆向反应（见实施例XIV）。因此，在本发明的实施方式中，甲基丙烯酸途径包含乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶，本文也称为3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶（见图9以及21）；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶，本文也称为巴豆酰基-CoA水合酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶。替代性地，甲基丙烯酸途径包含乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶（见图21）。
实施例XXIII
示例性羧酸还原酶
本实施例描述了羧酸还原酶执行羧酸到醛的转化的用途。
1.2.1.e酸还原酶.未活化的酸到醛的转化可以通过酸还原酶完成。这类转化的实施例包括但不仅限于4-羟基丁酸、琥珀酸、α-酮戊二酸以及4-氨基丁酸分别到4-羟基丁醛、琥珀酸半醛、2,5-二氧代戊酸以及4-氨基丁醛的转化。一种显著的羧酸还原酶可以发现于艾瓦诺卡氏菌，所述酶催化羧酸到其对应醛的依赖镁、ATP和NADPH的还原反应(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。这种酶由car基因编码以及被克隆和功能表达于大肠杆菌(Venkitasubramanian等人, J. Biol. Chem. 282:478-485(2007))。npt基因产物的表达经由转录后修饰改善了该酶的活性。npt基因编码将钝化脱辅基酶转化为活性全酶的特异性磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（PPTase）。这种酶的天然底物是香草酸，以及该酶显示对芳香族和脂肪族底物的广泛接受性(Venkitasubramanian等人，在Biocatalysis in thePharmaceutical and Biotechnology Industires中, ed. R.N. Patel, Chapter 15, pp.425-440,CRC Press LLC,Boca Raton,FL.(2006))。
基因 登录号 GI号 生物
car AAR91681.1 40796035 艾瓦诺卡氏菌（sp. NRRL 5646）
npt ABI83656.1 114848891 艾瓦诺卡氏菌（sp. NRRL 5646）
其他的car和npt基因可以基于序列同源性得到确认。
发现于灰色链霉菌的另一种候选酶由griC和griD基因编码。认为，这种酶将3-氨基-4-羟基苯甲酸转化为3-氨基-4-羟基苯甲醛，因为griC或者griD的删除导致细胞外3-乙酰基氨基-4-羟基苯甲酸（3-氨基-4-羟基苯甲酸代谢的一种分路产物）的堆积(Suzuki, 等人, J. Antibiot. 60(6):380-387(2007))。griC和griD与SGR_665（一种在序列上类似于艾瓦诺卡氏菌npt的酶）的共表达会是有益处的。
一种具有类似特性的酶α-氨基己二酸还原酶（AAR,EC1.2.1.31）参与一些真菌物种中的赖氨酸生物合成途径。这种酶自然地将α-氨基己二酸还原为α-氨基己二酸半醛。首先通过依赖ATP的腺苷酸形成活化羧基基团，然后通过NAD(P)H还原所述腺苷酸以收获醛和AMP。如同CAR，这种酶利用镁并需要通过PPTase进行活化。用于AAR及其相应的PPTase的候选酶发现于酿酒酵母(Morris等人,Gene98:141-145(1991))、白色念珠菌(Guo等人,Mol.Genet.Genomics269:271-279(2003))以及人体酵母菌探针(Ford等人,Curr.Genet.28:131-137(1995))中。来自人体酵母菌探针的AAR当表达于大肠杆菌中时显示出显著的活性(Guo等人,Yeast21:1279-1288(2004))。来自产黄青霉的AAR接受S-羧基甲基-L-半胱氨酸作为替代性底物，但是不与己二酸、L-谷氨酸或者二氨基庚二酸反应(Hijarrubia等人,J.Biol.Chem.278:8250-8256(2003))。迄今为止还未确认编码产黄青霉PPTase的基因。
基因 登录号 GI号 生物
LYS2 AAA34747.1 171867 酿酒酵母
LYS5 P50113.1 1708896 酿酒酵母
LYS2 AAC02241.1 2853226 白色念珠菌
LYS5 AAO26020.1 28136195 白色念珠菌
Lys1p P40976.3 13124791 人体酵母菌探针
Lys7p Q10474.1 1723561 人体酵母菌探针
Lys2 CAA74300.1 3282044 产黄青霉
羧酸还原酶的克隆以及表达.大肠杆菌被用作目标生物，以设计用于甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的途径。大肠杆菌提供用于生成能够生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯的非天然存在的微生的良好宿主。大肠杆菌能经受遗传操纵以及已知能够在各种氧合条件下有效地生产各种中间体和产物。
为生成经设计以生产甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯]的微生物菌株（如大肠杆菌菌株），利用熟知的分子生物技术将编码羧酸还原酶以及磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的核酸表达于大肠杆菌（参见，例如，Sambrook，同上，2001；Ausubel同上，1999）。具体地，来自艾瓦诺卡氏菌（指定720）、***垢分支杆菌mc(2)155（指定890）、鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10（指定891）以及海分枝杆菌M（指定892）的car基因在PA1/lacO启动子的控制下被克隆入pZS*13载体（德国吕尔茨海姆的Expressys）。npt（ABI83656.1）基因（即721）在与pZS*13中所用的那些类似的启动子和核糖体结合位点的控制下被克隆入pKJL33S载体（一种最初微型-F质粒载体PML31的衍生物）。
通过PCR克隆来自诺卡氏菌基因组DNA的car基因（GNM_720）。其核酸以及蛋白质序列分别如图22A和图22B中所示。通过基因Art合成npt基因（GNM_721）的密码子-优化版本（德国雷根斯堡）。其核酸以及蛋白质序列分别如图23A和图23B显示。***垢分支杆菌mc(2)155（指定890）、鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10（指定891）以及海分枝杆菌M（指定892）基因以及酶的核酸以及蛋白质序列可以分别见于图24、25以及26。将质粒转入宿主细胞以表达甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、3-羟基异丁酸酯和/或2-羟基异丁酸酯生产所需的蛋白质以及酶。
生成附加的CAR变体。生成CAR891的密码子优化版本并指定为891GA。CAR891GA的核酸以及氨基酸序列分别如图27A和图27B显示。生成超过2000CAR变体。具体地，在位置V295、M296、G297、G391、G421、D413、G414、Y415、G416以及S417进行所有的20种氨基酸组合，以及还对附加的变体进行了测试。示例性CAR变体包括：E16K；Q95L；L100M；A1011T；K823E；T941S；H15Q；D198E；G446C；S392N；F699L；V883I；F467S；T987S；R12H；V295G；V295A；V295S；V295T；V295C；V295V；V295L；V295I；V295M；V295P；V295F；V295Y；V295W；V295D；V295E；V295N；V295Q；V295H；V295K；V295R；M296G；M296A；M296S；M296T；M296C；M296V；M296L；M296I；M296M；M296P；M296F；M296Y；M296W；M296D；M296E；M296N；M296Q；M296H；M296K；M296R；G297G；G297A；G297S；G297T；G297C；G297V；G297L；G297I；G297M；G297P；G297F；G297Y；G297W；G297D；G297E；G297N；G297Q；G297H；G297K；G297R；G391G；G391A；G391S；G391T；G391C；G391V；G391L；G391I；G391M；G391P；G391F；G391Y；G391W；G391D；G391E；G391N；G391Q；G391H；G391K；G391R；G421G；G421A；G421S；G421T；G421C；G421V；G421L；G421I G421M；G421P；G421F；G421Y；G421W；G421D；G421E；G421N；G421Q；G421H；G421K；G421R；D413G；D413A；D413S；D413T；D413C；D413V；D413L；D413I；D413M；D413P；D413F；D413Y；D413W；D413D；D413E；D413N；D413Q；D413H；D413K；D413R；G414G；G414A；G414S；G414T；G414C；G414V；G414L；G414I；G414M；G414P；G414F；G414Y；G414W；G414D；G414E；G414N；G414Q；G414H；G414K；G414R；Y415G；Y415A；Y415S；Y415T；Y415C；Y415V；Y415L；Y415I；Y415M；Y415P；Y415F；Y415Y；Y415W；Y415D；Y415E；Y415N；Y415Q；Y415H；Y415K；Y415R；G416G；G416A；G416S；G416T；G416C；G416V；G416L；G416I；G416M；G416P；G416F；G416Y；G416W；G416D；G416E；G416N；G416Q；G416H；G416K；G416R；S417G；S417A；S417S；S417T；S417C；S417V S417L；S417I；S417M；S417P；S417F；S417Y；S417W；S417D；S417E；S417N；S417Q；S417H；S417K；以及S417R。
对CAR变体进行了活性筛查，以及发现众多CAR变体表现出CAR活性。
本实施例描述了CAR将羧酸转化为醛的用途。
实施例XXIV
用于4-羟基丁酰基-COA到甲基丙烯酸甲酯的转化的途径
本实施例描述了用于将4-羟基丁酰基-CoA转化为作为示例性甲基丙烯酸酯类的甲基丙烯酸甲酯的途径。
通向甲基丙烯酸甲酯的示例性途径如图30中所示。简言之，如上所述，4-羟基丁酰基-CoA可以转化为3-羟基丁酰基-CoA。如上所述，利用醇转移酶，尤其是甲基转移酶，可以如图30中所示，将3-羟基异丁酰基-CoA转化为3-羟基异丁酸酯甲基酯（见实施例III；还参见WO/2007/039415以及美国专利号7,901,915）。如上所述，3-羟基异丁酸酯甲基酯可以通过脱水酶或通过化学转化（例如，甲基丙烯酸酯到甲基丙烯酸酯类的转化）而转化为甲基丙烯酸甲酯（见图2）。示例性脱水酶包括上文中（例如，实施例V、VI、X以及XII中）所述的那些酶。
在去除CoA部分的条件下，核酸（尤其是DNA）编码能够实现醇部分从本文定义的醇起始材料转移到(甲基)丙烯酰基CoA的酶，如酶的转移酶（EC2）或水解酶（EC3）类别，例如，脂肪酶、酯酶（如乙酰基胆碱酯酶）、转移酶（如胆碱乙酰基转移酶）、蛋白酶或酰基酶（如氨基酰基酶）（包括编码一种或多种这类酶）。
作为转移酶的EC2组酶包括，例如，已知催化化学基团从一种化合物到另一种化合物移动的转氨酶、转酰胺基酶、转酮醇酶、转磷酸酶或胆碱乙酰基转移酶。也能够催化转酯反应的EC类别3；水解酶包括，例如，南极假丝酵母的脂肪酶（CAL B）、猪胰脂肪酶（PPL）、褶皱假丝酵母脂肪酶（CRL）、洋葱假单胞菌脂肪酶（PCL）等等；酯酶，如猪肝脏酯酶（PLE）、乙酰基胆碱酯酶；还有蛋白酶，如枯草溶菌素、例如来自曲霉属种、芽孢杆菌属种、根霉菌属种的蛋白酶；以及其他水解酶，如青霉素酰胺酶或者，例如，L-氨基酰基酶可以是催化所述转移的合适酶。
这些酶可以衍生自原核生物（如细菌）、真核生物或更高级的生物，如来自假丝酵母属种的脂肪酶、来自哺乳动物细胞的酯酶或胆碱乙酰基转移酶，以及可以将它们提供到同样的反应中。替代性地，其还可以以生物合成方式从衍生自生物质的合适的起始材料生产。
虽然本实施例描述了转化为甲基丙烯酸甲酯，本领域的技术人员理解的是，可以利用类似途径以及选择适于所需酯的转移酶而制造其他甲基丙烯酸酯类。
实施例XXV
3-羟基异丁酸酯、2-羟基异丁酸酯、3-羟基异丁酰基-COA或2-羟基异丁酰基-COA到甲基丙烯酸酯类的转化
本实施例描述了3–羟基异丁酸酯、2-羟基异丁酸酯、3-羟基异丁酰基-CoA或2-羟基异丁酰基-CoA到甲基丙烯酸酯类的转化。
本文包括的替代性方案是：
（1）A.糖类到3-羟基异丁酰基-CoA（酶，如前所述的途径），B.通过醇转移酶，3-羟基异丁酰基-CoA到3-羟基异丁酸酯，C.通过脱水酶或化学转化，3-羟基异丁酸酯到甲基丙烯酸酯类
（2）A.糖类到2-羟基异丁酰基-CoA（酶，如前所述的途径），B.通过醇转移酶，2-羟基异丁酰基-CoA到2-羟基异丁酸酯，C.通过脱水酶或化学转化，2-羟基异丁酸酯到甲基丙烯酸酯类
（3）A.糖类到3-羟基异丁酸酯（酶，如前所述的途径），B.通过3-羟基异丁酸酯形成酶，3-羟基异丁酸酯到3-羟基异丁酸酯，C.通过脱水酶或化学转化，3-羟基异丁酸酯到甲基丙烯酸酯类
（4）A.糖类到2-羟基异丁酸酯（酶，如前所述的途径），B.通过2-羟基异丁酸酯形成酶，2-羟基异丁酸酯到2-羟基异丁酸酯，C.通过脱水酶或化学转化，2-羟基异丁酸酯到甲基丙烯酸酯类
（5）A.提供到生物（可以是另一生物的产物（即共培养或单独发酵）或可以衍生自其他源）的外源性3-羟基异丁酸酯，B.通过3-羟基异丁酸酯形成酶，3-羟基异丁酸酯到2-羟基异丁酸酯，C.通过脱水酶或化学转化，3-羟基异丁酸酯到甲基丙烯酸酯类
（6）A.提供到生物（可以是另一生物的产物（即共培养或单独发酵）或可以衍生自其他源）的外源性3-羟基异丁酸酯，B.通过CoA转移酶或合成酶，3-羟基异丁酸酯到3-羟基异丁酰基-CoA，C.通过醇转移酶，形成3-羟基异丁酸酯，C.通过脱水酶或化学转化，3-羟基异丁酸酯到甲基丙烯酸酯类
（7）A.提供到生物（可以是另一生物的产物（即共培养或单独发酵）或可以衍生自其他源）的外源性2-羟基异丁酸酯，B.通过2-羟基异丁酸酯形成酶，2-羟基异丁酸酯到2-羟基异丁酸酯，C.通过脱水酶或化学转化，2-羟基异丁酸酯到甲基丙烯酸酯类
（8）A.提供到生物（可以是另一生物的产物（即共培养或单独发酵）或可以衍生自其他源）的外源性2-羟基异丁酸酯，B.通过CoA转移酶或合成酶，2-羟基异丁酸酯到2-羟基异丁酰基-CoA，C.通过醇转移酶，形成2-羟基异丁酸酯，C.通过脱水酶或化学转化，2-羟基异丁酸酯到甲基丙烯酸酯类
从3-羟基丁酸、2-羟基丁酸、3-羟基异丁酰基-CoA以及2-羟基异丁酰基-CoA到甲基丙烯酸酯类的途径如图28和图29中所示。通向这些甲基丙烯酸酯类前体的示例性途径已在本申请前文中进行了描述以及如图3、图5和图8中所示。3-羟基丁酸可以通过图3中所示的途径形成自琥珀酰-CoA或者如图5中所示形成自4-羟基丁酰基-CoA。3-羟基丁酰基-CoA可以如图5中所示的途径形成自4-羟基丁酰基-CoA。2-羟基异丁酸酯以及2-羟基丁酰基-CoA可以通过图8中所述的途径形成。
2-羟基异丁酸酯及其CoA酯，2-羟基异丁酰基-CoA，可以通过2-羟基异丁酰基-CoA转移酶或2-羟基异丁酰基-CoA合成酶相互转化。类似地，3-羟基异丁酸酯及其CoA酯，3-羟基异丁酰基-CoA，可以通过3-羟基异丁酰基-CoA转移酶或3-羟基异丁酰基-CoA合成酶相互转化。示例性CoA转移酶以及合成酶如上文实施例I以及实施例VII中所述。
3-羟基异丁酸酯脱水为甲基丙烯酸酯可以在与3-羟基异丁酸脱水为甲基丙烯酸的类似条件下执行。这些反应条件是温和的（参考：美国专利申请20100068773）。
2-羟基异丁酸酯到甲基丙烯酸酯类的化学脱水类似于2-羟基异丁酸到甲基丙烯酸的脱水，这在，例如，美国专利号3,666,805以及5,225,594中被披露。在这些参考文件中，通常在160-250℃反应温度下使用金属氧化物和氢氧化物、离子交换树脂、氧化铝、氧化硅、胺类、膦类、碱金属醇盐或羧酸盐使2-羟基异丁酸脱水。在一种方法（美国专利号5,225,594）中，2-羟基异丁酸与氢氧化钠在搅拌下真空（300torr）中于185-195℃反应，获得97.1%的2-羟基异丁酸转化率以及96%的甲基丙烯酸收率。可以应用一种类似方法使2-羟基异丁酸酯脱水为甲基丙烯酸酯类。
本申请通篇中已经引用了各种出版物。本申请中特此以引用方式并入这些出版物披露的全文（包括GenBank和GI号码公布），以便更充分地描述本发明所属的现有技术水平。虽然已经就上文提供的实施例对本发明进行了描述，但是应该理解的是，在不脱离本发明精神的情况下，可以作出各种修改。

Claims (46)

1.一种非天然存在的微生物，其具有甲基丙烯酸途径，所述微生物包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸，所述甲基丙烯酸途径包含选自如下的途径：
（a）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶；
（b）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；
（c）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）、柠康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；
（d）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）以及中康酸脱羧酶；
（e）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶；
（f）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；
（g）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）以及中康酸脱羧酶；
（h）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；
（i）乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；
（j）乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；
（k）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶；
（l）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；
（M）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）以及中康酸脱羧酶；以及
（n）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；
（o）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；以及
（p）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶。
2.权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸途径酶。
3.权利要求2所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含编码选自（a）-（p）的至少一种途径的每种酶的外源性核酸。
4.权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中，所述非天然存在的微生物进一步包含甲基丙烯酸酯类途径，该途径包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸，所述甲基丙烯酸酯类途径包含异丁烯酰基-CoA合成酶、异丁烯酰基-CoA转移酶以及醇转移酶。
5.权利要求4所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含两种或三种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸酯类途径酶。
6.权利要求4所述的非天然存在的微生物，其中，所述三种外源性核酸编码异丁烯酰基-CoA合成酶、异丁烯酰基-CoA转移酶以及醇转移酶。
7.一种非天然存在的微生物，其具有甲基丙烯酸酯类途径，所述微生物包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸，所述甲基丙烯酸酯类途径包含异丁烯酰基-CoA转移酶。
8.权利要求7所述的非天然存在的微生物，其中，该甲基丙烯酸酯类途径进一步包含异丁烯酰基-CoA合成酶以及醇转移酶。
9.权利要求7所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含两种或三种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸酯类途径酶。
10.权利要求7所述的非天然存在的微生物，其中，所述三种外源性核酸编码异丁烯酰基-CoA合成酶、异丁烯酰基-CoA转移酶以及醇转移酶。
11.权利要求7所述的非天然存在的微生物，其中，所述非天然存在的微生物进一步包含选自如下的甲基丙烯酸途径：
（a）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶；
（b）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；
（c）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）、柠康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；
（d）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）以及中康酸脱羧酶；
（e）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；以及柠康酸脱羧酶；
（f）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶；以及中康酸脱羧酶；
（g）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；以及中康酸脱羧酶；
（h）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶；以及柠康酸脱羧酶；
（i）乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；
（j）乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；
（k）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；以及柠康酸脱羧酶；
（l）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶；以及中康酸脱羧酶；
（M）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；以及中康酸脱羧酶；
（n）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶；以及柠康酸脱羧酶；
（o）3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（p）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（q）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（R）甲基丙二酰基-CoA变位酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（S）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（t）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶；
（u）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶；
（v）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（w）天冬氨酸氨基转移酶、谷氨酸变位酶、3-甲基天冬氨酸酶以及中康酸脱羧酶；
（x）α-酮戊二酸还原酶、2-羟基谷氨酸变位酶、3-甲基苹果酸脱水酶以及中康酸脱羧酶；
（y）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA转移酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶；
（z）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；烯酰基-CoA水合酶；以及3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（aa）4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶；巴豆酸酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA转移酶的任何一种；
（bb）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；
（cc）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；丁酰基-CoA脱氢酶；异丁酰基-CoA变位酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；
（dd）乳酸脱氢酶、乳酸-CoA转移酶、乳酰基-CoA脱水酶、酰基-CoA脱氢酶、丙酰基-CoA羧化酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（ee）缬氨酸氨基转移酶；2-酮异戊酸脱氢酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；
（ff）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；以及
（gg）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶。
12.一种非天然存在的微生物，其具有甲基丙烯酸途径，所述微生物包含编码甲基丙烯酸途径酶的以足以生产甲基丙烯酸的量表达的至少一种外源性核酸；所述非天然存在的微生物进一步包含：
（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；
（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或者
（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；
其中，所述甲基丙烯酸途径包含选自如下的途径：
（a）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）以及柠康酸脱羧酶；
（b）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；
（c）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）、柠康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；
（d）柠苹酸合酶、柠苹酸脱水酶（中康酸形成）以及中康酸脱羧酶；
（e）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；以及柠康酸脱羧酶；
（f）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶；以及中康酸脱羧酶；
（g）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；以及中康酸脱羧酶；
（h）柠苹酰-CoA裂解酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶；以及柠康酸脱羧酶；
（i）乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶以及柠康酸脱羧酶；
（j）乌头酸脱羧酶、衣康酸异构酶、柠康酸异构酶以及中康酸脱羧酶；
（k）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；以及柠康酸脱羧酶；
（l）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（柠康酸形成）；柠康酸异构酶；以及中康酸脱羧酶；
（M）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；以及中康酸脱羧酶；
（n）乌头酸脱羧酶；衣康酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酰-CoA脱水酶；柠苹酰-CoA转移酶、合成酶或水解酶；柠苹酸脱水酶（中康酸形成）；柠康酸异构酶；以及柠康酸脱羧酶；
（o）3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（p）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（q）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（R）甲基丙二酰基-CoA变位酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（S）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、醇/醛脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（t）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶；
（u）甲基丙二酰基-CoA变位酶、甲基丙二酰基-CoA表异构酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶以及3-氨基-2-甲基丙酸氨裂解酶；
（v）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（w）天冬氨酸氨基转移酶、谷氨酸变位酶、3-甲基天冬氨酸酶以及中康酸脱羧酶；
（x）α-酮戊二酸还原酶、2-羟基谷氨酸变位酶、3-甲基苹果酸脱水酶以及中康酸脱羧酶；
（y）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA转移酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶；
（z）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；烯酰基-CoA水合酶；以及3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（aa）4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶；巴豆酸酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；2-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA转移酶的任何一种；
（bb）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；
（cc）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；丁酰基-CoA脱氢酶；异丁酰基-CoA变位酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；
（dd）乳酸脱氢酶、乳酸-CoA转移酶、乳酰基-CoA脱水酶、酰基-CoA脱氢酶、丙酰基-CoA羧化酶、甲基丙二酰基-CoA还原酶、3-羟基异丁酸酯脱氢酶以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；
（ee）缬氨酸氨基转移酶；2-酮异戊酸脱氢酶；异丁酰基-CoA脱氢酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶；
（ff）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶；以及3-羟基异丁酸酯脱水酶；以及
（gg）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；巴豆酸酶；4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；4-羟基丁酰基-CoA变位酶；3-羟基异丁酰基-CoA脱水酶；以及异丁烯酰基-CoA合成酶或异丁烯酰基-CoA水解酶或异丁烯酰基-CoA转移酶。
13.权利要求12所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸途径酶。
14.权利要求13所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含编码选自（a）-（gg）的至少一种途径的每种酶的外源性核酸。
15.一种非天然存在的微生物，其具有2-羟基异丁酸途径，所述微生物包含编码2-羟基异丁酸途径酶的以足以生产2-羟基异丁酸的量表达的至少一种外源性核酸；所述非天然存在的微生物进一步包含：
（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；
（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或者
（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；
其中，所述2-羟基异丁酸途径包含选自如下的途径：
（a）乙酰乙酰基-CoA硫解酶；乙酰乙酰基-CoA还原酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；以及2-羟基异丁酰基-CoA转移酶或2-羟基异丁酰基-CoA水解酶或2-羟基异丁酰基-CoA合成酶；以及
（b）4-羟基丁酰基-CoA脱水酶；乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶；巴豆酸酶；3-羟基丁酰基-CoA变位酶；以及2-羟基异丁酰基-CoA水解酶或2-羟基异丁酰基-CoA合成酶或2-羟基异丁酰基-CoA转移酶的任何一种。
16.权利要求15所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含两种、三种、四种或五种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸途径酶。
17.权利要求15所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含编码选自（a）-（b）的至少一种途径的每种酶的外源性核酸。
18.一种非天然存在的微生物，其具有3-羟基异丁酸途径，所述微生物包含编码3-羟基异丁酸途径酶的以足以生产3-羟基异丁酸的量表达的至少一种外源性核酸；所述非天然存在的微生物进一步包含：
（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；
（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或者
（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；
其中所述3-羟基异丁酸途径包含选自如下的途径：
（a）4-羟基丁酰基-CoA变位酶；以及
（b）4-羟基丁酰基-CoA变位酶以及3-羟基异丁酰基-CoA合成酶或3-羟基异丁酰基-CoA水解酶或3-羟基异丁酰基-CoA转移酶。
19.权利要求18所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸途径酶。
20.权利要求18所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含编码选自（a）-（b）的至少一种途径的每种酶的外源性核酸。
21.一种非天然存在的微生物，其具有3-羟基异丁酰基-CoA途径，所述微生物包含编码3-羟基异丁酸途径酶的以足以生产3-羟基异丁酸的量表达的至少一种外源性核酸；所述非天然存在的微生物进一步包含：
（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；
（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或者
（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合；
其中所述3-羟基异丁酰基-CoA途径包含4-羟基丁酰基-CoA变位酶。
22.一种非天然存在的微生物，其具有甲基丙烯酸酯类途径，所述微生物包含包含编码甲基丙烯酸酯类途径酶的以足以生产甲基丙烯酸酯类的量表达的至少一种外源性核酸，所述甲基丙烯酸酯类途径包含醇转移酶或酯形成酶以及脱水酶。
23.权利要求22所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸酯类途径酶。
24.权利要求22所述的非天然存在的微生物，其中，所述两种外源性核酸编码醇转移酶以及脱水酶或或酯形成酶和脱水酶。
25.权利要求22所述的非天然存在的微生物，其中，所述脱水酶将3-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸酯转化为所述甲基丙烯酸酯类；或者，其中所述醇转移酶将3-羟基异丁酰基-CoA转化为3-羟基异丁酸酯或将2-羟基异丁酰基-CoA转化为2-羟基异丁酸酯。
26.权利要求22所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包括包含如下的甲基丙烯酸酯类途径：
（a）3-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或3-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；醇转移酶；以及脱水酶；
（b）3-羟基异丁酸酯形成酶和脱水酶；
（c）2-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或2-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；醇转移酶；以及脱水酶；或
（d）2-羟基异丁酸酯形成酶和脱水酶。
27.一种非天然存在的微生物，其具有甲基丙烯酸甲酯途径，所述微生物包含编码甲基丙烯酸甲酯途径酶的以足以生产甲基丙烯酸甲酯的量表达的至少一种外源性核酸，所述甲基丙烯酸甲酯途径包含醇转移酶或酯形成酶以及脱水酶。
28.权利要求27所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含两种外源性核酸，每种均编码甲基丙烯酸甲酯途径酶。
29.权利要求27所述的非天然存在的微生物，其中，所述两种外源性核酸编码醇转移酶以及脱水酶或酯形成酶和脱水酶。
30.权利要求7-11以及21-29中任一项所述的非天然存在的微生物，进一步包含：
（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；
（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或者
（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合。
31.权利要求12、15、18、21或30中任一项所述的非天然存在的微生物，其中，包含（i）的所述微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；醋酸激酶；磷酸转乙酰基酶；乙酰基-CoA合成酶；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶；铁氧还蛋白；及其组合。
32.权利要求12、15、18、21或30中任一项所述的非天然存在的微生物，其中，包含（ii）的所述微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；及其组合。
33.权利要求12、15、18、21或30中任一项所述的非天然存在的微生物，其中，所述微生物包含两种、三种、四种或五种外源性核酸，每种均编码（i）、（ii）或（iii）的酶。
34.权利要求12、15、18、21或30中任一项所述的非天然存在的微生物，其中，包含（i）的所述微生物包含编码ATP-柠檬酸裂解酶或柠檬酸裂解酶、富马酸还原酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的三种外源性核酸；其中包含（ii）的所述微生物包含编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶；以及H2氢化酶的四种外源性核酸；或者，其中包含（iii）的所述微生物包含编码CO脱氢酶以及H2氢化酶的两种外源性核酸。
35.权利要求1-34中任一项所述的非天然存在的微生物，其中，所述至少一种外源性核酸是异源性核酸，或者其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
36.一种用于生产甲基丙烯酸酯类的方法，该方法包含在各种条件下以及在足以生产3-羟基异丁酸酯、2-羟基异丁酸酯或甲基-3-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养一种非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物包含以足以生产3-羟基异丁酸酯、2-羟基异丁酸酯或甲基-3-羟基异丁酸酯的量表达的编码醇转移酶；或3-羟基异丁酸酯形成酶、2-羟基异丁酸酯形成酶或甲基-3-羟基异丁酸酯形成酶的外源性核酸，以及将所述3-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸酯类或将所述甲基-3-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸甲酯。
37.权利要求36所述的方法，其中，所述微生物包含：
包含如下的3-羟基异丁酸酯途径：
（a）3-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或3-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；
以及醇转移酶；或者
（b）3-羟基异丁酸酯形成酶；或者
包含如下的2-羟基异丁酸酯途径：
（a）2-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或2-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；
以及醇转移酶；或者
（b）2-羟基异丁酸酯形成酶。
38.一种用于生产甲基丙烯酸酯类的方法，所述方法包含在各种条件下以及在足以生产3-羟基异丁酸酯、2-羟基异丁酸酯或甲基-3-羟基异丁酸酯这么长的时间内培养一种非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物包含以足以生产3-羟基异丁酸酯、2-羟基异丁酸酯或甲基-3-羟基异丁酸酯的量表达的编码醇转移酶；或3-羟基异丁酸酯形成酶、2-羟基异丁酸酯形成酶或甲基-3-羟基异丁酸酯形成酶的外源性核酸，以及所述非天然存在的微生物进一步包含：
（i）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶；柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；或可选地选自异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、柠檬酰基-CoA合成酶或柠檬酰基-CoA裂解酶；
（ii）包含编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸的还原TCA途径，其中所述至少一种外源性核酸选自丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶以及H2氢化酶；或者
（iii）编码选自如下酶的至少一种外源性核酸：CO脱氢酶；H2氢化酶；及其组合，以及
将所述3-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸酯类；或将所述甲基-3-羟基异丁酸酯化学脱水以生产甲基丙烯酸甲酯。
39.权利要求38所述的方法，其中，所述微生物包含：
包含如下的3-羟基异丁酸酯途径：
（a）3-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或3-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；以及醇转移酶；或者
（b）3-羟基异丁酸酯形成酶；或者
包含如下的2-羟基异丁酸酯途径：
（a）2-羟基异丁酸酯-CoA转移酶或2-羟基异丁酸酯-CoA合成酶；以及醇转移酶；或者
（b）2-羟基异丁酸酯形成酶。
40.权利要求38-39中任一项的所述方法，其中，包含（i）的所述微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；醋酸激酶；磷酸转乙酰基酶；乙酰基-CoA合成酶；NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶；铁氧还蛋白；及其组合。
41.权利要求38-39中任一项的所述方法，其中，包含（ii）的所述微生物进一步包含编码选自如下酶的外源性核酸：乌头酸酶；异柠檬酸脱氢酶；琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA转移酶；富马酸酶；苹果酸脱氢酶；及其组合。
42.权利要求38-39中任一项的所述方法，其中，包含（i）的所述微生物包含编码ATP-柠檬酸裂解酶或柠檬酸裂解酶；富马酸还原酶；以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的三种外源性核酸；
其中，包含（ii）的所述微生物包含编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；CO脱氢酶；以及H2氢化酶的四种外源性核酸；或者
其中包含（iii）的所述微生物包含编码CO脱氢酶以及H2氢化酶的两种外源性核酸。
43.一种用于生产甲基丙烯酸的方法，包含在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸这么长的时间内培养权利要求1-6、12-14或30-35中任一项所述的非天然存在的微生物。
44.一种用于生产甲基丙烯酸酯类的方法，包含在各种条件下以及在足以生产甲基丙烯酸酯类这么长的时间内培养权利要求7-11、22-29或30-35中任一项所述的非天然存在的微生物。
45.一种用于生产2-羟基异丁酸、3-羟基异丁酸或3-羟基异丁酰基-CoA的方法，包含在各种条件下以及在足以生产2-羟基异丁酸、3-羟基异丁酸或3-羟基异丁酰基-CoA这么长的时间内培养权利要求15-21或30-35中任一项所述的非天然存在的微生物。
46.权利要求36-45中任一项的方法，其中，所述外源性核酸的至少一种是异源性核酸；或者，其中所述非天然存在的微生物在基本上厌氧的培养基中。
CN201280026997.7A 2011-04-01 2012-03-30 用于生产甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯类的微生物以及与之相关的方法 Pending CN103930558A (zh)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161471078P 2011-04-01 2011-04-01
US61/471,078 2011-04-01
US201161571232P 2011-06-22 2011-06-22
US61/571,232 2011-06-22
US201161509560P 2011-07-19 2011-07-19
US61/509,560 2011-07-19
US201161510054P 2011-07-20 2011-07-20
US61/510,054 2011-07-20
US201161512348P 2011-07-27 2011-07-27
US61/512,348 2011-07-27
PCT/US2012/031733 WO2012135789A2 (en) 2011-04-01 2012-03-30 Microorganisms for producing methacrylic acid and methacrylate esters and methods related thereto

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103930558A true CN103930558A (zh) 2014-07-16

Family

ID=46932426

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280026997.7A Pending CN103930558A (zh) 2011-04-01 2012-03-30 用于生产甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯类的微生物以及与之相关的方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9133487B2 (zh)
EP (1) EP2694663A4 (zh)
JP (1) JP2014518613A (zh)
KR (1) KR20140027195A (zh)
CN (1) CN103930558A (zh)
AU (1) AU2012236174A1 (zh)
BR (1) BR112013025226A2 (zh)
CA (1) CA2831885A1 (zh)
CO (1) CO6821890A2 (zh)
MX (1) MX2013011422A (zh)
PH (1) PH12013502032A1 (zh)
RU (1) RU2013148813A (zh)
SG (1) SG194026A1 (zh)
WO (1) WO2012135789A2 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109455828A (zh) * 2019-01-10 2019-03-12 江苏强农农业技术服务有限公司 一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法
CN109477082A (zh) * 2016-05-04 2019-03-15 环球生物能源公司 3-甲基巴豆酸脱羧酶(mdc)变体
CN109593663A (zh) * 2018-12-27 2019-04-09 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一种高效生物脱硫菌剂及其应用方法
CN111094543A (zh) * 2017-02-03 2020-05-01 徐东溵 从黄粉虫幼虫分离的具有塑料降解活性的微生物及利用其的塑料降解方法
CN111819284A (zh) * 2018-03-02 2020-10-23 三菱化学株式会社 3-羟基异丁酸酯和甲基丙烯酸酯的制造方法
CN112469813A (zh) * 2018-05-23 2021-03-09 三菱化学英国有限公司 用于产生甲基丙烯酸酯的方法
CN116064266A (zh) * 2022-11-01 2023-05-05 四川大学 盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9334508B2 (en) 2011-06-17 2016-05-10 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing carboxylic acids
WO2012177943A1 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto
CN104011216A (zh) 2011-06-30 2014-08-27 英威达技术有限责任公司 用于生产尼龙-7、尼龙-7,7和聚酯的生物转化工艺
US9102958B2 (en) 2011-12-16 2015-08-11 Invista North America S.á.r.l. Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage
US9102960B2 (en) 2011-12-16 2015-08-11 Invista North America S.á.r.l. Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage
AU2013243602B2 (en) 2012-04-02 2016-11-24 Genomatica, Inc. Car enzymes and improved production of fatty alcohols
GB201209425D0 (en) 2012-05-28 2012-07-11 Lucite Int Uk Ltd Process for production of methyl methacrylate
BR112015000069B1 (pt) 2012-09-10 2022-06-21 Mitsubishi Chemical Corporation Método para produzir éster de ácido metacrílico
WO2014038216A1 (ja) 2012-09-10 2014-03-13 三菱レイヨン株式会社 メタクリル酸及び／又はそのエステルの製造方法
WO2014071286A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Genomatica, Inc. Microorganisms for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing 1,2-propanediol
BR112015013413A2 (pt) 2012-12-14 2017-11-14 Invista Tech Sarl método para biosintetizar um produto e hospedeiro recombinante
MY175370A (en) 2012-12-17 2020-06-23 Genomatica Inc Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing adipate, 6-aminocaproate, hexamethylenediamine or caprolactam related thereto
US9580733B2 (en) 2012-12-31 2017-02-28 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 6-carbon chemicals via methyl-ester shielded carbon chain elongation
US9920336B2 (en) 2012-12-31 2018-03-20 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals from long chain fatty acids via oxidative cleavage
EP2938736A2 (en) 2012-12-31 2015-11-04 Invista Technologies S.A R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via c1 carbon chain elongation associated with coenzyme b synthesis
CN105408487A (zh) 2012-12-31 2016-03-16 英威达技术有限责任公司 通过甲酯保护的碳链延伸生产7碳化学物的方法
US9738911B2 (en) 2012-12-31 2017-08-22 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via pyruvate and succinate semialdehyde aldol condensation
CN105008543A (zh) 2012-12-31 2015-10-28 英威达技术有限责任公司 通过芳香族化合物生产7-碳化学物的方法
EP2971021A4 (en) 2013-03-15 2016-12-21 Genomatica Inc MICROORGANISMS AND METHODS FOR PRODUCING BUTADIENE AND RELATED COMPOUNDS BY ASSIMILATING FORMAT
WO2015002977A1 (en) * 2013-07-01 2015-01-08 Braskem S/A Ap 09 Modified microorganisms and methods of using same for anaerobic coproduction of isoprene and acetic acid
AU2014297758B2 (en) * 2013-08-01 2016-12-22 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing methacrylyl-CoA
TW201508064A (zh) * 2013-08-02 2015-03-01 Lucite Int Uk Ltd 製造甲基丙烯酸及其衍生物之方法
US20160201094A1 (en) * 2013-08-28 2016-07-14 Invista Technologies S.A.R.L. Methods for biosynthesizing methacrylate
US10174348B2 (en) 2013-08-29 2019-01-08 The Regents Of The University Of California Bacteria engineered for ester production
EP3077501B1 (en) 2013-12-03 2021-07-28 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for improving product yields on methanol using acetyl-coa synthesis
CA3192376A1 (en) 2013-12-27 2015-07-02 Genomatica, Inc. Methods and organisms with increased carbon flux efficiencies
AU2015225348B2 (en) * 2014-03-07 2017-06-08 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing methacrylic acid ester, and novel methacrylic acid ester synthase
LU92409B1 (en) * 2014-03-21 2015-09-22 Philipps Universit T Marburg Means and methods for itaconic acid production
BR112016026461A2 (pt) 2014-05-15 2017-12-12 Invista Tech Sarl métodos de produção de produtos químicos com 6 carbonos com uso de 2,6-diaminopimelato como precursor para 2-aminopimelato
BR112016029375A2 (pt) 2014-06-16 2017-10-17 Invista Tech Sarl métodos, reagentes e células para biossintetizar compostos
CN106795530A (zh) 2014-06-16 2017-05-31 英威达技术有限责任公司 用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞
CN106661597A (zh) 2014-06-16 2017-05-10 英威达技术有限责任公司 用于产生戊二酸和戊二酸甲酯的方法
EP3155109A1 (en) 2014-06-16 2017-04-19 Invista Technologies S.A R.L. Methods, reagents and cells for biosynthesizing compounds
DK3194604T3 (da) 2014-09-18 2020-05-25 Genomatica Inc Ikke-naturlig mikrobielle organismer med forbedret energisk effektivitet
MX2017010859A (es) 2015-02-27 2018-08-15 White Dog Labs Inc Metodo de fermentacion mixotrofica para poducir acetona, isopropanol, acido butirico y otros bioproductos, y mezclas de los mismos.
CA2985279A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Lucite International Uk Limited Process for the biological production of methacrylic acid and derivatives thereof
WO2016196962A1 (en) * 2015-06-04 2016-12-08 Bioamber Inc. Biobased production of functionalized alpha-substituted acrylates and c4-dicarboxylates
JP6800019B2 (ja) * 2015-10-23 2020-12-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア メチルメタクリレートの生物生産
US11441128B2 (en) 2015-10-30 2022-09-13 Genomatica, Inc. Methanol dehydrogenase fusion proteins
US10731185B2 (en) 2016-03-22 2020-08-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Genetically engineered microbes and methods for producing citramalate
GB201619827D0 (en) * 2016-11-23 2017-01-04 Lucite Int Uk Ltd Process for the production of methyl methacrylate
US10662273B2 (en) 2016-12-19 2020-05-26 Celanese International Corporation Waterborne acrylic dispersions with high biorenewable content
US20210079334A1 (en) 2018-01-30 2021-03-18 Genomatica, Inc. Fermentation systems and methods with substantially uniform volumetric uptake rate of a reactive gaseous component
EP3533878A1 (en) * 2018-02-28 2019-09-04 Dutch DNA Biotech B.V. Process for producing citramalic acid employing aspergillus
EP3553045A1 (en) 2018-04-09 2019-10-16 Kemijski Institut Process and catalysts to produce methacrylic acid monomer from biomass-derived carboxylic acids
US20220177895A1 (en) 2018-06-26 2022-06-09 Genomatica, Inc. Engineered microorganisms with g3p -> 3pg enzyme and/or fructose-1,6-bisphosphatase including those having synthetic or enhanced methylotrophy
EP4244347A1 (en) * 2020-11-10 2023-09-20 Industrial Microbes, Inc. Microorganisms capable of producing poly(hiba) from feedstock
WO2023190564A1 (ja) * 2022-03-29 2023-10-05 国立研究開発法人理化学研究所 メタクリル酸の製造方法
GB2621337A (en) * 2022-08-08 2024-02-14 Mitsubishi Chemical Uk Ltd Process for the biological production of methacrylic acid and derivatives thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090275096A1 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of methacrylic acid
WO2011031897A1 (en) * 2009-09-09 2011-03-17 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the co-production of isopropanol with primary alcohols, diols and acids

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582943B1 (en) 2002-02-05 2003-06-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for producing 2-hydroxyisobutyric acid and methacrylic acid from acetone cyanohydrin
CN101268196B (zh) * 2005-09-19 2014-03-12 西巴特殊化学品控股有限公司 生物催化的(甲基)丙烯酸酯的生产
DE102006025821A1 (de) 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
AU2008257512A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Evonik Rohm Gmbh A process for preparing methacrylic acid or methacrylic esters

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090275096A1 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of methacrylic acid
WO2011031897A1 (en) * 2009-09-09 2011-03-17 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the co-production of isopropanol with primary alcohols, diols and acids

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109477082A (zh) * 2016-05-04 2019-03-15 环球生物能源公司 3-甲基巴豆酸脱羧酶(mdc)变体
CN109477082B (zh) * 2016-05-04 2023-06-16 环球生物能源公司 3-甲基巴豆酸脱羧酶(mdc)变体
CN111094543A (zh) * 2017-02-03 2020-05-01 徐东溵 从黄粉虫幼虫分离的具有塑料降解活性的微生物及利用其的塑料降解方法
CN111094543B (zh) * 2017-02-03 2023-12-22 博路凌波股份有限公司 从黄粉虫幼虫分离的具有塑料降解活性的微生物及利用其的塑料降解方法
CN111819284A (zh) * 2018-03-02 2020-10-23 三菱化学株式会社 3-羟基异丁酸酯和甲基丙烯酸酯的制造方法
CN111819284B (zh) * 2018-03-02 2024-03-08 三菱化学株式会社 3-羟基异丁酸酯和甲基丙烯酸酯的制造方法
CN112469813A (zh) * 2018-05-23 2021-03-09 三菱化学英国有限公司 用于产生甲基丙烯酸酯的方法
CN109593663A (zh) * 2018-12-27 2019-04-09 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一种高效生物脱硫菌剂及其应用方法
CN109593663B (zh) * 2018-12-27 2021-12-07 山东海景天环保科技股份公司 一种高效生物脱硫菌剂及其应用方法
CN109455828A (zh) * 2019-01-10 2019-03-12 江苏强农农业技术服务有限公司 一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法
CN109455828B (zh) * 2019-01-10 2021-08-06 山东亿安生物工程有限公司 一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法
CN116064266A (zh) * 2022-11-01 2023-05-05 四川大学 盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140027195A (ko) 2014-03-06
JP2014518613A (ja) 2014-08-07
MX2013011422A (es) 2014-09-01
CA2831885A1 (en) 2012-10-04
US20130065279A1 (en) 2013-03-14
US9133487B2 (en) 2015-09-15
BR112013025226A2 (pt) 2018-09-11
WO2012135789A3 (en) 2014-05-01
AU2012236174A1 (en) 2013-10-17
WO2012135789A2 (en) 2012-10-04
RU2013148813A (ru) 2015-06-10
PH12013502032A1 (en) 2014-01-06
EP2694663A2 (en) 2014-02-12
EP2694663A4 (en) 2015-04-29
SG194026A1 (en) 2013-11-29
CO6821890A2 (es) 2013-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103930558A (zh) 用于生产甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯类的微生物以及与之相关的方法
US11708592B2 (en) Microorganisms and methods for the production of caprolactone
KR102043381B1 (ko) 2,4-펜타디에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올 및 관련 알코올을 생합성하기 위한 미생물과 방법
US11371063B2 (en) Microorganisms and methods for the production of butadiene using acetyl-coA
EP3967747B1 (en) Microorganisms and methods for improving product yields on methanol using acetyl-coa synthesis
CN102625845A (zh) 协同产生异丙醇与伯醇，二元醇和酸的微生物和方法
US20230136909A1 (en) Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing 3-hydroxyisobutyrate or methacrylic acid related thereto
CN103025877A (zh) 用于生物合成芳族化合物、2,4-戊二烯酸和1,3-丁二烯的微生物和方法
AU2012273093A1 (en) Microorganisms for producing 6-aminocaproic acid
TW202102678A (zh) 用於生產特定長度脂肪醇及相關化合物之微生物及方法
AU2012273005A1 (en) Microorganism for producing primary alcohols and related compounds and methods related thereto
AU2013202930B2 (en) Microorganisms and methods for producing 1,3-butanediol and related alcohols

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140716