CN103911438A - ***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法,其通过使用hMeDIP-Chip技术得到***羟甲基化状态的差异表达基因,深入研究这些差异表达基因将有助于进一步阐明***的发病机理,为***的诊断和治疗提供新途径。上述***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法设计合理可行,能够有效地协助建立一种***差异表达基因的图谱模型,获取作为中间结果的***的相关信息。
Description
技术领域
本发明涉及表观遗传学研究领域,尤其是涉及一种***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用。
背景技术
慢性肾衰竭是指各种肾脏病导致肾脏功能渐进性不可逆性减退,直至功能丧失所出现的一系列症状和代谢紊乱所组成的临床综合征,简称慢性肾衰。慢性肾衰的终末期即***。***不是一个独立的疾病,而是各种晚期的肾脏病共有的临床综合征,是慢性肾功能衰竭进入终末阶段时出现的一系列临床表现所组成的综合征。
慢性肾脏疾病(CKD)是复杂的疾病,近几十年来,其发病率逐年增长,调查结果发现中国人群中CKD的发病率为11.8%—13.0%,预测在全国范围内CKD患者已超过1亿。我国的***患者在100万以上,此类患者每年治疗总费用将超过500—1000亿元,因而解决好肾脏疾病的早期预警和有效防治问题有重要的意义。目前临床上尚缺乏早期诊断手段和行之有效治疗方法,其中部分患者进展至***。CKD患者发病较隐匿,疾病的发生往往先是功能和分子的变化,继而是形态学的改变,很多患者首诊时就已经出现肾病综合征或肾小球肾炎的临床症状。因此,有必要用创新的方法寻找并发现***特异性的生物标志物。
表观遗传学是研究DNA序列没有发生改变的情况下而基因表达和表型却发生可遗传改变的学科。这种变化涉及组蛋白修饰,主要包括乙酰化、甲基化、泛素化和磷酸化。研究表明,表观遗传异常与***发病相关,表观遗传学研究的发病机制密切相关可能为阐明***的发病机制和开发新的策略来治疗这种疾病的线索。
发明内容
基于此,有必要提供一种***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用。
一种***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法,包括如下步骤:
分别采集***患者和健康人的血液样本,并从所述血液样本中提取DNA;
将所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段,并加入76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链作为阳性对照;
将含有所述阳性对照的所述DNA片段加热变性,再将得到的单链DNA样本分成两份,其中一份作为实验组加入抗5’-羟甲基化胞嘧啶核苷抗体得到DNA片段抗体复合物,另一份作为对照组,记为Input,其中,实验组用免疫磁珠法分离所述DNA片段抗体复合物,共沉淀后非羟甲基化的DNA片段被清洗除去,得到纯化的DNA片段抗体复合物,记为hMedIP;
对上述实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段进行扩增;
对扩增后的实验组DNA片段抗体复合物和对照组DNA片段分别使用Cy5和Cy3染料标记;
将染料标记后的实验组DNA片段抗体复合物与对照组DNA片段混合后与羟甲基化微阵列检测芯片杂交,使用hMeDIP-Chip技术对比分析***患者和健康人的芯片杂交结果,得到***羟甲基化状态的差异表达基因。
在其中一个实施例中,在将所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段之前,所述分析方法还包括对提取的DNA使用NanoDrop ND-100分析仪测定所述DNA的数量和质量以及用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性的步骤。
在其中一个实施例中,在对上述实验组纯化的DNA片段和对照组的DNA片段进行扩增之前,所述分析方法还包括对免疫磁珠法分离得到的DNA片段抗体复合物的富集效率进行评估的步骤。
在其中一个实施例中,所述使用hMeDIP-Chip技术对比分析***患者和健康人的芯片杂交结果包括如下步骤:
使用高解析度芯片扫描仪分别检测***患者组与健康人的芯片杂交信号,获取Cy3及Cy5的荧光扫描图像;
使用Bioconductor packages Ringo、limma及MEDME对杂交结果进行数据提取、标准化和峰值分析;
经过校正得到所述羟甲基化微阵列检测芯片上每个检测探针的log2(hMeDIP/Input)值以及p-value值,log2(hMeDIP/Input)值代表每个探针在实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段中的相对富集强度,p-value表示探针红绿信号差异是由非生物因素造成的概率,p-value由修正的KS检验算法计算。
在其中一个实施例中,所述分析方法还包括在筛选得到所述***羟甲基化状态的差异表达基因之后针对筛选得到的差异表达基因使用实时荧光定量PCR对hMeDIP-Chip分析结果进行验证的步骤。
上述***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法通过使用hMeDIP-Chip技术来分析***羟甲基化状态的改变,得到***羟甲基化状态的差异表达基因,深入研究这些差异表达基因将有助于进一步阐明***的发病机理,为***的诊断和治疗提供新途径。上述***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法设计合理可行,能够有效地协助建立一种***差异表达基因的图谱模型,获取作为中间结果的***的相关疾病信息。
一种基因检测芯片,所述基因检测芯片上固定有上述任一实施例所述的方法得到的***羟甲基化状态的差异表达基因。
在其中一个实施例中,所述差异表达基因为HMGCR、THBD及STAT3中的至少一种。
通过上述基因检测芯片,可以为初步诊断***提供中间结果信息,检测过程方便,不需要使用传统的繁杂的检测步骤,但由于***往往是一种综合病征,获取这些中间结果之后还需要结合其他检测数据才能诊断为是否是***疾病。
附图说明
图1为hMeDIP-Chip技术在全基因组范围内分析***患者5-hmC状态技术路线图;
图2为***患者和健康人的总DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果图;
图3为***组的芯片杂交结果图;
图4为健康对照组的芯片杂交结果图;
图5为19号染色体上(Chr19)存在5-hmC水平差异的位点分析;
图6为5-hmC、un5-hmC基因在HCP、ICP、LCP分布;
图7为HCP、ICP、LCP的羟甲基化状态;
图8为HCP、ICP、LCP中羟甲基化基因所占总数比例;
图9为在启动子(promoter,下同)区(-800bp的~+200bp),5-hmC基因在HCP、ICP、LCP分布情况;
图10为CpG岛上5-hmC、un5-hmC基因的分布情况,其中两个intergenic表示CpG岛上5-hmC、un5-hmC基因;
图11为启动子区表达上调基因在各染色体上的分布(顺时针从1号染色体X和Y性染色体);
图12为CpG岛表达上调基因在各染色体上的分布(顺时针从1号染色体X和Y性染色体);
上述图中,纵坐标Enrichment peaks表示扫描图像中的富集峰值,黑色表示***组的羟甲基化,灰色表示健康对照组的羟甲基化,ALL代表所有DNA片段,Hydroxymethylated表示羟甲基化,Unhydroxymethylated表示羟甲基化表示未甲基化,下同。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用作进一步详细的说明。
一实施方式***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法,其包括如下步骤:
步骤S110:分别采集***患者和健康人的血液样本。
血液样本可以直接采集自患者或者健康人,也可以取自医院或研究机构的血液样本库。
步骤S120:从血液样本中提取DNA。
优选的,在本步骤提取DNA之后还包括使用NanoDrop ND-100分析仪测定提取的DNA的数量和质量以及使用琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA的完整性进行评估的步骤。
步骤S130:将DNA消化成200~1000bp的DNA片段,并加入76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链作为阳性对照。
在本实施方式中,使用Mse I限制性内切酶将DNA消化成小DNA片段。76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链可选用市售的通用完全羟甲基化的寡核苷酸链。76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链可选用市售的通用完全羟甲基化的寡核苷酸链。
步骤S140:将含有阳性对照的DNA片段加热变性,再将得到的单链DNA样本分成两份,其中一份作为实验组加入抗5’-羟甲基化胞嘧啶核苷抗体得到DNA片段抗体复合物,另一份作为对照组,记为Input,其中,实验组用免疫磁珠法分离DNA片段抗体复合物,共沉淀后非羟甲基化的DNA片段被清洗除去,得到纯化的DNA片段抗体复合物,记为hMeDIP。
因目前在人类基因组中发生羟甲基化的特定基因未明确,发生羟甲基化水平也未知,而将基因片段上芯片与芯片上探针杂交,需要对羟甲基化水平有一定的要求,因此,在本实施方式中,当得到纯化的DNA片段抗体复合物之后,该分析方法还包括使用NanoDrop ND-1000光谱分析仪对该DNA片段抗体复合物的富集效率进行评估的步骤。
步骤S150:使用Sigma WGA Kit对上述实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段进行扩增。
步骤S160:对扩增后的实验组DNA片段抗体复合物和对照组DNA片段分别使用Cy5和Cy3染料标记。
步骤S170:将染料标记后的实验组DNA片段抗体复合物与对照组DNA片段混合后与羟甲基化微阵列检测芯片杂交,使用hMeDIP-Chip技术对比分析***患者和健康人的芯片杂交结果,得到***羟甲基化状态的差异表达基因。
在本实施方式中,所述使用hMeDIP-Chip技术对比分析***患者和健康人的芯片杂交结果包括如下步骤:
使用高解析度芯片扫描仪分别检测***患者组与健康人的芯片杂交信号,获取Cy3及Cy5的荧光扫描图像;
使用Bioconductor packages Ringo、limma及MEDME对杂交结果进行数据提取、标准化和峰值分析;
经过校正得到羟甲基化微阵列检测芯片上每个检测探针的log2(HMeDIP/Input)值以及p-value值,log2(HMeDIP/Input)值代表每个探针在实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段中的相对富集强度,p-value表示探针红绿信号差异是由非生物因素造成的概率,p-value由修正的KS检验算法计算。
进一步,在筛选得到***羟甲基化状态的差异表达基因之后,本实施方式的分析方法还包括针对筛选得到的差异表达基因使用实时荧光定量PCR对hMeDIP-Chip分析结果进行验证的步骤。
具体在本实施方式中得到3个较大差异表达的基因,分别是三个表达上调的HMGCR、THBD及STAT3基因。
上述***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法通过使用hMeDIP-Chip技术来分析***羟甲基化状态的改变,得到***羟甲基化状态的差异表达基因,深入研究这些差异表达基因将有助于进一步阐明***的发病机理,为***的诊断和治疗提供新途径。上述***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法设计合理可行,能够有效地协助建立一种***差异表达基因的图谱模型,获取作为中间结果的***的相关疾病信息。
此外,本实施方式还提供了一种基因检测芯片,在该基因检测芯片上固定有上述方法得到的***羟甲基化状态的差异表达基因作为检测探针。
一种基因检测芯片,基因检测芯片上固定有由上述方法得到的***羟甲基化状态的差异表达基因。
在其中一个实施例中,差异表达基因为HMGCR、THBD及STAT3中的至少一种。
通过上述基因检测芯片,可以初步检测待测患者血液内上述三种差异表达基因的表达情况,为初步诊断***提供中间结果信息,检测过程方便,不需要使用传统的繁杂的检测步骤,但由于***往往是一种综合病征,获取这些中间结果之后还需要结合其他检测数据才能诊断为是否是***疾病。
以下为具体实施例部分:
1.实验对象
本实验中共有30个样本,见表1,其中,疾病组15人,健康对照组15人。疾病组患者来源于桂林市第181医院肾脏科。健康对照组与疾病组年龄、种族、性别相匹配。本研究征得了桂林市第181医院伦理委员会的同意。
表1.疾病组和对照组的人口学和临床特征
注:表1中数值均为平均数±标准差。
2.2.实验仪器与试剂
2.1实验主要仪器如表2所示:
表2实验主要仪器
仪器名称 | 生产商 | 产地 |
电泳槽 | Bio-Rad | 美国 |
电泳仪 | Bio-Rad | 美国 |
PCR仪 | VWR | 美国 |
NanoDrop ND-1000光谱分析仪 | Thermo scientific | 美国 |
Bioruptor超声波仪 | Diagenode | 比利时 |
摇床 | Thermo Scientific | 美国 |
Qiagen MinElute柱 | Qiagen | 美国 |
SpeedVac离心浓缩*** | Thermo Fisher Scientific | 美国 |
芯片杂交仪 | NimbleGen | 美国 |
GenePix4000B芯片扫描仪 | 冷泉港生物科技股份有限公司 | 中国 |
Real-time PCR仪 | Applied Bioscience | 美国 |
NimbleChip Mixer | NimbleGen | 美国 |
NimbleScan软件 | NimbleGen | 美国 |
涡旋振荡器 | VWR | 美国 |
磁力搅拌器 | VWR | 美国 |
2.2实验主要试剂如表3所示:
表3实验主要试剂
3.实验步骤
3.1血样采集
从***患者(取每个***患者血液标本5μl汇集成一个血液样本)和健康对照(取每个健康志愿者血液标本5μl汇集成一个血液样本)取得血液样本后,使用试剂盒Tissue Kit(Qiagen,Fremont,CA)分别提取疾病组和健康对照组的基因组DNA并纯化。
3.2全基因组DNA的提取:
1)取50-100μl的抗凝血至2ml离心管中,加20μl蛋白酶K,用PBS补加至220μl;
2)加入200μl缓冲液AL,涡旋震荡充分混匀,56℃孵育10min;
3)加入200μl的(96%-100%)乙醇,涡旋震荡充分混匀;
4)移取步骤3的混合液至离心柱上,离心柱放在2ml收集管上。≧6000g(8000rpm)离心1分钟;
5)离心柱放至新的2ml收集管上,加500μl的缓冲液AW1,≧6000g(8000rpm)离心1分钟;
6)离心柱放至新的2ml收集管上,加500μl的缓冲液AW2,20000g(14000rpm)离心3分钟;
7)将离心柱放在一个新的2ml收集管上,吸200μl的缓冲液AE在吸附膜上,室温1分钟,≧6000g(8000rpm)离心1分钟;
8)为增大DNA产量,重复步骤7(从离心管中吸取液体反复洗脱)。
对纯化后得的基因组DNA进行量化,DNA的数量和质量的用NanoDropND-1000测定,DNA完整性用琼脂糖凝胶电泳进行评估。
3.3超声打断基因组:
通过Bioruptor超声波仪(Diagenode)将基因组DNA超声打断成200bp-1000bpDNA片段(“Low”模式,10个循环,30秒“ON”,30秒“关”)。将剪切得到的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳进行分析。加入76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链用作阳性对照,作为检测富集率的一个参照。
3.4DNA免疫共沉淀
1)加热变性(94℃,10min),迅速在冰上冷却,加1μl免疫沉淀的初级抗体、400μl的免疫沉淀缓冲液(PBS:0.5%BSA),摇床培养过夜(4℃),并将得到的单链DNA样品分成两份;
2)其中一份作为实验组加入抗5’-羟甲基化胞嘧啶核苷抗体(Diagenode,200μl、4℃摇床培养2h),另一份作为对照组(input),不做任何处理;
3)用免疫磁珠法分离实验组中5’羟甲基化DNA片段的抗体复合物,样品中其余的非羟甲基化DNA片段被清洗掉(此过程即富集的过程:5hmC抗体复合物通过亲和固相得以捕获,其他任何未被捕获的片段直接被洗脱掉)。得到的5hmC抗体复合物重新悬浮于TE缓冲液(添加0.25%SDS、0.25mg/mL蛋白酶K)中,65℃,2h,然后使其冷却至室温;
4)用Qiagen MinElute柱(Qiagen)对免疫共沉淀的hMeDIP DNA片段进行纯化;
5)通过NanoDrop ND-1000测定评估免疫共沉淀的富集效率;
6)扩增:使用Sigma WGA kit对上述纯化得到的免疫沉淀DNA片段(hMeDIP与Input)进行必要的扩增。
3.5荧光标记与芯片杂交
1)通过NimbleGen Dual-Color DNA标记试剂盒(Nimblegen Systems,Inc.,Madison,WI,USA)对纯化得到的hMeDIP DNA片段(Cy5)、Input(Cy3)分别进行荧光标记,1μg hMeDIP DNA样品(或Input样品)加1OD的Cy5-9merprimer(或Cy3-9mer primer)。将标记后的hMeDIP与Input样品混合、变性(10min,98℃);
2)转移到37℃培养箱,加入100pmol脱氧核苷三磷酸、100U的Klenow片段(New England Biolabs,USA),继续培养2h;
3)加入0.1倍体积的0.5M的EDTA来终止反应,用异丙醇/乙醇沉淀对标记的DNA进行纯化;
4)在芯片杂交仪(Hybridization System-Nimblegen Systems,Inc.,Madison,WI,USA)(NimbleGen杂交缓冲液、hMeDIP DNA片段(Cy5)与Inputt(Cy3)混合物)进行微阵列杂交,42℃,16-20h;
5)杂交后,使用NimbleGen的洗涤缓冲液试剂盒(Nimblegen Systems,Inc.,Madison,WI,USA)进行洗涤。
3.6图像采集和数据分析
1)用高解析度芯片扫描仪检测分别检测***患者组与正常对照组的芯片杂交信号,获取Cy3、Cy5的荧光扫描图像;
2)使用Bioconductor packages Ringo、limma、MEDME对杂交结果进行数据提取、标准化、峰值分析;
3)经过校正得到羟甲基化微阵列检测芯片上每个探针的log2(hMeDIP/input)值以及p-value值,log2(hMeDIP/input)值代表每个探针在hMeDIP DNA和inputDNA中的相对富集强度,p-value表示探针红绿信号差异是由非生物因素造成的概率;p-value越低,表示该探针越有可能代表一个甲基化事件,p-value由修正的KS检验算法计算。
3.7实时荧光定量PCR
参照hmeDIP-chip结果中筛选的3个5-hmC特异表达的候选基因,根据每个基因序列设计特异性引物(表4),进行实时荧光定量PCR,对hmeDIP-chip结果进行验证。
引物通过引物设计软件Primer 5.0,ViiA 7 Real-time PCR System (AppliedBiosystems)设计。Realtime PCR反应体系:
RT-PCR 热循环程序95℃,10min;40个PCR循环(95℃,10秒;60℃,60秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的熔解曲线,扩增反应结束后,按 (95℃,10秒;60℃,60秒;95℃,15秒);并从60℃缓慢加热到99℃。数据采用2-△ △CT法进行分析
表4 反转录与RT PCR引物
2结果
2.1总DNA质量检测结果
使用NanoDrop ND-1000分析仪对DNA的数量和质量进行了测定,结果如表5所示,并使用琼脂糖凝胶电泳对DNA的完整性进行评估,结果如图2所示,其中,泳道1表示***疾病组的总DNA,泳道2表示健康人的总DNA。***组O.D.A260/A280比值为1.85,O.D.A260/A230比值为2.14,浓度为46.13ng/μl,总量4613ng;正常对照组O.D.A260/A280比值为1.81,O.D.A260/A230比值为2.05,浓度为41.60ng/μl,总量4160ng。总DNA质量检测结果表明所提样本总DNA质量良好。
表5DNA定性和定量
2.25羟基甲基化(5-hmC)差异基因在全基因组的分布
将Input(Cy5)与hMeDIP(Cy3)样品分别进行荧光标记后,将hMeDIP与Input样品混合、变性,与DNA微阵列芯片杂交。芯片扫描结果如图2和图3所示,从图2和图3可以看出芯片完整,两种荧光信号分布均匀、清晰,表明芯片无污染;没有高信号、低信号的团块、划痕,芯片中央、四角及中线与四个边交点的十字架及平均分布的红点显示清楚完整,无边缘化效应,这说明芯片杂交、洗涤及扫描步骤良好。羟甲基化和非羟甲基化位点分别通过Cy3和Cy5标记扩增显示于芯片上。对于芯片某一位点的信号,若Cy3信号较强,该位点则显示绿色增强信号,提示该位点呈高羟甲基化趋势;若Cy5信号较强,该位点则显示红色增强信号,提示该位点呈低羟甲基化趋势;如果两种信号强度相似,该位点则显示显黄色增强信号,提示该点无明显甲基化,扫描后分析后得到可视化分析。
使用Signalmap软件对部分存在5-hmC水平差异的位点进行分析,比较直观的观察到***组、健康对照组存在5-hmC水平差异的现象。以Chr19为例,显示该染色体存在的羟甲基化差异,如图5所示。
本实施例研究了***患者与正常对照组5-hmC表达差异的基因在启动子区域的分布,如图6至图8所示,在差异的基因池中,发现其中57.60%的差异基因属于HCP簇,接近基因组平均(64.00%),同样,在un5-hmC基因池,超过70.71%的差异基因被认为是HCP簇。由5-hmC差异的基因在全基因组的分布规律发现5-hmC差异的基因主要分布于HCP簇,76.49%HCP簇的基因提示5-hmC差异。相反,在ICP、LCP簇的基因约60%提示5-hmC差异,从而推测5-hmC差异的基因主要分布于启动子区域的HCP簇或者是CpG岛的HCP簇。
2.3疾病组和对照组5-hmC状态的对比
通过上述对hMeDIP-Chip结果的分析并与健康对照组相比较,如图9所示,***患者在启动子区有1875个5-hmC差异基因,其中960个基因上调,915个基因下调;在CPG岛有40635-hmC差异基因,其中1780个基因上调,2283个基因下调(图10)。图11显示***患者在基因启动子区5-hmC修饰上调的960个基因在染色体上的位置分布(顺时针从1号染色体到X和Y性染色体),在19号染色体上的上调基因所占百分比为8.96%。图12显示***患者在CpG岛5-hmC修饰上调的1780个基因在染色体上的位置分布(顺时针从1号染色体到X和Y性染色体),在19号染色体上的上调基因所占百分比为9.66%。从中挑选了15个差异大的基因见表6,挑选3个差异较大的特异基因:HMGCR、THBD、STAT3进行讨论可能与***关系密切。
表6hMeDIP-Chip结果中挑选的15个在***患者5-hmC状态中表现较大差异的基因
2.4实时荧光定量PCR验证结果
实时定量PCR时各样品加样量均为1μl并用Input DNA作为对照。表7-表9分别代表HMGCR、THBD及STAT3,其中:
*Ct↑,5-hmC表达长度↓(Ct>40或38,表示几乎无5-hmC的表达);
*NA表示无5-hmC的表达;%>0,表示有5-hmC的表达;
IP(Ct)差异(***与健康组间)>2,表示有5-hmC的表达差异;
Input校正列表:
%Input=2(CtInput-CtChIP)×Fd×100%
Fold Enrichment=[%(hMeDIP/Input)]/[%(Negative control/Input)]
表7
表8
表9
数据提示实时定量PCR验证本实施例结果与hMeDIP-Chip结果相符,证明了hMeDIP-Chip结果的可靠性。
本实施例主要分析***患者和健康者的5-hmC状态。这些5-hmC状态显著差异的候选基因(HMGCR、THBD及STAT3)与免疫、细胞周期、细胞生长增殖、DNA损伤修复相关。
候选基因中,HMGCR表达上调。HMGCR位于5号染色体q13.3-q14,也被称为LDLCQ3。HMG-CoA还原酶是胆固醇合成的限速酶,能够为寻找新的更加有效的CKD疾病治疗策略提供了靶点和研究基础。
THBD和STAT3对***5-hmC状态表现上调的基因。其中,THBD位于20号染色体p11.2。该基因无内含子,其编码的蛋白可以使C蛋白活化,降低Ⅴa、Ⅷa凝血因子和凝血酶的产生,该基因的突变会引起血栓栓塞性疾病。THBD内皮细胞膜蛋白具有抗凝和抗炎作用,包括抑制补体活性。
STAT3位于17号染色体q21.31,也被称为APRF;HIES。该基因编码的蛋白是STAT家族的成员,是一类DNA结合蛋白,作为白细胞介素-6(IL-6)信号传递中的急性期反应因子(acute-phase response factor,APRF)被纯化的,其功能如下:(1)位于丝氨酸磷酸化位点,可能由有丝***原激活的蛋白激酶磷酸化,它的磷酸化决定STAT3能否发挥最大的转录活性,并使STAT途径和Ras途径发生关联;(2)保守的氨基端序列,为STAT3和其他转录因子之间的作用、STAT3二聚体的形成以及和细胞因子受体间的结合等功能所必需;(3)位于具有高度保守性的SRC同源区2(SH2),其主要功能是促使STAT3与活化的受体形成复合物,介导Janus激酶(Janus Kinase,JAK)-STAT的相互作用,使STAT3形成二聚体,移入细胞核,结合DNA,调节基因表达。
STAT3参与肾小管上皮细胞由硫酸吲哚酚诱导的炎症和细胞衰老。慢性肾功能衰竭(CRF)与GH合成有关,在慢性肾功能衰竭的动物体内,生长激素诱导的酪氨酸磷酸化JAK2,STAT5和STAT3的降低75%,磷酸化STAT5和STAT3在核蛋白中也减少。经GH治疗的CRF动物,GHSOCS-2(suppressor ofcytokinesignaling-2)双倍表达;没经GH治疗的CRF动物,SOCS-3mRNA水平提高了60%。
综上所述,通过***评估***患者全基因组的5-hmC状态,获得了5-hmC和***之间的联系。研究结果表明,5-hmC涉及到***的非生理性环境,而且这些新的候选基因可能成为潜在的生物标志物或治疗靶点,可以通过进一步研究,以明确5-hmC候选基因在***的发病机制中的作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法,其特征在于,包括如下步骤:
分别采集***患者和健康人的血液样本,并分别从所述血液样本中提取DNA;
将所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段,并加入76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链作为阳性对照;
将含有所述阳性对照的所述DNA片段加热变性,再将得到的单链DNA样本分成两份,其中一份作为实验组加入抗5’-羟甲基化胞嘧啶核苷抗体得到DNA片段抗体复合物,另一份作为对照组,记为Input,其中,实验组用免疫磁珠法分离所述DNA片段抗体复合物,共沉淀后非羟甲基化的DNA片段被清洗除去,得到纯化的DNA片段抗体复合物,记为hMeDIP;
对上述实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段进行扩增;
对扩增后的实验组DNA片段抗体复合物和对照组DNA片段分别使用Cy5和Cy3染料标记;
将染料标记后的实验组DNA片段抗体复合物与对照组DNA片段混合后与羟甲基化微阵列检测芯片杂交,使用hMeDIP-Chip技术对比分析***患者和健康人的芯片杂交结果,得到***羟甲基化状态的差异表达基因。
2.如权利要求1所述的***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法,其特征在于,在将所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段之前,所述分析方法还包括对提取的DNA使用NanoDrop ND-100分析仪测定所述DNA的数量和质量以及用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性的步骤。
3.如权利要求1所述的***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法,其特征在于,在对上述实验组纯化的DNA片段和对照组的DNA片段进行扩增之前,所述分析方法还包括对免疫磁珠法分离得到的DNA片段抗体复合物的富集效率进行评估的步骤。
4.如权利要求1所述的***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法,其特征在于,所述使用hMeDIP-Chip技术对比分析***患者和健康人的芯片杂交结果包括如下步骤:
使用高解析度芯片扫描仪分别检测***患者组与健康人的芯片杂交信号,获取Cy3及Cy5的荧光扫描图像;
使用Bioconductor packages Ringo、limma及MEDME对杂交结果进行数据提取、标准化和峰值分析;
经过校正得到所述羟甲基化微阵列检测芯片上每个检测探针的log2(hMeDIP/Input)值以及p-value值,log2(hMeDIP/Input)值代表每个探针在实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段中的相对富集强度,p-value表示探针红绿信号差异是由非生物因素造成的概率,p-value由修正的KS检验算法计算。
5.如权利要求1所述的***羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法,其特征在于,所述分析方法还包括在筛选得到所述***羟甲基化状态的差异表达基因之后针对筛选得到的差异表达基因使用实时荧光定量PCR对hMeDIP-Chip分析结果进行验证的步骤。
6.一种基因检测芯片,其特征在于,所述基因检测芯片上固定有如权利要求1~5中任一项所述的方法得到的***羟甲基化状态的差异表达基因。
7.如权利要求6所述的基因检测芯片,其特征在于,所述差异表达基因为HMGCR、THBD及STAT3中的至少一种。
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN108048554A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-05-18 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | Thbd基因作为帕金森症诊断的分子标志物 |
CN111518893A (zh) * | 2020-05-11 | 2020-08-11 | 深圳市人民医院 | ***标志物及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102286464A (zh) * | 2011-06-30 | 2011-12-21 | 眭维国 | ***长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法 |
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102286464A (zh) * | 2011-06-30 | 2011-12-21 | 眭维国 | ***长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
ADAM M. ZAWADA ET AL: "superTAG methylation-specific digital karyotyping reveals uremia-induced epigenetic dysregulation of atherosclerosis-related genes", 《CIRC CARDIOVASC GENET》, 31 December 2012 (2012-12-31) * |
ANDREAS SCHERER ET AL: "alteration of human blood cell transcriptome in uremia", 《BMC MEDICAL GENOMICS》, 31 December 2013 (2013-12-31) * |
JEAN-CHRISTOPHE GRIS ET AL: "increased cardiovascular risk factors and features of endothelial activation and dysfunction in dialyzed uremic patients", 《KIDNEY INTERNATIONAL》, 31 December 1994 (1994-12-31), pages 809 - 2 * |
张轶群: "***性红斑狼疮CD4+T细胞全基因组DNA羟甲基化研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》, 15 February 2014 (2014-02-15) * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108048554A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-05-18 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | Thbd基因作为帕金森症诊断的分子标志物 |
CN111518893A (zh) * | 2020-05-11 | 2020-08-11 | 深圳市人民医院 | ***标志物及其应用 |
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