CN102286464A - ***长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型的构建方法，其包括以下步骤：A1、获取***患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，对各所述测试外周血样本，分别获取基因芯片数据；A2、将各所述测试外周血样本的基因芯片数据上传到基因芯片数据分析软件，并设置归一化基准以及数据滤过的比值倍数，获取差异表达基因，得到***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型。上述方案，为研究***提供了作为中间结果的信息，并且为进一步揭示***的病理机制提供了新思路。此外，本发明还涉及一种***长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型。

Description

***长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法

【技术领域】

本发明涉及一种***核糖核酸差异性表达模型，尤其涉及一种***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法。

【背景技术】

***是指急性或慢性肾功能不全发展到严重阶段时机体出现的一系列自体中毒的症状。***一般与遗传因素和环境因素相关，但这些因素并不能完全阐明***发生的机制。由急性肾损伤引起的炎性细胞因子，可能导致肾脏疾病的发生。一些研究发现铁，铁蛋白，C反应蛋白(CRP)，肿瘤坏死因子(INF)，白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素6(IL-6)等与***有关。在无肾实质损害的情况下，寻找影响***的潜在的细胞因子mRNAs。目前研究发现，***环境抑制HK-2细胞促炎性细胞因子mRNAs水平，同时影响microRNA的表达水平。有可能参与基因转录的改变和转录后修饰，基因转录的改变如聚合酶II招募，转录后修饰如由microRNA诱导等。研究人员已经从DNA，mRNA以及蛋白质等方面对***进行研究，希望通过此来阐明***机制，以便找到理想的生物标志物，有利于***的早期诊断和预防，但离成功仍有一定的距离。

目前主要依靠维持透析和肾移植等替代治疗***，但是***患者心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)的发生率和死亡率在持续增加，是患者在治疗时需要关切的问题。至今为止，对于***发病机制的研究仍有许多争议，目前临床上仍以水溶性小分子物质作为***判定及肾脏替代治疗疗效的指标，但***患者的预后水平不佳，即预测疾病的可能病程和结局不准确。因此为使***患者的临床管理得到改善，目前仍缺乏一个快速，有效，可靠的生物标记物来监测疾病的发生与发展。

核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)中的长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，起初被认为是基因转录的“噪音”。近年来的研究发现，lncRNA具有重要的生物学功能，可以同时上调或下调真核生物和原核生物中的基因表达，参与了基因组印记，X染色体沉默，应激反应等多种重要的调控过程。此外，近来有关胚胎干细胞，成人大脑，CD8+T细胞和其他一些疾病的全基因组的研究表明，lncRNA功能多样化并在特定细胞类型中表达或位于特定亚细胞层。

但是，如何结合lncRNA方法对***进行综合分析，目前尚未有具体的研究结果和技术信息。

因此，现有技术需要改进。

【发明内容】

有鉴于此，有必要提出一种***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型及其构建方法。

本发明的一个技术方案是，一种***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型的构建方法，其包括以下步骤：A1、获取***患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，对各所述测试外周血样本，分别获取基因芯片数据；A2、将各所述测试外周血样本的基因芯片数据上传到基因芯片数据分析软件，并设置归一化基准以及数据滤过的比值倍数，获取差异表达基因，得到***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型。

其中，应用于上述方案，所述步骤A1中，获取基因芯片数据具体执行以下步骤：A11、采用生理盐水对倍稀释全血，缓慢叠加于等体积的淋巴细胞缓冲液；A12、以800×g水平离心30分钟后，吸取单个核细胞，用生理盐水清洗两次，用枪头吸除管底沉淀细胞上的液体，加入1mL总RNA提取试剂吹打混匀后置于零下80℃冰箱保存；A13、采用总RNA提取试剂抽提RNA，通过硅胶膜纯化法获得纯化的RNA；A14、使用超微量核酸蛋白测定仪分别测定RNA在230nm、260nm、280nm波长下的吸收值，计算RNA浓度以评估RNA纯度，并使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性；A15、使用双链互补DNA合成试剂盒，将获得的RNA合成双链互补DNA，使用单色DNA标记试剂盒进行标记；A16、使用芯片杂交***对标记后的双链互补DNA进行排列杂交，得到杂交芯片，采用匹配的清洗试剂盒清洗杂交芯片；A17、使用芯片扫描仪扫描清洗后的杂交芯片的荧光强度，使用635nm激发，获得芯片扫描图像后，使用生物芯片扫描分析软件进行数据分析，导出格式化微阵列文本数据作为所述基因芯片数据。

应用于上述各方案，所述的构建方法中，所述步骤A1中，获取***患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，执行以下步骤A10：用肝素钠管获取已经脱离人体的外周血5mL作为所述测试外周血样本。

应用于上述各方案，所述的构建方法中，所述步骤A2之后，执行以下步骤A3：挑选若干个差异表达的lncRNA进行实时定量PCR的相对定量测试，其中，采用PCR引物设计软件设计引物，实时定量PCR时各样品加样量均为2μL，并使用β肌动蛋白作为内参，95℃预变性10min后，进行40个PCR循环，其中，95℃变性15秒钟，60℃退火60秒并收集荧光数据；扩增反应后，按95℃变性15秒钟，60℃退火20秒，从60℃缓慢加热到99℃熔解15秒，建立PCR产物的熔解曲线；其中，执行PCR热循环文件时的加热/冷却速度为2％。

应用于上述各方案，所述的构建方法中，采用2^-ΔΔCT法进行分析实时定量PCR的相对定量测试结果。

应用于上述各方案，所述的构建方法中，所述步骤A13中，所述硅胶膜纯化法采用Qiagen公司的RNeasy试剂盒完成。

应用于上述各方案，所述的构建方法中，所述步骤A15中，采用分光光度计检测荧光标记效率。

应用于上述各方案，所述的构建方法中，所述步骤A17中，所述芯片扫描图像按TIF图像格式进行存储，所述基因芯片数据按Excel文件格式进行存储。

应用于上述各方案，所述的构建方法中，所述步骤A17中，采用数据原始值减去扫描仪的背景值得到修正值，然后采用中值标准化方法对得到的修正值进行标准化，得到标准值数据，使用基因芯片数据分析软件对标准值数据进行数据分析。

应用于上述各方案，所述的构建方法中，所述步骤A2中，设置所述比值倍数大于2，并且，所述分析结果按Excel文件格式进行存储。

本发明的又一个技术方案是，一种***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，其采用任一上述的构建方法构建获得。

应用于上述各方案，所述***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型包括以下6个lncRNA，分别为：uc001boe，uc002flc，uc003obo，AY555145，BC041951以及U79273。

上述方案，采用lncRNA芯片技术检测离体的***外周血单核细胞中lncRNA表达的差异，初步筛选出与***相关的lncRNA，然后再通过实时定量PCR技术验证芯片结果的可靠性，从而建立了***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，为研究***提供了作为中间结果的信息，并且为进一步揭示***的病理机制提供了新思路，但由于lncRNA表达对于***的诊断支持还不够完整，因此还需要进一步的验证才能实现对***的诊断。

【附图说明】

图1是本发明一个实施例的示意图。

【具体实施方式】

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述。

本发明通过采用lncRNA芯片技术检测健康人、***患者外周血单核细胞中lncRNA表达谱的差异，筛选出差异表达的lncRNA，利用实时定量PCR技术进一步验证芯片结果，获取***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，协助研究***。如图1所示，本发明的一个实施例是，一种***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型的构建方法，其包括以下步骤：

A1、获取***患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，对各所述测试外周血样本，分别获取基因芯片数据；例如，所述步骤A1中，获取***患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，执行以下步骤A10：用肝素钠管获取已经脱离人体的外周血5mL作为所述测试外周血样本，或者，获取已经脱离人体的外周血7.5mL作为所述测试外周血样本。步骤A1中，分别获取离体的并且具有统计学意义的***患者组与正常对照组的测试外周血样本，例如，选取25名***患者作为***患者组，以及选取25名健康人作为正常对照组，分别获取这些组的成员的外周血，作为测试外周血样本。也就是说，基因芯片数据的来源是离体的测试外周血样本。

A2、将各所述测试外周血样本的基因芯片数据上传到基因芯片数据分析软件，并设置归一化基准以及数据滤过的比值倍数，获取差异表达基因，得到***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型。优选的，设置所述比值倍数大于2，并且，所述分析结果按Excel文件格式进行存储。

应用于上述各例及其组合，又一个实施例是，所述步骤A2之后，还执行以下步骤A3：挑选若干个差异表达的lncRNA进行实时定量PCR的相对定量测试，其中，采用PCR引物设计软件设计引物，实时定量PCR时各样品加样量均为2μl，并使用β肌动蛋白作为内参，95℃预变性10min后，进行40个PCR循环，其中，95度变性15秒钟，60度退火60秒并收集荧光数据；扩增反应后，按95度变性15秒钟，60度退火20秒，从60℃缓慢加热到99℃熔解15秒，建立PCR产物的熔解曲线；其中，执行PCR热循环文件时的加热/冷却速度为2％。优选的，采用2^-ΔΔCT法进行分析实时定量PCR的相对定量测试结果。

应用于上述各例及其组合，所述步骤A1中，获取基因芯片数据具体执行以下步骤：

A11、采用生理盐水对倍稀释全血，缓慢叠加于等体积的淋巴细胞缓冲液；通常采用等体积乃至1.5倍体积于全血的生理盐水，例如1.2倍体积于全血的生理盐水，全血即上述的离体的测试外周血样本，例如，取5mL全血，然后缓慢用6mL生理盐水稀释，再缓慢叠加于11mL淋巴细胞缓冲液；稀释与叠加过程优选沿壁逐滴加入。

A12、以800×g水平离心30分钟后，吸取单个核细胞，用生理盐水清洗两次，用枪头吸除管底沉淀细胞上的液体，加入1mL总RNA提取试剂吹打混匀后置于零下80℃冰箱保存；然后，可以继续执行后续步骤。

A13、采用总RNA提取试剂抽提RNA，通过硅胶膜纯化法获得纯化的RNA；例如，所述硅胶膜纯化法采用Qiagen公司的RNeasy试剂盒完成。

A14、使用超微量核酸蛋白测定仪分别测定纯化得到的RNA在230nm、260nm、280nm波长下的吸收值，计算RNA浓度以评估RNA纯度，并使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性；例如，使用NanoDropND-2000C超微量分光光度计作为所述超微量核酸蛋白测定仪，分别测定RNA在230nm、260nm、280nm波长下的吸收值。

A15、使用双链互补DNA合成试剂盒，将获得的RNA合成双链互补DNA，使用单色DNA标记试剂盒进行标记；例如，还采用分光光度计检测荧光标记效率。

A16、使用芯片杂交***对标记后的双链互补DNA进行排列杂交，得到杂交芯片，采用匹配的清洗试剂盒清洗杂交芯片；例如，使用罗氏NimbleGen芯片杂交***对标记后的双链互补DNA进行排列杂交，并采用罗氏NimbleGen芯片杂交***相匹配的清洗试剂盒清洗杂交芯片。

A17、使用芯片扫描仪扫描清洗后的杂交芯片的荧光强度，使用635nm激发，获得芯片扫描图像后，使用生物芯片扫描分析软件进行数据分析，导出格式化微阵列文本数据作为所述基因芯片数据。优选的，所述芯片扫描图像按TIF图像格式进行存储，所述基因芯片数据按Excel文件格式进行存储。优选的，应用于上述各例及其组合，还采用数据原始值减去扫描仪的背景值得到修正值，然后采用中值标准化方法对得到的修正值进行标准化，得到标准值数据，使用基因芯片数据分析软件对标准值数据进行数据分析。

应用于上述各例及其组合，本发明的又一个实施例是，一种***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，其采用任一上述的构建方法构建获得。优选的，所述***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型包括以下6个lncRNA，分别为：uc001boe，uc002flc，uc003obo，AY555145，BC041951以及U79273。

本发明上述各实施例，通过应用芯片技术高通量分析技术检测***患者PBMC中lncRNA表达图谱的变化，发现与健康对照者相比lncRNA表达图谱发生了显著变化，结合基因芯片数据分析方法构建***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，为通过lncRNA整体地、***地研究***提供作为中间结果的信息。应用于上述各例及其组合，下面再继续给出一个具体的实例对本发明进行详细说明。

标本收集：20例***患者来自于桂林解放军第一八一医院肾脏移植与血液净化透析中心住院部，肾功能衰竭的原因是慢性肾炎，无感染，糖尿病和自身免疫性疾病等，所有病例均未接受免疫抑制治疗，降脂药和非甾体抗炎药。20例健康志愿者来自体检正常人群，其性别、年龄、种族与选取的***患者相匹配，各组性别和年龄差异无统计学意义。

外周血单个核细胞的分离：血液标本***患者(n＝20)和正常健康组(n＝20)。用肝素钠管取外周血5mL，生理盐水对倍稀释全血。缓慢叠加于等体积(5mL)的淋巴细胞缓冲液上，800×g，30分钟水平离心。吸取单个核细胞，用生理盐水清洗细胞两次，用枪头尽量吸掉管底沉淀细胞上的液体，加入1mL总RNA提取试剂(TRIZOL试剂)吹打混匀后置于-80℃冰箱保存。

RNA抽提与质量检测：抽提总的RNA，用Trizol试剂(Invitrogen公司)和RNeasy试剂盒(Qiagen)，按照试剂使用说明，分别从***患者和健康人外周血单个核细胞中提取总RNA。使用Nanodrop ND-1000测定RNA在230，260，280nm波长下的吸收值，以计算浓度评估RNA纯度。使用甲醛变性琼脂糖电泳检测RNA纯度和完整性。本例中，TRIZOL试剂根据酚-异硫氢酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氢酸胍组成。对任何生物材料的RNA提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂后，可保持RNA的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含RNA的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。硅胶膜纯化法所使用的RNeasy试剂盒是由Qiagen公司设计，其设计思路是含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，核酸吸附在硅胶膜上，从而与其它细胞成分分开，然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出来。

cDNA样品合成，标记及芯片杂交：使用ds-cDNA合成试剂盒(Invitrogen公司)合成双链(double strand，ds)互补DNA，然后使用单色DNA标记试剂盒(Nimblegen公司)标记ds-cDNA，分光光度计检测荧光标记效率。所采用的芯片为Arraystar公司12×135K的lncRNA芯片，该芯片覆盖所有权威数据库如NCBI，Refseq，UCSC Known Gene，NRED，RNAdb等多个数据库的lncRNA。使用NimbleGen公司提供的杂化***进行排列杂交，然后采用Nimblegen清洗试剂盒清洗杂交芯片。

芯片表达分析：使用Genepix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，使用635nm激发，图像存成TIF文件；然后使用Genepix Pro 6.0分析数据，分析结果导出，最终用EXCEL文件表示。数据原始值通过减去扫描仪得到的背景值做修正，再用中值标准化修正值，即标准值；其中，修正值采用数据原始值减去扫描仪的背景值得到，然后对得到的修正值进行标准化，即将数据调整到同一水平，方法为中值标准化，最后得到的数据为标准值。把扫描获得的格式化微阵列文本数据上传到Agilent GeneSpring软件(version11.0)中进一步进行分析，设置归一化基准，数据滤过的比值倍数等，获取差异表达基因，实验结果用EXCEL数据表示出来。根据fold-change＞2判定差异表达基因。一般来说，样本标准值比对照标准值，比值大于2时，差异表达上调；比值小于0.5时，差异表达下调；比值0.5-2，则认为差异表达不显著。

实时定量PCR：挑选6个差异表达的lncRNA进行实时定量PCR的相对定量研究，验证芯片实验的可靠性。6个lncRNA分别为uc001boe，uc002flc，uc003obo，AY555145，BC041951和U79273，采用Primer 5.0软件设计引物，见表1。实时定量PCR时各样品加样量均为2μL，为校正差异，使用β-actin作为内参，因为β-actin在不同样品间表达量基本恒定。各指标均按以下程序进行：95℃预变性10min，然后执行40个PCR循环：95℃变性15秒；60℃退火60秒并收集荧光。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按95℃变性15秒；60℃退火20秒；99℃熔解15秒；并从60℃缓慢加热到99℃，仪器自动进行-Ramp Rate为2％。其中，得到的数据采用2^-ΔΔCT法进行分析。即，对得到的数据进行分析，具体如表3所示，其中，CT值指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时，所经历的循环数。荧光达到阈值的循环数越少，则CT值越小。熔解曲线呈单峰，说明没有非特异性荧光产生，表示定量准确。

实时定量PCR引物序列如下表1所示：

芯片杂交结果：利用芯片杂交分析***患者与正常对照组的lncRNA表达谱，共检测20294条lncRNA，其中差异倍数2倍以上，即fold-change＞2且差异有统计学意义的lncRNA，差异的统计学意义取P＜0.05，则基本上可以判定其为差异表达。

结果发现8815种lncRNA在***患者中差异表达，其中2418种表达上调，6397种表达下调；1236种10倍以上(fold-change＞10)差异表达的lncRNA，其中222种表达上调，1014种表达下调。列出6个进行实时定量PCR的相对定量研究的差异表达的lncRNA。

差异性表达的lncRNA如下表2所示：

lncRNA名称	Fold-change值	类型	染色体定位
				uc001boe	9.387054	上调	chr1
AY555145	9.242459	上调	chr3
				uc002flc	10.76878	上调	chr16
uc003obo	11.6211	下调	chr6
				U79273	15.95849	上调	chr17
BC041951	7.401034	上调	chr6

实时定量PCR结果：挑选6个差异表达的lncRNA uc001boe，uc002flc，uc003obo，AY555145，BC041951和U79273，进行实时定量PCR的相对定量研究。数据采用2^-ΔΔCT法进行分析。6个lncRNA的实时定量PCR结果与芯片结果一致，证实了芯片结果的可靠性。

实时定量PCR结果如下表3所示：

本发明以***为疾病模型，利用芯片技术高通量分析***患者外周血单个核细胞中差异表达的lncRNA。本例中，芯片采用Arraystar公司12×135K的lncRNA芯片，覆盖目前所有权威数据库NCBI，Refseq，UCSC Known Gene，NRED，RNAdb等多个数据库的lncRNA。共检测出8815种lncRNA在***患者中差异表达，其中2418种表达上调，6397种表达下调；1236种10倍以上差异表达的lncRNA，即fold-change＞10，其中222种表达上调，1014表达下调。本发明又一个例子是，选取上述1236种10倍以上差异表达的lncRNA建立***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型。

因此，利用芯片比较分析***患者与正常对照组的lncRNA表达，对于其中差异倍数2倍以上，即fold-change＞2的lncRNA，则认为其属于差异表达。结果显示8815种lncRNA在***患者中差异表达，其中2418种表达上调，6397种表达下调；1236种10倍以上差异表达的lncRNA，其中222种表达上调，1014种表达下调。挑选6个差异表达lncRNA进行实时定量PCR研究，其结果均符合芯片分析结果。正常对照组与***患者比较，lncRNA表达谱发生了显著变化，证实lncRNA在***患者外周血单个核细胞中出现了显著的差异表达。差异性表达lncRNAs中，可能部分参与肿瘤基因的转录调控过程，从而有助于进一步了解***的病理机制。

综上，本发明首次从lncRNA这一全新的角度探讨***的病理机制，从实验结果来看，在***外周血单个核细胞中有些lncRNA表达明显上调，有些表达明显下调，提示这些表达变化的lncRNA可能与***的病理机制相关。本发明还挑选6个差异表达的lncRNA作为一个***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型的示例，其包括以下6个lncRNA，分别为：uc001boe，uc002flc，uc003obo，AY555145，BC041951以及U79273。其中，lncRNA uc001boe编码Wiskott-Aldrich(WAS，一种血液病)综合症蛋白家族成员，可形成多蛋白复合体，结合受体激酶和肌动蛋白；lncRNA uc002flc的异常与常染色体隐性慢性肉芽肿病有关，即产生活性氧的能力减弱，杀菌障碍；lncRNA uc003obo即为MHC II类抗原；lncRNA BC041951是铁/锰超氧化物歧化酶家族成员，编码线粒体蛋白，其异常与特发性心肌炎和癌症发生有关；lncRNA AY555145编码鸟嘌呤核苷酸(G蛋白)结合蛋白α亚基，并参与多个信号通路。lncRNA U79273参与真核生物翻译起始，影响基因表达。

并且，本发明在数据分析中，还将20例***患者和20例正常对照组分别混合，制成两组混合样品，这样可有效消除个体间差异。利用lncRNA芯片比较分析***患者和正常对照组PBMC(peripheral blood mononuc lear cell，外周血单核细胞)中lncRNA表达图谱的变化，结果表明lncRNA表达图谱发生了显著变化，lncRNA有可能涉及***的病理机制并可能为潜在的诊断标志物。

因此，lncRNA可能是在***病理机制中起重要作用的影响因子，并成为其诊断的新生物标记，深入研究可为***的诊断，治疗和预防及其机理研究提供新途径。这样，挑选出特定的与***相关lncRNA，进一步深入研究，结合表达图谱芯片分析下游基因，鉴定其未知的功能，有助于进一步开展***的研究工作。也就是说，说明了***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型有望成为临床***研究的有力助手和补充方法。

但是，需要说明的是，lncRNA的变化并不能作为***的特异标志物，只有收集更多信息、并经过未来进一步的医学分析验证才能准确诊断***的疾病状态。因此根据现有技术中的医学知识和本发明申请公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出***患者的诊断结果。但是随着后续研究工作的开展，采用上述各例及其组合的构建方法，其所构建的***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，将作为中间结果的有效信息，为下一步的分析工作提供良好的信息支持和辅助数据。

需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即外周血，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；并且，上面列出的各个技术特征，其相互组合所能够形成各个实施方案，应被视为属于本发明说明书记载的范围。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1、获取***患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，对各所述测试外周血样本，分别获取基因芯片数据，具体执行以下步骤：

A11、采用生理盐水对倍稀释全血，再缓慢加入至等体积的淋巴细胞缓冲液；

A12、以800×g水平离心30分钟后，吸取单个核细胞，用生理盐水清洗两次，吸除管底沉淀细胞上的液体，加入1mL总RNA提取试剂吹打混匀后置于零下80摄氏度保存；

A13、采用总RNA提取试剂抽提RNA，通过硅胶膜纯化法获得纯化的RNA；

A14、使用超微量核酸蛋白测定仪分别测定RNA在230nm、260nm、280nm波长下的吸收值，计算RNA浓度以评估RNA纯度，并使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性；

A15、使用双链互补DNA合成试剂盒，将获得的RNA合成双链互补DNA，使用单色DNA标记试剂盒进行标记；

A16、使用芯片杂交***对标记后的双链互补DNA进行排列杂交，得到杂交芯片，采用匹配的清洗试剂盒清洗杂交芯片；

A17、使用芯片扫描仪扫描清洗后的杂交芯片的荧光强度，使用635nm激发，获得芯片扫描图像后，使用生物芯片扫描分析软件进行数据分析，导出格式化微阵列文本数据作为所述基因芯片数据；

A2、将各所述测试外周血样本的基因芯片数据上传到基因芯片数据分析软件，并设置归一化基准以及数据滤过的比值倍数，获取差异表达基因，得到***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1中，获取***患者组与正常对照组的离体的测试外周血样本，执行以下步骤A10：用肝素钠管获取已经脱离人体的外周血5mL作为所述测试外周血样本。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2之后，执行以下步骤A3：挑选若干个差异表达的长链非编码RNA进行实时定量PCR的相对定量测试，其中，采用PCR引物设计软件设计引物，实时定量PCR时各样品加样量均为2μL，并使用β肌动蛋白作为内参，95摄氏度预变性10分钟后，进行40个PCR循环，其中，95摄氏度变性15秒，60摄氏度退火60秒并收集荧光数据；扩增反应后，按95摄氏度变性15秒，60摄氏度退火20秒，从60摄氏度缓慢加热到99摄氏度熔解15秒，建立PCR产物的熔解曲线；

其中，执行PCR热循环文件时的加热/冷却速度为2％。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，采用2-ΔΔCT法进行分析实时定量PCR的相对定量测试结果。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A13中，所述硅胶膜纯化法采用Qiagen公司的RNeasy试剂盒完成。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A15中，采用分光光度计检测荧光标记效率。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A17中，所述芯片扫描图像按TIF图像格式进行存储，所述基因芯片数据按Excel文件格式进行存储；并且，采用数据原始值减去扫描仪的背景值得到修正值，然后采用中值标准化方法对得到的修正值进行标准化，得到标准值数据，使用基因芯片数据分析软件对标准值数据进行数据分析。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2中，设置所述比值倍数大于2，并且，所述分析结果按Excel文件格式进行存储。

9.一种***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，其特征在于，其采用如权利要求1至8任一所述的构建方法构建获得。

10.根据权利要求9所述的***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型，其特征在于，所述***外周血单核细胞长链非编码核糖核酸差异性表达图谱模型包括以下6个长链非编码RNA，分别为：uc001boe，uc002flc，uc003obo，AY555145，BC041951以及U79273。