CN103913499A - 一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，先对玻碳电极进行表面处理，然后取分散好的石墨烯（GR）水溶液滴涂在玻碳电极表面，再滴涂离子液体（IL）水溶液，然后浸入含有牛血红蛋白（BHb）和吡咯单体的除氧的磷酸盐缓冲液中，通过循环伏安扫描进行电聚合，再浸入洗脱液中洗脱模板分子BHb，得到MIPs/IL/GR/GCE；将MIPs/IL/GR/GCE作为工作电极，和参比电极、对电极连接在电化学工作站上以组成分子印迹电化学传感器。本发明基于IL能够在电极表面固定更多的模板分子BHb从而产生更多的印迹孔穴以提高其灵敏度，且能够缩短再键合平衡的时间，可成功地用于BHb的电化学检测，具有优异的灵敏度，高的选择性和快速的平衡响应，为BHb的免疫分析和临床检测提供了可能。

Description

一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及一种分子印迹电化学传感器的制备方法，具体地说是涉及一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法。 

背景技术

分子印迹技术（molecular imprinting technology,MIT）由于其良好的化学稳定性和热稳定性、重现性、制备价格低廉和对模板分子高的特异性识别能力为传感领域中生物分子的识别提供了巨大的潜能。近年来，作为一类模拟天然的抗原-抗体的生物分子识别***的合成材料，分子印迹聚合物（molecular imprinting polymers,MIPs）被广泛地应用于电化学传感领域。分子印迹聚合物不仅能够在电极表面聚集模板分子来提高传感器的灵敏度，而且能从类似分析物中分离出模板分子以提高传感器的选择性。目前为止，分子印迹电化学传感器（molecular imprinting electrochemical sensors,MIECSs）已被成功用于印迹生物小分子。与此同时，印迹生物大分子尤其是印迹蛋白质分子并将其应用于电化学检测引起了研究者们越来越多的关注。尽管用于识别生物小分子的分子印迹电化学传感器能够通过将分子印迹聚合物修饰到电极表面来提高其选择性，但是印迹了蛋白质分子的电化学传感器或生物传感器的灵敏度由于蛋白质大的分子尺寸、结构多变和较低的再键合效率一直面临着严峻的挑战。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法。 

本发明所采用的技术解决方案是： 

一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，包括以下步骤： 

（1）GR/GCE的制备 

选取玻碳电极，对其进行表面处理，然后取分散好的石墨烯水溶液滴涂在玻碳电极表面，置于红外灯下烘干，制得GR/GCE； 

（2）IL/GR/GCE的制备 

在步骤（1）得到的GR/GCE表面滴涂离子液体水溶液，晾干后得到IL/GR/GCE； 

（3）BHbMIPs/IL/GR/GCE的制备 

将步骤（2）得到的IL/GR/GCE浸入含有牛血红蛋白和吡咯单体的除氧的磷酸盐缓冲液（pH=7.0）中，牛血红蛋白的浓度为1g/L，吡咯浓度为1.0×10^-3mol/L-2.0×10^-2mol/L，在-0.2V～1.2V电位范围内，以80～120mV/s的扫速循环伏安扫描4～7圈后取出晾干，得到BHbMIPs/IL/GR/GCE； 

（4）MIPs/IL/GR/GCE的制备 

将步骤（3）得到的BHbMIPs/IL/GR/GCE浸入洗脱液中洗脱模板分子牛血红蛋白，得到MIPs/IL/GR/GCE； 

（5）分子印迹电化学传感器的制备 

将步骤（4）得到的MIPs/IL/GR/GCE作为工作电极，和参比电极、对电极正确连接在电化学工作站上以组成分子印迹电化学传感器。 

优选的，步骤（1）中，所述玻碳电极的表面处理过程如下：先将玻碳电极在金相砂纸上打磨，然后在麂皮上依次用0.3μm和0.05μm Al₂O₃粉抛光成镜面，再用二次蒸馏水冲洗玻碳电极表面，并分别置于二次蒸馏水和乙醇中超声洗涤20s，室温下晾干备用。 

优选的，步骤（1）中：所述石墨烯为石墨烯本体或经功能化的石墨烯，所述石墨烯水溶液的浓度为1mg/mL，取5.0μL滴涂在玻碳电极表面。 

优选的，步骤（2）中：所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，其水溶液的浓度为1.0×10^-4g/L，取5.0μL滴涂在玻碳电极表面。离子液体也可以为咪唑类离子液体或者与蛋白质分子能形成特定相互作用的离子液体。 

优选的，步骤（3）中：所述吡咯浓度为5.0×10^-3mol/L，扫速为100mV/s，扫描圈数为5圈。 

优选的，步骤（4）中：所述洗脱液为硫酸溶液，其浓度为1mol/L。 

优选的，步骤（5）中：所述参比电极为饱和氯化钾甘汞电极，对电极为铂丝电极。 

本发明的有益技术效果是： 

本发明制备的分子印迹电化学传感器，基于离子液体BmimBF₄能够在修饰电极表面固定更多的模板分子BHb从而产生更多的印迹孔穴以提高其灵敏度，且能够缩短再键合平衡的时间，对牛血红蛋白模板分子能够快速再键合，可成功地用于BHb的灵敏检测，具有优异的灵敏度，高的选择性和快速的平衡响应，为BHb的免疫分析和临床检测提供了可能。 

附图说明

图1为不同电极在含有0.1mmol/L的[Fe(CN)₆]^3-/4-的pH=7.0的磷酸盐缓冲液中的EIS图，频率为0.01-10⁵Hz，a为BHbMIPs/IL/GR/GCE，b为MIPs/IL/GR/GCE，c为BHbMIPs/GR/GCE和d为MIPs/GR/GCE。 

图2为不同印迹电极在含有0.1mmol/L的[Fe(CN)₆]^3-/4-的pH=7.0的磷酸盐缓冲液中的差分脉冲伏安图，扫速为100mV/s，a为MIPs/IL/GR/GCE，b为MIPs/IL/GCE，c为MIPs/GR/GCE和d为MIPs/GCE。 

图3为1.0g/L BHb在水溶液中，1.0g/L BHb在离子液体相中和纯离子液体的紫外-可见 光谱图，其中：图3A示出300-750nm，图3B示出450-750nm；图3A、3B中，a为BHb分子在水溶液中的紫外-可见光谱图，b为BHb分子在离子液体相中的紫外-可见光谱图； 

图4示出MIPs/IL/GR/GCE制备条件的优化，其中：图4A示出吡咯单体浓度的影响；图4B示出扫描圈数的影响；图4C示出扫速的影响； 

图5示出[Fe(CN)₆]^3-/4-在MIPs/IL/GR/GCE(a)和MIPs/GR/GCE(b)上的峰电流随着再键合时间的变化情况； 

图6示出MIPs/IL/GR/GCE对1.0×10^-3g/L BHb，BSA和HSA的选择性； 

图7示出[Fe(CN)₆]^3-/4-在MIPs/IL/GR/GCE上的响应电流变化值与BHb浓度的关系。 

具体实施方式

一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，包括以下步骤： 

（1）GR/GCE的制备 

选取玻碳电极，先将其在金相砂纸上打磨，然后在麂皮上依次用0.3μm和0.05μm Al₂O₃粉抛光成镜面，再用二次蒸馏水冲洗玻碳电极表面，并分别置于二次蒸馏水和乙醇中超声洗涤20s，室温下晾干备用。将石墨烯超声分散于水中，配制浓度为1mg/mL的石墨烯水溶液，取5.0μL分散好的石墨烯水溶液滴涂在处理后的玻碳电极表面，然后置于红外灯下烘干，制得石墨烯修饰的玻碳电极（GR/GCE）。 

（2）IL/GR/GCE的制备 

在步骤（1）得到的GR/GCE表面滴涂5.0μL浓度为1.0×10^-4g/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（BmimBF₄）水溶液，晾干后得到离子液体与石墨烯修饰的玻碳电极（IL/GR/GCE）。 

（3）BHbMIPs/IL/GR/GCE的制备 

将步骤（2）得到的IL/GR/GCE浸入含有牛血红蛋白和吡咯单体的除氧的磷酸盐缓冲液中（pH=7.0），溶液中牛血红蛋白（BHb）的浓度为1g/L，吡咯浓度为5.0×10^-3mol/L，在-0.2V～1.2V电位范围内，以100mV/s的扫速循环伏安扫描5圈后取出晾干，得到聚合物修饰电极IL/GR/GCE（BHbMIPs/IL/GR/GCE）。 

（4）MIPs/IL/GR/GCE的制备 

将步骤（3）得到的BHbMIPs/IL/GR/GCE浸入1mol/L的硫酸溶液中洗脱模板分子牛血红蛋白（BHb），得到印迹电极MIPs/IL/GR/GCE。 

（5）分子印迹电化学传感器的制备 

将步骤（4）得到的MIPs/IL/GR/GCE作为工作电极，和参比电极、对电极正确连接在电化学工作站上以组成分子印迹电化学传感器。所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝 电极。 

下面通过相应实验对本发明制备的分子印迹电化学传感器的电性能进行表征，作为对比，采用上述方法用不同的修饰电极分别制备了相应的聚合物修饰电极BHbMIPs/GR/GCE，BHbMIPs/IL/GCE和BHbMIPs/GCE，然后洗脱得到相应的印迹电极MIPs/GR/GCE，MIPs/IL/GCE和MIPs/GCE。 

众所周知，EIS是一种分析修饰电极界面性质的有效手段，能够用于表征传感器的构建过程。图1为EIS考察不同修饰电极在含有0.1mmol/L的[Fe(CN)₆]^3-/4-的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中的交流阻抗曲线。如曲线a和c，出现了较大的Nyquist圆弧，说明电聚合后得到的分子印迹聚合物膜对氧化还原探针产生大的电荷转移电阻。然而，曲线b和d中的Nyquist圆弧半径急剧减小，应该是由于模板分子洗脱后产生了印迹孔穴，为[Fe(CN)₆]^3-/4-探针通过印迹聚合物膜达到电极表面进行氧化还原反应提供了渗透通道。比较两个印迹电极（MIPs/IL/GR/GCE和MIPs/GR/GCE）在模板蛋白分子洗脱前后（a→b,c→d）的Nyquist圆弧的变化值，可发现MIPs/IL/GR/GCE比MIPs/GR/GCE拥有更大的变化值。这是由于离子液体能够结合更多的模板分子，从而得到更多的印迹孔穴，进而产生更多的通道，使得更多的电化学探针穿过聚合物膜到达IL/GR/GCE电极表面产生氧化还原电信号。 

为了研究分子印迹膜修饰电极的性能，进一步测试了不同印迹电极的DPV图（MIPs/GCE，MIPs/GR/GCE，MIPs/IL/GCE和MIPs/IL/GR/GCE）。如图2所示，MIPs/GR/GCE（曲线c）与MIPs/GCE（曲线d）相比，具有更大的[Fe(CN)₆]^3-/4-的峰电流，这是由于石墨烯大的比表面积和优异的电子传递能力产生了更大的氧化还原转换。当IL修饰到玻碳电极表面后，与MIPs/GCE（曲线d）相比，MIPs/IL/GCE（曲线b）具有更大的峰电流，这应该是由于IL的高的离子导电性，IL修饰的玻碳电极的导电性大幅提高。当把IL修饰到GR/GCE上后，MIPs/IL/GR/GCE（曲线a）的峰电流是最大的，这可能是由于GR的大比表面积和IL能在电极表面固定更多的BHb的协同作用。 

为了进一步说明离子液体BmimBF₄和牛血红蛋白分子BHb的作用，考察了1.0g/L BHb在水溶液中，1.0g/L BHb在离子液体相中和纯离子液体的紫外-可见光谱。如图3A，在水溶液中（曲线a）BHb分子在416nm处有一个尖锐的Soret吸收峰，在539nm处有一个Q带吸收峰，在575和630nm有两个特征吸收峰；当BHb在离子液体相中时（曲线b），Soret吸收峰从416nm蓝移到406nm，Q带吸收峰从539nm红移到550nm，575nm处的特征吸收峰红移到646nm，并且630nm处的特征吸收峰消失。在水溶液中血红素中的铁原子四配位，第五个配位点和水分子结合；当BHb在离子液体中时，铁原子的第五个配位点和离子液体中咪唑环中的氮原子配位，导致BHb吸收峰明显变化。因此，BmimBF₄能够在电极表面固定更多的 BHb从而提高MIPs/IL/GR/GCE的灵敏度。 

上述分子印迹电化学传感器是在优化条件下制备的，优选磷酸盐缓冲液中，吡咯浓度为5.0×10^-3mol/L，在-0.2V～1.2V电位范围内，以100mV/s的扫速循环伏安扫描5圈，得到聚合物修饰的IL/GR/GCE（BHbMIPs/IL/GR/GCE）。当然，制备分子印迹电化学传感器时也可选取吡咯浓度为1.0×10^-3mol/L-2.0×10^-2mol/L中的任意值，如吡咯浓度可选取为1.0×10^-3mol/L、3.0×10^-3mol/L、1.0×10^-2mol/L、2.0×10^-2mol/L等，扫速可在80～120mV/_s的范围内进行选取，如可选取为80mV/s、90mV/s、120mV/s等，扫描圈数还可为3、4、6或7圈等。但上述条件制得的分子印迹电化学传感器的活性应较优化条件下制得的电化学传感器性能较差。下面对优化条件的选取进行说明。 

单体浓度在聚合过程中影响着聚合物的沉积厚度和印迹分子的数量，将进一步影响传感器的电化学行为。为了研究吡咯浓度对MIECS的影响，电极在不同浓度的吡咯水溶液中(1.0×10^-3mol/L-2.0×10^-2mol/L，BHb浓度为定值1g/L)进行电聚合。如图4A，当吡咯浓度为5.0×10^-3mol/L时，[Fe(CN)₆]^3-/4-在MIECS上的响应峰电流最大，当吡咯浓度小于5.0×10^-3mol/L时，随浓度的减小，峰电流变小，可能是由于吡咯浓度太低导致在电聚合过程中没有那么多的BHb分子固定。当吡咯浓度大于5.0×10^-3mol/L时，随着浓度的增加，MIECS上的电流响应明显降低，应该是由于吡咯的浓度过大导致形成的印迹聚合物太过紧实不利于洗脱后印迹孔穴的形成。因此，制备MIECES的吡咯的最优浓度为5.0×10^-3mol/L。 

电聚合扫描圈数和扫速也是影响MIECS制备的重要因素，能够影响分子印迹聚合物的厚度和紧密度。为了考察扫描圈数对聚合物膜厚度的影响，分别考察了3、4、5、6、7圈的影响，如图4B。聚合圈数过多导致聚合物膜的厚度太大，减少了有效的印迹孔穴。根据[Fe(CN)₆]^3-/4-的峰电流的大小，最佳聚合圈数定为5圈。图4C所示的是在电聚合过程中扫速的影响。扫速过小，导致制备的聚合物膜过于紧实，不利于洗脱模板分子形成印迹孔穴；但是如果扫速过快，导致形成的聚合物膜过于疏松，使得洗脱后形成的孔穴容易坍塌。因此，电聚合过程中的扫速设为100mV/s。 

在最优条件下制备的MIPs/IL/GR/GCE能够提供更多的印迹孔穴从而在平衡时使得更多的模板(目标)分子能够键合到印迹电极的表面。为了进一步研究分子印迹电极的效能，通过记录MIPs/IL/GR/GCE浸没在1.0×10^-3g/L BHb溶液中不同时间后的DPV峰电流响应来考察印迹电极的吸附动力学，MIPs/GR/GCE作为对比电极。如图5所示，在相同条件下MIPs/IL/GR/GCE（曲线a，32.4μA和20min）比MIPs/GR/GCE（曲线b，19.8μA和120min）表现出更高、更快的电流响应，表示所制备的MIPs/IL/GR/GCE具有优异的灵敏度。离子液体BmimBF₄不仅降低了印迹电极的电子传递电阻而且加快了模板分子BHb再键合到印迹电 极上的速度，从而提高了印迹电极的灵敏度、减少了再键合达到平衡的时间。这种电化学检测方法为蛋白质的在线实时快速检测提供了一种新颖的手段。 

为了考察MIPs/IL/GR/GCE的选择性，以1.0×10^-3g/L BHb，BSA和HSA作为竞争蛋白，采用DPV法测定相应蛋白分子在MIPs/IL/GR/GCE上的峰电流变化值(ΔI)。如图6所示，MIPs/IL/GR/GCE对BHb分子的ΔI最大，分别是BSA的6.2倍，HSA的8.1倍，这都表明MIPs/IL/GR/GCE对模板分子BHb高的选择性。 

此外，用不同浓度的BHb溶液来检测制备的MIPs/IL/GR/GCE的灵敏度。如图7，随着BHb浓度的增加（从1.0×10^-10到1.0×10^-3g/L），MIPs/IL/GR/GCE上的电流变化值ΔI逐渐减小。线性方程为ΔI(μA)=32.37+3.08log C_BHb(g/L)，R=0.998，检出限为3.09×10^-11g/L（3σ）。这些结果表明制备的MIPs/IL/GR/GCE能够高灵敏度、高选择性地检测BHb。 

综上所述，本发明成功地制备了离子液体修饰的石墨烯基的牛血红蛋白分子印迹电极。该印迹电极是在优化条件下通过电聚合含有模板分子BHb的吡咯单体溶液得到的。在模板蛋白质分子的电化学检测中该印迹电极表现出优异的灵敏度，高的选择性和快速的平衡响应，在1.0×10^-10-1.0×10^-3g/L BHb浓度范围内呈现出良好的线性，R=0.998，且检测限为3.09×10^-11g/L。因此，该技术为临床中BHb的定量检测提供了一种可能的方法。 

以上材料：牛血红蛋白，购于国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白和人血清白蛋白，购于上海蓝季科技发展有限公司；1-丁基-3-甲基-四氟硼酸咪唑盐(BmimBF₄)，购于上海成捷化学有限公司；其他试剂均为分析纯。实验中所用溶液均由二次蒸馏水配制。仪器：上海辰华CHI660C电化学工作站，三电极工作体系：MIPs/IL/GR/GCE作为工作电极，饱和氯化钾甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极；SK5200H型超声波清洗仪(上海科导超声仪器)；UV755B紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)；红外灯。所有的电化学实验都是在pH=7.0含有0.1mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/4-的磷酸盐缓冲溶液中进行。 

以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。 

Claims (7)

1.一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）GR/GCE的制备

选取玻碳电极，对其进行表面处理，然后取分散好的石墨烯水溶液滴涂在玻碳电极表面，置于红外灯下烘干，制得GR/GCE；

（2）IL/GR/GCE的制备

在步骤（1）得到的GR/GCE表面滴涂离子液体水溶液，晾干后得到IL/GR/GCE；

（3）BHbMIPs/IL/GR/GCE的制备

将步骤（2）得到的IL/GR/GCE浸入含有牛血红蛋白和吡咯单体的除氧的磷酸盐缓冲液中，牛血红蛋白的浓度为1g/L，吡咯浓度为1.0×10^-3mol/L-2.0×10^-2mol/L，在-0.2V～1.2V电位范围内，以80～120mV/s的扫速循环伏安扫描4～7圈后取出晾干，得到BHbMIPs/IL/GR/GCE；

（4）MIPs/IL/GR/GCE的制备

将步骤（3）得到的BHbMIPs/IL/GR/GCE浸入洗脱液中洗脱模板分子牛血红蛋白，得到MIPs/IL/GR/GCE；

（5）分子印迹电化学传感器的制备

将步骤（4）得到的MIPs/IL/GR/GCE作为工作电极，和参比电极、对电极正确连接在电化学工作站上以组成分子印迹电化学传感器。

2.根据权利要求1所述的一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述玻碳电极的表面处理过程如下：先将玻碳电极在金相砂纸上打磨，然后在麂皮上依次用0.3μm和0.05μm Al₂O₃粉抛光成镜面，再用二次蒸馏水冲洗玻碳电极表面，并分别置于二次蒸馏水和乙醇中超声洗涤20s，室温下晾干备用。

3.根据权利要求1所述的一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中：所述石墨烯为石墨烯本体或经功能化的石墨烯，所述石墨烯水溶液的浓度为1mg/mL，取5.0μL滴涂在玻碳电极表面。

4.根据权利要求1所述的一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中：所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，其水溶液的浓度为1.0×10^-4g/L，取5.0μL滴涂在玻碳电极表面。

5.根据权利要求1所述的一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中：所述吡咯浓度为5.0×10^-3mol/L，扫速为100mV/s，扫描圈数为5圈，磷酸盐缓冲液的pH为7.0。

6.根据权利要求1所述的一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（4）中：所述洗脱液为硫酸溶液，其浓度为1mol/L。

7.根据权利要求1所述的一种用于牛血红蛋白检测的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（5）中：所述参比电极为饱和氯化钾甘汞电极，对电极为铂丝电极。