CN103919690A - 肉毒杆菌纳米乳液 - Google Patents

Abstract

本文所述的实施方案涉及包含肉毒杆菌毒素的纳米乳液。在一个实施方案中，该纳米乳液通过高压微流化制备并包含完全在10至300纳米之间的粒度分布。本发明所设想的纳米乳液可用于化妆品和肌肉挛缩症状的医学治疗。例如，肉毒杆菌毒素可以放松面部肌肉以使皮肤皱纹变平且较不明显。此外，本发明设想了可以在个人家中私下自给药而无需医务监督的化妆制品。

Description

肉毒杆菌纳米乳液

本申请是申请号200680052147.9、申请日2006年12月1日、发明名称“肉毒杆菌纳米乳液”的中国专利申请的分案申请。

相关申请

本申请涉及并依据35USC119(e)要求2005年12月1日提交的USSN60/741,139（‘139申请）的优先权；‘139申请的所有内容经此引用并入本文。

技术领域

本发明提供了含有肉毒杆菌毒素的纳米粒子组合物（例如纳米乳液）。

背景技术

肉毒杆菌已经在化妆皮肤学中用于治疗各种皮肤状况和失调症。例如，已经使用肉毒杆菌治疗皱纹（例如运动过度的面部线条）、颈阔肌带、肩颈纹（décolleté bands）、多汗症和某些神经肌肉失调症。通常，肉毒杆菌毒素通过注入相关部位来递送（即注入对皱纹或纹路形成负责的相关肌肉群；注入含汗腺的皮肤；等等）。

不幸地，递送肉毒杆菌毒素的现有策略产生许多不利影响。例如，不当注射技术会破坏组织和/或会将肉毒杆菌毒素送入非预期和/或不合意的位置。在眼周区域，眼睑和眉毛下垂是重要的不利影响。还会发生疼痛、血肿、瘀斑和青肿。

尽管已经开发出可以使某些副作用最小化的技术（例如在注射前将皮肤冷却以减少疼痛、血肿、瘀斑和青肿），仍然需要开发出用于递送肉毒杆菌毒素的改进的***和/或制剂。

发明内容

本发明提供了含有肉毒杆菌毒素的纳米粒子组合物（例如纳米乳液）。这类组合物可用在例如多种化妆和医疗用途中。在本发明的一些实施方案中，肉毒杆菌纳米粒子组合物可用于抚平皱纹。在本发明的一些实施方案中，肉毒杆菌纳米粒子组合物用于治疗多汗症。在本发明的一些实施方案中，肉毒杆菌纳米粒子组合物用于治疗肌肉挛缩和/或活动过度。本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物的其它用途在本文中作出描述和/或是本领域技术人员显而易见的。

在本发明的一些实施方案中，肉毒杆菌纳米粒子组合物通过暴露在高剪切力下来制备；在一些实施方案中，肉毒杆菌纳米粒子组合物通过微流化来制备；在一些实施方案中，肉毒杆菌纳米粒子组合物通过高压均化来制备。

本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物可以通过任何可用的方式给药，包括但不限于，经皮和注射（例如静脉内、皮下或肌内注射）。本发明包括下述发现，即某些肉毒杆菌毒素纳米粒子组合物可以在不改变或变动皮肤结构的情况下经皮递送。例如，不需要研磨剂或侵蚀或损害表皮层的试剂来实现本发明的肉毒杆菌毒素的经皮递送。因此，在许多实施方案中，在不会明显刺激皮肤的情况下实现肉毒杆菌毒素的经皮递送。

根据本发明，经皮递送可以以多种方式实现。在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物包含在乳霜中以便通过将乳霜施加到皮肤上来将肉毒杆菌毒素给药至对象。在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物包含在经皮贴膏中以使肉毒杆菌毒素从贴膏给药至对象。

在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物是含有具有最大和最小直径的粒子群的乳液，其中最大和最小直径之差不超过大约600,550,500,450,400,350,300,250,200,150,100,90,80,70,60,50或更少纳米。

在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有小于大约600,550,500,450,400,350,300,250,200,150,130,120,115,110,100,90,80纳米或更小的直径。

在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有在大约10至大约600纳米范围内的直径。在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子具有在大约10-300,10-200,10-150,10-130,10-120,10-115,10-110,10-100或10-90纳米范围内的直径。

在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有小于大约300,250,200,150,130,120或115,110,100或90纳米的平均粒度。在一些实施方案中，平均粒度为大约10-300,50-250,60-200,65-150,70-130纳米范围内。在一些实施方案中，平均粒度为大约80-110纳米。在一些实施方案中，平均粒度为大约90-100纳米。

在一些实施方案中，本发明的组合物内的大部分粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有小于指定尺寸或在指定范围内的直径。在一些实施方案中，大部分是指该组合物中的粒子的多于50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%或更多。

在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物基本不含直径大于大约120纳米的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）。在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有在大约30至大约115纳米范围内的直径。在一些实施方案中，该组合物中的大多数粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有在此范围内的直径；在一些实施方案中，这类组合物基本不含直径大于大约115纳米的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）。在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子(例如含肉毒杆菌毒素的粒子)具有在大约30至大约70纳米范围内的直径。在一些实施方案中，这类组合物中的大多数粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有在此范围内的直径；在一些实施方案中，该组合物基本不含直径大于大约70纳米的粒子。

在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物具有至少两个截然不同的粒子群。例如，在一些这类实施方案中，本发明的纳米粒子组合物中的大部分粒子具有在大约30-70纳米范围内的直径，而第二群粒子具有在70-120纳米范围内的直径。在一些这类实施方案中，该组合物不被直径大于120纳米的粒子污染。

在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素部分或完全存在于本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物中的纳米粒子中；在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素吸附在本发明的肉毒杆菌组合物中的纳米粒子表面上；在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素与纳米粒子和分散介质之间的界面结合。在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素在纳米粒子组合物内的两个或更多个这些位置中被发现。

在本发明的一些实施方案中，肉毒杆菌毒素选自A型、B型、C₁型、C₂型、D型、F型和G型。在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素作为分离的蛋白质存在；在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素作为蛋白质络合物的一部分存在。

本申请参考各种专利公开，它们均经此引用并入本文。

定义

磨损：本文所用的术语“磨损”是指改变、分解、去除或破坏皮肤表层的任何方式。在一些实施方案中，磨损是指改变、分解、去除或破坏皮肤表层的机械方式。在一些实施方案中，磨损是指改变、分解、去除或破坏皮肤表层的化学方式。为给出几个实例，如去角质剂、细粒（例如镁或铝粒子）、酸（例如α-羟基酸或β-羟基酸）、醇之类的试剂可能造成磨损。一般而言，渗透增强剂，如Donovan（例如美国公开2004/009180和2005/175636，和PCT公开WO04/06954）和Graham（例如美国专利6,939,852和美国公开2006/093624）等所述的那些预计造成磨损。当然，本领域普通技术人员会认识到，特定试剂可能在以某种浓度存在或与一种或多种其他试剂联用时造成磨损，但可能在不同的情况下不造成磨损。因此，特定材料是否是“研磨剂”取决于具体情况。磨损可以由本领域普通技术人员例如通过观察皮肤发红或刺激和/或显示角质层的改变、分解、去除或侵蚀的皮肤组织学检查来评估。

给药：本文所用的术语“给药“是指向对象递送本发明的纳米粒子组合物，不限于任何特定途径，而是指医疗团体认为适当的任何途径。例如，本发明考虑了包括但不限于经皮、肌内或皮下的递送或给药途径。在本发明的某些实施方案中，给药是经皮的。

生物活性剂：本文所用的短语“生物活性剂”是指在生物***和/或有机体中具有活性的任何物质。例如，在向有机体给药时对该有机体具有生物效应的物质被视为生物活性。在具体实施方案中，当蛋白质或多肽是生物活性的时，共享蛋白质或多肽的至少一种生物活性的该蛋白质或多肽的部分通常被称作“生物活性”部分。肉毒杆菌毒素是根据本发明的生物活性剂。

肉毒杆菌纳米粒子组合物：本文所用的术语“肉毒杆菌纳米粒子组合物”是指其中至少一个纳米粒子包括肉毒杆菌毒素的任何纳米粒子组合物。肉毒杆菌毒素可以存在于纳米粒子内，纳米粒子表面上和/或限定纳米粒子的胶束膜内。

肉毒杆菌毒素：本文所用的术语“肉毒杆菌毒素”是指由梭形芽孢肉毒杆菌（Clostridium botulinum）制成的任何神经毒素。除非另行指明，该术语包括保持适当活性（例如肌肉松弛活性）的这类神经毒素的片段或部分（例如轻链和/或重链）。本文所用的短语“肉毒杆菌毒素”包括肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。本文所用的肉毒杆菌毒素还包括肉毒杆菌毒素络合物（即例如，300、600和900kD络合物）以及纯化的（即例如分离的）肉毒杆菌毒素（即例如大约150kD）。“纯化的肉毒杆菌毒素”是指与其它蛋白质（包括用于肉毒杆菌毒素络合物的蛋白质）分离或基本分离的肉毒杆菌毒素。纯化的毒素可以高于95%纯度，且优选高于99%纯度。本领域普通技术人员会认识到，本发明不限于肉毒杆菌毒素的任何具体来源。例如，根据本发明使用的肉毒杆菌毒素可以从梭形芽孢肉毒杆菌中分离，可以化学合成，可以重组制造（即在宿主细胞或除梭形芽孢肉毒杆菌外的有机体中），等等。

药妆品：本文所用的术语“药妆品”是指既有化妆又有药物性质的任何试剂（例如过氧化苯甲酰或视黄醇）。药妆品通常可外用以改进络合或整体物理外观。药妆品可作为包括但不限于乳霜、油、泡沫、喷剂、液体等的组合物应用。为给出几个实例，类胡萝卜素、酚化合物和/或水溶性抗氧化剂可充当药妆品。

化妆制剂：术语“化妆制剂”在本文中用于表示含有一种或多种具有化妆性质的试剂的局部施用组合物。为给出几个实例，化妆制剂可以是皮肤软化剂、营养洗剂型乳液、清洁洗剂、清洁霜、皮肤乳、润肤洗剂、按摩霜、润肤霜、化妆基料、唇膏、面膜或面部凝胶、清洁制剂，例如香波、漂洗剂、沐浴液、润发剂、或肥皂，和/或皮肤病学组合物，例如洗剂、油膏、凝胶、乳霜、贴膏和/或喷剂。

乳霜：术语“乳霜”是指通常配制成施加到皮肤上的可涂开组合物。乳霜通常含有油和/或脂肪酸基基质。根据本发明配制的乳霜可以含有纳米粒子并在局部给药时能够基本完全渗透（例如这类纳米粒子完全渗透）皮肤。这类乳霜也可以充当并入的材料（例如用于肉毒杆菌毒素）的载体。

分散介质：本文所用的术语“分散介质”是指液体介质，粒子（例如纳米粒子）分散在其中。一般而言，在合并至少两种不混溶材料时形成分散体。“水包油”分散体是油性粒子分散在水性分散介质中的分散体。“油包水”分散体是水性粒子分散在油性分散介质中的分散体。本领域普通技术人员会认识到，分散体可以由任何两种不混溶介质形成并且不严格限于水性和油性介质的组合。术语“分散介质”因此广泛适用于任何分散介质，尽管其通常是指“水性”和“油性”类别。

包封的：术语“包封的”（也称作“包封”）在本文中用于表示包封体完全被另一材料包围。为给出一个实例，可以将生物活性剂（例如肉毒杆菌毒素）包封在本发明的乳液的纳米粒子内。这种包封可以例如在纳米粒子组合物（例如纳米乳液）形成过程中，例如在微流化过程中实现。

与...联合：本文所用的短语“与...联合”递送是指两种或更多材料的共递送。特别地，根据本发明，该短语在本文中用于表示生物活性剂与本发明的纳米粒子和/或纳米粒子组合物一起递送。当物质或试剂与纳米粒子和/或纳米粒子组合物结合；被纳米粒子包封或完全包围；与纳米粒子界面结合；和/或吸附到纳米粒子外表面上时，该物质或试剂与纳米粒子联合递送。要与纳米粒子和/或纳米粒子组合物联合递送的物质或试剂可以共价连接到纳米粒子和/或纳米粒子组合物上或不这样。要与纳米粒子和/或纳米粒子组合物联合递送的物质或试剂可以通过吸附力连接到纳米粒子和/或纳米粒子组合物上或不这样。在本发明的许多实施方案中，与纳米粒子或纳米粒子组合物联合递送的生物活性剂是肉毒杆菌毒素。

微流化：术语“微流化”在本文中通常用于描述已暴露在高剪切力下的组合物。在本发明的一些实施方案中，该组合物通过已知为“微流化器”的仪器或装置处理。但是，在其最广泛意义上，该术语包含已借助任何方式暴露在高剪切力下的任何组合物。例如，可以通过空化或通过高压均化来施加高剪切力。或者或另外，高剪切力可以通过暴露在高压，例如大约15,000psi下来施加。在一些实施方案中，这类高压在大约18,000至大约26,000psi的范围内；在一些实施方案中，其在大约20,000至25,000psi的范围内。如文中所述，高剪切力可以通过穿过如处理机（Microfluidics Corporation/MFICCorporation）的仪器或其他类似设备来施加。处理机通过将产品经由微通道加速至高速以减小尺寸至纳米范围来提供高压和所产生的高剪切速率。将流体一分为二并高速（50-300m/s范围）推过典型尺寸为大约75微米的微通道。在流体离开微通道时，其形成射流，其与来自相对的微通道的射流碰撞。在通道内，流体承受量级高于传统技术的高剪切（多达10⁷l/s）。射流碰撞造成亚微米级混合。因此，高剪切和冲击在技术中造成粒度降低和微相流的混合。在本发明的一些实施方案中，样品通过在高剪切力下暴露少于大约10分钟来“微流化”。在一些实施方案中，该时段少于大约9,8,7,6,5,4,3,2或1分钟。在一些实施方案中，该时段在大约1-2分钟或更低的范围内；在一些实施方案中，该时段为大约30秒。在本发明的一些实施方案中，样品通过单次暴露在高剪切力下来“微流化”；这种实施方案在此被称作“单程”微流化。

纳米乳液：乳液传统上在本领域中被定义为“由使用或不使用乳化剂分散在通常为液滴大于胶体尺寸的不混溶液体中的液体构成的体系”Medline Plus Online Medical Dictionary,Merriam Webster(2005)。术语"纳米乳液"在本文中用于表示至少一些液滴（或粒子）具有纳米级直径的乳液。如本领域普通技术人员理解的那样，纳米乳液的特征在于，液滴或粒子比微乳液液滴或粒子小一千倍。

纳米粒子：本文所用的术语“纳米粒子”是指直径小于1000纳米（nm）的任何粒子。在一些实施方案中，纳米粒子具有如NationalScience Foundation定义的小于300纳米的直径。在一些实施方案中，纳米粒子具有如the National Institutes of Health定义的小于100纳米的直径。本领域普通技术人员会认识到，本文所用的术语“纳米粒子”描述了在分散体或乳液中的分散的相。

纳米粒子组合物：本文所用的术语“纳米粒子组合物”是指包括至少一个纳米粒子的任何组合物。在一些实施方案中，纳米粒子组合物是纳米粒子的均匀集合。本文所述的纳米粒子组合物通常是乳液或分散体。在一些实施方案中，纳米粒子组合物是稳定的。在一些实施方案中，纳米粒子组合物包括要与纳米粒子联合递送的一种或多种生物活性剂。在一些实施方案中，纳米粒子组合物是纳米乳液。本领域普通技术人员会认识到，纳米粒子组合物可以根据任何可用方式制备，包括例如化学或机械方式。在本发明的一些实施方案中，纳米粒子组合物通过对样品施以微流化来制备。在本发明的一些实施方案中，纳米粒子组合物在不使用有毒溶剂的情况下制备和/或基本不含有毒溶剂。

不被污染：术语“不被污染”在本文中用于表示纳米粒子组合物时与“基本不含”同义，并描述了含有不多于大约50%所列材料的纳米粒子组合物。例如，如果纳米粒子组合物被说成“基本不含”直径超出所列范围的粒子，则该组合物中不多于大约50%的粒子具有超出此范围的直径。在一些实施方案中，不多于25%的粒子超出此范围。在一些实施方案中，不多于20%,19%,18%,17%,16%,15%,14%,13%,12%,10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%,0.5%或更少的粒子具有超出所列范围的直径。

可药用：本文所用的术语“可药用”是指在健全医疗鉴定的范围内适用于与人类和动物组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的与合理的益处/风险比率相称的试剂。

预混物：本文所用的术语“预混物”是指随后用于产生纳米粒子组合物或根据本发明的组分的任何组合。例如，预混物是经受高剪切力时产生本发明的纳米粒子的成分的任何集合。在一些实施方案中，预混物是在经受高剪切力时产生纳米粒子组合物，例如均匀纳米粒子组合物的成分的集合。预混物通常含有液体分散介质和足以在分散介质内产生纳米粒子的其它组分。根据本发明，肉毒杆菌毒素也可以包括在预混物中。该预混物也可以含有一种或多种表面活性剂和/或其它试剂。在一些实施方案中，预混物构成溶液。在预混物包括肉毒杆菌毒素和/或另一生物活性剂的一些具体实施方案中，在对预混物施加高剪切力之前肉毒杆菌毒素（和/或其它生物活性剂）在溶液中。

不显疗效：本文所用的术语“不显疗效”是指不响应医疗从业者通常观察到的生物活性剂或药物组合物递送后的预期临床效力的任何对象。

自给药：本文所用的术语“自给药”是指对象不需要医务监督就能够向自身给药组合物的情况。在本发明的一些实施方案中，自给药可以在诊所外进行。为给出一个实例，在本发明的一些实施方案中，对象可以在自己家中施用化妆面霜。

小分子：一般而言，“小分子”在本领域中被理解为是指尺寸小于大约5千道尔顿（Kd）的有机分子。在一些实施方案中，小分子小于大约3Kd、2Kd或1Kd。在一些实施方案中，小分子小于大约800道尔顿（D）,600D,500D,400D,300D,200D或100D。在一些实施方案中，小分子是非聚合的。在一些实施方案中，小分子不是蛋白质、肽或氨基酸。在一些实施方案中，小分子不是核酸或核苷。在一些实施方案中，小分子不是糖或多糖。

稳定的：术语“稳定的”在本文中用于纳米粒子组合物时，是指该组合物在一段时间内保持其物理结构的一个或多个方面（例如尺寸范围和/或粒子分布）。在本发明的一些实施方案中，稳定的纳米粒子组合物是平均粒度、最大粒度、粒度范围和/或粒度分布（即高于指定粒度和/或超出指定粒度范围的粒子的百分比）保持一段时间的粒子组合物。在一些实施方案中，该时段为至少大约1小时；在一些实施方案中，该时段为大约5小时，10小时，一(1)天，一(1)周，两(2)周,一(1)个月,两(2)个月，三(3)个月，四(4)个月，五(5)个月，六(6)个月，八(8)个月，十(10)个月，十二(12)个月，二十四(24)个月，或更久。在一些实施方案中，该时段在大约一(1)天至二十四(24)个月，两(2)周至十二(12)个月，两(2)个月至五(5)个月等的范围内。例如，如果纳米乳液粒子群经过长时间储存、温度变化和/或pH变化且该粒子群中大部分纳米粒子保持在指定范围（例如大约10-120纳米）内的直径，该纳米乳液是稳定的。对于一些这样的粒子群，大部分是多于大约50%,60%,70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%或更多。在本发明的一些实施方案中，当纳米粒子组合物包含肉毒杆菌毒素和/或至少一种其它生物活性剂时，如果生物活性剂（例如肉毒杆菌毒素）在该组合物中的浓度在指定条件组合下保持指定时长，则该纳米粒子组合物被视为稳定。

对象：本文所用的术语“对象”是指可将本发明的纳米粒子组合物递送或给予其的任何动物。例如，对象可以是人、狗、猫、牛、猪、马、小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠等等。在本发明的许多实施方案中，对象是人。

症状减轻：根据本发明，当特定疾病、失调症或状况的一个或多个症状的量级（例如强度）或频率减轻时，“症状减轻”。为清楚起见，特定症状发作的延迟被视为降低症状频率的一种形式。为给出几个实例，当所涉状况是面部皱纹时，当所选区域中一个或多个皱纹的深度和/或严重性降低时，该状况的症状减轻。当所涉状况是肌肉挛缩时，当肌肉变得较不紧张且更加松弛时，症状减轻。本发明不仅限于症状消除的情况。本发明具体考虑了减轻（尽管没有完全消除）一个或多个症状（和/或由此“改善”对象的状况）的治疗。

治疗有效量：本文所用的术语“治疗有效量”是指在对患有或易患一种疾病、失调症和/或状况的个体给药时足以治疗该疾病、失调症和/或状况的量。本领域普通技术人员会认识到，术语“治疗有效量”实际上不要求在特定个体中实现成功的治疗。相反，治疗有效量可以是在施用或递送给相当大量需要这种治疗的对象时提供特定的所需药理学响应的量。要明确理解的是，特定对象可能实际上对“治疗有效量”不显疗效。为给出一个实例，不显疗效的对象可能具有低生物利用率以致不能获得临床效力。在一些实施方案中，治疗有效量可能是指在一个或多个特定组织中测得的量。

有毒溶剂：本文所用的术语“有毒溶剂”是指可能改变、分解、去除或破坏动物组织的任何物质。本领域普通技术人员会理解的是，动物组织可以包括活细胞、死细胞、细胞外基质、细胞连接点、生物分子等。为给出几个实例，有毒溶剂包括二甲亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、氯仿、四甲基甲酰胺、丙酮、乙酸酯和链烷。

治疗：本文所用的术语“治疗”是指部分或完全减轻、改善、缓和、抑制特定疾病、失调症和/或状况（例如面部皱纹）的一种或多种症状或特征，延缓其发作、降低其严重程度和/或降低其发作率的生物活性剂的任何给药。这类治疗可用于没有表现出相关疾病、失调症和/或状况的对象和/或仅表现出该疾病、失调症和/或状况的早期征兆的对象。或者或另外，这类治疗可用于表现出相关疾病、失调症和/或状况的一种或多种确认征兆的对象。

均匀的：术语“均匀的”在本文中用于表示纳米粒子组合物时，是指其中单个纳米粒子具有指定粒径尺寸范围的纳米粒子组合物。例如，在一些实施方案中，均匀的纳米粒子组合物是其中最小直径与最大直径差不超过大约600,550,500,450,400,350,300,250,200,150,100,90,80,70,60,50或更少纳米的粒子组合物。在一些实施方案中，本发明的均匀肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有小于大约600,550,500,450,400,350,300,250,200,150,130,120,115,110,100,90,80纳米或更小的直径。在一些实施方案中，本发明的均匀肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有在大约10至大约600纳米范围内的直径。在一些实施方案中，本发明的均匀肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子具有在大约10-300,10-200,10-150,10-130,10-120,10-115,10-110,10-100或10-90纳米范围内的直径。在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有低于大约300,250,200,150,130,120或115,110,100或90纳米的平均粒度。在一些实施方案中，平均粒度在大约10-300,50-250,60-200,65-150,70-130纳米的范围内。在一些实施方案中，平均粒度为大约80-110纳米。在一些实施方案中，平均粒度为大约90-100纳米。在一些实施方案中，本发明的均匀纳米粒子组合物内的大部分粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有低于指定尺寸或在指定范围内的直径。在一些实施方案中，大部分是指组合物中粒子的多于50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%或更多。在本发明的一些实施方案中，均匀的纳米粒子组合物通过样品的微流化获得。

附图简述

图1显示了微流化的肉毒杆菌毒素纳米乳液的粒径分布的一个实施方案。

图2显示了均化的肉毒杆菌毒素微乳液的粒径分布的一个实施方案。

图3显示了在包含肉毒杆菌纳米粒子组合物的本发明的组合物的局部给药之前（A组）和两周后（B组）后尝试眉毛的最大升高的患者。

具体实施方式

某些优选实施方案描述

本发明涉及可用于化妆和医学治疗的肉毒杆菌毒素纳米乳液组合物。本发明尤其提供了用于制造包含肉毒杆菌毒素的纳米粒子组合物的***，并进一步提供了在各种情况中使用这类组合物的方法。在一个实施方案中，医学治疗减缓肌肉挛缩和/或过度活动；在另一实施方案中，医学治疗减缓多汗症。在一个实施方案中，化妆治疗抚平皮肤皱纹。在一个实施方案中，肉毒杆菌毒素纳米乳液通过微流化制备。肉毒杆菌毒素纳米乳液的给药可以通过包括但不限于肌内注射或经皮局部给药的方法进行。

肉毒杆菌毒素生物学

肉毒杆菌毒素（BTX）BTX在自然中由厌氧的***梭形芽孢肉毒杆菌生成并且是有效的多肽神经毒素。最显著地，BTX在人类和动物中造成被称作肉毒杆菌中毒的神经麻痹性疾病。BTX可以明显未被占用地（untenanted）透过肠道内衬并侵袭外周运动神经元。肉毒杆菌毒素中毒的症状可以从行走、吞咽和交谈困难进行到呼吸肌肉的麻痹，和死亡。

BTX-A是人类已知的最致命的天然生物试剂。对于市售BTX-A，雌性Swiss Webster小鼠（18-20克）中的LD₅₀为大约50皮克；该量被定义为1单位BTX-A。在摩尔基础上，BTX-A比白喉致命大约18亿倍，比***致命大约6亿倍，比眼镜蛇毒素致命大约3千万倍，并且比霍乱致命大约一千二百万倍（Singh等人编辑,"Critical Aspectsof Bacterial Protein Toxins"Natural Toxins II,第63-84页,Plenum Press,New York,1996）。

肉毒杆菌毒素的不同血清型所影响的动物物种和所引发的麻痹严重性和持续时间不同。例如，已经确定，如通过在大鼠中产生的麻痹速度测得，BTX-A比BTX-B更有效500倍。另外，BTX-B经确定在480U/kg的剂量下在灵长动物中无毒，这是BTX-A的灵长动物LD₅₀的大约12倍。此外，已知的是，肉毒杆菌毒素B型在肌内注射时具有更短的活性持续时间并且在相同剂量水平下也不如BTX-A有效。

肉毒杆菌毒素明显以高亲和力结合到类胆碱能的运动神经元上，移向神经元中并阻断乙酰胆碱的释放。

肉毒杆菌毒素已经在临床情况中用于治疗某些神经肌肉失调症。特别地，BTX-A已经被美国食品药品管理局批准用于治疗睑痉挛、斜视和偏侧面肌痉挛。非A型肉毒杆菌毒素血清型明显具有比BTX-A低的效力和/或更短的活性持续时间。外周肌肉内BTX-A的临床效果通常在注射一周内看出。从BTX-A的单次肌内注射起，症状缓解的典型持续时间平均为大约3个月。

尽管所有肉毒杆菌毒素血清型明显抑制神经递质乙酰胆碱在神经肌肉连接点的释放，它们通过影响不同的神经分泌蛋白质和/或在不同位置裂解这些蛋白质来实现这一点。例如，A和E型肉毒杆菌均裂解25千道尔顿（kD）的突触相关蛋白（SNAP-25），但它们靶向该蛋白质内的不同氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒杆菌毒素作用于囊泡相关蛋白（VAMP，也称作小突触囊泡蛋白（synaptobrevin）），其中各血清型在不同位置裂解蛋白质。最后，C₁型肉毒杆菌毒素已经显示裂解突触融合蛋白和SNAP-25。作用机制中的这些差异可能影响各种肉毒杆菌毒素血清型的相对效力和/或作用持续时间。明显地，已知的是，胰岛B细胞的胞质溶胶含有至少SNAP-25（Biochem J1;339(pt1):159-65(1999年4月)）和小突触囊泡蛋白（Mov Disord1995年5月;10(3):376）。

对于所有七种已知肉毒杆菌毒素血清型，肉毒杆菌毒素蛋白质分子的分子量为大约150kD。有趣地，梭形芽孢杆菌以包含150kD肉毒杆菌毒素蛋白质分子以及相联非毒素蛋白质的络合物的形式释放出肉毒杆菌毒素。因此，梭形芽孢杆菌可以以900kD、500kD和360kD形式产生BTX-A络合物。B和C₁型肉毒杆菌毒素明显作为仅500kD络合物产生。D型肉毒杆菌毒素作为300kD和500kD络合物产生。最后，E和F型肉毒杆菌毒素作为仅大约300kD络合物产生。

BTX络合物（即分子量大于大约150kD的那些组合物）被认为含有非毒素凝血素蛋白质和非毒素和非毒性的非凝血素蛋白质。在摄取毒素时，这两种非毒素蛋白质（与肉毒杆菌毒素分子一起构成相关神经毒素络合物）可用于为肉毒杆菌毒素分子提供抗变性稳定性和抗消化酸作用。另外，较大的（大于大约150kD分子量）肉毒杆菌毒素络合物可能造成肉毒杆菌毒素离开肉毒杆菌毒素络合物肌内注射位置的较慢扩散速率。

BTX蛋白质或BTX络合物可以根据本发明使用。实际上，本领域普通技术人员会认识到，可以如本文所述使用保持适当活性的BTX蛋白质或络合物的任何部分或片段。

体外研究已经表明，肉毒杆菌毒素抑制了钾阳离子引发的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原细胞培养物中释放出来。另外，已经报道，肉毒杆菌毒素抑制了甘氨酸和谷氨酸盐在脊髓神经元的原始培养中的诱发释放，并且在大脑突触体制品中，肉毒杆菌毒素抑制了神经递质乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸盐各自的释放。

如上所述，肉毒杆菌毒素来源对本发明不重要。但是，为了完整性，我们指出，对于某些肉毒杆菌毒素制品，容易获得各种来源，包括商业来源。

例如，BTX或BTX络合物可以通过在发酵器中建立并培养梭形芽孢肉毒杆菌培养物，然后根据已知程序收取并提纯发酵后的混合物来获得。所有肉毒杆菌毒素血清型最初作为无活性单链蛋白质合成，其必须被蛋白酶裂解或切断以变成刺激神经的。产生肉毒杆菌毒素血清型A和G的菌株具有内源蛋白酶，并因此可以主要以其活性形式从细菌培养物中回收血清型A和G。相反，肉毒杆菌毒素血清型C₁、D和E通过非蛋白水解菌株合成并因此在从培养物中回收时通常是非活化的。血清型B和F由蛋白水解和非蛋白水解菌株制成并因此可以以活性或非活性形式回收。但是，甚至产生例如，BTX-A血清型的蛋白水解菌株通常仅裂解所产生的一部分毒素。切断（nicked）与未切断（unnicked）分子的确切比例可以取决于培养长度和培养物的温度。因此，一定百分比的例如BTX-A毒素的任何制品可能是非活性的。非活性肉毒杆菌毒素分子在临床制品中的存在有助于制品的总蛋白质载量，其在一些市售肉毒杆菌毒素制剂中与提高的抗原性相关，而不影响其临床效力。

高质量结晶A型肉毒杆菌毒素可以由具有≥3x10⁷U/mg,A₂₆₀/A₂₇₈小于0.60和在凝胶电泳中明显的谱带图案的特征的梭形芽孢肉毒杆菌的HallA菌株制造。已知的Schantz方法可用于获得包括A型的结晶肉毒杆菌毒素（Shantz等人,1992,Microbiol.Rev.,56:80）。

通常，肉毒杆菌毒素络合物可以通过在合适的培养基中培养梭形芽孢肉毒杆菌（例如A型）来从厌氧发酵中分离和提纯。在分离出非毒素蛋白质后，可以使用已知方法获得纯肉毒杆菌毒素，例如具有大约150kD分子量和1-2x10⁸LD₅₀U/mg或更大的特定效力的纯化肉毒杆菌毒素A型；具有大约156kD分子量和1-2x10⁸LD₅₀U/mg或更大的特定效力的纯化肉毒杆菌毒素B型；具有大约155kD分子量和1-2x10⁷LD₅₀U/mg或更大的特定效力的纯化肉毒杆菌毒素F型。

或者或另外，已制成并纯化的肉毒杆菌毒素和毒素络合物可获自例如，ListBiological Laboratories,Inc.,Campbell,Calif.;the Centre forApplied Microbiology and Research,Porton Down,U.K.;Wako(Osaka,日本)以及获自Sigma Chemicals of St Louis,Mo。

纯肉毒杆菌毒素在作为游离溶液给药时如此不稳定以致其通常不用于制备药物组合物。此外，肉毒杆菌毒素络合物，例如毒素A型络合物也容易由于表面变性、热和碱性条件而变性。在一些情况下，灭活的毒素形成类毒素蛋白质，其可能是免疫原的。所得抗体会使患者对毒素注射不显疗效。

在一些实施方案中，本发明提供了肉毒杆菌毒素纳米粒子组合物（例如纳米乳液），其中肉毒杆菌毒素在与目前给药的游离溶液相比具有改进的稳定性。也就是说，在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物中存在的肉毒杆菌毒素至少部分被保护以防至少一种不利条件，例如热、碱性条件、酸性条件、降解酶、宿主有机体抗体，等等。或者或另外，本发明的纳米粒子组合物中存在的肉毒杆菌毒素可能表现出比肉毒杆菌毒素在游离溶液中的在其它方面相当的制品低的表面变性。为给出一个具体实例，本发明的微流化纳米乳液内的50皮克肉毒杆菌毒素被保护以防可能造成表面变性的某些不利条件等。

实际上，本发明的一个方面包括识别可通过并入纳米粒子组合物中来稳定化的肉毒杆菌毒素。本领域普通技术人员容易认识到，根据本发明的这一方面的纳米粒子组合物可以通过任何可用的方式制备。

本发明还提供了肉毒杆菌毒素纳米粒子组合物（例如纳米乳液），其中肉毒杆菌毒素与目前给药的游离溶液相比具有改进的渗透皮肤的能力。例如，包含在本发明的微流化纳米乳液中的肉毒杆菌毒素与这类游离溶液相比具有改进的透膜性质。在一个实施方案中，给药与细胞内积聚之间的最小化时间产生具有改进的效力和降低的副作用的给药方法。

此外，如本文所示，本发明提供了肉毒杆菌毒素纳米粒子组合物，肉毒杆菌毒素可从中穿过皮肤而不需要改变或分解皮肤结构。例如，生物活性剂的商业可用的经皮给药技术传统上要求至少皮肤外层的化学、物理、电或其它分解。这类分解会造成刺激、不合意的医疗副作用和/或不想要的审美后果。本发明提供了在用于皮肤时不会显著刺激皮肤和/或侵蚀角质层并允许肉毒杆菌毒素渗透皮肤以产生其生物作用的肉毒杆菌毒素纳米粒子组合物。

至于蛋白质，一般而言，可以通过三种空间构型的变化来影响肉毒杆菌毒素（其是细胞内肽酶）的生物活性。因此，热、各种化学品、表面拉伸和表面干燥法可以使A型肉毒杆菌毒素去毒。另外，已知的是，将通过已知培养、发酵和提纯获得的毒素络合物稀释至用于药物组合物制剂的低得多的毒素浓度会造成毒素的迅速去毒，除非存在合适的稳定剂。毒素从毫克量稀释成每毫升含有若干纳克的溶液由于在这样大的稀释时特定毒性的迅速损失而构成显著困难。由于毒素可能在含毒素的药物组合物配制后数月或数年使用，毒素的溶液制品必须与稳定剂，例如白蛋白一起配制。

如上所述，本发明提供了肉毒杆菌毒素的稳定制品。尽管本发明的制剂本身可能给予额外稳定性，但在本发明的一些实施方案中，考虑使用附加稳定剂。例如，在一些实施方案中，与肉毒杆菌毒素一起使用至少一种附加蛋白质。在一些实施方案中，这种附加蛋白质包含白蛋白。在一些实施方案中，这种附加蛋白质包含一种或多种在肉毒杆菌毒素络合物中天然发现的蛋白质。实际上，在本发明的一些实施方案中，使用完整的肉毒杆菌毒素络合物。在一些这样的实施方案中，也使用白蛋白。因此，在一些实施方案中，本发明提供了含白蛋白的肉毒杆菌微流化纳米乳液。

在本发明的一些实施方案中，所用肉毒杆菌毒素是 由以无菌真空干燥形式包装的纯化肉毒杆菌毒素A型络合物、白蛋白和氯化钠构成。

中存在的A型肉毒杆菌毒素由在含有N-Z胺和酵母提取物的培养基中生长的梭形芽孢肉毒杆菌的Hall菌株的培养物制成。肉毒杆菌毒素A型络合物通过一系列酸沉淀从培养溶液中提纯成由活性高分子量毒素蛋白质和相联凝血素蛋白质构成的结晶络合物。结晶络合物再溶于含盐水和白蛋白的溶液并无菌过滤（0.2微米），然后真空干燥。可以在肌内注射之前与无菌的未防腐（non-preserved）盐水一起重构。每小瓶以无防腐剂的无菌的真空干燥形式含有大约100单位(U)的梭状芽孢肉毒杆菌毒素A型纯化神经毒素络合物、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠。

目前，通常与0.9%氯化钠一起重构以通过注射给药。由于鼓泡或类似的剧烈搅拌会使变性，通常将稀释剂注入小瓶。作为游离溶液的被推荐在重构后四小时内给药。此外，在重构和注射之间，进一步推荐将重构的储存在冰箱（即例如2℃至8℃之间）中。重构的无色透明并且不含微粒物。

已经报道，已经在如下临床情况中使用：

（1）每次肌内注射大约75-125单位的（多肌肉）以治疗宫颈肌张力障碍；

（2）每次肌内注射5-10单位的以治疗眉间纹路（眉沟）（5单位肌内注入降眉间肌，10单位肌内注入各个皱眉肌）；

（3）通过***的intrasphincter注射大约30-80单位的以治疗便秘；

（4）每肌肉大约1-5单位的肌内注射以通过注射上眼睑的侧睑板前轮匝肌和下眼睑的侧睑板前轮匝肌来治疗睑痉挛；

（5）为了治疗斜视，眼外肌用大约1-5单位的肌内注射，注射量随要注射的肌肉大小和所需肌肉麻痹程度（即所需屈光度校正量）而变。

（6）为了治疗中风后的上肢痉挛，如下将肌内注入五个不同的上肢屈肌：

（a）指深屈肌：7.5U至30U

（b）指浅屈肌：7.5U至30U

（c）尺侧腕屈肌：10U至40U

（d）桡侧腕屈肌：15U至60U

（e）肱二头肌：50U至200U

五个指定肌肉各自已经在相同治疗期中注射，以使患者在各治疗期通过肌内注射接受90U至360U的上肢屈肌

（7）为了治疗偏头痛，25U的的颅骨膜注射（对称注入眉间肌、额肌和颞肌）与赋形剂相比已经如通过偏头痛频率、最大严重程度、相关呕吐和在25U注射后三个月内的急性药物应用的降低的测量值所测得的那样表现出作为偏头痛预防性疗法的显著益处。

本发明表明（参见，例如实施例4和5）含有的本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物在并入施加到皮肤上以经皮递送毒素的乳霜中时，实现与过去注射含有大致相同的的肉毒杆菌毒素溶液时观察到的那些相当的生物学结果（即皱纹减少）。

A型肉毒杆菌毒素的正面临床响应已经引起对其它肉毒杆菌毒素血清型的兴趣。已经进行两种市售A型肉毒杆菌制品（和）和B和F型肉毒杆菌毒素制品（均获自Wako Chemicals,日本）的研究以确定局部肌肉弱化效力、安全性和抗原潜力。将肉毒杆菌毒素制品注入右腓肠肌头部（0.5至200.0单位/千克）并使用小鼠脚趾外展评分检定法（digit abduction scoring assay）（DAS）评估肌肉弱化。由剂量响应曲线计算ED₅₀值。

肌内注射另一些小鼠以测定LD₅₀剂量。作为LD₅₀/ED₅₀计算治疗指数。各组小鼠接受（5.0至10.0单位/千克）或肉毒杆菌毒素B型（50.0至400.0单位/千克）的后肢注射，并测试肌肉弱化和增加的水消耗量，后者是口腔干燥的公认模型。通过在兔子中每月肌内注射（1.5或6.5纳克/千克B型肉毒杆菌毒素或0.15纳克/千克），评估抗原潜力。对于所有血清型，最高肌肉弱化和持续时间是剂量相关的。

DASED₅₀值（单位/千克）如下：6.7，24.7，B型肉毒杆菌毒素：27.0至244.0，F型肉毒杆菌毒素：4.3。具有比B型肉毒杆菌毒素或F型肉毒杆菌毒素长的作用持续时间。治疗指数值如下：10.5，6.3，B型肉毒杆菌毒素：3.2。在注射B型肉毒杆菌毒素的小鼠中，水消耗量大于注射的小鼠，尽管B型肉毒杆菌毒素在弱化肌肉方面较不有效。在注射四个月后，2/4（用1.5纳克/千克治疗）和4/4（用6.5纳克/千克治疗）的兔子对B型肉毒杆菌毒素产生抗体。在单独研究中，0/9的治疗的兔子表现出对A型肉毒杆菌毒素的抗体。DAS结果表明A型肉毒杆菌毒素的相对峰效力等于F型肉毒杆菌毒素，且F型肉毒杆菌毒素大于B型肉毒杆菌毒素。对于作用持续时间，A型肉毒杆菌毒素大于B型肉毒杆菌毒素，且B型肉毒杆菌毒素作用持续时间大于F型肉毒杆菌毒素。如治疗指数值所示，两种市售A型肉毒杆菌毒素制品（和）不同。在B型肉毒杆菌毒素后肢注射后观察到的增加的水消耗量性能表明，临床上显著量的这种血清型进入鼠科动物***循环。结果也表明，为了实现与A型肉毒杆菌毒素相当的效力，必须提高所检查的其它血清型的剂量。但是，提高的剂量可能会损害安全性。此外，在兔子中，B型比更具抗原性，这可能由于为实现B型肉毒杆菌毒素有效剂量而注射的更高蛋白质载量。Eur J Neurol6(Suppl4):S3-S10(1999)。

如本文所述，本发明考虑了任何血清型的肉毒杆菌毒素的用途。本领域普通技术人员能够容易评估特定血清型对特定用途的适当性，并根据本文的教导，能够制备含有这类肉毒杆菌毒素的纳米粒子组合物。因此，本发明提供了含有任何血清型的肉毒杆菌毒素的纳米粒子组合物，包括仅含肉毒杆菌毒素蛋白质的组合物，和含有一种或其它蛋白质的组合物。在一些实施方案中，这类其它蛋白质包含白蛋白或由白蛋白构成；在一些实施方案中，使用肉毒杆菌毒素络合物。

可以根据本发明使用的肉毒杆菌毒素的市售来源包括，但不限于，（与人血清白蛋白和乳糖的梭形芽孢肉毒杆菌A型毒素凝血素络合物；Ispen Limited,Berkshire U.K.）和/或（由B型肉毒杆菌毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠构成的可注射溶液，pH5.6，Elan Pharmaceuticals,Dublin,Ireland）等。

纳米粒子组合物

如本文所述，本发明尤其提供了如下组合物，该纳米粒子组合物包括含有肉毒杆菌毒素的纳米粒子组合物。

一般而言，纳米粒子组合物是包括至少一个纳米粒子的任何组合物。肉毒杆菌纳米粒子组合物是含有肉毒杆菌毒素的纳米粒子组合物。肉毒杆菌毒素可以被一个或多个纳米粒子包封或完全包围；与纳米粒子界面结合；和/或吸附到一个或多个纳米粒子外表面上。肉毒杆菌毒素可以共价连接到纳米粒子和/或纳米粒子组合物上或不这样；肉毒杆菌毒素可以通过吸附力连接到纳米粒子和/或纳米粒子组合物上或不这样。

在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物具有纳米粒子的均匀集合。例如，在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物中纳米粒子的最小直径和最大直径之差不超过大约600,550,500,450,400,350,300,250,200,150,100,90,80,70,60,50或更少纳米。

在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有小于大约600,550,500,450,400,350,300,250,200,150,130,120,115,110,100,90,80纳米或更小的直径。

在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有在大约10至大约600纳米范围内的直径。在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子具有在大约10-300,10-200,10-150,10-130,10-120,10-115,10-110,10-100或10-90纳米范围内的直径。

在一些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物内的粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有小于大约300,250,200,150,130,120或115,110,100或90纳米的平均粒度。在一些实施方案中，平均粒度为大约10-300,50-250,60-200,65-150,70-130纳米。在一些实施方案中，平均粒度为大约80-110纳米。在一些实施方案中，平均粒度为大约90-100纳米。

在一些实施方案中，本发明的组合物内的大部分粒子（例如含肉毒杆菌毒素的粒子）具有小于指定尺寸或在指定范围内的直径。在一些实施方案中，大部分是指该组合物中的粒子的多于50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%或更多。

在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物基本不含直径超过120纳米的粒子。具体而言，在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物中少于50%的纳米粒子具有超过120纳米的直径。在一些实施方案中，少于25%的粒子具有超过120纳米的直径。在一些实施方案中，少于20%,19%,18%,17%,16%,15%,14%,13%,12%,10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%,0.5%或更少的粒子具有超过120纳米的直径。此外，在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物中的纳米粒子具有在10-120纳米范围内的直径。

Ζ电势是剪切面上电势的测量值。剪切面是将结合到固体表面（例如本发明的纳米粒子的表面）上并表现出弹性特性的液体薄层与表现出正常粘性的剩余液体（例如液体分散介质）分离的虚曲面。在一些实施方案中，本发明的纳米粒子具有-50mV至+50mV的Z电势。在一些实施方案中，本发明的纳米粒子具有-25mV至+25mV的Z电势。在一些实施方案中，本发明的纳米粒子具有-10mV至+10mV的Z电势。

本发明的纳米粒子组合物通常是乳液或分散体。在一些实施方案中，组合物是“水包油”分散体（即油性粒子分散在水性分散介质内的分散体）；在一些实施方案中，组合物是“油包水”分散体（即水性粒子分散在油性分散介质内的分散体）。

在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物不需要有毒溶剂。相反，在组合物中引发纳米粒子形成的许多传统策略采用有毒（通常有机）溶剂。在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物不需要聚合物。相反，制备含纳米粒子结构的组合物的许多传统策略需要聚合物。

在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物具有比其它纳米粒子组合物更好的组织吸收和/或更好的生物相容性。例如，在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物具有比不均匀的、采用一种或多种有毒（例如有机）溶剂和/或采用一种或多种聚合物的纳米粒子组合物更好的组织吸收和/或更好的生物相容性。

在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物（例如肉毒杆菌纳米粒子组合物）是稳定的。在本发明的一些实施方案中，稳定的纳米粒子组合物是平均粒度、最大粒度、粒度范围和/或粒度分布（即高于指定粒度和/或超出指定粒度范围的粒子的百分比）保持一段时间的粒子。在一些实施方案中，该时段为至少大约1小时；在一些实施方案中，该时段为大约5小时，10小时，一(1)天，一(1)周，两(2)周,一(1)个月,两(2)个月，三(3)个月，四(4)个月，五(5)个月，六(6)个月，八(8)个月，十(10)个月，十二(12)个月，二十四(24)个月，或更久。在一些实施方案中，该时段在大约一(1)天至二十四(24)个月，两(2)周至十二(12)个月，两(2)个月至五(5)个月等的范围内。例如，如果纳米乳液粒子群经过长时间储存、温度变化和/或pH变化且该粒子群中大部分纳米粒子保持在指定范围（例如大约10-120纳米）内的直径，该纳米粒子组合物是稳定的。对于一些这样的粒子群，大部分是多于大约50%,60%,70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%或更多。在本发明的一些实施方案中，当纳米粒子组合物包含肉毒杆菌毒素和/或至少一种其它生物活性剂时，如果生物活性剂（例如肉毒杆菌毒素）在该组合物中的浓度在指定条件组合下保持指定时长，则该纳米粒子组合物被视为稳定。

如本文所述，本发明的纳米粒子组合物可用于各种医疗、化妆和营养保健用途中。这类组合物可通过任何可用途径递送给对象，包括但不限于，注射、口服、经皮递送等。在某些实施方案中，组合物通过注射来递送。在某些实施方案中，组合物经皮递送。

应该指出的是，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物可容易地与已描述的其它含肉毒杆菌毒素的组合物相区分。例如，Donovan已经描述了将肉毒杆菌毒素并入脂囊泡以经皮递送的制品（美国公开2004/0009180）。这类囊泡也要求包含增强剂，例如醇，以促进肉毒杆菌毒素透过皮肤吸收。Donovan也描述了并入传递体中的神经毒素，该传递体是含有脂质和膜软化剂的可变形载体（Hofer等人,2000,World J.Surg.,24:1187;和美国专利6,165,500）。Donovan具体描述了包含肉毒杆菌毒素的磷脂酰胆碱＋胆酸钠脂质体的制备。

Suvanprakorn等人也已经描述了脂质体包封的材料在离散的大珠粒中的悬浮液；据说可包封的字面上(literally)数百化合物之一是（美国公开2004/0224012）。所考虑的制造这些多层囊泡脂质体的方法包括冻干/复水和有机溶液脱水/水性复水。制造脂质体的这些传统方法预计产生微粒尺寸的囊泡。

制造纳米粒子组合物的方法

一般而言，本发明的纳米粒子组合物（例如肉毒杆菌纳米粒子组合物）可以通过任何可用方法制备。在一些实施方案中，纳米粒子组合物通过化学方式制备。但是，化学方式通常要求有毒（通常有机）溶剂；在一些实施方案中，纳米粒子组合物根据本发明不采用这类溶剂制备。

在本发明的某些实施方案中，纳米粒子组合物通过制备预混物并对该预混物施以高剪切力来制备。本文所用的术语“剪切力”是指与材料平面平行的力，而非与材料平面垂直的力。

可以使用本领域中已知的任何方法产生高剪切力。在一些实施方案中，使用空化产生高剪切力。根据本发明，机械能（即高剪切力）的使用可以替代或最大限度降低使用昂贵和/或有毒化学溶剂的任何要求；可以提高纳米粒子集合的速度，可以提高在组分的特定混合物中产生的纳米粒子的收率，和/或可以极大降低制备纳米乳液组合物的总成本。此外，在将如生物活性剂（例如肉毒杆菌毒素）的试剂并入本发明的纳米粒子组合物的那些实施方案中，高剪切力的使用与形成纳米粒子的传统方法相比可以提高纳米粒子的负载能力。在传统方法中，纳米粒子表面内或表面上的试剂载量通常依赖于试剂向纳米粒子内部和/或向纳米粒子表面的扩散。根据本发明，高剪切力的使用可以实现纳米粒子组合物中更小粒子（例如平均）的制造和/或更窄粒度分布。

在一些实施方案中，通过暴露在高压下，例如通过在例如大约15,000psi下的高压下的连续湍流来实现高剪切力。在一些实施方案中，这类高压在大约18,000至大约26,000psi的范围内；在一些实施方案中，其在大约20,000至25,000psi的范围内。

在一些实施方案中，高剪切力或高压可以通过空化或通过高压均化来施加。

在一些实施方案中，高剪切力可以通过穿过如处理机（Microfluidics Corporation/MFIC Corporation）的仪器或其他类似设备来施加。处理机通过将产品经由微通道加速至高速以减小尺寸至纳米范围来提供高压力和所产生的高剪切速率。将流体一分为二并高速（50-300m/s范围）推过典型尺寸为大约75微米的微通道。在流体离开微通道时，其形成射流，其与来自相对的微通道的射流碰撞。在通道内，流体承受量级高于传统技术的高剪切（多达10⁷l/s）。射流碰撞造成亚微米级混合。因此，高剪切和冲击在技术中造成粒度降低和微相流的混合。

更通常地，微流化器可以是为单作用增强器泵提供动力的任何设备。增强器泵将液压增强至所选水平，这又对产物流施以压力。随着泵运行通过其压力冲程，其以恒定压力驱使产品通过相互作用室。在相互作用室内特别设计了固定几何结构的微通道，产物流经由该通道加速至高速，产生高剪切和冲击力，这在高速产物流撞击自身和撞击耐磨表面时可产生均匀的纳米粒子组合物（例如纳米乳液）。

在增强器泵完成其压力冲程时，其反向并吸入新的产品量。在吸取冲程结束时，其又反向并在恒定压力下驱除产品，由此重复该过程。

在离开相互作用室时，产品流经机载换热器，其将产品调节至所需温度。此时，产品可以再循环通过该***以进一步加工或向外引导到该方法的下一步骤（美国专利4,533,254；和4,908,154）。

在本发明的一些实施方案中，样品通过在高剪切力下暴露少于大约10分钟来“微流化”。在一些实施方案中，该时段少于大约9,8,7,6,5,4,3,2或1分钟。在一些实施方案中，该时段在大约1-2分钟或更低的范围内；在一些实施方案中，该时段为大约30秒。

在本发明的一些实施方案中，样品通过单次暴露在高剪切力下来“微流化”；这种实施方案在此被称作“单程”微流化。

本发明包括确认对预混物施以高剪切力可以产生纳米粒子组合物，并特别可产生均匀的纳米粒子组合物。

一般而言，通过施加高剪切力制备本发明的纳米粒子组合物用的预混物预计含有至少两种不混溶材料，其中之一构成分散介质（即粒子（例如纳米粒子）在该液体介质中分散在最终纳米粒子组合物中）。“水包油”分散体是油性粒子分散在水性分散介质中的分散体。“油包水”分散体是水性粒子分散在油性分散介质中的分散体。本领域普通技术人员会认识到，分散体可以由任何两种不混溶介质形成，并且不严格限于水性和油性介质的组合。术语“分散介质”因此广泛适用于任何分散介质，尽管其通常是指“水性”和“油性”类别。

因此，在本发明的一些实施方案中，预混物含有水性分散介质和以纳米粒子形式分散在该分散介质中的油性介质；在本发明的一些实施方案中，预混物含有油性分散介质和以纳米粒子形式分散在油性分散介质中的水性介质。

本领域普通技术人员充分知道可根据本发明用作分散介质或要分散的介质的合适的水性介质。这类水性介质的代表包括，例如，水、盐水溶液（包括磷酸盐缓冲盐水）、注射用水、短链醇、5%葡萄糖、林格氏溶液（乳酸盐化林格氏注射液，乳酸盐化林格氏＋5%葡萄糖注射液，酰化林格氏注射液）、Normosol-M、Isolyte E和类似物，及其组合。

本领域普通技术人员也充分知道可根据本发明用作分散介质或要分散的介质的合适的油性介质。这类油性介质的代表包括，例如，饱和和不饱和杏仁、杏核、鳄梨、巴西棕榈、佛手柑、黑加仑籽油(blackcurrent seed)、琉璃苣、刺桧、甘菊、卡诺拉、香菜、腊棕榈、蓖麻、肉桂、可可油、椰子、鳕鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻子、香叶醇、葫芦、葡萄籽、榛子、海索草、荷荷巴、夏威夷核果、醒目熏衣草、熏衣草、柠檬、山鸡椒、澳洲坚果、锦葵、芒果籽、白芒花籽(meadowfoam seed)、貂油、肉豆蔻、橄榄、橙子、罗非鱼(orange roughy)、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香、sasquana、香薄荷、沙棘、芝麻、乳木果油、有机硅、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿(tsubaki)、香根草、胡桃、和麦芽油；硬脂酸丁酯；甘油三辛酸酯；甘油三癸酸酯；环状聚二甲基硅氧烷；癸二酸二乙酯；聚二甲基硅氧烷360；肉豆蔻酸异丙酯；矿物油；辛基十二烷醇；油醇；硅油；及其组合。

除了这两种不混溶介质外，本发明的预混物可以包括，例如一种或多种生物活性剂（例如肉毒杆菌毒素）和/或一种或多种表面活性剂或乳化剂。合适的表面活性剂或乳化剂包括，但不限于，磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）；二油基磷脂酰乙醇胺（DOPE）；二油基氧基丙基三乙铵（DOTMA）；二油酰基磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂酰甘油（DPPG）；己烷癸醇；脂肪醇，例如聚乙二醇（PEG）；聚氧乙烯-9-十二烷基醚；表面活性脂肪酸，例如棕榈酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸单甘油酯；脂肪酸二甘油酯；脂肪酸酰胺；三油酸失水山梨糖醇酯（斯盘85）甘胆酸酯；单月桂酸失水山梨糖醇酯（斯盘20）；聚山梨酯20（吐温-20）；聚山梨酯60（吐温-60）；聚山梨酯65（吐温-65）；聚山梨酯80（吐温-80）；聚山梨酯85（吐温-85）；聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；失水山梨糖醇脂肪酸酯，例如三油酸失水山梨糖醇酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；联十六烷基磷酸酯；二棕榈酰基磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷基胺；十六烷基胺；棕榈酸乙酰酯；蓖麻醇酸甘油酯；硬脂酸十六烷基酯；肉豆蔻酸异丙酯；四丁酚醛；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂性质的合成和/或天然洗涤剂；脱氧胆酸盐；环糊精；离液盐；离子配对剂；及其组合。表面活性剂组分可以是不同表面活性剂的混合物。这些表面活性剂可以从天然来源中提取和纯化，或可以在实验室中合成制备。在优选实施方案中，表面活性剂可购得。

在本发明的一些实施方案中，最终纳米粒子组合物中存在的所有组分均存在于预混物中并经受高剪切力以产生纳米粒子组合物。在本发明的一些实施方案中，最终纳米粒子组合物中存在的一种或多种组分不在预混物中或以比最终纳米粒子组合物中少的量存在于预混物中。也就是说，在本发明的一些实施方案中，在对预混物施以高剪切力后将一种或多种材料添加到纳米粒子组合物中。

在本发明的某些实施方案中，预混物在施加剪切力之前以溶液形式制备。特别地，对于包括至少一种生物活性剂（例如肉毒杆菌毒素）的纳米粒子组合物，通常最好在施加高剪切力之前将生物活性剂溶解在预混物中。由此，在许多实施方案中，生物活性剂可溶解在至少一种介质中（或组合预混物中所用的介质）。在本发明的一些实施方案中，这类溶解要求加热；在另一些实施方案中，不要求加热。

在本发明的一些实施方案中，预混物组分可以在施加高剪切力之前集合成粒子。至少一些这类粒子可以是微粒或甚至纳米粒子。在一些实施方案中，本发明的纳米粒子组合物由预混物制成，其中预混物选自悬浮液或微乳液。但是，在一些实施方案中，在施加高剪切力前，在预混物中不形成粒子结构。

在本发明的某些实施方案中，选择或调节预混物组分的相对量以产生具有所需特性的纳米粒子。在一些实施方案中，预混物包含比率为0.5-10的油和表面活性剂。在一些实施方案中，油与表面活性剂的比率为大约0.5:1,1:1,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1或10:1。在一些实施方案中，表面活性剂与油的比率为大约0.5:1,1:1,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1或10:1。在一些实施方案中，预混物包含比率为0.5-2的油和表面活性剂。在一些实施方案中，油与表面活性剂的比率为大约0.5:1,1:1或2:1。在一些实施方案中，表面活性剂与油的比率为大约0.5:1,1:1或2:1。在某些实施方案中，油与表面活性剂的比率为大约1:1。

在一些实施方案中，预混物中油的百分比为0%-30%。在一些实施方案中，预混物中油的百分比为1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,9%,10%,11%,12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%或30%。在一些实施方案中，油的百分比为大约8%。在一些实施方案中，油的百分比为大约5%。

在一些实施方案中，预混物中表面活性剂的百分比为0%-30%。在一些实施方案中，预混物中表面活性剂的百分比为1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,9%,10%,11%,12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%或30%。在一些实施方案中，表面活性剂的百分比为大约8%。在一些实施方案中，表面活性剂的百分比为大约5%。

在一些实施方案中，纳米粒子组合物不含多于一种油。在一些实施方案中，纳米粒子组合物可以包含两种或更多的油。在一些实施方案中，纳米粒子组合物不含多于一种表面活性剂。在一些实施方案中，纳米粒子组合物可以包含两种或更多表面活性剂。

在一些实施方案中，纳米粒子组合物基本由水、油、表面活性剂和肉毒杆菌毒素构成。在一些实施方案中，纳米粒子组合物基本由水、油、表面活性剂、至少一种肉毒杆菌毒素和至少一种用于制造和/或保存纳米粒子组合物的物质（例如蛋白质、盐，等等）构成。

在一些实施方案中，纳米粒子组合物由水、油、表面活性剂和肉毒杆菌毒素构成。在一些实施方案中，纳米粒子组合物由水、油、表面活性剂、至少一种肉毒杆菌毒素和至少一种用于制造和/或保存纳米粒子组合物的物质（例如蛋白质、盐，等等）构成。

纳米粒子组合物的给药方法

本发明提供了为各种用途，包括化妆、营养保健和医疗用途而递送纳米粒子组合物（例如肉毒杆菌纳米粒子组合物）的方法。这类纳米粒子组合物可能包括一种或多种生物活性剂。在许多实施方案中，纳米粒子组合物包括肉毒杆菌毒素。

在一些实施方案中，本发明考虑了递送本发明的纳米粒子组合物的方法，包括但不限于，经皮、肌内或皮下给药途径。这些给药途径特别有利于要发挥局部作用的制剂（例如某些肉毒杆菌毒素纳米粒子组合物）。但是，制剂成分的随后组织吸收不总是可预测的。

在本发明的一些实施方案中，本发明的制剂可以例如使用脂质基载体包封以例如利于进入细胞。但是，脂质基载体效力可能取决于i）脂质组成（即例如分子尺寸和电荷）；ii）组合物和包含的任何生物活性剂或其它实体的结构（例如分子尺寸和pH电离化）；和iii)对象的总体健康状况。本发明考虑了与包含脂质基载体的均匀微流化纳米乳液相关的组合物和方法，由此改进药妆品（即例如肉毒杆菌毒素）的生物利用率。

本发明具体提供了用于治疗各种失调症、疾病或状况的肉毒杆菌毒素，特别是肉毒杆菌毒素纳米粒子组合物的给药方法。肉毒杆菌毒素的外周注射（即肌内或皮下）或局部施加的经皮给药的临床效果通常在一周内看出。A型肉毒杆菌毒素从单次肌内注射起的症状缓解（即例如松弛肌肉麻痹）的典型持续时间可以为最多四个月或更久；在本发明的肉毒杆菌毒素的经皮给药后的临床效果持续时间可以为最多四个月或更久，这取决于各对象和/或本发明的肉毒杆菌纳米粒子制品的特定制剂的特性。

本领域普通技术人员会认识到，肉毒杆菌毒素目前几乎完全通过注射，特别是通过液体盐水溶液的注射来给药，通常由冻干的制品重构。

如本文所述，这类制品中的肉毒杆菌毒素尤其容易发生造成蛋白质损失和/或蛋白质活性损失的不稳定性。这类不稳定性被怀疑是蛋白质变性、降解、二聚和/或聚合的结果。已知具有肉毒杆菌稳定化作用的最常见制剂是人白蛋白。最近论述了人源白蛋白的可能的免疫学后果（美国公开2005/0238667）。该公开提出，重组白蛋白、糖基稳定剂和抗氧化氨基酸可能产生与原生白蛋白制品相比具有改进的效力的肉毒杆菌毒素。

同样如上文所述，（以无菌真空干燥形式包装的纯化梭状芽孢肉毒杆菌毒素A型络合物、人血清白蛋白、和氯化钠）目前使用无防腐剂的无菌普通盐水（0.9%氯化钠，注射级）重构以注射。具体而言，标准注射规程包括在适当尺寸的注射器中吸取适当量的稀释剂。由于鼓泡或类似的剧烈搅拌使变性，温和地将稀释剂注入含指定量冻干的小瓶中。出于无菌原因，标准注射规程包括在重构后4小时内施用水溶液。

尽管与可购得的肉毒杆菌毒素制品相关的问题（包括稳定性问题、无菌性问题等）是公知的，但是仅开发出极少的改进制剂。此外，注射仍然是用于递送肉毒杆菌毒素的标准方法，尽管侵入技术不受欢迎，患者不适，等等。

本发明提供了改进的肉毒杆菌毒素组合物（例如肉毒杆菌毒素纳米粒子组合物）并进一步提供递送肉毒杆菌毒素的改进方法。特别地，本发明提供了（通过任何可用途径）递送肉毒杆菌纳米粒子组合物的方法，并进一步提供了通过非注射途径递送肉毒杆菌毒素的方法。

一般而言，本发明的肉毒杆菌纳米乳液组合物可以通过任何可获得的方式给药，包括但不限于，肠道外、口服、经皮、经口腔、经眼、经鞘、经直肠等。但是，在某些实施方案中，该组合物通过注射给药；在一些实施方案中通过皮下注射，在一些实施方案中通过肌内注射，在一些实施方案中通过静脉注射，等等。在某些实施方案中，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物经皮给药。

在某些实施方案中，本发明提供了肉毒杆菌毒素的经皮给药方法。人皮肤包括真皮和表皮。表皮具有几层组织，即角质层、透明层、颗粒层（stratum granulosum）、棘层，和基底层（从皮肤外层向内依次识别）。

角质层构成笼统而言药品和具体而言假设肉毒杆菌毒素的经皮递送中的最显著障碍。角质层通常为约10-15微米厚，并且其由以几层排列的平坦的角质化细胞（角化细胞）构成。角化细胞之间的细胞间距被脂质结构填充，并可以在物质渗透皮肤中发挥重要作用（Bauerova等人,2001,European Journal of Drug Metabolism andPharmacokinetics,26:85）。

角质层下方的其余表皮为大约150微米厚。真皮为大约1-2毫米厚并位于表皮下方。真皮受到各种毛细管以及神经元过程的刺激。

药物的经皮给药通常是试图在没有与注射和口服相关的不合意后果的情况下提供药品的替代给药途径的研究对象。例如，针通常造成局部疼痛，并且可能使接受注射的患者接触血液传染病。口服通常由于患者胃部的极酸环境而承受药品的差生物利用率。

已经力图通过提供非侵入给药来开发某些药物的经皮给药技术以试图克服这些缺点。为了减轻对患者皮肤的损害，经皮给药通常是合意的。因此，药品的经皮给药可以减轻或消除与注射相关的疼痛，降低血液污染的可能性，且药物一经***并入即改进其生物利用率。

传统上，药品经皮给药中的尝试集中于提高角质层的渗透性。一些尝试包括使用提高分子透过皮肤的渗透性的化学增强剂。一些尝试包括使用机械装置以绕过或消除部分角质层。此外，尝试包括使用超声或电离子透入法以促进药物渗透皮肤。在大多数情况下，目标是药剂，通常小分子透过皮肤，通常以使试剂可以通入真皮中的毛细管床，在此试剂可以***进入对象以实现治疗效果。

尽管小分子是经皮给药技术的主要焦点，重要的是指出，大分子，例如多肽，和蛋白质络合物，看起来也能够经皮给药。大约48kD的***也已经借助超声成功经皮给药（Mitragotri等人,1995,Science,269:850;和美国专利5,814,599和6,002,961）。

本发明尤其提供不要求使用研磨剂或其它破坏剂（化学、机械、电、磁等）的肉毒杆菌毒素经皮给药法。本发明人已经令人惊讶地发现，在没有可渗透或破坏角质层的进一步步骤的情况下，包含在本发明的纳米粒子组合物中的肉毒杆菌毒素有效地经皮递送。本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物对于此类试剂或步骤的使用，在本发明的所有实施方案中不必排除，但是也并不需要。

本发明因此提供了通过本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物的局部施用来给药肉毒杆菌毒素的方法。在一些实施方案中，将本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物直接施加到皮肤上并经表皮层吸收。在一些实施方案中，肉毒杆菌纳米粒子组合物可以在不使用化学或机械皮肤渗透增强剂或造成磨损的其它试剂的情况下渗透皮肤表层，包括角质层、皮肤毛孔和/或皮腺。

本领域普通技术人员会认识到，局部给药的本发明的组合物可包括化妆制剂，例如皮肤软化剂、营养洗剂型乳液、清洁洗剂、清洁霜、皮肤乳、润肤洗剂、按摩霜、润肤霜、化妆基料、唇膏、面膜或面部凝胶、清洁制剂，例如香波、漂洗剂、沐浴液、润发剂、或肥皂，或皮肤病学组合物，例如洗剂、油膏、凝胶、乳霜、贴膏或喷剂。

局部给药用的本发明的组合物可以配制和/或给药以使大约10^-3U/kg至10U/kg的肉毒杆菌毒素透过患者皮肤。在一些实施方案中，该组合物配制和/或给药以使大约10^-2U/kg至大约1U/kg经皮透过患者皮肤。在一些实施方案中，该组合物配制和/或给药以使大约10^-1U/kg至大约1U/kg透过患者皮肤。在一些实施方案中，该组合物配制和/或给药以使大约0.1单位至大约5单位透过患者皮肤到皮下靶位。

本领域普通技术人员会认识到，单位在本文中是指在生物学上或在生物活性上与肉毒杆菌毒素的商业制造商指定的单位相当的单位。

根据本发明给药的肉毒杆菌毒素的治疗效果可以持续得与注射溶液的效果一样长。这类注射溶液的效果可以持续最多大约4个月。此外，可以保留肉毒杆菌毒素以使其缓慢释放的合成聚合物载体的使用可以延长该效果最多大约5年（美国专利6,312,708）。

在一个实施方案中，本发明提供了肉毒杆菌毒素的局部制剂，其避免潜在并发症，包括但不限于，全身毒性或肉毒杆菌中毒。在一个实施方案中，在最低的副作用风险下，肉毒杆菌毒素（包括A,B,C,D,E,F或G型）的剂量可以为低至大约1单位至高达大约20,000单位。特定剂量可能随要治疗的状况和所用的治疗方案而变。例如，皮下活动过度肌肉的治疗可能要求肉毒杆菌毒素的高的经皮剂量（例如1000单位至20,000单位）。与此相比，神经炎症或活动过度汗腺的治疗可能要求肉毒杆菌毒素的相对较小的经皮剂量（例如大约1单位至大约1,000单位）。

本发明的一个实施方案考虑了经皮递送给人类患者的包含稳定化肉毒杆菌毒素的药物组合物。肉毒杆菌毒素可以选自A,B,C₁,D,E,F和G型肉毒杆菌毒素、分离和/或纯化（即大约150kD）的肉毒杆菌毒素，以及原生或重组制成的肉毒杆菌毒素。该组合物可以包含大约1单位至大约20,000单位的肉毒杆菌毒素，且该组合物可以包含足以实现持续1个月至5年的治疗效果的肉毒杆菌毒素量。

在一些实施方案中，本发明提供了能使肉毒杆菌毒素渗透对象皮肤而不会以显著量渗透血管的肉毒杆菌毒素（例如肉毒杆菌纳米粒子组合物）局部制剂。例如，在本发明的一些实施方案中，在施加本发明的局部和/或经皮制品时，药物组合物中存在的少于大约25%或甚至少于大约5%的肉毒杆菌毒素渗入血管。

本领域普通技术人员会认识到，实现肉毒杆菌毒素的经皮给药的本发明的组合物可以包含在如贴膏之类的器具中。

各种经皮贴膏结构是本领域中已知的；本领域普通技术人员会认识到本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物可以容易地并入多种这样的结构中。在一些实施方案中，经皮贴膏可以进一步包含多个从施加到皮肤上的贴膏一面上延伸的针头，其中这些针头从贴膏上延伸以穿透皮肤角质层。在一些实施方案中，针头不破裂血管。

在本发明的一些实施方案中，肉毒杆菌毒素（例如肉毒杆菌纳米粒子组合物）可以在贴膏中的储库(depot)中提供以致施加到贴膏上的压力造成将肉毒杆菌毒素导出贴膏（任选透过针头）并透过角质层。

在本发明的一些实施方案中，经皮贴膏包括粘合剂。粘性贴膏的一些实例是公知的（例如，参见美国专利Des.296,006;6,010,715;5,591,767;5,008,110;5,683,712;5,948,433;和5,965,154）。粘性贴膏通常以具有施加到个人皮肤上的粘性层，用于容纳药剂的储库或储器，和防止药物漏出储库的外表面为特征。贴膏的外表面通常是非粘性的。

根据本发明，将神经毒素并入贴膏以使神经毒素保持稳定更长时间。例如，神经毒素可以存在于本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物中。或者或另外，神经毒素可以并入聚合基质中，该基质使神经毒素稳定化并允许神经毒素从基质和贴膏中扩散出。神经毒素也可以并入贴膏的粘性层中以使贴膏一旦施加到皮肤上，神经毒素可以透皮扩散。在一个实施方案中，粘性层可以热活化，其中大约37℃的温度使粘合剂缓慢液化，以致神经毒素透皮扩散。粘合剂在低于37℃下储存时可以保持粘性，并且一旦施加到皮肤上，粘合剂丧失其液化时的粘性。一旦贴膏不再粘贴到皮肤上，毒素的给药完成。

本领域普通技术人员会认识到，经皮贴膏是可用于施用本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物的器具的一个实例。为给出一些其它实例，可以使用能够施加该组合物而不用首先将该组合物施加到手指（这可能造成手指的不合意麻痹）上的器具。合适的器具包括刮刀、药签，无针头的注射器，和粘性贴膏。刮刀或药签或类似物的使用可能要求将该器具***含该组合物的容器。使用注射器可以通过使该注射器充满组合物来实现。该组合物随后用刮刀或药签局部铺开，或可以从注射器中推出到个人皮肤上。

在本发明的许多实施方案中，可能理想的是将肉毒杆菌毒素的递送仅限于预期递送区域。在一些实施方案中，这类受限递送可以通过在能够将该组合物施加到皮肤上的靶位上而不会将该组合物施加到皮肤的非靶位区域上的施加器具中使用本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物来实现。明确地，为此可以使用经皮贴膏。或者或另外，如果肉毒杆菌毒素要局部施加到仅所选区域，可以覆盖或预处理其它区域或以其它方式防止其暴露。

肉毒杆菌毒素的治疗用途

如本文所述，本发明的许多实施方案包括在纳米粒子组合物的情况下向对象递送肉毒杆菌毒素。这类递送可用于各种情况，特别包括某些化妆和医疗用途。下面更详细论述某些这样的用途。

化妆用途

肉毒杆菌毒素A（BTXA）已经成为化妆皮肤学中广泛使用的药物。在化妆用途中观察到的BTXA的副作用对患者依从性具有显著影响。目前，因为BTXA通过注射给药，这需要受过训练的人员，且因为用于防止BTXA的副作用的主要工具是专业知识和技术，BTXA由医疗人员和在临床情况中给药。正确注射技术的使用是必须的，因为大多数不想要的效果是由不正确的技术引起的。对于医生选择最佳剂量、时间和技术，人体解剖知识（即，例如，面部和面外(extrafacial)肌肉）是重要的。

BTXA的目前给药程序的最常见副作用是疼痛和血肿。例如，当BTXA溶液通过注射给药至眼周区域时，眼睑和眉毛下垂是常见的副作用。也可能在上和下面部和在面外位置发生疼痛、血肿、瘀斑和青肿。其它可能的副作用包括，但不限于，头疼和可能的与伴随药物的相互作用。已经建议通过实施适当的稀释、储存和注射技术以及小心排除患者的任何禁忌症来避免大多数不想要的副作用。可以通过在BTXA注射之前和之后冷却皮肤来防止疼痛、血肿、瘀斑和青肿。上眼睑下垂可以使用阿可乐定或苯肾上腺素滴眼液（Wollina等人,2005,Am.J.Clin.Dermatol,6:141）部分校正。然而，目前的策略保留了显著的副作用。

相反，本发明提供了以使副作用最小化的方式安全有效地施用肉毒杆菌毒素的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明考虑了作为包含纳米粒子组合物，例如微流化纳米乳液的局部递送组合物的肉毒杆菌给药方法。在一个实施方案中，该组合物作为乳霜、油膏、油、泡沫、喷剂或凝胶配制。

本领域普通技术人员会认识到，本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物可以与多种化妆可接受介质一起配制在化妆制品中，例如液体、乳霜、乳液、凝胶、增稠洗剂或粉剂；它们可以含有水以及任何化妆可接受的溶剂，特别是单醇，例如具有1至8个碳原子的链烷醇（例如乙醇、异丙醇、苄醇和苯基乙醇），多醇，例如烷撑二醇（例如甘油、乙二醇和丙二醇），和二醇醚，例如单-、二-和三-乙二醇单烷基醚，例如乙二醇单甲醚和二乙二醇单甲醚，它们单独或在混合物中使用。这类组分可以例如以总组合物重量的最多高达70重量%的比例存在。

包括本发明的肉毒杆菌纳米粒子组合物的化妆制品可以含有至少一种填料，尤其用以获得无光泽产品，这是油性皮肤的个体尤其需要的。术语“填料”是指单独或结合使用的在室温和大气压下为固体的任何粒子，其不与该组合物的各种成分化学反应并且不溶于这些成分，即使使这些成分达到高于室温的温度，尤其是达到其软化点或其熔点。这类惰性填料通常具有至少高于170℃，更好高于200℃的熔点。

填料可以是吸收剂或非吸收剂，即特别能够吸收组合物的油以及皮肤分泌的生物物质。在一些实施方案中，填料是微粒并具有0.01至150微米，优选0.5至120微米，更好1至80微米的表观直径。表观直径相当于元素粒子沿其最小维度（薄层的厚度）内切的圆的直径。皱纹的治疗

涉及前额、眉间、rhytids和/或眶周区域的面部皱纹是常见的审美问题并且被认为与下方的面部肌肉***的过度活动相关。例如，眉间皱纹的产生至少部分与下方降眉间肌、皱眉肌和轮匝肌的活动相关。面部纹路被认为是成问题的，因为它们产生变老的外表。在一些情况下，它们也会被误解为是负面情绪（例如愤怒、焦虑、悲伤）、疲劳或压力的表现。

近年来，肉毒杆菌毒素溶液的注射已经成为治疗机能亢进面部纹路的最流行疗法之一。在注射后，该毒素用于麻痹或弱化面部模拟肌。这显著减轻或消除皱纹的外观。Sadick NS.,"The cosmetic use ofbotulinum toxin type B in the upper face"Clin Dermatol.22(l):29-33(2004)。

肉毒杆菌毒素溶液的最初化妆用途是用于治疗前额皱眉纹（Carruthers等人,1992,J.Dermatol.Surg Oncol,18:17）。也已经指出，将BTX溶液注入颈阔肌使嘴部上提（Brandt等人,1998,Dermatol.Surg.,24:1232）。也已经将BTX溶液注入下巴位置以治疗突出颏褶（Carruthers等人,"Cosmetic Uses of Botulinum A Exotoxin,"第325-48页,Advances in Dermatology,James等人编辑,Mosby-Yearbook,Chicago,1997）。

本发明提供了用于治疗面部皱纹和/或不好看的面部表情（例如由于下方面部肌肉组织的过度活动）的纳米粒子组合物。当然，与面部皱纹和/或表情的治疗相关的原理和/或组合物同样可用于由身体其它地方的肌肉活性引起的不合意的纹路或皱纹（例如颈纹等等）。在一些实施方案中，用于治疗皱纹的本发明的纳米粒子组合物包含一种或多种神经麻痹毒素；在一些实施方案中，这类毒素能够阻断面部肌肉活动；在一些实施方案中，这类毒素包含肉毒杆菌毒素（BTX）。在一些实施方案中，本发明考虑将微流化肉毒杆菌毒素纳米乳液施用于面部皱纹。

最近已经建议，通过经由反复注射来长期使用A型肉毒杆菌毒素治疗，可以延迟面部皱纹和/或纹路的出现（Binder,2006,Arch.FacialPlast.Surg.,8:426）。但是，反复注射对患者而言是疼痛的，并且存在可能引起副作用（例如下垂）的注射非计划肌肉群的风险。在一些实施方案中，在长时间内将肉毒杆菌纳米乳液施加到面部和/或颈部以延迟面部（或颈部）纹路或皱纹的出现。在一些实施方案中，在长期时间内将肉毒杆菌纳米乳液以定期间隔施加到面部和/或颈部以延迟面部纹路或皱纹的出现。在一些实施方案中，在多于6个月的时期内，将肉毒杆菌毒素以定期间隔施加到面部和/或颈部以延迟面部纹路或皱纹的出现。在一些实施方案中，在多于1年的时期内，将肉毒杆菌毒素以定期间隔施加到面部和/或颈部以延迟面部纹路或皱纹的出现。在一些实施方案中，在多于5年的时期内，将肉毒杆菌毒素以定期间隔施加到面部和/或颈部以延迟面部纹路或皱纹的出现。在一些实施方案中，在多于10年的时期内，将肉毒杆菌毒素以定期间隔施加到面部和/或颈部以延迟面部纹路或皱纹的出现。

运动过度面部纹路

已经在机能亢进面部纹路的处理中评测B型肉毒杆菌毒素（BTX-B）的注射。例如，在皱眉肌、轮匝肌或额肌中用400至800单位BTX-B治疗24名患者。可以使用Wrinkle Improvement Score（WIS）和Rated Numeric Kinetic Line Scale（RNKLS）评测面部纹路改进。一个研究报道，在72小时内开始出现效果。对于所有位置，WIS和RNKLS在治疗后在统计上更好，该效果持续8周。一般而言，患者在WIS上表现出适度改善（级别2）和在RNKLS上表现出2点改善（Ramirez等人,2002,Otolaryngol.Head Neck Surg.,126:459）。

在一些实施方案中，本发明考虑将肉毒杆菌纳米粒子组合物，例如微流化肉毒杆菌毒素纳米乳液施用到运动过度的面部纹路上。在一些实施方案中，本发明考虑在皱纹形成之前将肉毒杆菌纳米粒子组合物施用到通常产生皱纹的面部区域上。重复这种施用预计可以延迟皱纹的出现和/或减轻可能最终产生的强度或严重程度（Binder,2006,Arch.Facila Plast.Surg.,8:426）。

颈阔肌带

颈阔肌是位于刚好在属于面部肌肉群的浅筋膜下的颈部各侧上的宽的薄的肌肉层，其受面部神经支配，并将下唇和嘴角拉向侧面和下方并在运动时有效地扩张颈部并上拉其皮肤。

肉毒杆菌毒素Z的注射已经被报道用于治疗下垂的肥大颈阔肌肌肉带（即，通常被称作衰老颈(aging neck)）。基于颈横行纹、颈阔肌带和皮肤松弛的分级***（I至IV）可以将变形程度分类并用作肉毒杆菌推荐剂量的指导。例如，II型是指轻度颈横行纹；薄的轻度颈阔肌松弛；和轻度皮肤松弛；III型是指中度颈横行纹；厚的中度颈阔肌松弛；和中度皮肤松弛（Matarasso等人,1999,Plast.Reconstr.Surg,103:645）。

在一个实施方案中，本发明考虑将肉毒杆菌纳米粒子组合物，例如微流化毒杆菌毒素纳米乳液施用到颈阔肌带上。

医疗用途

神经肌肉失调症

细菌梭形芽孢肉毒杆菌制成的BTX在以尚不致命剂量给药时可逆麻痹条纹肌。BTX已经用于治疗涉及肌肉痉挛和/或挛缩的许多神经肌肉失调症和症状，包括各种形式的麻痹、面部挛缩、肌张力障碍、偏侧面肌痉挛、震颤、僵直（例如由多发性硬化造成）、眶后肌和各种其它眼科症状（Carruthers等人,1996,J Am.Acad.Dermatol,34:788）。

面部麻痹

已经报道，将BTX注入患者面部一侧上的肌肉群已用于治疗面部联带运动和由面部神经麻痹引起的垂直不对称（Armstrong等人,1996,Clin.Otolaryngol.,21:15）。在后一程序中，与口腔相关的提口角肌、颧大肌、rizorius和降口角肌以及与患者面部正常侧上的眼睛相关的各种肌肉均作为一组治疗以作用于患者面部的整个垂直对称性以补偿面部未治疗侧上的神经***作用。

在一个实施方案中，本发明考虑将肉毒杆菌纳米粒子组合物，例如微流化肉毒杆菌毒素纳米乳液施用于痉挛面部肌肉。

睑痉挛

响应反复和节奏性眼睑肌肉挛缩来诊断睑痉挛（即，也称作眼睑痉挛）。在一些情况下，眼睑可以反复关闭（或几乎关闭）和再打开。这种状况的开始通常由于疲劳、压力和/或咖啡因。但是，一旦痉挛开始，它们可以断断续续持续几天。

在眼睑完全关闭的情况下，更严重的挛缩是可能的。眼睛表面（角膜）或眼睑内的衬膜（结膜）的发炎会引起这种加剧的状况。这种形式的眼睑颤搐持续更久，通常非常不舒服，并且也会造成眼睑完全关闭。

睑痉挛的症状包括但不限于，眼睑（通常上眼睑）的反复不受控颤搐或痉挛、光敏感性或视觉模糊。

在一些实施方案中，本发明考虑将肉毒杆菌纳米粒子组合物，例如微流化肉毒杆菌毒素纳米乳液施用于眼睑肌肉。

脑麻痹

脑麻痹包括以运动损失或其它神经机能的损失为特征的一类失调症。这些失调症由胎儿发育过程中或大致出生时出现的脑损伤引起。脑麻痹可以由大脑（脑的最大部分，其与更高的智力、感觉和随意肌活动相关）损伤引起。

大脑损伤会在非常不同的区域中造成神经机能损失。CP的典型发现是可能影响单肢、身体一侧（痉挛性偏瘫）、两腿（痉挛性双瘫）或两臂和两腿（痉挛性四肢瘫痪）的僵直状态（增加的肌肉紧张）。此外，这些可能是运动的部分或完全损失（麻痹）、感觉异常、和听力和视力缺陷。说话异常是常见的并可能突发。

CP患者中的智力机能可能从极聪明、正常到严重智力障碍。在2岁之前症状通常明显，并在严重情况下可能早到3个月时出现。脑麻痹是非进行类型的脑病（脑损伤）和由不会恶化的疾病直接造成的症状。

脑***分类包括痉挛型、运动障碍型、运动失调型和混合型。痉挛型脑麻痹构成大约50%的情况。运动障碍型（指痉病）脑麻痹影响大约20%。其包括异常活动（扭转、抽搐或其它活动）的发生。运动失调型脑麻痹包括震颤、不稳步态、共济损失，和异常活动。其影响大约10%。其余20%被分类成混合型，包括上述症状的任何组合。

脑***症状包括但不限于，癫痫、肌肉挛缩、吸允或进食困难、不规则呼吸、运动技巧的延迟发育，例如伸手、坐、滚、爬、走、运动发育迟缓、智力迟钝、说话异常（发音困难）、视力异常、听力异常、僵直状态、渐进关节挛缩、有限运动范围，或钉形牙。

肉毒杆菌毒素通过减轻畸形、促进机能、改进运动控制和缩短的肌肉的伸长来有效治疗脑麻痹和其它张力亢进的儿童。对于病灶性张力亢进的儿童，肉毒杆菌毒素提供了显著但暂时的可重复变化，其影响复原。研究迅速得出毒素对损伤和机能限制的积极作用。仍要测定肉毒杆菌毒素的长期使用和该毒素在小儿张力亢进失调症患者的整个寿命中起到的作用（Gaebler-Spira等人,2003,Phys.Med.Rehabil.Clin.N.Am.,14:703）。

在一个实施方案中，本发明考虑将肉毒杆菌纳米粒子组合物，例如微流化肉毒杆菌毒素纳米乳液施用于表现出张力亢进症状的患者。在一个实施方案中，张力亢进包括脑麻痹。在一个实施方案中，患者是儿童。

斜视

斜视涉及一个眼睛与另一眼睛相比的偏位并且也被称作交叉眼、内斜视、外斜视、斜眼或角膜白斑。斜视被认为由眼睛之间的协调欠缺引起。因此，眼睛看向不同方向并且不能同时聚焦在单点上。

在儿童斜视的大多数情况下，原因不明。在多于一半的这些情况下，在出生时或出生后不久存在问题（先天斜视）。当两个眼睛没有聚焦在相同图像上时，大脑可能学会忽视来自一个眼睛的输入信息。如果使其继续，被大脑忽视的眼睛不再很好地看见。这种视力损失被称作弱视，并且通常与斜视相关。

成人的后天斜视可以由眼眶或脑的损伤引起，包括封闭性脑损伤和中风。糖尿病患者通常具有循环损失，这造成后天麻痹性斜视。由任何原因引起的一个眼睛的视力损失通常造成眼睛逐渐向外转（外斜视）。由于成人大脑已经针对视力得以开发，在成人斜视的情况下没有发生与弱视相关的问题，其中大脑忽视来自一个眼睛的输入信息。

斜视的症状包括，但不限于，出现交叉的眼睛，不能对准相同方向的眼睛，不协调的眼睛运动、复视或仅一个眼睛的透视力损失的视力。

已经报道了在后天内斜视的患者中肉毒杆菌疗法的长期结果。在远景研究中记录68个患有后天内斜视的儿童（年龄范围，8-64个月）。在两个内直肌中注射肉毒杆菌毒素A。在最后注射后，在1和2周；3、6和12个月；和每年评测运动和感觉情况。

在自最后注射起4.8年的平均追踪期后，在一次注射的36个儿童（52.9%）中获得运动成功，在两次和三次注射后分别升至48（70.6%）和60（88.2%）个儿童。48个（70.6%）患者具有至少周边融合（1类双眼视(binocularity)）和32个（47.1%）具有至少400秒弧的体视锐度（2类双眼视）。较高的远视、较不严重的弱视和较小的内斜视角度是运动成功的最佳预测值。极低弱视和有利的运动校准与更好的双眼视结果相关联。

肉毒杆菌毒素可能是后天内斜视的有效的长期治疗法。其尤其可用于具有高远视、极低弱视和小的内斜视偏位的儿童（Tejedor等人，2001,Investigative Ophthalmology and Visual Science,42:2542）。

在一个实施方案中，本发明考虑将肉毒杆菌纳米粒子组合物，例如微流化肉毒杆菌毒素纳米乳液施用于表现出斜视症状的患者。在一个实施方案中，患者是儿童。

肌张力障碍

肌张力障碍是包括不随意的缓慢和扭转运动的医疗状况。不受控或缓慢的运动是指肌肉紧张的受损（通常在大的肌肉群），造成头部、肢翼、躯干或颈部（即颈部肌张力障碍）的缓慢的不随意挛缩。肌肉的缓慢弯曲扭转运动（指痉病）或持续肌肉挛缩（肌张力障碍）可能由许多状况引起，包括脑麻痹、脑炎,药物副作用、肝脑病和亨廷顿氏舞蹈病。异常运动可能在睡眠过程中减轻或消失，但其由于情绪压力而恶化。这些运动可能表现出异常和有时怪异的姿势。

在一个实施方案中，本发明考虑将肉毒杆菌纳米粒子组合物，例如微流化肉毒杆菌毒素纳米乳液施用于表现出肌张力障碍症状的患者。

***增生

肉毒杆菌毒素注射可能在患有良性***增生的男性中有效。在随机的安慰剂控制研究中记录30名患有良性***增生的男性。在基线评测后，各参与者接受4毫升注入***的溶液。对照组中的患者接受盐水溶液，且治疗组中的患者接受200U肉毒杆菌毒素A。通过比较症状分数、血清***特异性抗原浓度、***体积、***后(postvoid)残留尿量和最高尿流速来评测各组的结果。

在2个月后，治疗组中的13名患者和对照组中的3名患者具有主观症状缓解（P=0.0007）。在接受肉毒杆菌毒素的患者中，症状分数与基线值相比降低65%，且血清***特异性抗原浓度从基线降低51%。在接受盐水的患者中，症状分数和血清***特异性抗原浓度与基线值和1个月值相比没有显著变化。追踪期平均为19.6+/-3.8个月（Maria等人,2003,Urology62:259）。

在一个实施方案中，本发明考虑将肉毒杆菌纳米粒子组合物，例如微流化肉毒杆菌毒素纳米乳液施用于表现出***增生症状的患者。

多汗症

多汗症是人过度且不可预测地出汗的医疗状况。多汗症患者即使在温度凉爽时和他们静止时也会出汗。出汗有助于身体保持凉爽并且完全天然。人在温暖温度中、在他们运动时或由于使他们紧张、愤怒、窘迫或害怕的情况而更加出汗。

但是，在没有这类引发机制的情况下发生过度出汗。多汗症患者似乎具有活动过度的汗腺。不受控的出汗会造成身体和情绪的明显不适。在过度出汗影响手、脚和腋窝时，其被称作原发性或病灶性多汗症。原发性多汗症影响2%-3%的人口，而少于40%的具有该状况的患者寻求医学建议。在大多数原发性多汗症的情况中，找不到成因。其似乎在家族中出现。如果由于另一医学状况而发生出汗，其被称作继发性多汗症。出汗可能在全身，或其可以局限于一个区域。造成继发性多汗症的状况包括但不限于，肢端肥大症、甲状腺机能亢进、葡萄糖控制失调症、嗜铬细胞瘤、类癌瘤综合征、癌症、结核病、感染、绝经、脊髓损伤、中风、帕金森症、心脏病或肺病、药物滥用或焦虑状况。多汗症的原发性症状是潮湿。

A型肉毒杆菌毒素（）由FDA在2004年批准用于治疗严重的腋下出汗，被称作原发性腋下多汗症的状况。注入腋下的小剂量的纯化肉毒杆菌毒素暂时阻断刺激出汗的神经。副作用包括注射位置疼痛和流感类疼痛。用于手掌出汗的会造成温和但暂时的虚弱和强烈的疼痛。

在一个实施方案中，本发明考虑将肉毒杆菌纳米粒子组合物，例如微流化肉毒杆菌毒素纳米乳液施用于表现出多汗症症状的患者。

实施例

下列实施例仅用于提供本发明考虑的具体实施方案的例证。这些实施例无论如何都不是限制性的。

实施例1：肉毒杆菌纳米乳液制剂

此实施例构成通过微流化制成的包含肉毒杆菌毒素（即例如，）的纳米乳液的一个实施方案。

微流化制品如下制造：

1.将5克大豆油和5克吐温80混合，按需要加热（通常不要求）以使该混合物乳化。

2.将包含在人白蛋白基质（Allergan,Irvine CA）中的100单位的添加到100毫升去离子水/蒸馏水中并搅拌至均匀混合。

3.将步骤1制品添加到步骤2制品中并搅拌至均匀混合。

4.将制品均化1分钟（参见表1和图1中的所得粒子分布）。

5.使用处理机进行在24,000psi下的单程微流化程序。

使用能够筛选大约0.6纳米–6000纳米的粒子的Malvern Nano S粒度筛选机评测所得纳米乳液的粒度。纳米乳液制品具有两个粒度峰，其具有95.33纳米的平均粒度（表2和图2）。

表1:均化的微乳液的粒度分布

		直径（纳米）	%强度	宽度（纳米）
					Z-平均：3391	峰1	1512	100	76.6
PDI：0.341	峰2	0	0	0
					截距：0.5852	峰3	0	0	0

表2：微流化的微乳液的粒度分布

		直径（纳米）	%强度	宽度（纳米）
					Z-平均：95.33	峰1	134.2	76.49	31.03
PDI：0.252	峰2	44.97	23.51	6.34
					截距：0.9659	峰3	0	0	0

实施例2:注射的 纳米乳液的肌肉松弛效果

此实施例构成具有与作为盐水溶液的游离溶液注射液相当的效力的纳米乳液的一个实施方案。

实验设计比较下列两种制品：

1)根据实施例1制成的纳米乳液经由肌内注射（IM），注入Swiss Webster雌性小鼠的后腿（腓肠肌）。

2)盐水溶液经由肌内注射（IM）注入Swiss Webster雌性小鼠的后退腓肠肌。

使用Digit Abduction Score（DAS）检定法测定局部肌肉弱化效力（Aoki,1999）。如下分配DAS值：（0）平足，脚趾与对照腿一样张开；（1）平足，脚趾外展宽度与对照腿相比不同，或两个脚趾接触且其余脚趾完全张开；（2）平足，在所有脚趾端有微小空间或三个脚趾接触；（3）如果脚是平的，五个脚趾接触，如果脚弯曲，四个脚趾一起；（4）弯曲的脚，所有五个脚趾接触。

在单盲规程下七天通过DAS评测纳米乳液和盐水溶液的IM注射。观察到肉毒杆菌毒素纳米乳液（3.96U/5μl）和肉毒杆菌毒素盐水溶液（3.96U/5μl）的1-2的DAS分数。对照组（其是空白纳米乳液）具有DAS(0)。各组（肉毒杆菌毒素纳米乳液、盐水和对照物）由五个（5）动物构成。

这种信息证实，微流化技术不会破坏如非微流化肉毒杆菌毒素盐水溶液的注射所表现出的肉毒杆菌毒素的功能特性，且肉毒杆菌毒素纳米乳液在功能上有效。

实施例3：经皮 纳米乳液的肌肉松弛效果

此实施例证实经皮施加的肉毒杆菌纳米乳液（即，例如，纳米乳液）的治疗效力。

将根据实施例1制成的纳米乳液（9.9U/100μl）局部施用于五个（5）Swiss Webster雌性小鼠的后腿腓肠肌。五个（5）SwissWebster雌性小鼠的对照组接受除忽略外相同制成的纳米乳液。对于肉毒杆菌毒素纳米乳液治疗组而非在对照组中，治疗后7天中，观察到1-2的DAS分数，其根据实施例2评分。在治疗后的任何时间都没有观察到皮肤的恶化（例如发炎、发红等等）。数据表明，以与传统给药的肉毒杆菌毒素注射液类似的方式，在经皮给药后，肉毒杆菌毒素纳米乳液在生物上是活性的。

实施例4：由肉毒杆菌纳米乳液的给药引起的肌肉松弛效果：标准注 射肉毒杆菌vs.局部肉毒杆菌纳米乳液在小鼠中的受控比较

此实施例提供了受控实验以证实本发明的局部肉毒杆菌纳米乳液的应用可以引发与标准注射肉毒杆菌制品（其不是纳米乳液）相当的肌肉松弛效果。

方法

将35个雌性Swiss Webster小鼠购自Charles River，体重大约20克。在到达时，所有动物在笼子中适应一周（如下所述，每组每笼子收容5个小鼠）并提供标准笼子垫草和Purina5001食品。在一周后，使用Digit Abduction Scoring（DAS）测定施加根据实施例1制成的纳米乳液后的局部肌肉功能。在DAS检定法中，将小鼠以尾巴短暂（10秒）倒挂以引发特有的惊愕反应，其中动物伸展其后腿并外展其后脚趾。每周一次进行该检定法达3周。

对于小鼠的三个治疗组，制备三个治疗制品：1)在注射用盐水溶液中的2)含的纳米乳液和3)含有纳米乳液的除了也按照与含的纳米乳液相同的方式通过处理机加工的外的所有成分的"空白"纳米乳液。

治疗范例

第1组（IM）用悬浮在盐水溶液中然后注入小鼠后腿腓肠肌的10U/5uL的/千克体重注射15个小鼠。

第2组（局部）用10U/100μl的纳米乳液/千克体重局部治疗15个小鼠，其施加到后腿腓肠肌上方的小鼠皮肤。

第3组（对照组）用不含的空白纳米乳液局部治疗15个小鼠，其施加到后腿腓肠肌上方的小鼠皮肤。

评估

在注射和/或经皮施加后一周，使用DAS检定法测定治疗的潜在局部肌肉弱化效果。对于接下来的三周，该检定法每周进行一次。在或对照制品的注射和/或经皮施加后，由不知道治疗的观察者以五点分数（0＝正常至4＝脚趾外展和腿伸展的最大减少）将不同的脚趾外展程度评分。

结果和结论

在治疗后1周，与分数为0.5±0.3(P<.001)的用空白纳米乳液治疗的小鼠对照组（#3组）相比，用局部肉毒杆菌纳米乳液制品治疗的小鼠组（#2组）在Aoki级别中实现2.8±0.3的分数。作为比较，用在盐水溶液中的肉毒杆菌注射的那些小鼠（#1组）具有3.5±0.3的分数。到治疗后三周，用局部肉毒杆菌纳米乳液制品治疗的小鼠组和用在盐水中的肉毒杆菌注射的小鼠具有如通过关于注射肉毒杆菌的出版文献所预计到的在对照级别的Aoki分数。（使用肉毒杆菌一再观察到小鼠中的Aoki分数的这种降低，但是这在以治疗剂量用在人类中时具有持续的抗皱效果几个月）。此外，在治疗后的任何时间都没有观察到皮肤的恶化（例如发炎，发红，等等）。

总体而言，这种受控数据明显表明，局部肉毒杆菌纳米乳液制品实现与注射肉毒杆菌相当的生物效果。

实施例5：将肉毒杆菌纳米粒子组合物施用于人类对象以缓解皱纹

将本发明的局部肉毒杆菌纳米乳液制备并用于具有显著前额皱纹的人以测定其在松弛产生那些皱纹的前额肌肉中是否有效（与悬浮在注入这些肌肉的简单盐水溶液中的肉毒杆菌的给药所预期到的相同方式）。

方法

使用下列步骤制造肉毒杆菌纳米乳液：

1.在无菌小瓶中搅拌800毫克大豆油和800毫克吐温80达5分钟。

2.在8.4毫升0.9%盐水中添加4500单位的批准的A型肉毒杆菌毒素药品。搅拌20分钟。

3.将样品均化1分钟

4.将样品搅拌20分钟

5.在23,000psi微流化一次

将纳米乳液添加到相同体积的皮肤乳霜（Base PCCA VanishingCream Light）中并涡漩成均匀乳霜。

选择在前额具有显著横纹的代表其额肌过度活动的患者进行治疗。该患者从未用肉毒杆菌产品或皮肤填充产品治疗。在治疗之前使用4点皱纹分数由委员会验证的整形外科医生评估，分数“1”等于“无皱纹”，且分数“4”等于明显皱纹。在其面部“静止”时和在其试图通过收缩其额肌（这通过试图最大抬高其眉毛来实现）（"最大抬眉"）来制造最大皱纹时，使用该等级评估该患者。

该患者在静止时具有4分，在最大抬眉时具有4分。他表现出能够收缩额肌的优异活动性。使用数码SLR相机以及数码摄像机，在静止时和在被要求实施最大抬眉时将患者拍照（图3A，在治疗之前的最大抬眉）。

患者被要求在治疗当天不使用任何面部彩妆或防晒霜，在来到诊所之前用Ivory Soap洗脸。在诊所时，由整形外科医生将0.6CC的纳米乳液霜（如实施例1中制备）施加到患者前额以分布在其额肌上。将乳霜通过吸移管施加到患者前额皮肤上并由外科医生用手指（带有塑料手套）擦进皮肤直至外科医生不再能看见乳霜。患者在医师诊所观察3小时。其被要求不触摸其前额12小时，然后用Ivory Soap和水将其洗掉。在1天后然后在1、2、4、8和12周回访观察患者。在回访时，由医师评估静止和最大抬眉时的患者皱纹。医师也重复标准化数字静止照片和视频。

结果

到治疗后第一周，如其在被要求的最大抬眉时不能抬高其眉毛所示，患者不能收缩其额肌（图3B）。其皱纹分数为静止时2，和最大抬眉时2。医师临床评估为，治疗已经引发与其在其它患者上在类似治疗区域中使用肉毒杆菌毒素注射进行的治疗等同的被治疗的肌肉的完全麻痹。患者到第8周略微恢复眉毛活动性，但在观察的12周时继续显著降低其眉毛活动性。

患者能够在未被治疗的皮肤区域下方移动其其它面部肌肉，并且整形外科医师没有观察到副作用，在刚治疗后或在任何回访时不包括皮肤变化。同样地，在治疗后的任何时间，患者没有报道副作用，包括其皮肤的任何变化（例如发炎、发红等等）

结论

总体而言，该实验强烈表明，该局部肉毒杆菌纳米乳液制品产生由整形外科医师评定为在临床效力方面与对该患者注射肉毒杆菌（在简单盐水溶液中）的标准治疗后预计到的效力相当的明显生物和临床效果。

实施例6：其它肉毒杆菌纳米粒子组合物制剂

根据实施例1制备各种不同的毒杆菌纳米粒子组合物，只是在一些情况下，所用设备、外加压力、肉毒杆菌添加量和制成的纳米粒子组合物体积不同，这些可能解释所观察的尺寸的变化性。观察下列平均粒度和分布（表3）：

表3：微流化纳米乳液的粒度分布

实施例7：外加压力与所获得的平均粒度的关系

如实施例1中所述（只是不存在肉毒杆菌毒素）制备预混物制剂，并分成4个100毫升等分试样，A-D，将它们各自通入在不同压力下的如下表4中所示产生不同的平均粒度：

表4：在不同压力下微流化的纳米乳液的粒度

制剂	压力（psi）	平均粒度（纳米）
			A	3,500	142纳米
B	10,000	107纳米
			C	17,000	94纳米
D	24,000	89纳米

等同物和范围

前文是本发明的某些非限制性优选实施方案的描述。本领域技术人员能够认识到或使用仅常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。本领域普通技术人员会认识到，可以在不背离下列权利要求所指定的本发明的精神或范围的情况下对本说明书作出各种变动和修改。

在权利要求书中，除非作出相反说明或从文中明显看出不同的情况，“a,”“an,”和“该”可以表示一种或一种以上。除非作出相反说明或从文中明显看出不同的情况，如果一组成员的一个、多于一个、或所有成员存在于、用于给定产品或方法中或以其它方式与其相关，则在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为是满足的。本发明包括一组的正好一个成员存在于、用于给定产品或方法中或以其它方式与其相关的实施方案。本发明也包括一组的多于一个或所有成员存在于、用于给定产品或方法中或以其它方式与其相关的实施方案。此外，要理解的是，本发明包括所有变体、组合和排列，其中将来自一个或多个权利要求或来自说明书的相关部分的一个或多个限制、要素、条款、描述项等引入另一权利要求。例如，依赖于另一权利要求的任何权利要求可以改变以包括在依赖于相同基础权利要求的任何其它权利要求中发现的一个或多个限制。此外，在权利要求列出组合物时，要理解的是，包括将该组合物用于本文公开的任何目的的方法，并且包括根据本文公开的任何制造方法或本领域已知的其它方法制造组合物的方法，除非另行指明或除非本领域普通技术人员明显看出会发生冲突或矛盾。此外，本发明包括根据本文公开的任何制备组合物的方法制成的组合物。

在要素作为列表列出时，例如以马库什形式，要理解的是，也公开了要素的每一亚群，并且可以从该群中去除任何要素。同样要指出的是，术语“包含”是开放的并能够包括附加要素或步骤。应该要理解的是，一般而言，在本发明或本发明的方面被指包含特定要素、特征、步骤等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由这类要素、特征、步骤等构成或基本由其构成。为简要起见，在本文中没有赘述地(inhaec verba)具体列出这些实施方案。因此，对于包含一个或多个要素、特征、步骤等的本发明的各实施方案，本发明也提供了由这些要素、特征、步骤等构成或基本由其构成的实施方案。

在给出范围时，包括端点。此外，要理解的是，除非另行指明或除非从文中和/或本领域普通技术人员的理解中明显看出不同的情况，以范围表示的值可以在本发明的不同实施方案中采用在指定范围内的任何具体值，至该范围下限单位的1/10，除非文中清楚另行指明。还要理解的是，除非另行指明或除非从文中和/或本领域普通技术人员的理解中明显看出不同的情况，以范围表示的值可以采用在给定范围内的任何子范围，其中该子范围的端点表示至与该范围下限单位的1/10相同的精确度。

此外，要理解的是，可以从任何一个或多个权利要求明确排除本发明的任何具体实施方案。可以从任何一个或多个权利要求中排除本发明的任何实施方案、要素、特征、用途或组合物和/或方法的方面（例如，任何肉毒杆菌毒素、任何油、任何表面活性剂、任何分散介质、任何纳米粒子或包含任何纳米粒子的组合物、任何制造纳米粒子的方法，任何给药途径或位置，组合物的任何给药目的，等等）。为简要起见，本文中没有明确列出排除一种或多种要素、特征、用途或方面的所有实施方案。

Claims (180)

1.包含粒子群的纳米乳液，其中大部分粒子具有大约10至大约300纳米的直径，且其中所述纳米乳液包含至少一种肉毒杆菌毒素。

2.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子具有大约10至大约250纳米的直径范围。

3.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子具有大约10至大约200纳米的直径范围。

4.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子具有大约10至大约150纳米的直径范围。

5.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子具有大约10至大约120纳米的直径范围。

6.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子具有大约10至大约100纳米的直径范围。

7.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子具有大约10至大约50纳米的直径范围。

8.权利要求1的纳米乳液，其中该粒子群基本不含直径超过300纳米的粒子。

9.权利要求1的纳米乳液，其中少于50%的粒子具有超过300纳米的直径。

10.权利要求1的纳米乳液，其中少于25%的粒子具有超过300纳米的直径。

11.权利要求1的纳米乳液，其中少于10%的粒子具有超过300纳米的直径。

12.权利要求1的纳米乳液，其中少于5%的粒子具有超过300纳米的直径。

13.权利要求1的纳米乳液，其中少1%的粒子具有超过300纳米的直径。

14.权利要求1的纳米乳液，其中该粒子群基本不含直径超过200纳米的粒子。

15.权利要求1的纳米乳液，其中少于50%的粒子具有超过200纳米的直径。

16.权利要求1的纳米乳液，其中少于25%的粒子具有超过200纳米的直径。

17.权利要求1的纳米乳液，其中少于10%的粒子具有超过200纳米的直径。

18.权利要求1的纳米乳液，其中少于5%的粒子具有超过200纳米的直径。

19.权利要求1的纳米乳液，其中少于1%的粒子具有超过200纳米的直径。

20.权利要求1的纳米乳液，其中该粒子群基本不含直径超过120纳米的粒子。

21.权利要求1的纳米乳液，其中少于50%的粒子具有超过120纳米的直径。

22.权利要求1的纳米乳液，其中少于25%的粒子具有超过120纳米的直径。

23.权利要求1的纳米乳液，其中少于10%的粒子具有超过120纳米的直径。

24.权利要求1的纳米乳液，其中少于5%的粒子具有超过120纳米的直径。

25.权利要求1的纳米乳液，其中少于1%的粒子具有超过120纳米的直径。

26.权利要求1的纳米乳液，其中最小粒径与最大粒径之差不超过大约600纳米。

27.权利要求1的纳米乳液，其中最小粒径与最大粒径之差不超过大约500纳米。

28.权利要求1的纳米乳液，其中最小粒径与最大粒径之差不超过大约400纳米。

29.权利要求1的纳米乳液，其中最小粒径与最大粒径之差不超过大约300纳米。

30.权利要求1的纳米乳液，其中最小粒径与最大粒径之差不超过大约200纳米。

31.权利要求1的纳米乳液，其中最小粒径与最大粒径之差不超过大约100纳米。

32.权利要求1的纳米乳液，其中最小粒径与最大粒径之差不超过大约50纳米。

33.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有300纳米的平均直径。

34.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有200纳米的平均直径。

35.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有150纳米的平均直径。

36.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有100纳米的平均直径。

37.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有75纳米的平均直径。

38.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有50纳米的平均直径。

39.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有100-300纳米的平均直径。

40.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有50-250纳米的平均直径。

41.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有60-200纳米的平均直径。

42.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有65-150纳米的平均直径。

43.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有70-130纳米的平均直径。

44.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有80-110纳米的平均直径。

45.权利要求1的纳米乳液，其中粒子具有90-100纳米的平均直径。

46.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液基本不含毒性溶剂。

47.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含少于50%的毒性溶剂。

48.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含少于25%的毒性溶剂。

49.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含少于10%的毒性溶剂。

50.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含少于5%的毒性溶剂。

51.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含少于1%的毒性溶剂。

52.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液是稳定的。

53.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子稳定至少1天。

54.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子稳定至少2周。

55.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子稳定至少2个月。

56.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子稳定至少5个月。

57.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子稳定至少12个月。

58.权利要求1的纳米乳液，其中大部分粒子稳定至少24个月。

59.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过暴露在高剪切力下来产生。

60.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过在高剪切力下暴露少于10分钟来产生。

61.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过在高剪切力下暴露少于2分钟来产生。

62.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过在高剪切力下暴露少于1分钟来产生。

63.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过在高剪切力下暴露少于30秒来产生。

64.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过暴露在高于3,000psi的压力下来产生。

65.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过暴露在高于10,000psi的压力下来产生。

66.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过暴露在高于18,000psi的压力下来产生。

67.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过暴露在高于24,000psi的压力下来产生。

68.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过微流化产生。

69.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过在高于3,000psi的压力下微流化来产生。

70.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过在高于10,000psi的压力下微流化来产生。

71.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过在高于18,000psi的压力下微流化来产生。

72.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过在高于24,000psi的压力下微流化来产生。

73.权利要求68-72任一项的纳米乳液，其中微流化是单程微流化。

74.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过空化来产生。

75.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液通过高压均化来产生。

76.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素包封在粒子内。

77.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素吸附在粒子表面上。

78.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素与粒子界面结合。

79.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素选自A型、B型、C₁型、C₂型、D型、F型和G型。

80.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。

81.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素是肉毒杆菌毒素络合物。

82.权利要求81的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素络合物包含非毒素凝血素蛋白质和非毒性非凝血素蛋白质。

83.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素包含在白蛋白基质内。

84.权利要求83的纳米乳液，其中白蛋白是人白蛋白。

85.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素是纯化的肉毒杆菌毒素蛋白质或其片段。

86.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素与其它蛋白质分离或基本分离。

87.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素与非毒素蛋白质分离或基本分离。

88.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素与梭形芽孢肉毒杆菌分离。

89.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素由化学合成。

90.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素经重组制造。

91.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液可以渗透皮肤而不改变或变动皮肤。

92.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液可以在不使用皮肤渗透增强剂或研磨剂的情况下渗透皮肤。

93.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液可以在不使用皮肤渗透增强剂或研磨剂的情况下渗透皮肤表层。

94.权利要求93的纳米乳液，其中皮肤表层是角质层的表面。

95.权利要求93的纳米乳液，其中皮肤表层包括皮肤毛孔。

96.权利要求93的纳米乳液，其中皮肤表层包括皮腺。

97.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液可以在不使用化学渗透增强剂或研磨剂的情况下渗透皮肤。

98.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液可以在不使用机械渗透增强剂或研磨剂的情况下渗透皮肤。

99.权利要求1的纳米乳液，其中粒子可以渗透皮肤而不改变或变动皮肤。

100.权利要求1的纳米乳液，其中粒子可以在不使用皮肤渗透增强剂或研磨剂的情况下渗透皮肤。

101.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素可以渗透皮肤而不改变或变动皮肤。

102.权利要求1的纳米乳液，其中肉毒杆菌毒素可以在不使用皮肤渗透增强剂或研磨剂的情况下渗透皮肤。

103.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含油。

104.权利要求103的纳米乳液，其中油选自杏仁、杏核、鳄梨、巴西棕榈、佛手柑、黑加仑籽油、琉璃苣、刺桧、甘菊、卡诺拉、香菜、腊棕榈、蓖麻、肉桂、可可油、椰子、鳕鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻子、香叶醇、葫芦、葡萄籽、榛子、海索草、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴、夏威夷核果、醒目熏衣草、熏衣草、柠檬、山鸡椒、澳洲坚果、锦葵、芒果籽、白芒花籽、貂油、肉豆蔻、橄榄、橙子、罗非鱼、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香、sasquana、香薄荷、沙棘、芝麻、乳木果油、有机硅、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿、香根草、胡桃、和麦芽油及其组合。

105.权利要求103的纳米乳液，其中油是大豆油。

106.权利要求103的纳米乳液，其中油选自硬脂酸丁酯、甘油三辛酸酯、甘油三癸酸酯、环状聚二甲基硅氧烷、癸二酸二乙酯、聚二甲基硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油；及其组合。

107.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液不含多于一种的油。

108.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含表面活性剂。

109.权利要求108的纳米乳液，其中表面活性剂是非离子型洗涤剂。

110.权利要求108的纳米乳液，其中表面活性剂选自磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）；二油基磷脂酰乙醇胺（DOPE）；二油基氧基丙基三乙铵（DOTMA）；二油酰基磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂酰甘油（DPPG）；己烷癸醇；脂肪醇，例如聚乙二醇（PEG）；聚氧乙烯-9-十二烷基醚；表面活性脂肪酸，例如棕榈酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸单甘油酯；脂肪酸二甘油酯；脂肪酸酰胺；三油酸失水山梨糖醇酯（斯盘85）甘胆酸酯；单月桂酸失水山梨糖醇酯（斯盘20）；聚山梨酯20（吐温-20）；聚山梨酯60（吐温-60）；聚山梨酯65（吐温-65）；聚山梨酯80（吐温-80）；聚山梨酯85（吐温-85）；聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；失水山梨糖醇脂肪酸酯，例如三油酸失水山梨糖醇酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；联十六烷基磷酸酯；二棕榈酰基磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷基胺；十六烷基胺；棕榈酸乙酰酯；蓖麻醇酸甘油酯；硬脂酸十六烷基酯；肉豆蔻酸异丙酯；四丁酚醛；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂性质的合成和/或天然洗涤剂；脱氧胆酸盐；环糊精；离液盐；离子配对剂；及其组合。

111.权利要求108的纳米乳液，其中表面活性剂是吐温80。

112.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液不含超过一种的表面活性剂。

113.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含油和表面活性剂。

114.权利要求113的纳米乳液，其中油和表面活性剂以0.5-2.0的比率存在。

115.权利要求113的纳米乳液，其中油和表面活性剂以0.5-1.5的比率存在。

116.权利要求113的纳米乳液，其中油和表面活性剂以0.5-1.0的比率存在。

117.权利要求113的纳米乳液，其中油和表面活性剂以1.0-2.0的比率存在。

118.权利要求113的纳米乳液，其中油和表面活性剂以1.5-2.0的比率存在。

119.权利要求113的纳米乳液，其中油在纳米乳液中的百分比为1%-30%。

120.权利要求113的纳米乳液，其中油在纳米乳液中的百分比为1%-20%。

121.权利要求113的纳米乳液，其中油在纳米乳液中的百分比为1%-10%。

122.权利要求113的纳米乳液，其中油在纳米乳液中的百分比为大约8%。

123.权利要求113的纳米乳液，其中油在纳米乳液中的百分比为大约5%。

124.权利要求113的纳米乳液，其中表面活性剂在纳米乳液中的百分比为1%-30%的范围。

125.权利要求113的纳米乳液，其中表面活性剂在纳米乳液中的百分比为1%-20%的范围。

126.权利要求113的纳米乳液，其中表面活性剂在纳米乳液中的百分比为1%-10%的范围。

127.权利要求113的纳米乳液，其中表面活性剂在纳米乳液中的百分比为大约8%。

128.权利要求113的纳米乳液，其中表面活性剂在纳米乳液中的百分比为大约5%。

129.权利要求113的纳米乳液，其中油选自杏仁、杏核、鳄梨、巴西棕榈、佛手柑、黑加仑籽油、琉璃苣、刺桧、甘菊、卡诺拉、香菜、腊棕榈、蓖麻、肉桂、可可油、椰子、鳕鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻子、香叶醇、葫芦、葡萄籽、榛子、海索草、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴、夏威夷核果、醒目熏衣草、熏衣草、柠檬、山鸡椒、澳洲坚果、锦葵、芒果籽、白芒花籽、貂油、肉豆蔻、橄榄、橙子、罗非鱼、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香、sasquana、香薄荷、沙棘、芝麻、乳木果油、有机硅、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿、香根草、胡桃、和麦芽油及其组合。

130.权利要求113的纳米乳液，其中油是大豆油。

131.权利要求113的纳米乳液，其中油选自硬脂酸丁酯、甘油三辛酸酯、甘油三癸酸酯、环状聚二甲基硅氧烷、癸二酸二乙酯、聚二甲基硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油；及其组合。

132.权利要求113的纳米乳液，其中表面活性剂是非离子型洗涤剂。

133.权利要求113的纳米乳液，其中表面活性剂选自磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）；二油基磷脂酰乙醇胺（DOPE）；二油基氧基丙基三乙铵（DOTMA）；二油酰基磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂酰甘油（DPPG）；己烷癸醇；脂肪醇，例如聚乙二醇（PEG）；聚氧乙烯-9-十二烷基醚；表面活性脂肪酸，例如棕榈酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸单甘油酯；脂肪酸二甘油酯；脂肪酸酰胺；三油酸失水山梨糖醇酯（斯盘85）甘胆酸酯；单月桂酸失水山梨糖醇酯（斯盘20）；聚山梨酯20（吐温-20）；聚山梨酯60（吐温-60）；聚山梨酯65（吐温-65）；聚山梨酯80（吐温-80）；聚山梨酯85（吐温-85）；聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；失水山梨糖醇脂肪酸酯，例如三油酸失水山梨糖醇酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；联十六烷基磷酸酯；二棕榈酰基磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷基胺；十六烷基胺；棕榈酸乙酰酯；蓖麻醇酸甘油酯；硬脂酸十六烷基酯；肉豆蔻酸异丙酯；四丁酚醛；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂性质的合成和/或天然洗涤剂；脱氧胆酸盐；环糊精；离液盐；离子配对剂；及其组合。

134.权利要求113的纳米乳液，其中表面活性剂是吐温80。

135.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含分散在水性分散介质内的油性粒子。

136.权利要求135的纳米乳液，其中水性分散介质选自水、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水、短链醇、5%葡萄糖、林格氏溶液、乳酸盐化林格氏注射液、乳酸盐化林格氏＋5%葡萄糖注射液、酰化林格氏注射液、Normosol-M、Isolyte E，及其组合。

137.权利要求135的纳米乳液，其中水性分散介质是水。

138.权利要求135的纳米乳液，其中油性粒子包含选自杏仁、杏核、鳄梨、巴西棕榈、佛手柑、黑加仑籽油、琉璃苣、刺桧、甘菊、卡诺拉、香菜、腊棕榈、蓖麻、肉桂、可可油、椰子、鳕鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻子、香叶醇、葫芦、葡萄籽、榛子、海索草、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴、夏威夷核果、醒目熏衣草、熏衣草、柠檬、山鸡椒、澳洲坚果、锦葵、芒果籽、白芒花籽、貂油、肉豆蔻、橄榄、橙子、罗非鱼、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香、sasquana、香薄荷、沙棘、芝麻、乳木果油、有机硅、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿、香根草、胡桃或麦芽油的油。

139.权利要求135的纳米乳液，其中油性粒子包含大豆油。

140.权利要求135的纳米乳液，其中油性粒子包含选自硬脂酸丁酯、甘油三辛酸酯、甘油三癸酸酯、环状聚二甲基硅氧烷、癸二酸二乙酯；聚二甲基硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油及其组合的油。

141.权利要求1的纳米乳液，其中纳米乳液包含分散在油性分散介质中的水性粒子。

142.权利要求141的纳米乳液，其中水性粒子包含选自水、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水、短链醇、5%葡萄糖、林格氏溶液、乳酸盐化林格氏注射液、乳酸盐化林格氏＋5%葡萄糖注射液、酰化林格氏注射液或Normosol-M、Isolyte E的水性物质。

143.权利要求141的纳米乳液，其中水性粒子包含水。

144.权利要求141的纳米乳液，其中油性分散介质选自杏仁、杏核、鳄梨、巴西棕榈、佛手柑、黑加仑籽油、琉璃苣、刺桧、甘菊、卡诺拉、香菜、腊棕榈、蓖麻、肉桂、可可油、椰子、鳕鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻子、香叶醇、葫芦、葡萄籽、榛子、海索草、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴、夏威夷核果、醒目熏衣草、熏衣草、柠檬、山鸡椒、澳洲坚果、锦葵、芒果籽、白芒花籽、貂油、肉豆蔻、橄榄、橙子、罗非鱼、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香、sasquana、香薄荷、沙棘、芝麻、乳木果油、有机硅、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿、香根草、胡桃和麦芽油，及其组合。

145.权利要求141的纳米乳液，其中油性分散介质是大豆油。

146.权利要求141的纳米乳液，其中油选自硬脂酸丁酯、甘油三辛酸酯、甘油三癸酸酯、环状聚二甲基硅氧烷、癸二酸二乙酯；聚二甲基硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油及其组合。

147.包含直径为大约10至大约300纳米的粒子群的纳米乳液，其中所述纳米乳液包含至少一种肉毒杆菌毒素，且其中该肉毒杆菌毒素是包含与非毒素蛋白质结合的肉毒杆菌毒素的络合物的一部分。

148.包含直径为大约10至大约300纳米的粒子群的纳米乳液，其中该纳米乳液通过暴露在高剪切力下来产生；其中该纳米乳液包含至少一种肉毒杆菌毒素、至少一种油、和至少一种非离子型洗涤剂；且其中肉毒杆菌毒素包含在人白蛋白基质内。

149.纳米乳液，包含：

直径为大约10至大约300纳米的粒子群；

至少一种肉毒杆菌毒素；

至少一种油；和

不超过一种表面活性剂；

其中该纳米乳液通过暴露在高剪切力下来产生。

150.包含权利要求1、21、31或41任一纳米乳液的药物组合物。

151.权利要求150的组合物，其中该组合物选自乳霜、洗剂、凝胶、油膏、喷剂、粉剂、润肤剂及其组合。

152.权利要求150的组合物，其中该组合物是乳霜。

153.将肉毒杆菌毒素经皮给药至对象的方法，包括下列步骤：

（a）提供包含肉毒杆菌毒素的组合物；和

（b）将该组合物施用于对象皮肤。

154.权利要求153的方法，其中该组合物使用粘性贴膏经皮给药。

155.权利要求153的方法，其中该组合物使用抹刀经皮给药。

156.权利要求153的方法，其中该组合物使用药签经皮给药。

157.权利要求153的方法，其中该组合物使用不带针头的注射器经皮给药。

158.权利要求153的方法，其中该组合物使用戴手套的手指经皮给药。

159.权利要求153的方法，其中该组合物使用未受保护的手指经皮给药。

160.权利要求153的方法，其中该组合物使用能够将组合物施加到皮肤上的靶位而不将组合物施加到皮肤的非靶位的装置来经皮给药。

161.权利要求153的方法，其中所有肉毒杆菌毒素渗透皮肤。

162.权利要求153的方法，其中至少99%的肉毒杆菌毒素渗透皮肤。

163.权利要求153的方法，其中至少95%的肉毒杆菌毒素渗透皮肤。

164.权利要求153的方法，其中至少90%的肉毒杆菌毒素渗透皮肤。

165.权利要求153的方法，其中至少75%的肉毒杆菌毒素渗透皮肤。

166.权利要求153的方法，其中至少50%的肉毒杆菌毒素渗透皮肤。

167.权利要求153的方法，其中至少25%的肉毒杆菌毒素渗透皮肤。

168.权利要求153的方法，其中至少10%的肉毒杆菌毒素渗透皮肤。

169.权利要求153的方法，其中至少1%的肉毒杆菌毒素渗透皮肤。

170.权利要求153的方法，其中该组合物被给药以治疗皱纹、面部纹路和/或颈纹。

171.权利要求170的方法，其中皱纹、面部纹路和/或颈纹选自运动过度的面部纹路、面部皱纹、颈阔肌带、肩颈纹及其组合。

172.权利要求171的方法，其中面部皱纹涉及前额区域、眉间区域、额肌区域、颞肌区域、rhytids区域或眼眶周区域。

173.权利要求153的方法，其中该组合物被给药以治疗多汗症。

174.将肉毒杆菌毒素经皮给药至对象的方法，包括下列步骤

（a）提供：

（i）对象；

（ii）包含权利要求1、21、31或41任一项的纳米乳液的组合物；和

（b）将该组合物施用于对象皮肤。

175.治疗皱纹、面部纹路和/或颈纹的方法，包括下列步骤：

（a）提供：

（i）表现出皱纹、面部纹路和/或颈纹症状的对象；

（ii）包含权利要求1、21、31或41任一项的纳米乳液的组合物；和

（b）将该组合物施用于对象皮肤以便减轻症状。

176.延迟皱纹、面部纹路和/或颈纹的出现的方法，包括下列步骤：

（a）提供：

（i）没有表现出皱纹、面部纹路和/或颈纹症状的对象；

（ii）包含权利要求1、21、31或41任一项的纳米乳液的组合物；和

（b）将该组合物施用于对象皮肤以便延迟症状出现。

177.制造纳米乳液的方法，包括下列步骤：

（a）提供预混物，其包含：

（i）油；

（ii）表面活性剂；和

（iii）水相；和

（b）在获得权利要求1、21、31或41任一项的纳米粒子组合物的条件下，对预混物施以高剪切力或高压均化一段时间。

178.权利要求177的方法，其中该预混物包含肉毒杆菌毒素。

179.制造纳米乳液的方法，包括下列步骤：

（a）提供预混物，其包含：

（i）油；

（ii）表面活性剂；和

（iii）水相；

（b）形成包含预混物的溶液；和

（c）在获得权利要求1、21、31或41任一项的纳米粒子组合物的条件下，对预混物施以高剪切力或高压均化一段时间。

180.制造纳米乳液的方法，包括下列步骤：

（a）提供预混物，其包含：

（iv）油；

（v）表面活性剂；

（vi）水相；和

（vii）肉毒杆菌毒素；

（b）形成包含预混物的溶液；和

（c）在获得权利要求1、21、31或41任一项的纳米粒子组合物的条件下，对该溶液施以高剪切力或高压均化一段时间；

其中油和表面活性剂以0.5-2.0（按重量计）的比率存在；且其中通过微流化产生高剪切力。