CN103891502A - 一种降低烟叶中镉含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种降低烟叶中镉含量的方法，所述方法的具体步骤如下:（1）用纳米材料氧化锌代替原Kafer培养基中的ZnSO₄·7H₂O，在1升培养基中加入纳米材料氧化锌10mg；（2）将活化后的印度梨形孢（Piriformospora indica）接种于步骤（1）所述的液体Kafer培养基中培养，然后收集菌丝体，制备印度梨形孢菌丝液，接着浇灌于烟苗根部，灌根处理，使印度梨形孢定殖于烟苗根部；（3）经印度梨形孢定殖后的烟苗移栽，进行常规的水肥管理，使烟草正常生长。本方法可以改善烟草生长状况，减少重金属镉从根系向烟草地上部分的迁移，降低烟叶重金属残留，而且易于掌握、成本较低、简单实用，绿色环保，不会引起二次污染。

Description

一种降低烟叶中镉含量的方法

技术领域

本发明涉及微生物资源的利用和农产品质量安全技术领域，尤其涉及一种降低烟叶中镉含量的方法。

背景技术

随着化肥、农药的大量施用和工业的迅速发展，环境污染日益严重。镉是一种有毒的重金属，也是主要的环境污染物之一。烟草是我国重要的经济作物之一，我国烟草的种植面积、烤烟产量和生产量均居世界首位。近年来，常有烟草重金属超标等质量安全问题的报道，其中镉、铬、铅对烟草生长和品质的影响较为严重。土壤中镉和铅能抑制烟草生长，使烟草形态、生理生化及结构发生变化；降低烟叶香气物质的含量，不利于香味的形成(李春明,马新明,袁祖丽,等.镉和铅污染对烤烟根区土壤微生物及烟叶品质的影响.应用生态学报,2005,16(11):2182-2186；马新明,李春明,袁祖丽,等.铅污染对烤烟光合特性,产量及其品质的影响.植物生态学报,2006,30(3):472-478)；镉胁迫对烟草活性氧清除***影响明显，使***中酶的活性和比例失调，降低了活性氧清除功能，造成细胞膜的功能紊乱(严重玲,洪业汤,付舜珍.Cd,Pb胁迫对烟草叶片中活性氧清除***的影响.生态学报,1997,17(5):488-492；袁祖丽,吴中红.镉胁迫对烟草根抗氧化能力和激素含量的影响.生态学报,2010,30(15):4109-4118)；土壤中镉含量升高，烟叶中叶绿素的含量随之降低，净光合速率下降(马新明,李春明,田志强,等.镉污染对烤烟光合特性,产量及其品质的影响.生态学报,2006,26(12):4039-4044.；高家合，王树会.镉胁迫对烤烟生长及生理特性的影响.农业环境科学学报，2006，25(5):1167-1170)。土壤中的铅污染能降低种子活力，铬污染造成烟草生长的迟缓和发育的滞后，降低了烟草中总氮、烟碱、可溶性总糖和还原糖的含量，严重影响了烟叶的品质(史宏志,刘国顺,常思敏,等.烟草重金属研究现状及农业减害对策.中国烟草学报,2011,17(3):89-94)。因此，如何减少烟叶中镉积累已经成为烟草行业一个主要的任务。

烟草中重金属主要来自植烟土壤，同时肥料和农药的不规范也会导致烟草的重金属含量过高。治理植烟土壤重金属污染的主要措施有工程措施、物理化学修复、植物修复和根际微生物修复等方法，但上述方法对土壤重金属污染修复的可操作性、有效性、广谱性与安全性都有待完善与提高。目前，最常用降低烟草重金属残留的措施是施用各种改良剂，如石灰、钙镁磷肥、粘土矿物等无机改良剂，以及畜禽粪便等各种有机肥等（胡钟胜,章钢娅,王广志,等.修复剂对烟草吸收污染土壤中砷的改良.土壤,2006,38(2):200-205；周泽庆,招启柏,朱卫星,等.重金属污染植烟土壤改良剂原位修复研究进展.安徽农业科学,2009,37(11):5100-5102.)。中国发明专利（CN1017M405A)发明了一种降低农作物镉、铅污染的土壤改良剂，主要包含Ca(OH)₂、Na₂SiO₇等无机组分以及稻草秸秆、山毛豆脱落物等有机组分。由于种种原因，这些改良剂的大面积施用往往受到限制，如石灰、粘土矿物对土壤性状的影响较大，而钙镁磷肥、畜禽粪便中往往含有重金属。因此，提出一种更经济实用的技术措施用于有效降低烟草重金属残留就显得非常必要。

中国专利申请201310104049.7公开了里氏木霉联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用，菌剂使用方法是在伴矿景天幼苗根际施加里氏木霉FS10-C发酵液或微生物制剂；中国专利申请201210137704公开了一种利用丛枝菌根修复重金属污染土壤的方法，菌种使用方法是将丛枝菌根接种于稗草根部。上述两项专利是用生物菌种来提高寄主吸收土壤中重金属的能力，随后移除寄主植物，完成重金属污染土壤的修复。这类方法能够降低土壤中的重金属含量，但同时也降低了耕地的复种指数，且如何处理寄主植物也是生产实际中的难题。中国专利申请20121007120和201010525189均公开了一种利用丛枝菌根真菌降低烟草重金属残留的方法，丛枝菌根真菌和烟草形成丛枝菌根共生体，促进烟草生长，降低烟草重金属残留。然而丛枝菌根真菌不能在人工合成的培养基上生长，不利于该菌的大规模推广应用。

印度梨形孢是一种根部内生真菌，具有广泛的寄主范围，能促进植物生长，提高寄主对生物和非生物胁迫的抗性，并能在合成培养基上培养，为该菌在农业和园艺业的大面积应用提供了可能（楼兵干，孙超，蔡大广.印度梨形孢的多种功能及其应用前景.植物保护学报.2007,34(6):653-656）。因此，通过开发利用印度梨形孢，在不影响烟叶产量和品质的前提下降低烟叶中重金属含量，尤其是镉的含量，具有广泛的应用前景。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种降低烟叶中镉含量的方法，利用生物方法降低烟叶中重金属镉残留。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种降低烟叶中镉含量的方法，利用在烟草根部寄生印度梨形孢来降低烟草重金属镉残留。

进一步的，所述降低烟叶镉含量的方法具体包括以下步骤：

（1）印度梨形孢培养基的配制：

用粒径为30nm的纳米材料氧化锌代替原Kafer培养基中的ZnSO₄·7H₂O，在1升培养基中加入纳米材料氧化锌10mg，所述新配置的Kafer培养基中每升含有：2.00g蛋白胨，1.00g酵母提取物，1g水解酪蛋白，0.6gNaNO₃，0.52gKCl，0.52gMgSO₄·7H₂O，1.52gKH₂PO₄，10mgZnO，10mgH₃BO₃，5mgMnSO₄·H₂O，1.6mgCoCl·5H₂O，1.6mgCuSO₄·5H₂O，1.1mg(NH₄)₆MO₇O₂₄，1.3mgFeSO₄，1.8mgEDTA，0.1mg硫胺素，0.04mg甘氨酸，0.01mg烟酸和0.01mg吡哆醇；

（2）印度梨形孢菌丝液灌根处理烟苗根部

将活化后的印度梨形孢接种于步骤（1）所述的液体Kafer培养基中常规培养，然后收集菌丝体，制备印度梨形孢菌丝液，浇灌于烟苗根部，进行灌根处理，使印度梨形孢定殖于烟苗根部；

（3）烟草苗的移栽和后期的管理

经印度梨形孢定殖后的烟草苗进行移栽，之后进行常规的水肥管理，使烟苗正常生长。

进一步的，所述步骤（2）中印度梨形孢的培养条件为25℃-28℃、100rpm-120rpm摇床避光培养，5-7d后过滤，收集菌丝体，用蒸馏水配成浓度为2g/L-4g/L的菌丝液。

进一步的，步骤（2）中印度梨形孢菌丝液处理烟草苗的方式为：将印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部；或将印度梨形孢菌丝液加入烟草育苗器对烟草进行育苗；或用印度梨形孢菌丝液对烟草种子进行种子包衣，还可以用印度梨形孢菌丝液对烟草苗进行沾根处理。

进一步的，步骤（2）中用印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部时每棵苗浇灌的印度梨形孢菌丝液量为50mL。

进一步的，步骤（2）中烟苗为4叶期时用印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1、与现有技术中丛枝菌根真菌相比，本发明的印度梨形孢可在培养基上生长，应用方便；且能够改善烟草的营养状况，具有生物肥料的功能，促进烟草的生长，减少化肥的使用。

2、本发明采用粒径为30nm的纳米材料氧化锌代替原Kafer培养基中的ZnSO₄·7H₂O，在1升培养基中加入纳米材料氧化锌10mg，在含纳米材料ZnO(30nm)0.01mg/L的Kafer培养基培养的印度梨形孢，其在烟草根部的定殖率显著提高，由原来的80.0%提高到95.0%，能显著地提高烟草生物量，促进烟草的生长，降低重金属从根系向烟草地上部分的迁移，从而降低烟草重金属镉残留。试验证实使用本发明方法能显著的降低成熟烟叶中镉含量，使水培、盆栽和大田成熟烟叶中镉的含量分别下降28.4-50.2%、22.8-46.2%、28.5-51.8%。

3、本发明降低烟草中重金属残留的方法易于掌握、成本较低、简单实用，绿色环保，不会引起二次污染；它不仅适用于重金属污染土壤中烟草的种植，对于非污染土壤也可使用。

4、本发明中印度梨形孢菌丝液的使用方法多样，可以将印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部，还可以加入烟草育苗器对烟草进行育苗，还可以用印度梨形孢菌丝液对烟草种子进行种子包衣，还可以对烟草苗进行沾根处理。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明：

一种降低烟叶镉含量的方法，利用在烟草根部寄生印度梨形孢来降低烟草重金属镉残留，本发明印度梨形孢由印度爱德大学AjitVarma教授惠赠。

进一步的，所述降低烟叶镉含量的方法具体包括以下步骤：

（1）印度梨形孢培养基的配制：

用粒径为30nm的纳米材料氧化锌代替原Kafer培养基中的ZnSO₄·7H₂O，在1升培养基中加入纳米材料氧化锌10mg，所述新配置的Kafer培养基中每升含有：2.00g蛋白胨，1.00g酵母提取物，1g水解酪蛋白，0.6gNaNO₃，0.52gKCl，0.52gMgSO₄·7H₂O，1.52gKH₂PO₄，10mgZnO，10mgH₃BO₃，5mgMnSO₄·H₂O，1.6mgCoCl·5H₂O，1.6mgCuSO₄·5H₂O，1.1mg(NH₄)₆MO₇O₂₄，1.3mgFeSO₄，1.8mgEDTA，0.1mg硫胺素，0.04mg甘氨酸，0.01mg烟酸和0.01mg吡哆醇；

（2）印度梨形孢菌丝液灌根处理烟苗根部

将活化后的印度梨形孢接种于步骤（1）所述的液体Kafer培养基中常规培养，然后收集菌丝体，制备印度梨形孢菌丝液，浇灌于烟苗根部，进行灌根处理，使印度梨形孢定殖于烟苗根部；

（3）烟草苗的移栽和后期的管理

经印度梨形孢定殖后的烟草苗进行移栽，之后进行常规的水肥管理，使烟苗正常生长。

进一步的，所述步骤（2）中印度梨形孢的培养条件为25℃-28℃、100rpm-120rpm摇床避光培养，5-7d后过滤，收集菌丝体，用蒸馏水配成浓度为2g/L-4g/L的菌丝液。

进一步的，步骤（2）中印度梨形孢菌丝液处理烟草苗的方式为：将印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部；或将印度梨形孢菌丝液加入烟草育苗器对烟草进行育苗；或用印度梨形孢菌丝液对烟草种子进行种子包衣，还可以用印度梨形孢菌丝液对烟草苗进行沾根处理。

进一步的，步骤（2）中用印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部时每棵苗浇灌的印度梨形孢菌丝液量为50mL。

进一步的，步骤（2）中烟苗为4叶期时用印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部。

实施例1

一种降低烟叶镉含量的方法，利用在烟草根部寄生印度梨形孢来降低烟草重金属镉残留，包括如下步骤：

菌种的活化：将保存在冰箱里的印度梨形孢菌种接种于Kafer培养基（KM）平板上，置于28℃恒温箱里避光培养7天。用直径为5mm的打孔器在活化好的印度梨形孢菌落边缘打孔。

菌液的培养：配制液体Kafer培养基和含纳米材料ZnO(30nm)0.01g/L的液体Kafer培养基（即以粒径为30nm的纳米材料ZnO代替ZnSO₄·7H₂O），用250mL三角锥形瓶分装，每瓶装150mL培养基，灭菌备用。在无菌条件下，将印度梨形孢菌丝块加入装有上述培养基的三角锥形瓶中，每瓶6块菌丝块；置于恒温摇床120rpm、28℃避光振荡培养5-7天。

菌丝体的收集：锥形瓶中菌丝置于250mL离心瓶中，8000rpm离心20min，去上清，收集菌丝体，置于4℃保存，备用；

烟苗的准备：将烟草种子消毒后播撒在孔穴育苗盘中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，进行正常水肥管理。

菌丝液浇灌到秧苗根部：用水将印度梨形孢菌丝配成含菌丝浓度为4g/L的菌丝液，将菌丝液浇灌于4叶期烟苗根部，设2个处理与1个对照。处理1为含纳米材料ZnO(30nm)的液体Kafer培养基培养的印度梨形孢菌丝液，处理2为普通液体Kafer培养基培养的印度梨形孢菌丝液，对照浇灌相同体积的水。

菌丝液浇灌后15天，通过台盼蓝染色显微镜下观察检测印度梨形孢在烟苗根部的定殖情况，结果显示处理1的定殖率为95%，处理2的定殖率为80%，结果表明含纳米材料ZnO(30nm)的液体Kafer培养基培养的印度梨形孢菌丝在烟苗根部的定殖率明显提高。

将烟苗分别移到（1）塑料桶中进行水培：挑选处理1和对照中长势一致的烟苗移栽至塑料桶（容积为4L）中，桶内装有Cd浓度为含1mg/L的Hoagland营养液4L，每桶培养烟苗4株，对照和处理各3桶。

测定烟叶中的镉含量：水培后2周取样（最大叶），测定Cd元素含量，结果是处理组烟叶镉含量比对照降低了47.7%（表1）。

表1镉处理2周接种与未接种印度梨形孢的水培烟草中镉含量

注：处理1为含纳米材料ZnO(30nm)的液体Kafer培养基培养的印度梨形孢菌丝液（表2、表3同）

（2）塑料盆中进行盆栽：挑选处理1和对照中长势一致的烟苗移栽至塑料盆（底直径20cm,高27cm）中，盆内装有含Cd(NO₃)₂浓度为5mg/kg的大田土壤10kg，每盆种植烟苗1株，对照和处理各3株。

测定烟叶中的镉含量：盆栽后50天取样（最大叶），测定Cd元素含量，结果是处理组烟叶镉含量比对照降低了33.0%（表2）。

表2镉处理后烟叶中镉的含量

（3）将烟苗移至大田中：挑选处理1和对照中长势一致的烟苗移栽至大田中，70d后进行镉胁迫处理:以烟草茎基部为中心，10cm为半径，浇灌浓度为0.1g/L的硝酸镉溶液500mL，以浇灌500mL的水作为对照。每个处理各10株；50天后采收成熟叶，测定烟叶中镉的含量。

测定烟叶中的镉含量：镉处理50天后采收成熟烟叶，105℃杀青30min、70℃烘干至恒重，用HNO₃-H₂O₂(2:l)消煮，Varian820ICP—MS电感耦合等离子体质谱仪测定Cd元素含量，结果是处理组烟叶镉含量比对照降低了35.1%（表3）。

表3镉处理后大田成熟烟叶中镉含量

实施例2

将实施例1中印度梨形孢菌丝块改成印度梨形孢孢子液，接种于含10mg/LZnO的液体Kafer培养基中，于恒温摇床120rpm、25℃避光振荡培养7天，其余等同于实例1，最终水培、盆栽和大田烟叶中镉的含量分别降低46.2%、38.9%、51.8%。

实施例3

将实施例1中印度梨形孢菌丝液浓度改为2g/L，其余等同于实例1，最终水培、盆栽和大田烟叶中镉的含量分别降低49.2%、48.5%、47.5%。

实施例4

将实施例1中印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部改成印度梨形孢菌丝液加入烟草育苗器对烟草进行育苗，其余等同于实例1，最终水培、盆栽和大田烟叶中镉的含量分别降低28.4%、22.8%、28.5%。

实施例5

将实施例1中印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部改成印度梨形孢菌丝液对烟草苗进行沾根处理，其余等同于实例1，最终水培、盆栽和大田烟叶中镉的含量分别降低50.2%、46.2%、47.8%。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种降低烟叶中镉含量的方法，其特征在于，利用在烟草根部寄生印度梨形孢来降低烟草重金属镉残留。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述降低烟叶镉含量的方法具体包括以下步骤：

（1）印度梨形孢培养基的配制：

用粒径为30nm的纳米材料氧化锌代替原Kafer培养基中的ZnSO₄·7H₂O，在1升培养基中加入纳米材料氧化锌10mg，所述新配置的Kafer培养基中每升含有：2.00g蛋白胨，1.00g酵母提取物，1g水解酪蛋白，0.6gNaNO₃，0.52gKCl，0.52gMgSO₄·7H₂O，1.52gKH₂PO₄，10mgZnO，10mgH₃BO₃，5mgMnSO₄·H₂O，1.6mgCoCl·5H₂O，1.6mgCuSO₄·5H₂O，1.1mg(NH₄)₆MO₇O₂₄，1.3mgFeSO₄，1.8mgEDTA，0.1mg硫胺素，0.04mg甘氨酸，0.01mg烟酸和0.01mg吡哆醇；

（2）印度梨形孢菌丝液灌根处理烟苗根部

将活化后的印度梨形孢接种于步骤（1）所述的液体Kafer培养基中常规培养，然后收集菌丝体，制备印度梨形孢菌丝液，浇灌于烟苗根部，进行灌根处理，使印度梨形孢定殖于烟苗根部；

（3）烟草苗的移栽和后期的管理

经印度梨形孢定殖后的烟草苗进行移栽，之后进行常规的水肥管理，使烟苗正常生长。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中印度梨形孢的培养条件为25℃-28℃、100rpm-120rpm摇床避光培养，5-7d后过滤，收集菌丝体，用蒸馏水配成浓度为2g/L-4g/L的菌丝液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中印度梨形孢菌丝液处理烟草苗的方式为：将印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部；或将印度梨形孢菌丝液加入烟草育苗器对烟草进行育苗；或用印度梨形孢菌丝液对烟草种子进行种子包衣，或用印度梨形孢菌丝液对烟草苗进行沾根处理。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中用印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部时每棵苗浇灌的印度梨形孢菌丝液量为50mL。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中烟苗为4叶期时用印度梨形孢菌丝液浇灌于烟草苗根部。