CN103897047A - 蛋白BhHSP70-1及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白BhHSP70-1及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，称为BhHSP70-1，来源于苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，BhHSP70-1是与植物抗旱、抗盐性相关的蛋白；对于培育抗旱、抗盐性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

蛋白BhHSP70-1及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白BhHSP70-1及其编码基因与应用。
背景技术
随着全球水资源的缺乏和极端气候事件的增长，干旱对作物的产量和品质的影响日趋显著。因此，通过分子操作技术提高作物的抗旱性日显重要。
生物体受到干旱胁迫或其它不良环境因素后，会产生一系列的应急反应，其中热激蛋白(heat shock protein，HSP)会在体内迅速积累，在保护细胞、新生蛋白的折叠、变性蛋白的重新折叠和已经形成聚合体的蛋白质的分解等过程中具有关键作用。进一步研究发现，HSPs的含量与生物体耐胁迫性呈正相关，且能够提高生物体的应激能力和在逆境中的存活率。
复苏植物可以忍受极度干旱的条件，待水份充足时又能很快恢复正常生命活动。已知被子植物中的复苏植物很少，且主要分布在南非、南美和澳大利亚。旋蒴苣苔（Boeahygrometrica）是在我国分布的一种苦苣苔科复苏植物，该植物的叶片具有很强的耐旱复苏能力，在室温、相对空气湿度为0的条件下生长72小时后，叶片相对含水量降为3％左右，叶片面积皱缩至原叶片面积的1/3以下，光合作用基本停止。只要重新给水，叶片就可以吸水伸展，并恢复成未处理前的叶片表观状态和生理状态（包括光合作用的恢复）。
发明内容
本发明的一个目的是提供蛋白BhHSP70-1及其编码基因。
本发明提供的蛋白，称为BhHSP70-1，来源于苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boeahygrometrica），是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。
上述基因是如下(1）-(4）中任一一种的DNA分子：
(1）编码序列是序列表中序列1自5’末端第559-2508位核苷酸所示的DNA分子；
(2）编码序列是序列表中序列1自5’末端第559-2505位核苷酸所示的DNA分子；
(3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
(4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
上述序列表中的序列1由2804个碱基组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第559-2508位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的BhHSP70-1。
含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组载体为将上述蛋白的编码基因替换掉Bin19-35S-LEA-polyA中的LEA片段得到的载体pBin19-BhHSP70-1；具体为将上述蛋白的编码基因***取代Bin19-35S-LEA-polyA的BamHI和Xho1酶切识别位点间的小片段（LEA片段）得到的重组载体pBin19-BhHSP70-1。
可用现有的植物表达载体构建含有BhHSP70-1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。
使用BhHSP70-1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子（pUbi）等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
上述引物对在本发明的实施例具体为5’-TGGATCCATGGCAGGGAAAGGAG-3’所示的引物和5’-ACTCGAGTCAACCTCCTCGATCT-3’所示的引物。
上述蛋白、上述编码基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围；在上述应用中，所述调节植物耐逆性具体为提高植物耐逆性；所述耐逆性具体为耐盐性或耐旱性；
上述植物具体为双子叶植物或单子叶植物，上述双子叶植物进一步具体为拟南芥。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的培育转基因植物的方法，为将上述蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
上述方法中，所述耐逆性为耐盐性或耐旱性；
上述蛋白的编码基因通过上述的重组载体导入目的植物。
上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。
扩增上述BhHSP70-1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
携带有本发明的与植物抗旱、抗盐相关蛋白编码基因BhHSP70-1的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花等农作物，也可以是苜蓿、三叶草、冰草等牧草以及草莓、西红柿等果蔬花卉植物。
本发明的实验证明，本发明从复苏植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）中筛选到一个受干旱诱导表达的BhHSP70-1基因，将该基因导入野生型拟南芥，得到转BhHSP70-1拟南芥，与野生型拟南芥相比，该转BhHSP70-1拟南芥的抗旱、抗盐性明显提高，说明BhHSP70-1是与植物抗旱、抗盐性相关的蛋白。因此蛋白BhHSP70-1及其编码基因对于培育抗旱、抗盐性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为BhHSP70-1基因在旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）干旱复苏过程中的表达情况
图2为T2代转BhHSP70-1拟南芥的RT-PCR检测结果
图3为T2代转BhHSP70-1拟南芥的抗旱能力鉴定
图4为T2代转BhHSP70-1拟南芥的抗盐能力鉴定
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中载体Bin19记载在如下文献中：D.A.Frisch,L.W.Harris-Haller,N.T.Yokubaitis,T.L.Thomas,S.H.Hardin,T.C.Hall,Complete sequence ofthe binary vectorBin19,Plant Mol.Biol.27(1995)405-409；公众可从中国科学院植物研究所获得。
实施例1、BhHSP70-1基因的克隆及表达
一、BhHSP70-1基因的克隆
提取经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）叶片总RNA，利用
Figure BDA00002664048200041
文库构建试剂盒(Stratagene，La Jolla,CA)构建cDNA文库。从中随机挑选4800个基因，用BioGridrobot(BioRobotics Ltd,Cambridge,UK)自动化点样在Hybond-N+尼龙膜(AmershamBiosciences，Freiburg,Germany)上，制成cDNA微阵列(cDNA芯片)。将该cDNA芯片分别与未经干旱处理正常生长的旋蒴苣苔叶片和经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔叶片的polyA-RNA所制备的33P标记的探针进行杂交，分析它们在正常条件及干旱诱导后基因表达的动态变化。结果发现，有1个经干旱诱导上调的基因，获取该基因的方法具体如下：
提取经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica；记载在如下文献中：Deng Xin,Hu Zhiang,Wang Hongxin,Wen Xiaogang,Kuang Tingyun.Effects ofdehydration and rehydration on photosynthesis of detached leaves of theresurrective plant Boea hygrometrica,Acta Botanica Sinica.2000,42(3):321-323；公众可从中国科学院植物研究所获得)叶片的总RNA并以其为模板，用基因特异性引物GSP-Race1:5’-AACACTAATCCCACCAA-3’进行反转录。反应体系为：总RNA（2μg/μl）1.0μl，GSP-Race1（1μM）2μl，dNTP（2mM）5μl，DEPC-H2O6.0μl，5×M-MLV buffer4μl，RNase抑制剂（5u/μl,购自Takara公司）1μl，M-MLV（购自Promega公司）1μl。37℃反应1h后再65℃10min，纯化回收（三博PCR产物回收试剂盒）后加C尾。反应体系为：cDNA5μl，DEPC-H2O13.5μl，5×buffer5μl，dCTP（10mm）0.5μl。75℃反应5min后加入1μl TdT（购自takara公司），再37℃反应1h，得到加C尾的cDNA序列。
以上述获得的加C尾的cDNA序列为模板，PCR扩增。反应体系为：cDNA1μl，10×PCR buffer1μl，dNTP（2mm）1μl，引物GSP-Race2:5’-CGAAGATCTTCTTATCAGCAGCAG-3’（10μm）0.5μl，多聚G锚定引物5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACG-3’（10μm）0.5μl，Taq酶（购自takara公司）0.1μl。反应条件为：先95℃预变性4min，然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，再72延伸2分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。得到PCR产物1。
将PCR产物1进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到2000bp左右的条带；回收该2000bp左右的条带，与载体pGEM-T（购自promega公司）连接后进行测序。根据测序结果设计引物5’-TGGATCCATGGCAGGGAAAGGAG-3’和引物5’-ACTCGAGTCAACCTCCTCGATCT-3’。
以上述获得的cDNA为模板，用引物5’-TGGATCCATGGCAGGGAAAGGAG-3’和引物5’-ACTCGAGTCAACCTCCTCGATCT-3’进行PCR扩增，得到PCR产物2。
上述PCR反应体系为：cDNA1μl，10×PCR buffer1μl，dNTP（2mm）1μl，引物各0.5μl，Taq酶（购自takara公司）0.1μl。程序为：95℃预变性4min，94℃变性45秒，52℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共27个循环；最后再72℃延伸10分钟。
经过测序，该PCR产物2具有序列表中序列1自5’末端第559-2505位核苷酸，该序列所示的基因命名为BhHSP70-1，序列1包含完整的BhHSP70-1基因的开放阅读框（ORF）、5’-UTR(5’-非翻译区)和3’-UTR，其ORF为序列表中序列1自5′末端第559-2508位的核苷酸。该基因编码的蛋白命名为BhHSP70-1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
二、BhHSP70-1基因在旋蒴苣苔干旱复苏过程中的表达
对旋蒴苣苔进行8种不同程度的干旱处理，分别为：新鲜植株（F），新鲜植株土里慢速干旱5天（S5），新鲜植株土里慢速干旱14天（S14），浇水复苏3-4天（A），F和A从土里取出空气中快速干旱2小时（F2、A2），F和A从土里取出空气中快速干旱48小时（F48、A48）。分别提取8中处理旋蒴苣苔叶片的总RNA、反转录获得cDNA。用基因特异性引物BhHSP70-1-f5’-TGAGAAGTGTCTGAGGGAGGC-3’，和BhHSP70-1-r5’-TCTTTGCCATTGAAGAAGTCC-3’进行Q-PCR扩增。并以18SrRNA基因为内参，扩增引物为18S-f5’-CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG-3’，和5’-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3’。反应体系为：cDNA1μl，10μl2×SYBR GreenMaster Mix，引物各0.5μl，dd水8.5μl。程序为：95℃预变性30秒，95℃变性5秒，55℃退火30秒，72℃延伸30分钟，共50个循环。
结果如图1所示，可以看出该基因明显受干旱诱导。
实施例2、BhHSP70-1在提高植物抗旱和抗盐中的应用
一、转BhHSP70-1拟南芥的获得
1、重组载体的获得
将由实施例1得到的PCR产物2(也可以人工合成序列表中序列1自5’末端第559-2505位核苷酸)进行回收，得到的回收产物连接到pEasy-blunt载体（北京全式金公司）上，获得中间载体pBhHSP70-1。
具体构建方法如下：
1）将中间载体pBhHSP70-1用BamHI和Xho1（购自大连宝生物公司）双酶切后，回收1961bp的片段（BhHSP70-1基因）；
2）将含CaMV35Sq启动子和pA的载体Bin19-35S-LEA-polyA（Liu X.,Wang Z,WangL.L.,Wu R.H.Phill ips J.and Deng X。LEA4group genes from the resurrectionplant Boea hygrometrica confer dehydration tolerance in transgenic tobacco，Plant Science176(2009)90–98；公众可从中国科学院植物研究所获得）用BamHI和Xho1酶切去掉LEA片段，回收约13kb的载体骨架，将载体骨架与1）得到的1961bp的片段连接，获得重组载体pBin19-BhHSP70-1（用BamHI和Xho1酶切验证，得到1961bp为阳性）。
该重组载体pBin19-BhHSP70-1受35S启动子（Odell,JT;Nagy，F;Chua,NH.Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus35Spromoter.Nature.313(2005):810–812）控制。
2、重组农杆菌的获得
将上述重组载体pBin19-BhHSP70-1转化到农杆菌Gv3101（Agrobacteriumtumefaciens strain GV3101；文献：Binary Agrobacterium vectors for planttransformation,M Bevanin,Nucleic Acids Research(1984)12(22):8711-8721；公众可从中国科学院植物研究所获得）细胞中，用含有50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml庆大霉素和50μg/ml利福平的YEB培养基进行筛选，得到重组菌Gv3101/pBin19-BhHSP70-1（提取质粒，用BamHI和Xho1酶切验证，得到1961bp为阳性）。
3、转BhHSP70-1拟南芥的获得
将重组菌Gv3101/pBin19-BhHSP70-1采用花器官浸泡法转化野生型拟南芥Col-0（ecotype columbia，Arabidopsis thaliana；中国科学院植物研究所，文献：Arabidopsis,a useful weed.Meyerowitz EM,Cell(1989)56:263-270；公众可从中国科学院植物研究所获得），得到T0代转BhHSP70-1拟南芥。
取T0代转BhHSP70-1拟南芥种子全部均匀地播种于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基上，将具有抗性的成活幼苗移至温室培养（培养温度22℃，光周期16/8小时），收集4株T1代转BhHSP70-1拟南芥的种子。分别取以上4株100粒T1代转BhHSP70-1拟南芥种子播种于含100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基中，将分离比为3：1的T1代转BhHSP70-1拟南芥的成活幼苗（5-10棵）移至温室培养，收集T2代转BhHSP70-1拟南芥的种子。分别取100粒T2代转BhHSP70-1拟南芥种子播种于含100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基中，将不发生分离转基因的成活苗（10棵左右）移至温室培养，收集T3代转BhHSP70-1拟南芥的纯合体种子。结果共获得4个T3代转BhHSP70-1拟南芥株系：1-3、2-1、3-3、4-1。
提取10天苗龄的上述4个株系的T3代转BhHSP70-1拟南芥的总RNA并以其为模板，以HSP70-1-f5’-TGGATCCATGGCAGGGAAAGGAG-3’和HSP70-1-r5’-ACTCGAGTCAACCTCCTCGATCT-3’为引物进行RT-PCR，同时以未转基因的野生型拟南芥作为对照。Actin的引物为actin F:5'-gtatggtgaaggctggatttgc-3'；actin R5'-tgaggtaatcagtaaggtcacgtcc-3'；
PCR扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后再72℃延伸10分钟；同时以actin基因做为内参，PCR扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环；最后再72℃延伸10分钟。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，每组样品进行2次重复。
结果如图2所示，可以看出，未转基因的野生型拟南芥（WT）中没有扩增出条带，T3代转BhHSP70-1拟南芥株系：1-3、2-1、3-3、4-1中，皆有250bp的片段，说明T3代转BhHSP70-1拟南芥株系：1-3、2-1、3-3、4-1为阳性T3代转BhHSP70-1拟南芥纯合体。
采用同样的方法将空载体pBin19转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥（鉴定方法同上，结果与野生型拟南芥无显著差异）。
2、转BhHSP70-1拟南芥的抗旱、抗盐性
将T3代转BhHSP70-1拟南芥株系：1-3、2-1、3-3、4-1、转空载体拟南芥和未转基因的野生型拟南芥播于MS培养基上，4℃春化3天后，培养在22℃、50%湿度、光照16h和黑暗8h的条件下，4天后将小苗进行分别转移至含40%（质量百分含量）PEG的MS培养基和含有100mM（质量百分含量）NaCl的MS培养基上，15天后照相并统计根长。每个株系8株，实验共设三次重复，结果取平均值。
含40%（质量百分含量）PEG的MS培养基处理的各株系结果如图3所示，其中图3A为表型观察，可以看出，与野生型拟南芥（WT）相比，T3代转BhHSP70-1拟南芥株系的根长明显大于野生型。统计根长结果如图3B所示，T3代转BhHSP70-1拟南芥株系：1-3、2-1、4-1的根长分别为0.74cm、0.85cm、1.71；
野生型拟南芥（WT）的根长为0.37cm；
转空载体拟南芥和未转基因野生型拟南芥结果无显著差异。
含有100mM（质量百分含量）NaCl的MS培养基处理的各株系结果如图4所示，其中图4A为表型观察，可以看出，与野生型拟南芥（WT）相比，T3代转BhHSP70-1拟南芥株系的根长明显大于野生型。统计根长结果如图4B所示，T3代转BhHSP70-1拟南芥株系：1-3、2-1、3-3、4-1的根长分别为4.43cm、3.78cm、4.00cm、4.27cm；
野生型拟南芥（WT）的根长为2.82cm；
转空载体拟南芥和未转基因野生型拟南芥结果无显著差异。
上述结果表明，转BhHSP70-1拟南芥在含PEG和NaCl的培养基上长势均明显优于野生型，具体表现在根长均明显大于野生型，最高达到3倍。
综上所述，BhHSP70-1基因过表达植株的抗旱、抗盐性明显优于未转基因的植株，说明BhHSP70-1是与植物抗旱、抗盐相关的蛋白。
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Claims (10)

1.一种蛋白，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(1）-(4）中任一一种的DNA分子：
(1）编码序列是序列表中序列1自5’末端第559-2508位核苷酸所示的DNA分子；
(2）编码序列是序列表中序列1自5’末端第559-2505位核苷酸所示的DNA分子；
(3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
(4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：
所述重组载体为将权利要求1所述蛋白的编码基因替换掉表达载体Bin19-35S-LEA-polyA中的LEA片段得到的载体。
6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述编码基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用；
所述耐逆性具体为耐盐性或耐旱性；
所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。
8.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性或耐旱性；
权利要求1所述蛋白的编码基因通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。
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