CN103866037B - 由探测和标记寡核苷酸的切割及延伸测定检测靶核酸序列 - Google Patents

由探测和标记寡核苷酸的切割及延伸测定检测靶核酸序列 Download PDF

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Abstract

本发明涉及借助于探测和标记的寡核苷酸切割以及延长试验的靶核酸序列检测。本发明通过切割与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸放出片段，并且，所述片段与捕捉和制模寡核苷酸杂交形成延长双链体后检测所述延长双链体的存在来检测靶核酸序列。延长双链体提供由表示延长双链体存在的标记发出的信号（信号的产生、增加、消灭或者减少），并具有可调节的Tm值，这能够很好地被适用于对靶核酸序列的存在的检测。

Description

由探测和标记寡核苷酸的切割及延伸测定检测靶核酸序列
本申请是申请号为201280001703.5、申请日为2012年1月11日、发明名称为“借助于探测和标记的寡核苷酸切割以及延长试验的靶核酸序列检测”的中国发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
本发明涉及借助于探测和标记的寡核苷酸(PTO)切割以及延长(PTOCE，PTOCleavage and Extension)试验的靶核酸序列检测(Detection of Target Nucleic AcidSequence by PTO Cleavage and Extension Assay)。
【背景技术】
DNA杂交(hybridization)是分子生物学的基本的过程，受离子强度、碱基结构、核酸片段的长度、错配程度以及变性剂的存在的影响。基于DNA杂交的技术将成为决定特定核酸序列的非常有用的用具，将会明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分析。
但是，在仅依赖杂交的以往的方法以及过程中，发生因探针和非-靶序列之间的非-特异性杂交引起的假阳性结果的可能性高。因此，以往的方法以及过程存在改善可靠度的问题。
除探针杂交过程以外还提出了利用酶反应的几种接近法，例如，TaqManTM探针方法。
在TaqManTM探针方法中，与靶核酸序列杂交的标记探针借助上游引物-依赖性DNA聚合酶的5’核酸酶活性被切割，来产生表示靶序列存在的信号(美国专利第5,210,015号、第5,538,848号以及第6,326,145号)。TaqManTM探针方法提出用于信号产生的两种接近法：聚合-依赖性切割(polymerization-dependent cleavage)以及聚合-独立性切割(polymerization-independent cleavage)。在聚合-依赖性切割中，上游引物的延长必须在核酸聚合酶与标记谈着的5’-末端接触之前发生。随着延长反应的进行，聚合酶逐渐地切割标记探针的5’-末端。在聚合-独立切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，由此 与靶核酸序列进行杂交，上游引物的3’-末端和核酸聚合酶的结合使上述核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触来放出标记。并且，TaqManTM探针方法公开，通过在其5’-末端部位具有不与靶序列杂交的5’-尾巴区域的标记探针被切割来形成包含5’-尾巴区域的片段。
也有对具有对靶序列非-互补的5’-尾巴区域的探针被5’核酸酶切割，放出包含5’-尾巴区域的片段的几种方法的报告。
例如，美国专利第5,691,142号就公开了对借助DNA聚合酶的5’核酸酶活性来被切割的切割结构。公开中则例示有对包含对模板非-互补的5’部位以及对模板互补的3’部位的寡核苷酸与模板杂交，并且上游寡核苷酸与模板非常邻近而由此与模板进行杂交的切割结构。切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者具有合成活性的变形DNA聚合酶切割，来放出与模板非-互补的5’部位。之后，被放出的5’部位与具有发夹结构的寡核苷酸杂交，形成切割结构。由此，诱导渐进性的切割反应来检测靶序列。
美国专利第7,381,532号则公开了具有3’-末端被阻断的上游寡核苷酸的切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者FEN核酸酶切割，来放出非-互补的5’皮瓣（flap）部位，被放出的5’皮瓣部位借助大小分析或者相互作用性双重标记来被检测的过程。美国专利第6,893,819号则公开了能够检测的被放出的皮瓣借助核酸合成依赖性的、皮瓣-媒介连续性扩增方法而生成的内容。在此方法中，从第一个切割结构放出的皮瓣，以核酸合成依赖性方式切割第二个切割结构来放出皮瓣，并检测被放出的皮瓣。
借助在液相中的荧光-标记探针的杂交，即使利用一种荧光标记也可根据解链曲线分析来同时检测多个靶核酸序列。但是，借助相互作用性-双重标记探针的5’核酸酶-媒介切割来检测靶核酸的以往技术，在多重靶检测中对相异的靶序列需要种类相异的荧光标记。因这种荧光标记的种类数的限度，被检测的靶序列的数量将受限。
美国申请公开号第2008-0241838号中公开了利用在靶核酸序列具有非-互补的5’部位的探针的切割以及捕捉（capture）探针的杂交的靶检测方法。标记位于非-互补的5’部位。杂交于靶序列的表及探针 被切割而放出片段，之后，片段与捕捉探针杂交而检测靶序列的存在。在此方法中，未切割的/完好无损的（uncleaved/intact）探针不与捕捉探针杂交是必须的。为此，需要长度短的捕捉探针在固相基质上实现固定化。但是，这种限制会降低固相基质上的杂交效率，并且使反应条件的最优化变得困难。
因此，对开发以更加便利、具有可靠性以及再现性的方式，不仅借助杂交，还借助5’核酸切割反应（5’nucleolytic reaction）等的酶反应，在液相以及固相中检测靶序列，更为优选地检测多个靶序列的新颖的接近法的要求正在抬头。并且，在本行业正需求一种不受限于标记（尤其，荧光标记）种类的数量的新颖的靶检测方法。
在本说明书全文中参照多个专利及文献，其引用由括号来表示。这样的专利及文献，作为参照全部包括在本说明书中，因此能够更加明确地说明本发明所属的技术领域的水准及本发明的内容。
【发明概述】
本发明者为了开发具有更加得到改善的准确性以及方便性的，尤其以多重方式检测靶序列的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本发明者定立了用于检测靶序列的新颖的方案，这种靶检测是通过探针杂交、酶探针切割、延长以及延长双链体（extendedduplex）的检测来达成的。本发明的方案不仅优秀地适用于固相反应，而且也能够优秀地适用于液相反应，具有更加得到改善的准确性以及方便性，能够检测多个靶序列。
因此，本发明的目的在于，提供利用探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE，PTO Cleavage and Extension）试验，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法。
本发明的再一目的在于，提供用于利用探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE，PTO Cleavage and Extension）试验，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法的试剂盒。
本发明的另一目的及优点，通过所附的权利要求书及附图，以及 下面的详细说明将变得更加明确。
【附图说明】
图1表示利用于PTO切割以及延长试验（PTOCE assay）的探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）以及捕捉和制模寡核苷酸（CTO，Capturingand Templating Oligonucleotide）的图示性结构。优选地，PTO以及CTO的3’-末端因被阻断，因而防止延长。
图2表示包含解链分析的PTOCE试验。CTO在其制模部位具有报道分子以及猝灭分子。
图3表示包含解链分析的PTOCE试验。CTO在其制模部位具有报道分子。上述报道分子被要求，根据存在于单-链形态或者双-链形态来表示出相异的信号强度。
图4表示包含解链分析的PTOCE试验。CTO在其模板部位具有iso-dC残基以及报道分子。猝灭-iso-dGTP在延长反应期间***（incorporated）到延长双链体内。
图5表示包含解链分析的PTOCE试验。PTO在其5’-标记部位具有报道分子，CTO在其制模部位具有iso-dC残基。猝灭-iso-dGTP在延长反应期间***到延长双链体内。
图6表示包含解链分析的PTOCE试验。PTO在其5’-标记部位具有报道分子以及猝灭分子。
图7表示包含解链分析PTOCE试验。PTO在其5’-标记部位具有报道分子。上述报道分子被要求，根据存在于单-链形态或者双-链形态来表示出相异的信号强度。
图8表示包含解链分析的PTOCE试验。PTO在其5’-标记部位具有猝灭分子，CTO在其捕捉部位具有报道分子。
图9表示包含指定温度下的检测的PTOCE试验。CTO在其制模部位具有报道分子以及猝灭分子。CTO通过其3’-末端在固相基质上实现固定化。
图10表示包含指定温度下的检测的PTOCE试验。报道-标记dATP在延长反应期间***到延长双链体内。CTO通过其3’-末端在固相基质上实现固定化。
图11表示包含指定温度下的检测的PTOCE试验。CTO在其制模部位具有iso-dC残基，报道-iso dGTP在延长反应期间***到延长双链体内。CTO通过其3’-末端在固相基质上实现固定化。
图12表示包含指定温度下的检测的PTOCE试验。PTO在其5’-标记部位具有报道分子。CTO通过其5’-末端在固相基质上实现固定化。
图13表示包含利用嵌入标记的指定温度下的检测的PTOCE试验。CTO通过5’-末端在固相基质上实现固定化。
图14表示借助于包含解链分析的PTOCE试验的淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae）基因的检测结果。CTO在其制模部位具有报道分子以及猝灭分子。
图15表示借助于包含解链分析的PTOCE试验的淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae）基因的检测结果。PTO在其5’-末端具有猝灭分子，CTO在其3’-末端具有报道分子。
图16表示延长双链体的Tm值借助CTO序列来得到调节的结果。
图17表示借助于利用PCR扩增的PTOCE试验的淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae）基因的检测结果。CTO在其制模部位具有报道分子以及猝灭分子。图17a表示包含实时PCR检测的PTOCE试验的结果，图17b表示包含后-PCR解链分析的PTOCE试验的结果。
图18表示借助于利用PCR扩增的PTOCE试验的淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae）基因的检测结果。CTO在其5’-末端具有iso-dC残基以及报道分子。猝灭-iso-dGTP在延长反应期间***到延长双链体内。图18a表示包含实时PCR检测的PTOCE试验的结果，图18b表示包含后-PCR解链分析的PTOCE试验的结果。
图19表示借助于利用PCR扩增的PTOCE试验的淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae）基因的检测结果。PTO在其5’-末端具有猝 灭分子，CTO在其3’-末端具有报道分子。图19a表示包含实时PCR检测的PTOCE试验的结果，图19b表示包含后-PCR解链分析的PTOCE试验的结果。
图20表示借助于包含后-PCR解链分析的PTOCE试验的淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoea，NG）基因以及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）基因的同步检测结果。CTO在其制模部位具有报道分子以及猝灭分子。
图21表示借助于包含微阵列中的解链分析的PTOCE试验的淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae）基因的检测结果。CTO通过其5’-末端来实现固定化。PTO在其5’-标记部位具有报道分子。
图22表示在微阵列中借助于包含指定温度下的实时检测的PTOCE试验的淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）基因的检测结果。CTO通过其5’-末端来实现固定化。PTO在其5’-标记部位具有报道分子。
图23表示在微阵列中借助于包含指定温度下的实时检测的PTOCE试验的淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）基因的检测结果。CTO通过其3’-末端来实现固定化，在其制模部位具有报道分子以及猝灭分子。
图24表示在微阵列中借助于包含在指定温度下的终点检测的PTOCE试验的单一或者多个靶检测结果。CTO通过其5’-末端来实现固定化。PTO在其5’-标记部位具有报道分子。淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae，NG）基因以及金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）基因被用作靶核酸序列。
【发明详述】
本发明提供借助探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE，PTO Cleavage andExtension）试验检测靶核酸序列的新颖的方法以及用于借助探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE，PTOCleavage and Extension）试验检测靶核酸序列的试剂盒。
本发明不仅包含杂交反应，还包含随着靶核酸序列的存在而发生的酶反应。
【I.借助于包含解链分析的探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE）的靶检测过程】
根据本发明的一实施方式，本发明提供一种借助PTOCE（PTO切割以及延长）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其包括如下步骤：
步骤（a），将上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；
步骤（b），在用于切割上述PTO的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或者其延长链诱导借助于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段；
步骤（c），将从上述PTO放出的上述片段与捕捉和制模寡核苷酸（CTO，Capturingand Templating Oligonucleotide）进行杂交；上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）制模部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的上述捕捉部位杂交；
步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延长反应；杂交于上述CTO的捕捉部位的上述片段，通过被 延长来形成延长双链体，上述延长双链体具有根据（i）上述片段的序列和/或长度、（ii）上述CTO的序列和/或长度、或者（iii）上述片段的序列和/或长度和上述CTO的序列和/或长度可进行调节的Tm值；
步骤（e），在规定范围的温度下，通过对上述延长双链体进行解链（melting）来提供表示上述延长双链体的存在的靶信号；上述靶信号由（i）与上述片段和/或上述CTO连接的至少一个标记、（ii）在上述延长反应期间***到上述延长双链体内的标记、（iii）在上述延长反应期间与***到上述延长双链体内的标记和上述片段和/或上述CTO连接的标记、或者（iv）嵌入标记来提供；以及
步骤（f），通过测定上述靶信号来检测上述延长双链体；上述延长双链体的存在表示上述靶核酸序列的存在。
本发明者为了开发具有更加得到改善的准确性以及方便性的，尤其以多重方式检测靶序列的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本发明者定立了用于检测靶序列的新颖的方案，这种靶检测是通过探针杂交、酶探针切割、延长以及延长双链体（extendedduplex）的检测来达成的。本发明的方案不仅优秀地适用于固相反应，而且也能够优秀地适用于液相反应，具有更加得到改善的准确性以及方便性，能够检测多个靶序列。
本发明利用以下连续性的结果：探针杂交、探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probingand Tagging Oligonucleotide）的切割以及延长、靶-依赖性延长双链体的形成、以及延长双链体的检测。因此，本发明被命名为探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE，PTOCleavage and Extension）试验。
本发明中，延长双链体的特征在于，具有提供借助解链分析或者在指定温度（predetermined temperature）下的检测来表示延长双链体的存在的信号的标记。并且，延长双链体的特征在于，具有可调节的Tm值，这对多个靶检测或者与非-靶信号进行区分起着重要的作用。
由于延长双链体只在靶核酸存在的情况下生成，因而延长双链体的存在表示靶核酸的存在。
对包含解链分析的探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE，PTO Cleavageand Extension）试验进行更详细的说明，如下：
【步骤（a）：靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO的杂交】
根据本发明，首先将靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）进行杂交。
在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味着所要检测的核酸序列，且，在杂交、退火或者扩增条件下与探针或者引物进行退火或者杂交。
在本说明书中使用的术语“探针（probe）”意味着与靶核酸序列实质上互补的部位或者包含这些部位的单-链核酸分子。
在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链（模板）互补的引物延长产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合剂的存在以及适合的温度与pH的条件下，可起到合成的起始点的作用。
优选地，探针以及引物为单-链脱氧核糖核苷酸分子。在本发明中利用的探针或者引物可包含天然（naturally occurring）脱氧单磷酸核苷（dNMP）（即，脱氧腺苷酸（dAMP）、dGMP（脱氧鸟苷酸）、dCMP（脱氧胞苷酸）及dTMP（脱氧胸苷酸））、变形的核苷酸或者非-天然核苷酸。并且，探针或者引物还可包含核糖核苷酸。
就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在之下引发延长产物的合成。引物的适合的长度取决于包括例如，温度、应用领域及引物的根源（source）的多个因素。在本说明书中使用的术语“退火”或“引发”意味着在模板核酸并置（apposition）寡脱氧核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互补的核酸分子。
在本说明书中使用的术语“杂交（hybridization）”意味着互补的 单链核酸形成双链核酸。在两个核酸链之间的互补性完全匹配（perfect match）时发生杂交，或者即使存在一部分错配（mismatch）碱基也能发生杂交。杂交时所需的互补性的程度可随着杂交条件而不同，尤其是可通过温度来进行调节。
上游寡核苷酸以及PTO与靶核酸序列的杂交可在通常借助最佳化步骤而决定的合适的杂交条件下实施。温度、成分的浓度、杂交及清洗次数、缓冲液成分及它们的pH及离子强度等条件可根据包含寡核苷酸（上游寡核苷酸以及PTO）的长度及糖皮质激素（GC）含量以及靶核苷酸序列等的多种因子而变化。例如，在利用相对短的寡核苷酸的情况下，优选地，选择低的严格条件（stringent condition）。用于杂交的详细条件可以在Joseph Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor5，N.Y.（2001）；及M.L.M.Anderson，Nucleic AcidHybridization，Springer-Verlag New York Inc.N.Y.（1999）确认。
术语“退火”和“杂交”没有区分，在本说明书中混用。
上游寡核苷酸以及PTO具有与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“互补的”意味着在预定的退火条件或者严格条件下引物或者探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补，并包括“实质上互补的（substantiallycomplementary）”及“完全互补的（perfectly complementary）”，优选地意味着完全互补的意思。
PTO的5’-标记部位具有与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。捕捉和制模寡核苷酸（CTO，Capturing and TemplatingOligonucleotide）的制模部位具有与PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“非-互补的”意味着在预定的退火条件或者严格条件下引物或者探针不以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地非-互补，并包括“实质上非互补的（substantially non-complementary）”及“完全非-互补的（perfectly non-complementary）”，优选地意味着完全非-互补的意思。
在本说明书中使用的术语“探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and TaggingOligonucleotide）”意味着寡核苷酸，其包含：（i）3’-靶向部位，其起到探针的作用；以及（ii）5’-标记部位，其具有在与靶核酸序列杂交后被切割，进而从PTO放出，并与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位必须以5’→3’顺序而置。在图1中图示PTO。
优选地，在3’-靶向部位与靶核酸序列杂交，5’-标记部位不与靶核酸序列杂交的严格条件下实施步骤（a）的杂交。
PTO不要求任何特定的长度。例如，PTO的长度可具有15-150核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-150核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-50核苷酸、30-150核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸、30-50核苷酸、35-100核苷酸、35-80核苷酸、35-60核苷酸或者35-50核苷酸的长度。只要PTO的3’-靶向部位与靶核酸序列特异性地杂交，就可以具有任何长度。例如，PTO的3’-靶向部位可具有10-100核苷酸、10-80核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-50核苷酸、20-40核苷酸或者20-30核苷酸的长度。只要5’-标记部位与CTO的制模部位特异性地杂交后被延长，就可以具有任何长度。例如，PTO的5’-标记部位可具有5-50核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或者15-20核苷酸的长度。
PTO的3’-末端还可具有3’-OH末端（terminal）。优选地，PTO的3’-末端被“阻断”，由此防止其延长。
阻断可通过以往方法来达成。例如，阻断可通过在最后核苷酸的3’-羟基上追加如生物素、标记、磷酸盐基、烷基、非-核苷酸连接肽、硫代磷酸酯或者烷烃-二醇残基等的化学组成部分（moiety）来实施。择一性地，阻断可通过去除最后核苷酸的3’-羟基或者利用如双脱氧核 苷酸这种没有3’-羟基的核苷酸来实施。
择一性地，可设计成使PTO具有发夹结构。
PTO的5’-标记部位以及靶核酸序列之间的非-杂交意味着在特定杂交条件下它们之间非-形成稳定的双-链。根据本发明的优选实例，不参与与靶核酸序列的杂交的PTO的5’-标记部位形成单-链。
上游寡核苷酸位于PTO的上游。
并且，与靶核酸序列杂交的上游寡核苷酸或者其延长链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
基于上游寡核苷酸的对PTO切割的诱导可通过两种方式来达成。（i）诱导上游寡核苷酸延长-独立性切割；以及（ii）诱导上游寡核苷酸延长-依赖性切割。
在上游寡核苷酸与PTO相邻近，进而能够充分诱导借助于具有5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割反应的情况下，与上游寡核苷酸结合的上述酶能够无需延长反应而切割PTO。另一方面，在上游寡核苷酸与PTO隔开的情况下，具有聚合酶活性的酶（例如，模板-依赖性聚合酶）能够促进上游寡核苷酸（例如，上游引物）的延长，与延长产物结合的具有5’核酸酶活性的酶切割PTO。
因此，上游寡核苷酸能够以两种方式位于与PTO相对的位置。上游寡核苷酸可位于与PTO邻近的位置，由此以延长-独立性方式能够充分诱导PTO的切割。择一性地，上游寡核苷酸可位于充分能够以延长-依赖性方式诱导PTO切割的与PTO隔开的位置。
在本说明书中揭示方位（positions）或者位置（locations）而使用的术语“邻近的（adjacent）”意味着上游寡核苷酸紧位于与PTO的3’-靶向部位相近的位置形成缺口（nick）。并且，上述术语意味着上游寡核苷酸位于从PTO的3’-靶向部位隔开1-30核苷酸、1-20核苷酸或者1-15核苷酸的位置。
在本说明书中揭示方位或者位置而使用的术语“隔开（distant）”包含能够充分产生延长反应的某种位置或者场所。
根据本发明的优选实例，上游寡核苷酸可位于从PTO隔开的位 置，由此以延长-依赖性方式能够充分诱导PTO的切割。
根据本发明的优选实例，上游寡核苷酸为上游引物或者上游探针。上游引物适合诱导延长-独立性切割或者延长-依赖性切割，上游探针适合诱导延长-独立性切割。
选择性地，上游寡核苷酸可具有与PTO的3’-靶向部位的5’-一部分部分重叠的序列（partial-overlapped sequence）。优选地，重叠的序列为1-10核苷酸长度、更优选为1-5核苷酸长度、进而优选为1-3核苷酸长度。在上游寡核苷酸具有与PTO的3’-靶向部位的5’-一部分部分重叠的序列（partial-overlapped sequence）的情况下，在步骤（b）的切割反应中，3’-靶向部位将与5’-标记部位一起被部分切割。并且，重叠的序列能够使3’-靶向部位中所需的特定部位被切割。
根据本发明的优选实例，上游引物通过其延长链来诱导借助于具有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
只要上游寡核苷酸能够诱导与靶核酸序列杂交的PTO的切割，使得包含PTO的5’-标记部位或者PTO的5’-标记部位的一部分的片段被放出，与借助于上游寡核苷酸的切割反应相关的以往技术就能够适用于本发明。例如，美国专利第5,210,015号、第5,487,972号、第5,691,142号、第5,994,069号、第7,381,532号以及美国申请公开号第2008-0241838号就能够应用于本发明。
根据本发明的优选实例，上述方法在存在下游引物的情况下实施。下游引物能够使与PTO杂交的靶核酸序列追加生成，并能够提高靶检测的灵敏度。
根据本发明的优选实例，在利用上游引物以及下游引物的情况下，为了引物的延长可追加使用模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的优选实例，上游寡核苷酸（上游引物或者上游探针）、下游引物和/或PTO的5’-标记部位具有由本发明者开发的双重引发寡核苷酸（DPO）结构。具有DPO结构的寡核苷酸与以往引物以及探针相比表现出相当得到改善的靶特异度（参照WO2006/095981;Chun等,Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection ofrespiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19gene,Nucleic Acid Research,35:6e40（2007））。
根据本发明的优选实例，PTO的3’-靶向部位具有由本发明者开发的变形双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构。变形双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构与以往的探针相比表现出相当得到改善的靶特异性（参照WO2011/028041）。
【步骤（b）：从PTO放出片段】
接着，在用于切割PTO的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触。与靶核酸序列杂交的PTO被具有5’核酸酶活性的酶切割，因而放出包含PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段。
在本说明书中使用的术语“用于切割PTO的条件”意味着借助具有5’核酸酶活性的酶产生对与靶核酸序列杂交的PTO的切割的充分的条件，例如，温度、pH、离子强度及缓冲液、寡核苷酸的长度及序列和酶。例如，在利用作为具有5’核酸酶活性的酶的Taq DNA聚合酶的情况下，用于切割PTO的条件包含Tris-HCl缓冲液、氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl2）以及温度。
在PTO与靶核酸序列杂交的情况下，虽然3’-靶向部位进行杂交，但是其5’-标记部位则不与靶核酸序列杂交而形成单-链（参照图2）。像这样，将单-链以及双-链结构都包含在内的寡核苷酸可借助在本领域被告知的多种技术，利用具有5’核酸酶活性的酶来切割。
PTO的切割位置根据上游寡核苷酸（上游探针或者上游引物）的种类、上游寡核苷酸的杂交位置以及切割条件会不同（美国专利第5,210,015号、第5,487,972号、第5,691,142号、第5,994,069号以及第7,381,532号或者美国申请公开号第2008-0241838号）。
为了PTO的切割反应可利用多个以往技术，会放出包含5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段。
综合来看，在步骤（b）的切割反应中可有三种切割位置。第一切割位置为PTO的杂交部位（3’-靶向部位）以及非-杂交部位（5’-标 记部位）之间的连接位置（junctionsite）。第二切割位置为从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开一部分核苷酸的位置。第三切割位置为从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着5’-方向隔开一部分核苷酸的位置。
根据本发明的优选实例，上游引物被延长的同时借助具有5’核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶而开始切割PTO的位置是PTO及靶核酸序列之间的双链开始的地点或者从其开始的地点隔开1-3核苷酸的位置。
因此，在本说明书中揭示借助于具有5’核酸酶活性的酶的对PTO的切割而使用的术语“包含PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段”意味着包含（i）5’-标记部位、（ii）5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分、以及（iii）5’-标记部位的一部分。并且，在本发明中，术语“包含PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段”表现为“PTO片段”。
在本说明书中揭示如同PTO的5’-标记部位的一部分、PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分以及CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分的PTO或者CTO而使用的术语“一部分（part）”意味着由1-40、1-30、1-20、1-15、1-10或者1-5核苷酸构成的核苷酸序列，优选为1核苷酸、2核苷酸、3核苷酸或者4核苷酸。
根据本说明书的优选实例，具有5’核酸酶活性的酶为具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者FEN核酸酶，更优选为具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶或者FEN核酸酶。
适合于本发明的具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶为从多种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包含Thermus aquaticus（Taq）、Thermus thermophilus（Tth）、Thermusfiliformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermusscotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Thermococcus litoralis、Thermococcus barossi、Thermococcusgorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus woesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictiumoccultum、Aquifex pyrophilus以及Aquifex aeolieus。最优选地，热稳定性DNA聚合酶为Taq聚合酶。
择一性地，本发明可使用变形为少具有聚合酶活性的、具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。
所使用的皮瓣内切核酸酶（FEN，flap endonuclease）为5’皮瓣-特异性核酸酶（5’flap-specific nuclease）。
适合于本发明的FEN核酸酶包含从多种细菌种得到的FEN核酸酶，其包含Sulfolobus solfataricus、Pyrobaculum aerophilum、Thermococcus litoralis、Archaeaglobus veneficus、Archaeaglobus profundus、Acidianus brierlyi、Acidianusambivalens、Desulfurococcus amylolyticus、Desulfurococcus mobilis、Pyrodictiumbrockii、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus zilligii、Methanopyrus kandleri、Methanococcus igneus、Pyrococcus horikoshii、Aeropyrum pernix以及Archaeaglobusveneficus。
优选地，在步骤（a）中利用上游引物的情况下，用于切割PTO的条件包含上游引物的延长反应。
根据本发明的优选实例，在步骤（a）中利用上游引物，为了使上述上游引物延长而利用模板-依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶为与具有5’核酸酶活性的酶相同的酶。
选择性地，在步骤（a）中利用上游引物，为了使上述上游引物延长而利用模板依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶为与具有5’核酸酶活性的酶相异的酶。
【步骤（c）：从PTO放出的片段与CTO的杂交】
从PTO放出的片段与CTO（Capturing and Templating Oligonucleotide）杂交。
CTO沿着3’→5’方向包含（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）制模部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。
CTO起到用于延长从PTO放出的片段的模板的作用。起到引物作用的上述片段与CTO杂交，通过被延长来形成双链体。
只要制模部位具有与PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的序列，就可以包含任何序列。并且，只要制模部位能够起到用于延长从PTO放出的片段的模板的作用，就可以包含任何序列。
如上所述，优选地，在放出具有PTO的5’-标记部位的片段的情况下，CTO的捕捉部位应被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列。优选地，在放出具有5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分的片段的情况下，CTO的捕捉部位应被设计成包含与5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的核苷酸序列。优选地，在放出具有PTO的5’-标记部位的一部分的片段的情况下，CTO的捕捉部位应被设计成具有与5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列。
另一方面，可通过预想PTO的切割位置来设计CTO的捕捉部位。例如，在CTO的捕捉部位被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列的情况下，具有5’-标记部位的一部分的片段或者具有5’-标记部位的片段可与捕捉部位杂交，之后将被延长。在放出包含5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分的片段的情况下，上述片段可能与被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列的CTO的捕捉部位杂交，即使在上述片段的3’-末端部位存在错配核苷酸，也能够成功地被延长。这是由于即使引物的3’-末端包含一部分错配核苷酸（例如，1-3错配核苷酸），引物也能够根据反应条件而被延长的原因。
在放出包含5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分的片段的情况下，通过将CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分设计成具有 与上述被切割的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的核苷酸序列，就能够解决与错配核苷酸相关的问题（参照图1）。
优选地，对与被切割的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分的核苷酸序列，可根据PTO的3’-靶向部位上的预想到的切割位置来选择。优选地，与被切割的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分的核苷酸序列为1-10核苷酸，更优选为1-5核苷酸，进而优选为1-3核苷酸。
CTO的3’-末端可包含不包含于与片段的杂交的追加的核苷酸。并且，只要CTO与上述片段稳定地杂交，CTO的捕捉部位就能够包含仅仅与上述片段的一部分（例如，包含片段的3’-末端部位的片段的一部分）互补的核苷酸序列。
对在本说明书中使用的术语“包含与5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补核苷酸序列的捕捉部位”，如同上述，将包含CTO的捕捉部位的多种设计以及结构来进行说明。
CTO可被设计成具有发夹结构。
CTO的长度可以是多种的。例如，CTO具有7-1000核苷酸、7-500核苷酸、7-300核苷酸、7-100核苷酸、7-80核苷酸、7-60核苷酸、7-40核苷酸、15-1000核苷酸、15-500核苷酸、15-300核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-1000核苷酸、20-500核苷酸、20-300核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-40核苷酸、30-1000核苷酸、30-500核苷酸、30-300核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸或者30-40核苷酸的长度。只要与从PTO放出的片段特异性地杂交，CTO的捕捉部位就可以具有任何长度。例如，CTO的捕捉部位可以具有5-100核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-100核苷酸、10-60核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-100核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或者15-20核苷酸的长度。并且，只要CTO的制模部位在从PTO放出的片段的延长反 应中起到模板作用，CTO的制模部位就可以具有任何长度。例如，CTO的制模部位可以具有2-900核苷酸、2-400核苷酸、2-300核苷酸、2-100核苷酸、2-80核苷酸、2-60核苷酸、2-40核苷酸、2-20核苷酸、5-900核苷酸、5-400核苷酸、5-300核苷酸、5-100核苷酸、5-80核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、10-900核苷酸、10-400核苷酸、10-300核苷酸、15-900核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸或者15-20核苷酸的长度。
CTO的3’-末端可以具有3’-OH末端。优选地，CTO的3’-末端被阻断成防止其延长。通过以往方法就能够达到阻断CTO的非-延长。例如，可以通过在CTO的最后核苷酸的3’-羟基追加如生物素、标记、磷酸基、烷基、非-核苷酸连接肽、磷硫酰或者烷烃-二醇残基等的化学性的部分（moiety）来实施阻断。择一性地，阻断可通过去除最后核苷酸的3’-羟基或者利用如双脱氧核苷酸这种没有3’-羟基的核苷酸来实施。
从PTO放出的片段与CTO杂交，提供适合于片段的延长的形态。并且，即使非切割PTO通过其5’-标记部位来与CTO的捕捉部位杂交，由于PTO的3’-靶向部位不会与CTO杂交，因而防止延长双链体的形成。
参照对步骤（a）中的杂交的说明，就能够更详细地说明步骤（c）中的杂交。
【步骤（d）：片段的延长】
利用模板-依赖性核酸聚合酶以及步骤（c）的结果物来实施延长反应。与CTO的捕捉部位杂交的片段，通过被延长来形成延长双链体。相反，与CTO的捕捉部位杂交的非切割PTO则不被延长也不会因此而形成延长双链体。
在本说明中使用的术语“延长双链体”意味着借助将模板-依赖性核酸聚合酶和CTO制模部位利用为模板使与CTO的捕捉部位杂交的片段被延长的延长反应而形成的双链体。
延长双链体具有与非切割PTO以及CTO之间的杂交物（hybrid） 的Tm值相异的Tm值。
优选地，延长双链体具有高于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的Tm值的Tm值。
延长双链体的Tm值可根据（i）片段的序列和/或长度、（ii）CTO的序列和/或长度、（iii）片段的序列和/或长度和CTO的序列和/或长度来调节。
本发明的一大特征在于，使用延长双链体的可调节的Tm值，以借助步骤（e）中的延长双链体的解链来提供表示延长双链体的存在的靶信号。
在本说明书中使用的术语“Tm”意味着双链核酸分子群（population）的一半被解离为单-链分子的解链温度。Tm值是根据杂交的核苷酸的长度以及G/C含量来决定的。Tm值可以通过如Wallace rule（R.B.Wallace等,Nucleic Acids Research,6:3543-3547（1979））以及nearest-neighbor方法（SantaLucia J.Jr.等,Biochemistry,35:3555–3562（1996））;Sugimoto N.等，Nucleic AcidsRes.,24:4501-4505（1996））等的以往的方法来计算。
根据本发明的优选实例，Tm值意味着在实际使用的反应条件下的实际Tm值。
在步骤（d）中使用的模板-依赖性核酸聚合酶包含任何核酸聚合酶，例如，E.coliDNA聚合酶I的“克列诺（Klenow）”片段、热稳定性DNA聚合酶以及噬菌体T7DNA聚合酶。优选地，聚合酶是能够从多种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包含Thermusaquaticus（Taq）、Thermus thermophilus（Tth）、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermuschliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermusoshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps17、Thermus thermophilus、Thermotogamaritima、Thermotoga neapolitana、 Thermosipho africanus、Thermococcuslitoralis、Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus furiosus （Pfu）、Pyrococcus woesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictiumoccultum、Aquifex pyrophilus以及Aquifex aeolieus。最为优选地，模板-依赖性核酸聚合酶为Taq聚合酶。
根据本发明的优选实例，在步骤（b）中利用的具有5’核酸酶活性的酶与在步骤（d）中利用的模板-依赖性核酸聚合酶是相同的。更为优选地，在步骤（b）中利用的具有5’核酸酶活性的酶、为了使上游引物延长而利用的模板-依赖性核酸聚合酶以及在步骤（d）中利用的模板-依赖性核酸聚合酶是相同的。
延长双链体具有（i）与PTO片段和/或CTO连接的至少一个标记、ii）在延长反应期间***到延长双链体内的标记、（iii）在延长反应期间***到延长双链体内的标记以及与PTO片段及/或者CTO连接的标记、或者（iv）来源于嵌入标记（intercalating label）的标记。
在靶核酸序列存在的情况下，由于形成延长双链体，因而延长双链体的存在就能够表示靶核酸序列的存在。为了以直接的方式检测延长双链体的存在，在步骤（d）中形成具有提供可检测的信号的标记的延长双链体。利用于延长双链体的标记根据延长双链体是否为双链还是单链，来提供信号的变化，最终借助延长双链体的解链来提供表示延长双链体的存在的靶信号。
【步骤（e）：延长双链体的解链】
在延长反应之后，通过延长双链体在规定范围的温度下被解链来提供表示延长双链体的存在的靶信号。
靶信号由（i）与上述片段和/或上述CTO连接的至少一个标记、（ii）在上述延长反应期间***到上述延长双链体内的标记、（iii）在上述延长反应期间***到上述延长双链体内的标记和上述片段和/或上述CTO连接的标记、或者（iv）嵌入标记（intercalatinglabel）来提供。
在本说明书中使用的术语“靶信号”意味着能够表示延长双链体的存在的所有信号。例如，靶信号包含来自标记的信号（信号的产生或者消灭）、来自标记的信号的变化（信号的增加或者减少）、解链曲线、解链模式以及解链温度（或者Tm值）。
根据本发明的优选实例，靶信号是指在解链步骤中从延长双链体的标记发出的信号的变化。可通过在两个相异的温度下测定信号来得到信号的变化。择一性地，靶信号是通过在规定温度范围内测定从延长双链体的标记发出的信号而得到的解链曲线、解链方式以及解链温度（或者Tm值）。优选地，温度范围为用于分析解链曲线的温度范围或者是延长双链体的Tm值的周围温度。
延长双链体具有高于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的Tm值。因此，延长双链体以及杂交物表示出相异的解链模式。这种相异的解链模式使非-靶信号与靶信号产生区别。相异的解链模式或者解链温度会使靶信号与合适的标记***一同产生。
解链可通过以往技术来实施，例如，包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙醇酸处理、酶方法（例如，解旋酶反应）以及结合蛋白质，但并不局限于此。例如，解链可以通过以80-105℃的温度进行热处理来达成。进行上述处理的一般的方法提供在Joseph Sambrook,等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（2001）。
在本发明中使用的合适的标记***在其种类、位置以及信号产生方式等方面是多样的。
对有用于本发明的标记***，可以如下进行详细说明。
【（i）与片段和/或CTO连接的标记】
根据本发明的优选实例，上述信号由与片段和/或CTO连接的至少一个的标记来提供。由于延长双链体形成在PTO片段以及CTO之间，因而PTO片段或者CTO的标记存在于延长双链体，在解链步骤提供靶信号。
标记包含相互作用性双重标记以及单一标记。
【（i-1）相互作用性双重标记】
上述相互作用性标记***为能量非-放射性地（non-radioacively）传达到供体分子及受体分子之间的信号产生***。作为相互作用性标记***的代表性例子，荧光共振能量转移技术（FRET，fluorescence resonance energy transfer）标记***包含荧光报道分子（供体分子）及猝灭分子（受体分子）。在荧光共振能量转移技术中，能量供体为荧光性，但是，能量受体可以是荧光性或者非-荧光性。在相互作用性标记***的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，为发色团（chromophore），能量受体为荧光性。在相互作用性标记***的另一形态中，能量供体为发光性（luminescent），例如，生物发光性、化学发光性或者电化学发光性，受体为荧光性。供体分子以及受体分子在本说明书中可分别被说明为报道分子以及猝灭分子。
优选地，表示延长双链体的存在（即，靶核酸序列的存在）的信号借助相互作用性标记来产生，更优选为荧光共振能量转移（FRET）标记***（即，相互作用性双重标记***）。
【实例1（链内相互作用性-双重标记）】
在相互作用性双重标记***的实例1中，片段或者CTO具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；在上述步骤（e）中的延长双链体的解链诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来在步骤（e）中提供靶信号。在图2、图6以及图9中图示相互作用性双重标记***的实例1。实例1被命名为链内相互作用性-双重标记。
【图2中的实例1（链内相互作用性-双重标记）】
所例示的实例可通过参考图2来说明。CTO的制模部位具有报道分子以及猝灭分子。与靶核酸序列杂交的PTO通过被切割来放出片段，上述片段与CTO的捕捉部位杂交并被延长而形成延长双链体。
在步骤（d）中形成延长双链体的情况下，CTO的报道分子以及猝灭分子结构性地（conformationally）隔开，猝灭分子不猝灭来自报道分子的信号；在步骤（e）中延长双链体被解链的情况下，报道分子以及猝灭分子结构性地相邻近，猝灭分子猝灭来自报道分子的信号， 由此提供靶信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
在本说明书中使用的“报道分子以及猝灭分子结构性地相邻近”的表现意味着报道分子以及猝灭分子借助片段或者CTO的形态性结构，例如随机大肠杆菌（coli）以及发夹结构来三维地相邻近。
在本说明书中使用的“报道分子以及猝灭分子结构性地隔开”意味着报道分子以及猝灭分子通过借助于双链的形成的片段或者CTO的形态性结构的变化来三维地隔开。
优选地，在步骤（e）中所提供的靶信号包含通过测定步骤（d）中所产生的荧光信号的变化来得到的解链曲线、解链模式或者Tm值。
根据本发明的优选实例，只要来自报道分子的信号依赖性地通过延长双链体的解链来被猝灭或者不猝灭，报道分子以及猝灭分子就能够位于CTO的任何位置。
根据本发明的优选实例，报道分子以及猝灭分子都与CTO的制模部位或者捕捉部位相连接。
根据本发明的优选实例，报道分子以及猝灭分子位于CTO的5’-末端以及3’-末端。
根据本发明的优选实例，CTO的报道分子以及猝灭分子中的一个位于其5’-末端或者从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，剩余的一个根据CTO的形态位于猝灭或者不猝灭来自报道分子的信号的位置。
根据本发明的优选实例，CTO的报道分子以及猝灭分子中的一个位于其3’-末端或者从其3’-末端隔开1-5核苷酸的位置，剩余的一个根据CTO的形态（conformation）位于猝灭或者不猝灭来自报道分子的信号的位置。
根据本发明的优选实例，报道分子以及猝灭分子位于相互隔开最大80核苷酸的位置，更优选为最大60核苷酸，进而优选为最大30核苷酸，最优选为最大25核苷酸。根据本发明的优选实例，报道分子以及猝灭分子位于相互隔开最小4核苷酸的位置，更为优选为最小6核苷酸，进而优选为最小10核苷酸，最优选为最小15核苷酸。
在本发明中，可形成非切割PTO以及CTO之间的杂交物。
如图2所示，在CTO的制模部位被标记为相互作用性双重标记的情况下，非切割PTO以及CTO之间的杂交物的来自标记的信号的变化将不会被诱导。因此杂交物将不会提供非-靶信号。
在CTO的捕捉部位被标记为相互作用性双重标记的情况下，非切割PTO以及CTO之间的杂交物在解链步骤中提供非-靶信号。在这种情况下，可根据延长双链体以及杂交物的Tm值的差异来区分延长双链体的靶信号和杂交物的非-靶信号。
【图6中的实例1（链内相互作用性-双重标记）】
所例示的实例可通过参考图6来说明。PTO的5’-标记部位具有报道分子以及猝灭分子。与靶核酸序列杂交的PTO通过被切割来放出包含具有报道分子以及猝灭分子的5’-标记部位的片段。上述片段与CTO的捕捉部位杂交。
在步骤（d）中形成延长双链体的情况下，片段的报道分子以及猝灭分子结构性地隔开，猝灭分子不猝灭来自报道分子的信号；在步骤（e）中延长双链体被解链的情况下，报道分子以及猝灭分子结构性地互相邻近，猝灭分子猝灭来自报道分子的信号，由此提供靶信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
根据本发明的优选实例，只要根据延长双链体的解链来自报道分子的信号被猝灭或者不被猝灭，报道分子以及猝灭分子就能够位于片段的任何位置。
根据本发明的优选实例，片段的报道分子以及猝灭分子中的一个位于其5’-末端或者从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，剩余的一个根据片段的形态（conformation）位于猝灭或者不猝灭来自报道分子的信号的位置。
根据本发明的优选实例，报道分子以及猝灭分子位于相互隔开最大50核苷酸的位置，更优选为最大40核苷酸，进而优选为最大30核苷酸，最优选为最大20核苷酸。根据本发明的优选实例，报道分子以及猝灭分子位于相互隔开最小4核苷酸的位置，更优选为最小6核苷酸，进而优选为最小10核苷酸，最优选为最小15核苷酸。
如图6所示，非切割PTO以及CTO之间的杂交物在解链步骤中提供非-靶信号。在这种情况下，可根据延长双链体以及杂交物的Tm值的差异来区分延长双链体的靶信号和杂交物的非-靶信号。
【实例2（链之间的相互作用性-双重标记）】
在相互作用性标记***的实例2中，片段具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，CTO则具有相互作用性双重标记的剩余的一个；在上述步骤（e）中的延长双链体的解链诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来在步骤（e）中提供靶信号。
所例示的实例可通过参考图8来说明。
在步骤（d）中形成延长双链体的情况下，借助与PTO连接的猝灭分子来猝灭来自与CTO连接的报道分子的信号。在步骤（e）中延长双链体被解链的情况下，报道分子以及猝灭分子互相隔开，猝灭分子不猝灭来自报道分子的信号，由此提供靶信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
优选地，在步骤（e）中所提供的靶信号包含通过测定来自相互作用性双重标记的荧光信号的变化来得到的解链曲线、解链模式或者Tm值。
只要借助延长双链体的猝灭分子猝灭来自报道分子的信号，报道分子以及猝灭分子就能够位于PTO片段以及CTO的任何位置。
根据本发明的优选实例，PTO的报道分子或者猝灭分子位于5’-标记部位的5’-末端。
根据本发明的优选实例，CTO的报道分子或者猝灭分子位于其3’-末端。
如图8所示，非切割PTO以及CTO之间的杂交物在解链步骤中提供非-靶信号。在这种情况下，可根据延长双链体以及杂交物的Tm值的差异来区分延长双链体的靶信号和杂交物的非-靶信号。
有用于本发明的报道分子以及猝灭分子，可包含本发明所属技术领域公知的任何分子。其例将如下：Cy2TM（506）、YO-PROTM-1（509）、YOYOTM-1（509）、Calcein（517）、FITC（518）,FluorXTM（519）、 AlexaTM（520）、Rhodamine110（520）、Oregon GreenTM500（522）、Oregon GreenTM488（524）、RiboGreenTM（525）、Rhodamine GreenTM（527）、Rhodamine123（529）、Magnesium GreenTM（531）、Calcium GreenTM（533）、TO-PROTM-1（533）、TOTO1（533）、JOE（548）、BODIPY530/550（550）、Dil（565）、BODIPY TMR（568）、BODIPY558/568（568）、BODIPY564/570（570）、Cy3TM（570）、AlexaTM546（570）、TRITC（572）、Magnesium OrangeTM（575）、Phycoerythrin R&B（575）、Rhodamine Phalloidin（575）、Calcium OrangeTM（576）、Pyronin Y（580）、Rhodamine B（580）、TAMRA（582）、Rhodamine RedTM（590）、Cy3.5TM（596）、ROX（608）、Calcium CrimsonTM（615）、AlexaTM594（615）、Texas Red（615）、Nile Red（628）、YO-PROTM-3（631）、YOYOTM-3（631）、Rphycocyanin（642）、C-Phycocyanin（648）、TO-PROTM-3（660）、TOTO3（660）、DiD DilC（5）（665）、Cy5TM（670）、Thiadicarbocyanine（671）、Cy5.5（694）、HEX（556）、TET（536）、Biosearch Blue（447）、CAL Fluor Gold540（544）、CAL FluorOrange560（559）、CAL Fluor Red590（591）、CALFluor Red610（610）、CAL Fluor Red635（637）、FAM（520）、Fluorescein（520）、Fluorescein-C3（520）、Pulsar650（566）、Quasar570（667）、Quasar670（705）以及Quasar705（610）。括号内的数字为以纳米为单位表示的最大的发光波长。优选地，报道分子以及猝灭分子包含JOE、FAM、TAMRA、ROX以及以荧光素为基础的标记。
适合的一对报道分子-猝灭分子公开在许多文献中：Pesce等,editors,Fluorescence Spectroscopy（Marcel Dekker,New York,1971）;White等,FluorescenceAnalysis:A Practical Approach （Marcel Dekker,New York,1970）;Berlman,Handbookof Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2nd Edition（Academic Press,NewYork,1971）;Griffiths,Color AND Constitution of Organic Molecules（AcademicPress,New York,1976）;Bishop,editor,Indicators（Pergamon Press,Oxford,1972）;Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals （MolecularProbes,Eugene,1992）;Pringsheim,Fluorescence and Phosphorescence（IntersciencePublishers,New York,1949）;Haugland,R.P.,Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals,6th Edition（Molecular Probes,Eugene,Oreg.,1996）;美国专利第3,996,345号以及第4,351,760号。
在本发明中，值得关注的是可以利用能够对广范围波长或者特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光黑猝灭分子。非-荧光黑猝灭分子的例子为黑洞猝灭剂（BHQ：black holequencher）以及4-[4-（二甲基氨基）苯偶氮]苯甲酸（DABCYL：4-[4-（Dimethylamino）phenylazo]benzoic acid）。
在适用于CTO的荧光共振能量转移（FRET）标记中，报道分子包含荧光共振能量转移（FRET）的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移（FRET）的剩余伙伴（受体）。例如，荧光素染料（fluorescein dye）被利用为报道分子，罗丹明染料（rhodamine dye）被利用为猝灭分子。
【（i-2）单一标记】
并且，本发明通过利用提供用于表示靶核酸序列的存在的信号的单一标记***来优秀地实施。
根据本发明的优选实例，片段或者CTO具有单一标记，步骤（e）中的延长双链体的解链，诱导来自单一标记的信号的变化来在步骤（e）中提供靶信号。
【图3中的实例1（单一标记***）】
所例示的实例可通过参考图3来说明。CTO的制模部位具有单一荧光标记。与靶核酸序列杂交的PTO通过被切割来放出片段。上述片段与CTO的捕捉部位杂交并被延长而形成延长双链体。借助延长双链体的形成，从单一荧光标记发出的荧光的强度被增加。在延长双链体在步骤（e）中被解链的情况下，从单一荧光标记发出的荧光的强度被减少，由此提供靶信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
根据本发明的优选实例，只要根据延长双链体的解链，来自单一标记的信号的水平有变化，单一标记就能够位于CTO的任何位置。
根据本发明的优选实例，单一标记与CTO的制模部位或者捕捉部位相连接。
如图3所示，在CTO的制模部位被标记为单一标记的情况下，从非切割PTO以及CTO之间的杂交物的标记发出的信号的变化将不会被诱导。因此，杂交物将不会提供非-靶信号。
在CTO的捕捉部位被标记为单一标记的情况下，非切割PTO以及CTO之间的杂交物在解链步骤中提供非-靶信号。在这种情况下，可根据延长双链体以及杂交物的Tm值的差异来区分延长双链体的靶信号和杂交物的非-靶信号。
【图7中的实例2（单一标记***）】
所例示的实例可通过参考图7来说明。PTO的5’-标记部位具有荧光标记。与靶核酸序列杂交的PTO通过被切割来放出包含具有单一荧光标记的5’-标记部位的片段。通过杂交，从5’-标记部位的单一荧光标记发出的荧光强度被增加。延长双链体在步骤（e）中被解链的情况下，从单一荧光标记发出的信号强度被减少，由此提供靶信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
根据本发明的优选实例，只要根据延长双链体的解链，来自单一标记的信号的水平有变化，单一标记就能够位于PTO片段的任何位置。
如图7所示，非切割PTO以及CTO之间的杂交物在解链步骤中提供非-发信号。在这种情况下，可根据延长双链体以及杂交物的Tm值的差异来区分延长双链体的靶信号和杂交物的非-靶信号。
在本说明书中使用的单一标记应根据存在于双链或者单链来能够提供相异的信号。单一标记包含荧光标记、发光标记、化学发光标记、电化学标记以及金属标记。优选地，单一标记包含荧光标记。
在本发明中使用的单一荧光标记的种类以及优选的结合位置公开于美国专利第7,537,886号以及第7,348,141号中，所教示的事项将作为参照包含于本说明书。优选地，单一荧光标记包含JOE、FAM、TAMRA、ROX以及以荧光素为基础的标记。被标记的核苷酸的残基比位于5’-末端或者3’-末端，更优选地位于寡核苷酸内的内部核苷酸残基。
对在本发明中有用的单一荧光标记，可参照上述叙述的对报道以及猝灭分子的说明来进行说明。
特别是，在固相中利用单一标记来实施本发明的情况下，可利用一般的荧光标记，并不需要根据存在于双链或者单链来能够提供具有相异的强度的荧光信号的特定的荧光标记。在固相基质中提供的靶信号将被测定。在图12中图示使用固定化的CTO的单一标记***的实例。
在利用于固相基质上实现固定化的CTO的情况下，可利用化学标记（例如，生物素）或者酶标记（例如碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶）。
在利用“与片段和/或CTO连接的标记”的标记***中，在形成非切割PTO以及上述CTO之间的杂交物的情况下，标记将位于上述杂交物在步骤（e）中不提供非-靶信号的范围内。择一性地，在形成非切割PTO以及上述CTO之间的杂交物的情况下，标记能够位于上述杂交物在步骤（e）中提供非-靶信号的范围内；上述延长双链体的Tm值高于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的Tm值。
尤其，在非切割PTO以及CTO之间的杂交物位于不提供非-靶信号的范围内的情况下，包含上述杂交物的Tm值的区间可被利用于选择用于检测靶核酸序列的延长双链体的Tm值。
【（ii）***到延长双链体内的标记】
本发明为了提供用于表示延长双链体的存在的靶信号，可利用在延长反应期间***到延长双链体内的标记。
即使PTO片段或者CTO不具有标记，利用在延长反应期间*** 到延长双链体内的标记就能够成功地标记延长双链体。在图10以及图11中图示单一-标记核苷酸在延长反应期间***到延长双链体内的实例（参照图10以及图11的C及D）。并且，本实例还能够适用于利用解链分析的其他实例。
根据本发明的优选实例，靶信号由在延长反应期间***到延长双链体内的单一标记来提供；上述***的单一标记与在延长反应期间***的核苷酸相连接；步骤（e）中的上述延长双链体的解链，诱导来自单一标记的信号的变化来在步骤（e）中提供靶信号。
所例示的实例可通过参考图10来说明。与靶核酸序列杂交的PTO通过被切割来放出片段。上述片段与在固相基质上实现固定化的CTO的捕捉部位杂交，在由单一荧光标记来标记的核苷酸存在的情况下被延长而形成延长双链体。来自延长双链体的荧光信号能够从CTO实现固定化的固相基质的点上检测。在延长双链体被解链的情况下，放出具有荧光标记的链，从而在点上不再检测荧光信号（图10中未表示）。因而，能够借助延长双链体的解链在点上提供信号的变化。即，提供靶信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
在步骤（e）中提供的靶信号包含在CTO-固定化点上通过测定荧光强度的变化来得到的解链曲线、解链模式、或者Tm值。
根据本发明的优选实例，如图11所示，在延长反应期间***的核苷酸具有第一非-天然碱基（non-natural base），CTO具有对上述第一非-天然碱基有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基。优选地，具有第二非-天然碱基的核苷酸位于CTO的制模部位的任何位置。
在本说明书中使用的术语“非-天然碱基”意味着能够形成氢键碱基对的如同腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）以及尿嘧啶（U）的天然碱基。在本说明书中使用的术语“非-天然碱基”包含作为母体化合物（mother compound）具有与天然碱基相异的碱基对模式的碱基，例如，记载于美国专利第5,432,272号、第5,965,364号、第6,001,983号以及第6,037,120号。非-天然碱基之间的碱基对，与天然碱基类似地包含两个或者三个的氢键。并且，非-天然碱基之间 的碱基对也能够以特定的方式形成。
非-天然碱基的特定的例可包括以下碱基的碱基对组合：iso-C/iso-G、iso-dC/iso-dG、K/X、H/J以及M/N（参照美国专利第7,422,850号）。
所例示的实例可通过参考图11来说明。片段与包含核苷酸的CTO杂交，该核苷酸具有对第一非-天然碱基（例如，iso-dG）有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基（例如，iso-dC）。通过在具有由单一荧光标记来标记的第一非-天然碱基的核苷酸存在的情况下，实施延长来形成延长双链体。在延长反应中，具有第一非-天然碱基的核苷酸被***到具有第二非-天然碱基的核苷酸的对面位置。
从延长双链体发出的荧光信号能够在有固定化的CTO的固相基质的点上被检测。在延长双链体被解链的情况下，放出具有荧光标记的链，从而在点上不再检测荧光信号（图11中未表示）。因而，借助延长双链体的解链能够在点上提供信号的变化。即，提供信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
利用在延长反应期间***到延长双链体内的标记的情况下，由于杂交物不被延长，因而标记不被包含于非切割PTO以及CTO之间的杂交物内。因此，杂交物不提供非-靶信号。
所使用的单一标记的种类以及特征可参照在本说明书中所述的对利用“与片段和/或CTO连接的标记”的标记***的说明来进行说明。
【（iii）***到延长双链体内的标记和与片段或者CTO连接的标记】
如图4以及图5所示，本发明可利用标记***，该标记***利用了在延长反应期间***到延长双链体内的标记和与片段和/或CTO连接的标记的组合。
根据本发明的优选实例，靶信号由在延长反应期间***到延长双链体内的标记和与片段和/或CTO连接的标记来提供，***的标记与在上述延长反应期间***的核苷酸连接；上述两个标记为报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；上述步骤（e）中的延长双链体的 解链，诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供步骤（e）中的靶信号。
更为优选地，在延长反应期间***的核苷酸具有第一非-天然碱基，CTO具有对第一非-天然碱基有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基。
所例示的实例可通过参考图4来说明。片段与包含核苷酸的CTO杂交，该核苷酸具有对报道或者猝灭分子以及第一非-天然碱基（例如，iso-dG）有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基（例如，iso-dC）。通过在具有被标记为猝灭或者报道分子的第一非-天然碱基的核苷酸存在的情况下实施延长来形成延长双链体，借助猝灭分子来猝灭来自报道分子的信号。在延长反应中，具有第一非-天然碱基的核苷酸被***到具有第二非-天然碱基的核苷酸的对面位置。
在步骤（e）中延长双链体被解链的情况下，报道分子以及猝灭分子互相隔开，猝灭分子不猝灭来自报道分子的信号，由此提供靶信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
优选地，在步骤（e）中提供的信号包含通过测定来自相互作用性双重标记的信号的变化来得到的解链曲线、解链模式或者Tm值。
CTO上的标记位置以及被***的标记的***位置，在上述两个标记在解链步骤中起到诱导信号的变化的相互作用性双重标记作用的范围内决定。
更为优选地，CTO的制模部位具有核苷酸，该核苷酸具有报道或者猝灭分子以及第二非-天然碱基。步骤（d）中的延长反应在具有对猝灭或者报道分子以及CTO内的第二非-天然碱基有着特异结合亲和性的第一非-天然碱基的核苷酸存在的情况下实施。步骤（d）延长双链体的两个非-天然碱基在形成碱基-对的同时，借助猝灭分子猝灭来自报道分子的信号，并且诱导信号的变化，由此提供靶信号。选择性地，片段具有报道或者猝灭分子，CTO的制模部位具有核苷酸，该核苷酸具有第二非-天然碱基。步骤（d）中的延长反应在具有对猝灭或者报道分子以及CTO内的第二非-天然碱基有着特异结合亲和性的第 一非-天然碱基的核苷酸存在的情况下实施。步骤（d）延长双链体的两个非-天然碱基在形成碱基-对的同时，借助猝灭来诱导信号的变化，由此提供靶信号。
所例示的再一实施例通过参照图5来说明。在本实施例中，包含报道或者猝灭分子的片段与包含核苷酸的CTO杂交，该核苷酸具有对第一非-天然碱基（例如，iso-dG）有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基（例如，iso-dC）。通过在具有被标记为猝灭或者报道分子的第一非-天然碱基的核苷酸存在的情况下实施延长而形成延长双链体，借助猝灭分子猝灭来自报道分子的信号。在延长反应中，具有第一非-天然碱基的核苷酸被***到具有第二非-天然碱基的核苷酸的对面位置。
在步骤（d）中形成延长双链体的情况下，报道分子以及猝灭分子结构性地互相隔开，猝灭分子不猝灭来自报道分子的信号；在上述步骤（e）中延长双链体被解链的情况下，报道分子以及猝灭分子结构性地互相邻近，猝灭分子猝灭来自报道分子的信号，由此提供靶信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
优选地，在步骤（e）中所提供的靶信号包含通过测定来自相互作用性双重标记的信号的变化来得到的解链曲线、解链模式或者Tm值。
PTO的标记位置以及被***的标记的***位置，在上述两个标记在解链步骤中起到诱导信号的变化的相互作用性双重标记作用的范围内决定。
利用在延长反应期间***到延长双链体内的标记的情况下，由于杂交物不被延长，因而标记不被包含于非切割PTO以及CTO之间的杂交物内。因此，杂交物在解链步骤中不提供非-靶信号。
【（iv）嵌入标记（Intercalating label）】
本发明能够使用提供用于表示延长双链体的存在的靶信号的嵌入标记。由于试料内的双-链核酸分子能够产生信号，因而，嵌入标记在利用固定化的CTO的固相反应中更为有用。
在本发明中有用的嵌入标记的例包含：SYBRTMGreen I、 PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTOTM43、SYTOTM44、SYTOTM45、SYTOXTMBlue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PROTM1、TO-PROTM1、SYTOTM11、SYTOTM13、SYTOTM15、SYTOTM16、SYTOTM20、SYTOTM23、TOTOTM-3、YOYOTM3、GelStarTM以及thiazole orange。信号通过嵌入染料特异性地夹入双-链核酸分子内来产生。
在图13中图示，嵌入染料夹入延长双链体的碱基-对之间的实例（图13的C以及D）。并且，本实例还可适用于利用解链分析的其他实例。
所例示的实例可通过参考图13来说明。片段与在固相基质实现固定化的CTO的捕捉部位杂交。在存在嵌入染料（例如，SYBRTMGreen）的情况下实施延长来形成包含嵌入染料的延长双链体。可通过利用嵌入荧光染料来检测从有着固定化的CTO的固相基质的点上的延长双链体发出的荧光信号。在延长双链体被解链的情况下，放出嵌入荧光染料，从而在点上不再检测荧光信号（图13中未表示）。因而，提供信号来在步骤（e）中表示延长双链体的存在。
非切割PTO以及CTO之间的杂交物在解链步骤中提供非-靶信号。在这种情况下，可根据延长双链体以及杂交物的Tm值的差异来区分延长双链体的靶信号和杂交物的非-靶信号（图13中未表示）。
优选地，在步骤（e）中提供的信号包含通过测定在步骤（e）中产生的荧光信号的变化来得到的解链曲线、解链模式、或者Tm值。
【步骤（f）：靶信号的检测】
最终，延长双链体通过测定步骤（e）中提供的靶信号来被检测，由此，延长双链体的存在表示靶核酸序列的存在。
根据靶信号的种类，能够以多种方法来检测。
根据优选实例，靶信号的检测借助解链分析来实施。
在本说明书中使用的术语“解链分析”意味着借助延长双链体的解链得到表示延长双链体的存在的靶信号的方法，并包含在两种相异的温度下测定信号的方法、解链曲线分析、解链模式分析以及解链峰值 分析。优选地，解链分析为解链曲线分析。
根据本说明书中的优选实例，在步骤（e）的解链之后实施杂交来提供表示上述延长双链体的存在的靶信号。在这种情况下，通过杂交曲线分析来检测延长双链体的存在。
解链曲线或者杂交曲线可通过以往的技术，例如，通过美国专利第6,174,670号以及第5,789,167号,Drobyshev等,Gene188:45（1997）;Kochinsky and Mirzabekov HumanMutation19:343（2002）;Livehits等,J.Biomol.Structure Dynam.11:783（1994）;以及Howell等，Nature Biotechnology17:87（1999）中所说明的技术来得到。例如，解链曲线或者杂交曲线可由有关杂交严格度（stringency）的参数的输出信号（output signal）变化的图表（graphic plot）或者陈列（display）构成。输出信号能够直接测绘出杂交参数。典型地，就解链曲线或者杂交曲线而言，例如，Y-轴为表示双链体结构的程度（即，杂交程度）的荧光、X-轴具有测绘（plotting）有杂交参数的输出信号。
PTO以及CTO可由天然（naturally occurring）dNMPs构成。择一性地，PTO以及CTO可包含变形核苷酸或者非-天然核苷酸，例如PNA（Peptide Nucleic Acid,参照PCT申请第WO92/20702号）以及LNA（Locked Nucleic Acid,参照PCT申请第WO98/22489号、第WO98/39352号以及第WO99/14226号）。PTO以及CTO可包含如同脱氧肌苷（deoxyinosine）、肌苷（inosine）、1-（2’-脱氧-β-D-呋喃核糖）-3-硝基吡咯（1-（2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl）-3-nitropyrrole）以及5-硝基吲哚（5-nitroindole）等的通用碱基。术语“通用碱基”意味着分别对DNA/RNA碱基能够几乎没有区别地形成碱基对。
如同上述，PTO能够在从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开的位置被切割。切割位置能够位于PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分。在PTO片段包含PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分的情况下，与3’-靶向部位的5’-末端的一部分杂交的CTO的位置能够包含通用碱基、退化性序列（degenerate sequence）或者它们的 组合。例如，PTO在从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开一个核苷酸的位置被切割，为了与上述核苷酸的杂交，有利地，CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分包含通用碱基。万一，PTO在从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开两个核苷酸的位置被切割，有利地，CTO的捕捉部位的5’-末端包含退化性序列，沿着其3’-方向邻近的核苷酸包含通用碱基。像这样，在3’-靶向部位的5’-末端的一部分的多个位置上产生PTO的切割的情况下，对CTO利用通用碱基或者退化性序列将具有用处。并且，在诱导上游引物延长-依赖性切割的情况下，将具有相同的5’-标记部位的PTO利用到多个靶核酸序列筛选时，3’-靶向部位的5’-末端的一部分能够生成互不相同的PTO片段。在这种情况下，通用碱基以及退化性序列将被有用地使用到CTO。为了实现多个靶核酸序列的筛选，在对CTO利用通用碱基以及退化性序列的战略中使用一个类型的CTO或者最小数量的类型的CTO。
根据本发明的优选实例，本发明的方法在上述反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行上述步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者步骤（a）-步骤（f）的步骤，优选地，一同包含下游引物。这种反复能够扩增靶核酸序列和/或靶信号。
根据本发明的优选实例，步骤（a）-步骤（f）在一个反应容器或者个别反应容器中实施。例如，步骤（a）-步骤（b）、步骤（c）-步骤（d）或者步骤（e）-步骤（f）能够在个别反应容器中实施。
根据本发明的优选实例，步骤（a）-步骤（b）以及步骤（c）-步骤（f）根据反应条件（尤其，温度）能够在一个反应容器同时或者个别进行。
本发明中要检测和/或扩增的靶核酸序列包括所有DNA（gDNA及cDNA）分子以及RNA分子均不要求具有任何特定序列或者长度。
当把mRNA用作初期物质时，在实施退火步骤之前必需要进行反转录步骤，以上详细的内容公开在Joseph Sambrook等、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、ColdSpring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（2001）；以及Noonan、K.F等， Nucleic Acids Res.16:10366（1988）。为了实现反转录反应，可利用与随机六聚体或者mRNA杂交的寡核苷酸dT引物。
在本发明中可检测和/或扩增的靶核酸序列还都包含任何自然（naturallyoccurring）原核细胞核酸、真核细胞（例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物）核酸、病毒（例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV：HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS）、流感病毒、EB病毒（Epstein-Barr virus）、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等）核酸或者类病毒核酸。
并且，本发明对核苷酸变异的检测非常有用。优选地，靶核酸序列包含核苷酸变异。在本说明书中使用的术语“核苷酸变异”意味着在连续的DNA片段或者序列类似的DNA片段中存在于特定位点的DNA序列的所有单一或者多个核苷酸置换、缺失、或者***。这种连续的DNA片段包含一个基因或者一个染色体的任意其他部位。这种核苷酸变异可以是突变（mutant）或者多态性等位基因变异（polymorphic allele variations）。例如，在本发明中检测的核苷酸变异包括：单核苷酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphism）、突变（mutation）、缺失、***、置换以及移位。核苷酸变异的例子包括：人类基因组的多种变异（例如，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR：methylenetetrahydrofolate reductase）基因的变异）、病原体的药物耐性相关的变异以及癌产生-相关的变异。
在检测靶核酸序列的核苷酸变异的本发明中，所使用的引物或者探针具有对靶核酸序列的上述核苷酸变异互补的序列的情况下，包含上述核苷酸变异的靶核酸序列在本说明书中将被记载为匹配模板（matching template）。在所使用的引物或者探针具有对靶核酸序列的核苷酸变异非-互补的序列的情况下，包含上述核苷酸变异的靶核酸序列在本说明书中将被记载为错配模板（mismatching template）。
为了检测核苷酸变异，可将上游引物的3’-末端设计成位于靶核酸序列中的核苷酸变异位置的对面。根据本发明的优选实例，上游引物 的3’-末端具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的上游引物的3’-末端通过被匹配模板退火并被延长来诱导PTO切割。作为其结果物，PTO片段通过与CTO杂交来提供靶信号。相反，上游引物的3’-末端在错配模板中与核苷酸变异错配的情况下，即使上游引物与错配模板杂交，为了实现延长反应，在需要对引物的3’-末端进行退火的条件下也不会被延长，由此不会产生靶信号。
择一性地，可利用对具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的PTO的杂交有着依赖性的PTO切割。例如，在已调节的条件下，具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的PTO与匹配模板杂交后被切割。作为结果物，PTO片段通过与CTO杂交来提供靶信号。相反，在已调节的条件下，PTO不会与具有对核苷酸变异位置非-互补的序列的错配模板杂交，并且不会被切割。在这种情况下，优选地，对PTO的核苷酸变异互补的序列位于PTO的3’-靶向部位的中间。
择一性地，为了检测核苷酸变异，优选地，PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分位于靶核酸序列的核苷酸变异，PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。
在用于检测单一核苷酸变异的实例中，PTO的3’-靶向部位的5’-末端具有对靶核酸序列的单一核苷酸变异互补的序列。如同上述，与匹配模板杂交的PTO的切割，例如，在上游引物延长-依赖性切割诱导下，可在沿着3’-方向与PTO的3’-靶向部位的5’-末端仅邻近（immediately adjacent）的位置被诱导。PTO片段的3’-末端具有对单一核苷酸变异互补的核苷酸。PTO片段通过与具有包含相当于核苷酸变异的序列的捕捉部位的CTO杂交后被延长来形成延长双链体，由此来提供靶信号。假如，同样的PTO与除核苷酸变异外对匹配模板具有相同的序列的错配模板杂交，有可能在从PTO的3’-靶向部位的5’-末端沿着3’-方向隔开两个核苷酸的位置产生PTO的切割。PTO片段的3’-末端除具有与单一核苷酸变异互补的核苷酸以外还具有被追加切割的核苷酸。在与追加被切割的核苷酸杂交的CTO的位置被设 计成对上述追加被切割的核苷酸具有非-互补的序列的情况下，PTO片段的3’-末端不与CTO杂交，在已调节的条件下，PTO片段不会被延长。假如，PTO片段被延长而形成了延长双链体，上述双链体也会具有与借助于PTO以及错配模板之间的杂交的双链体相异的Tm值。
根据本发明的优选实例，在PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分具有对核苷酸变异互补的序列的PTO的切割位置，在与匹配模板或者与错配模板的杂交上依赖性地相异，由此从上述两个杂交结果放出的PTO片段具有相异的序列，优选地，在其3’-末端一部分，更为优选地，在其3’-末端具有相异的序列。
根据本发明的优选实例，通过选择考虑PTO片段的3’-末端的一部分的差异的CTO的核苷酸序列，能够区分匹配模板和错配模板。
根据本发明的优选实例，在本发明中所利用的靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。利用预-扩增的核酸序列，能够大大提高本发明的靶检测的灵敏度以及特异性。
根据本发明的优选实例，上述方法在存在下游异物的情况下实施。
能够同时检测（多重检测）至少两种的靶核酸序列使得本发明的优点更为突出。
根据本发明的优选实例，上述方法是为了检测至少两种靶核酸序列而实施的（更优选为至少三种，进而优选为至少五种）。
根据本发明的优选实例，上述方法为了检测至少两种靶核酸序列而实施（更优选为至少三种，进而优选为至少五种）；上述上游寡核苷酸包含至少两种寡核苷酸（更优选为至少三种，进而优选为至少五种），PTO包含至少两种PTO（更优选为至少三种，进而优选为至少五种），CTO包含至少一种CTO（更优选为至少两种，进而优选为至少三种，最优选为至少五种）；在存在上述至少两种的靶核酸序列的情况下，上述方法提供相当于至少两种的靶核酸序列的至少两种的靶信号。
至少两个PTO的5’-标记部位能够具有相同的序列。例如，本发明在靶核酸序列的筛选中实施的情况下，PTO的5’-标记部位可以具 有相同的序列。
尤其，能够将一种CTO利用到多个靶核酸序列的检测上。例如，将在5’-标记部位具有相同的序列的PTO利用于靶核酸序列的筛选的情况下，可以利用一种CTO。
根据本发明的优选实例，相当于至少两种靶核酸序列的延长双链体具有相异的Tm值。
根据本发明的优选实例，相当于至少两种靶核酸序列的至少两种信号是由相异的种类的标记提供。
根据本发明的优选实例，相当于至少两种靶核酸序列的至少两种靶信号是由相同的种类的标记提供。
根据本发明的优选实例，相当于至少两种靶核酸序列的至少两种靶信号是由相同的种类的标记提供；相当于至少两种靶核酸序列的上述延长双链体具有相异的Tm值。
在本说明书中使用的术语“相异的种类的标记”意味着具有可检测的信号相异的特征的标记。例如，将作为荧光报道标记的FAM以及TAMRA当作相异种类的标记，这是因为它们的激发（excitation）以及释放波长相异。
为了根据解链曲线分析同时检测至少两种靶核酸序列，在实施本发明而使相当于至少两种的靶核酸序列的延长双链体具有相异的Tm值的情况下，即使利用一种标记（例如，FAM）也能够检测至少两种靶核酸序列。
【利用在固相上实现固定化的CTO的靶检测】
本发明的突出的优点为，即使在如同微阵列的固相中，靶核酸序列的检测也是有效的。
根据本发明的优选实例，本发明在固相中实施，CTO通过其5’-末端或者3’-末端在固相基质上实现固定化。在固相中，测定由固相基质上提供的靶信号。
在利用固定化的CTO的情况下，在上述叙述的利用标记***的解链分析可适用于本发明的固相反应。
根据本发明的优选实例，靶信号是由与片段连接的单一标记或者在上述延长反应期间***到上述延长双链体内的单一标记来提供。特别，在固相中，在利用单一标记来实施本发明的情况下，可利用一般的荧光标记，不需要根据存在于双链或者单链来能够提供具有相异的强度的荧光信号的特定的荧光标记。
利用在固相基质上实现固定化的CTO的情况下，可利用化学标记（例如，生物素）或者酶标记（例如碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶）。
为了实现固相反应，CTO借助其5’-末端或者3’-末端（优选为，3’-末端）在固相基质的表面直接或者间接（优选为间接）实现固定化。并且，CTO能够以共价键或者非共价键方式，在固相基质表面上实现固定化。在固定化的CTO在固相基质表面间接性地实现固定化的情况下，利用合适的连接肽。在本发明中有用的连接肽可包含利用于固相基质表面上的探针固定化的任何连接肽。例如，具有胺基的烷基或者芳基化合物、或者具有硫醇基的烷基或者芳基化合物可作为连接肽利用于CTO固定化。并且，可将聚尾（poly T tail）或者聚腺苷酸尾（poly A tail）使用为连接肽。
根据本发明的优选实例，在本发明中利用的固体基质为微阵列。提供本发明的反应环境的微阵列包括在本发明所属的技术领域中公知的任何微阵列。本发明的全部过程，即与靶序列的杂交、切割、延长、解链以及荧光的检测在微阵列上实施。在微阵列上实现固定化的CTO会被利用为杂交阵列因素（hybridizable array element）。用于制备微阵列的固体基质包括，金属（例如，金、金与铜的合金及铝）、金属氧化物、玻璃、陶瓷、石英、硅、半导体、Si/SiO2晶圆、锗、砷化镓、碳、碳纳米管、聚合物（例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯以及聚丙烯酰胺）、琼脂糖凝胶（sepharose）、琼脂糖（agarose）及胶体（colloids），但是不局限于此。本发明的多个固定化CTO可固定化在固体基质上的一个寻址（addressable）部位或者多个寻址部位，固体基质可包括2-1000000个寻址部位。为了借助如光刻法、喷墨打印 法、机械点样法及与其类似的方法等现有制备技术，生产用于特定应用的阵列而可以组装（fabricate）固定化的CTO。
在固相中实施的本发明，由于固定化的CTO上的标记物理性地隔开，因而即使利用一种标记也能够同时检测多个靶核酸序列。因此，在固相中借助本发明可检测的靶核酸序列的数量不受限制。
【II.利用靶核酸序列的扩增的优选实例】
优选地，本发明利用能够合成靶核酸序列的上游引物以及包含下游的一对引物，并通过靶核酸序列的扩增来同时实施。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供一种借助PTOCE（PTO切割以及延长）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（a），将上述靶核酸序列与包含上游引物及下游引物引物的一对引物以及探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）进行杂交；上述上游引物及上述下游引物分别包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述PTO位于上述上游引物以及上述下游引物之间；上述PTO因其3’-末端被阻断，因而防止延长；
步骤（b），在用于延长上述引物以及切割上述PTO的条件下，将步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶相接触；在上述PTO与上述靶核酸序列杂交的情况下，上述上游引物被延长，上述延长链诱导借助于具有上述5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤（c），将从上述PTO放出的上述片段和捕捉和制模寡核苷酸（CTO，Capturingand Templating Oligonucleotide）进行杂交；上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO 的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）制模部位，其包含与上述5’-标记部位以及上述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的上述捕捉部位杂交；
步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延长反应；杂交于上述CTO的上述捕捉部位的上述片段，通过被延长来形成延长双链体；上述延长双链体具有根据（i）上述片段的序列和/或长度、（ii）上述CTO的序列和/或长度、或者（iii）上述片段的上述序列和/或长度和上述CTO的上述序列和/或长度可进行调节的Tm值；
步骤（e），在规定范围的温度下，通过对上述延长双链体进行解链（melting）来提供表示上述延长双链体的存在的靶信号；上述靶信号由（i）与上述片段和/或上述CTO连接的至少一个标记、（ii）在上述延长反应期间***到上述延长双链体内的标记、（iii）在上述延长反应期间***到上述延长双链体内的标记和与上述片段和/或上述CTO连接的标记、或者（iv）嵌入标记来提供；以及
步骤（f），通过测定上述靶信号来检测上述延长双链体；上述延长双链体的存在表示上述靶核酸序列的存在。
由于本发明的优选实例实施上述详述的本发明的步骤，因此，为了避免本说明书的过度的复杂性，省略它们之间共同的内容。
根据本发明的优选实例，上述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者步骤（a）-步骤（f）的步骤。反应的反复伴随着靶核酸序列的扩增。优选地，上述扩增根据在美国专利第4,683,195号、第4,683,202号以及第4,800,159号中公开的聚合酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction）来实施。
根据本发明的优选实例，上述方法是为了检测至少两种靶核酸序列而实施。
根据本发明的优选实例，相当于至少两种靶核酸序列的至少两种 靶信号由相同种类的标记提供；相当于至少两种靶核酸序列的上述延长双链体具有相异的Tm值。
【III.借助包括在指定温度下的检测过程的PTOCE的靶检测方法】
为了利用与延长双链体的形成相关联而产生的靶信号，可对本发明进行变形。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供一种借助探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE，PTO Cleavage and Extension）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（a），将上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及（ii）5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位则不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；
步骤（b），在用于上述PTO的切割的条件下，将步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或者其延长链诱导借助于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤（c），将从上述PTO放出的上述片段与捕捉和制模寡核苷酸（CTO，Capturingand Templating Oligonucleotide）进行杂交；上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）制模部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述 CTO的上述捕捉部位杂交；
步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延长反应；杂交于上述CTO的上述捕捉部位的上述片段，通过被延长来形成延长双链体；上述延长双链体具有根据（i）上述片段的序列和/或长度、（ii）上述CTO的序列和/或长度、或者（iii）上述片段的上述序列和/或长度和上述CTO的上述序列和/或长度可进行调节的Tm值；上述延长双链体借助（i）与上述片段和/或CTO连接的至少一个标记、（ii）在上述延长反应期间***到上述延长双链体内的标记、（iii）与上述片段和/或上述CTO连接的至少一个标记和在上述延长反应期间***到上述延长双链体内的标记、或者（iv）嵌入标记来提供靶信号；以及
步骤（e），在上述延长双链体维持其双-链形态的指定温度下，通过测定上述靶信号来检测上述延长双链体，由此，上述延长双链体的存在表示上述靶核酸序列的存在。
由于本发明的优选实例除了解链步骤以外，实施上述详述的本发明的步骤，因此，为了避免本说明书的过度的复杂性，省略它们之间共同的内容。
由于靶信号是通过测定在延长双链体的解链中提供的信号的变化来提供的，因此，利用上述的解链分离的本发明，需要对在至少两个相异的温度下从标记发出的信号进行检测。
不同与此，在本发明的一实施方式中，延长双链体本身提供区分形成延长双链体的情况和不形成延长双链体的情况的信号，在延长双链体维持双-链形态的指定温度（predetermined temperature）下检测上述信号，由此决定靶核酸序列的存在。
本发明是为了检测靶核酸序列而测定与延长双链体的形成相关的靶信号的。
在本发明中，延长双链体具有标记，由此延长双链体提供靶信号。
优选地，靶信号包含在指定温度下从延长双链体的标记发出的信号（信号的产生或者信号的消灭）。
本发明的标记能够以与利用上述叙述的解链分析的方法相同的方式来实施。图2-图13能够说明在指定温度下的检测而稍微变形的本发明的一实施方式。
以从延长双链体发出的靶信号为基础的工作原理如下：（i）片段的延长诱导来自标记的信号的变化来提供靶信号；或者（ii）片段以及CTO的杂交诱导来自标记的信号的变化来提供靶信号，由上述延长双链体来维持靶信号。
工作原理（i）的实例可通过参照图9来说明。在利用固定化的CTO的情况下，本发明以更有效的方式检测多个靶核酸序列。固定化的CTO的制模部位具有报道分子以及猝灭分子。报道分子以及猝灭分子通过结构性地互相邻近，猝灭分子猝灭来自报道分子的信号。在片段与CTO的捕捉部位杂交的情况下，猝灭分子猝灭来自报道分子的信号。借助上述延长双链体的形成，报道分子以及猝灭分子结构性地互相隔开，猝灭分子不猝灭来自报道分子的信号。靶信号在延长步骤中被提供（图9的C以及D）。
在图9中，非切割PTO以及CTO之间的杂交物（hybrid）不形成延长双链体。因此，猝灭分子依然猝灭来自报道分子的信号。杂交物不提供非-靶信号。
工作原理（ii）的实例可通过参照图6来说明。图不仅表示利用解链分析的方法，还表示本发明的实施方式。PTO的5’-标记部位具有报道分子以及猝灭分子。报道分子以及猝灭分子结构性地互相邻近，猝灭分子猝灭来自报道分子的信号。与靶核酸序列杂交的PTO通过被切割来放出包含具有报道分子以及猝灭分子的5’-标记部位的片段，上述片段与CTO的捕捉部位杂交。借助上述杂交，报道分子以及猝灭分子结构性地互相隔开，猝灭分子不猝灭来自报道分子的信号。靶信号在片段杂交的步骤中被提供，由延长双链体来维持靶信号（图6的C以及D）。
在图6中，由非切割PTO以及CTO之间的杂交物来提供非-靶信号（图6的C以及D）。为了去除非-靶信号，需要解离杂交物。因此， 所决定的测定靶信号的温度要能够使杂交物解离。根据本发明的优选实例，上述温度追加考虑杂交物的Tm值来决定。
根据本发明的优选实例，能够在杂交物部分被解离的温度下检测延长双链体。
指定温度高于比杂交物的Tm值减少10℃的温度，优选地，高于比杂交物的Tm值减少5℃的温度，更为优选地，高于杂交物的Tm值的温度，进而优选地高于比杂交物的Tm值增加5℃的温度。
根据本发明的优选实例，由延长双链体来提供的靶信号，在步骤（d）的延长期间被提供；如图2-4以及图9-11所示，上述非切割PTO以及CTO之间的杂交物不提供非-靶信号。
根据本发明的优选实例，由延长双链体来提供的靶信号，借助于步骤（c）中的片段以及CTO的杂交来提供，在步骤（d）中上述延长双链体的形成，能维持靶信号；由非切割PTO以及CTO之间的上述杂交物来提供非-靶信号；如图5-8以及图12-13所示，上述指定温度高于杂交物的Tm值。
在由非切割PTO以及CTO之间的杂交物来提供非-靶信号的情况下（图6的D画面），为了去除非-靶信号需要解离杂交物。因此，所决定的测定靶信号的温度要能够使杂交物解离。
可如下说明对本发明有用的标记***：
【（i）与片段和/或CTO连接的标记】
【（i-1）相互作用性双重标记】
在相互作用性双重标记***的实例中，CTO具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；在步骤（d）中的上述片段的延长，诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号。在图2中图示，相互作用性双重标记***的实例1。靶信号通过延长-同步化（extension-synchronized）信号产生来提供。
根据本发明的优选实例，报道分子以及猝灭分子能够位于CTO的制模部位。
根据本发明的优选实例，CTO的报道分子以及猝灭分子中的一个 位于其5’-末端或者从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，剩余一个位于根据CTO的形态猝灭或者不猝灭来自报道分子的信号的位置。
在相互作用性双重标记***的实例中，CTO具有包含报道分子或者猝灭分子的相互作用性双重标记；步骤（c）中的片段以及CTO的杂交，诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号，由上述延长双链体来维持靶信号。
根据本发明的优选实例，报道分子以及猝灭分子能够位于CTO的捕捉部位。
根据本发明的优选实例，CTO的报道分子以及猝灭分子中的一个位于其3’-末端或者从其3’-末端隔开1-5核苷酸的位置，剩余一个位于根据CTO的形态猝灭或者不猝灭来自报道分子的信号的位置。
在本实例中，非切割PTO以及CTO之间的杂交物提供非-靶信号；测定上述靶信号的温度要考虑杂交物的Tm值来决定。
在相互作用性双重标记***的实例中，片段具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；步骤（c）中的上述片段以及CTO的杂交，诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号，由上述延长双链体来维持靶信号。在图6中图示，相互作用性双重标记***的实例1。
根据本发明的优选实例，片段的报道分子以及猝灭分子中的一个位于其5’-末端或者从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，剩余一个位于根据片段的形态猝灭来自报道分子的信号的位置。
在本实例中，由非切割PTO以及CTO之间的杂交物来提供非-靶信号；测定上述靶信号的温度要考虑杂交物的Tm值来决定。
在相互作用性双重标记***的实例中，上述片段具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，CTO具有上述互作用性双重标记中的剩余一个；步骤（c）中的上述片段以及CTO的杂交，诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号，由上述延长双链体来维持靶信号。在图8中图示，相互作用性双重标记***的实例。
只要来自报道分子的信号被猝灭分子猝灭，报道分子以及猝灭分子能够位于PTO片段以及CTO的任何位置。
根据本发明的优选实例，优选地，PTO的报道分子或者猝灭分子位于PTO的5’-末端。
根据本发明的优选实例，优选地，CTO的报道分子或者猝灭分子位于CTO的5’-末端。
在本实例中，由非切割PTO以及CTO之间的杂交物来提供非-靶信号；测定上述靶信号的温度要考虑杂交物的Tm值来决定。
【（i-2）单一标记】
在单一标记***的实例中，CTO具有单一标记，在步骤（d）中的片段的延长，诱导来自单一标记的信号的变化来提供靶信号。在图3中图示，单一标记***的实例。靶信号通过延长-同步化（extension-synchronized）信号产生来提供。
根据本发明的优选实例，CTO的制模部位由单一标记来标记。
在单一标记***的实例中，CTO具有单一标记，在步骤（c）中的片段以及CTO的杂交，诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号，由上述延长双链体来维持靶信号。
根据本发明的优选实例，CTO的捕捉部位由单一标记来标记。
在本实例中，由非切割PTO以及CTO之间的杂交物来提供非-靶信号；测定上述靶信号的温度要考虑杂交物的Tm值来决定。
在单一标记***的实例中，片段具有单一标记，在步骤（c）中的片段以及CTO的杂交，诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号，由上述延长双链体来维持靶信号。在图12中图示，单一标记***的实例。
在本实例中，由非切割PTO以及CTO之间的杂交物来提供非-靶信号；测定上述靶信号的温度要考虑杂交物的Tm值来决定。
在本说明书中使用的单一标记应根据存在于双链或者单链来能够提供相异的信号。单一标记包含荧光标记、发光标记、化学发光标记、电化学标记以及金属标记。优选地，单一标记包含荧光标记。在本发 明中使用的单一荧光标记的种类以及优选的结合位置公开于美国专利第7,537,886号以及第7,348,141号中，这将作为参照包含于本说明书。优选地，单一荧光标记包含JOE、FAM、TAMRA、ROX以及以荧光素为基础的标记。被标记的核苷酸的残基比位于5’-末端或者3’-末端，更为优选地位于寡核苷酸内的内部核苷酸残基。
对在本发明中有用的单一荧光标记，可参照如上所述的对报道以及猝灭分子的说明来进行说明。
特别是，在固相中利用单一标记来实施本发明的情况下，可利用一般的荧光标记，并不需要根据存在于双链或者单链来能够提供具有相异的强度的荧光信号的特定的荧光标记。
利用在固相基质上实现固定化的CTO的情况下，可利用化学标记（例如，生物素）或者酶标记（例如碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶）。
根据本发明的优选实例，在形成非切割PTO以及CTO之间的杂交物的情况下，如图2-3以及图9所示，与片段和/或CTO连接的标记位于上述杂交物在步骤（d）中不提供非-靶信号的范围内。
选择性地，如图6-8以及图12所示，在形成非切割PTO以及CTO之间的杂交物的情况下，标记可位于上述杂交物在步骤（d）中提供非-靶信号的范围内；上述延长双链体的Tm值高于非切割PTO以及CTO之间的杂交物。
【（ii）***到延长双链体内的标记】
特别是，通过利用固定化的CTO在固相中实施本发明的情况下，如图10以及图11所示，更有用于本标记***提供靶信号。
根据本发明的优选实例，靶信号由在延长反应期间***到延长双链体内的单一标记来提供；被***的单一标记与在延长反应期间***的核苷酸相连接；步骤（d）中的片段的延长，诱导来自单一标记的信号的变化来提供步骤（d）中的靶信号。
根据本发明的优选实例，如图11所示，在延长反应期间***的核苷酸具有第一非-天然碱基，CTO具有核苷酸，该核苷酸具有对第一 非-天然碱基有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基。优选地，具有第二非-天然碱基的核苷酸能够位于CTO的制模部位的任何位置。
利用在延长反应期间***到延长双链体内的标记的情况下，由于杂交物不被延长，因而标记不被包含于非切割PTO以及CTO之间的杂交物内。因此，杂交物不提供非-靶信号。
【（iii）***到延长双链体内的标记和与片段或者CTO连接的标记】
如图4以及图5所示，本发明可利用标记***，该标记***利用了在延长反应期间***到延长双链体内的标记和与片段和/或CTO连接的标记的组合。
根据本发明的优选实例，靶信号由在延长反应期间***到延长双链体内的标记和与片段和/或CTO连接的标记来提供；上述***的标记与在延长反应期间***的核苷酸相连接；上述两个标记为报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；上述步骤（d）中的片段的延长，诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号。
更为优选地，在延长反应期间***的核苷酸具有第一非-天然碱基，CTO具有核苷酸，该核苷酸具有对第一非-天然碱基有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基。
优选地，在步骤（e）中提供的靶信号是来自步骤（d）的相互作用性双重标记的信号。
利用在延长反应期间***到延长双链体内的标记的情况下，由于杂交物不被延长，因而标记不被包含于非切割PTO以及CTO之间的杂交物内。因此，杂交物不提供非-靶信号。
【（iv）嵌入标记（Intercalating label）】
本发明能够使用提供用于表示延长双链体的存在的靶信号的嵌入标记。由于试料内的双-链核酸分子能够产生信号，因而，嵌入标记在利用固定化的CTO的固相反应中更为有用。
所例示的实例可通过参考图13来说明。与靶核酸序列杂交的PTO通过被切割来放出片段。上述片段与CTO杂交。在存在嵌入染料（例 如，SYBRTM Green）的情况下实施延长来形成包含嵌入染料的延长双链体。
在图13中，非切割PTO以及CTO之间的杂交物提供非-靶信号（图13的C以及D），为了去除非-靶信号，需要解离杂交物。因此，测定靶信号的温度要考虑杂交物的Tm值来决定。
优选地，在步骤（e）中提供的靶信号是从嵌入染料发出的信号。
根据本发明的优选实例，PTO和/或CTO因其3’-末端被阻断，因而防止延长。
根据本发明的优选实例，上游寡核苷酸为上游引物或上游探针。
根据本发明的优选实例，上游寡核苷酸位于与PTO相邻近的部位，以能够诱导借助于具有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
根据本发明的优选实例，上游引物通过其延长链来诱导借助于具有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
根据本发明的优选实例，上述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者步骤（a）-步骤（e）的步骤。
根据本发明的优选实例，步骤（a）-步骤（b）或者步骤（c）-步骤（e）在一个反应容器或者个别反应容器中实施。
根据本发明的优选实例，上述方法是为了检测至少两种靶核酸序列而实施；上述上游寡核苷酸包含至少两种寡核苷酸；PTO包含至少两种PTO；CTO包含至少一种CTO；在存在上述至少两种靶核酸序列的情况下，上述方法提供相当于至少两种靶核酸序列的至少两种靶信号。
根据本发明的优选实例，上游寡核苷酸为上游引物，为了实现上述上游引物的延长，在步骤（b）中利用模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的优选实例，CTO通过其5’-末端或者3’-末端在固相基质上实现固定化，检测由上述固相基质提供的靶信号。
根据本发明的优选实例，靶信号由与片段连接的单一标记或者在延长反应期间***到延长双链体内的单一标记提供。
根据本发明的优选实例，上述方法在存在下游引物的情况下实施。
步骤（e）的检测能够以实时方式、终-点方式或者预定时间间隔方式来实施。在本发明追加包含反复步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者（a）-步骤（e）的步骤的情况下，优选地，应在指定温度下的上述反复的各循环中（即，实时方式）、在指定温度下的上述反复的终点（即，终-点方式）或者在指定温度下的上述反复期间在各个预定时间间隔实施信号检测。优选地，上述检测能够以实时方式在上述反复的各循环中实施，能够改善检测的准确性和定量化。
【IV.用于靶检测的试剂盒】
根据本发明的还一实施方式，本发明提供一种用于借助PTOCE（PTO切割以及延长）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包括：
（a）上游寡核苷酸；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
（b）探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）；上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；上述上游寡核苷酸或者其延长链诱导借助于具有5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分的片段；以及
（c）捕捉和制模寡核苷酸（CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide）；上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列；以及（ii）制模部位，其包含与上述PTO的上述5’-标记部位以及上述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的上述捕捉部位杂交；并且，与上 述CTO的上述捕捉部位杂交的上述片段借助模板-依赖性核酸聚合酶而被延长来形成延长双链体。
由于本发明的试剂盒是为了实施上述说明的本发明的检测方法而构成的，因此，为了避免本说明书的过度的复杂性，省略它们之间共同的内容。
根据本发明的优选实例，上述试剂盒还包括具有5’核酸酶活性的酶。
根据本发明的优选实例，上述试剂盒还包括模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的优选实例，上述PTO和/或CTO具有至少一个标记。
根据本发明的优选实例，上述试剂盒还包括在延长反应期间***到上述延长双链体内的标记。
根据本发明的优选实例，上述试剂盒还包括在延长反应期间***到上述延长双链体的标记，上述PTO和/或CTO具有至少一个标记。
根据本发明的优选实例，上述试剂盒还包括嵌入标记。
根据本发明的优选实例，上述标记为单一标记或者相互作用性双重标记。
根据本发明的优选实例，上述试剂盒用于检测至少两种核酸序列；上游寡核苷酸包含至少两种寡核苷酸；PTO包含至少两种PTO；CTO包含至少两种CTO。
根据本发明的优选实例，上述CTO通过其5’-末端或者3’-末端在固相基质上实现固定化。
根据本发明的优选实例，上述试剂盒还包含下游引物。
在本说明书中，上述的本发明的所有试剂盒可选择性地包含，如同缓冲液、DNA聚合酶辅因子以及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等的，实施靶扩增PCR反应（例如，聚合酶链式反应）所需的试剂。选择性地，本发明的试剂盒还可包含多种多聚核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液及试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。并且，试剂盒可包含实施阳性对照组及阴性对照组反应时所必需的试剂。熟知本说明书 的公开事项的本技术领域的普通技术人员能够容易地决定在特定反应中使用的试剂的最适量。典型的是，本发明的试剂盒由包含在前面揭示的组成成分的额外的包装体或者组分（compartment）所制备。
对本发明的特征以及优点，如下进行概括：
（a）本发明提供一种靶-依赖性延长双链体，其通过与靶核酸序列杂交的PTO（Probing and Tagging Oligonucleotide）被切割而放出片段，上述片段与CTO（Capturingand Templating Oligonucleotide）杂交而形成。延长双链体提供表示靶核酸序列的存在的信号（信号的产生或者消灭）或者信号变化（信号增加或者减少）。
（b）延长双链体的存在由如解链曲线以及在指定温度下的检测（例如，实施方式及终-点方式）等的多种方法或者过程来决定。
（c）本发明即使仅使用一种标记（例如，FAM），也能够借助解链曲线分析来同时检测至少两种靶核酸序列。相反，在液相中实施的以往多重实施方式，由于与可检测的荧光标记的数量相关的限度，因而存在严重的问题。本发明成功克服了这种缺点，拓宽了多重实时检测的应用。
（d）本发明可以利用多个标记***来实施。例如，与PTO和/或CTO的任何位置连接的标记可利用于提供用于表示延长双链体的靶信号。并且，可以将在延长反应期间***到延长双链体内的标记利用于本发明。不仅如此，还可以利用这种标记的组合。可适用于本发明的多目的性的标记***会根据实验条件或者目的来选择合适的标记***。
（e）本发明提供一种靶-依赖性延长双链体，其包含根据（i）上述片段的序列和/或长度、（ii）上述CTO的序列和/或长度、或者（iii）上述片段的上述序列和/或长度和上述CTO的上述序列和/或长度可进行调节的Tm值。
（f）利用扩增产物的以往解链曲线分析依赖于扩增产物的序列，由此十分难以得到扩增产物的所需的Tm值。相反，本发明依赖于延长双链体的序列，而不是扩增产物的序列，因此，可以选择延长双链 体的所需的Tm值。因此，本发明能够容易地适用于多个靶序列的检测。
（g）利用标记探针以及靶核酸序列间的直接杂交的以往解链曲线分析由于探针的非-特异性杂交，产生假阳性信号的可能性高。相反，由于本发明不仅利用PTO杂交，还利用酶切割以及延长，因而完美地克服了假阳性信号的问题。
（h）以往解链曲线分析的Tm值，受靶核酸序列的序列变异的影响。但是，本发明的延长双链体与靶核酸序列的序列变异无关，能够提供不变的恒定的Tm值，在解链曲线分析中能够保障卓越的准确性。
（i）值得关注的是，可以不用考虑靶核酸序列而选择PTO的5’-标记部位的序列以及CTO的序列。据此能够事先-设计对PTO的5’-标记部位以及CTO的全部序列。虽然PTO的3’-靶向部位需要考虑靶核酸序列来制备，但是CTO可以不用考虑靶核酸序列的信息或者靶核酸序列而以已有方式（ready-made fashion）来制备。这种特征能够在多重靶检测，特别是，利用在固相基质上实现固定化的CTO的微阵列中提供突出的优点。
以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅是用于更加具体地说明本发明的，根据本发明的主旨本发明的范围不局限于这些实施例，这对本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
【实施例】
【实施例1：对探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE，Probing and TaggingOligonucleotide Cleavage&Extension）试验的评价】
通过就延长双链体是否能够提供用于靶核酸序列的检测的靶信号进行试验，来对作为本发明的新颖的试验的探测和标记的寡核苷酸切割以及延长（PTOCE，PTO Cleavageand Extension）进行了评价。
为了这个评价，实施了借助解链分析来检测延长双链体的存在的 PTOCE试验（包含解链分析的PTOCE试验）。本发明者为了上游引物的延长、PTO的切割以及PTO片段的延长，利用了具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。
在实施试验期间形成的延长双链体被设计成具有相互作用性双重标记。延长双链体的相互作用性双重标记是由（i）被标记为报道分子以及猝灭分子的CTO（双重-标记CTO）或者（ii）具有猝灭分子的PTO以及具有报道分子的CTO（猝灭-标记PTO以及报道-标记CTO）来提供。PTO以及CTO的3’-末端用碳间隔区（carbon spacer）来阻断。将对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成寡核苷酸利用为靶模板。
【1-1.利用双重-标记CTO的PTOCE试验】
PTO不具有标记。CTO在其制模（templating）部位具有猝灭分子（BHQ-1）以及荧光报道分子（FAM）。在本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO以及CTO的序列如下：
NG-T5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTC TTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-1
5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：3）
NG-CTO-15’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T （FAM）]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：4）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记（tagging）部位。）
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2）10pmole、PTO（SEQ ID NO：3）5pmole、CTO（SEQID NO： 4）2pmole、含有2.5mM MgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））1.6单元（unit）的20μl的最终体积实施了反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下60秒的过程反复进行了30次。反应后，将反应混合物冷却至35℃，在35℃下维持30秒后，通过从35℃慢慢加热至90℃，得到了解链曲线。通过在温度上升期间连续测定荧光来监测了双-链DNA的解离。解链峰值来源于解链曲线数据。
如图14所示，在有模板的情况下，在相当于延长双链体的预想Tm值的76.5℃下检测出了峰值。在无模板的情况下，没有检测出任何峰值。由于在本标记方法中，非切割PTO以及CTO之间的杂交物（hybrid）不提供任何信号，因而没有检测出相当于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的峰值。在不存在PTO或者不存在CTO的情况下，没有观察出任何峰值。
【1-2.利用猝灭-标记PTO以及报道-标记CTO的PTOCE试验】
PTO将其5’-末端标记为猝灭分子（BHQ-1）。CTO将其3’-末端标记为荧光报道分子（FAM）。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO以及CTO的序列如下：
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCT TTTTGTTCTTGCTCG
GCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-25’-[BHQ-1]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTT TCG[C3spacer]-3’
（SEQ ID NO：5）
NG-CTO-2
5’-CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTC GT[FAM]-3’（SEQ ID NO：6）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记部位。）
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2）10pmole、PTO（SEQ ID NO：5）5pmole、CTO（SEQID NO：6）2pmole、含有2.5mM MgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））1.6单元（unit）的20μl的最终体积实施了反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下60秒、以及在72℃下30秒的过程反复进行了30次。反应后，将反应混合物冷却至35℃，在35℃下维持30秒后，通过从35℃慢慢加热至90℃，得到了解链曲线。通过在温度上升期间连续测定荧光来监测了双-链DNA的解离。解链峰值来源于解链曲线数据。
如图15所示，在有模板的情况下，在相当于延长双链体的预想Tm值的77℃下检测出了峰值。由于在本标记方法中，非切割PTO以及CTO之间的杂交物提供非-靶信号，因而在相当于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的Tm值的64.0℃-64.5℃下，出现了峰值。在不存在PTO或者不存在CTO的情况下，没有观察出任何峰值。
这种结果显示试验能够形成靶-依赖性延长双链体，并且，上述延长双链体，提供用于表示靶核酸序列的存在的靶信号。
【实施例2：延长双链体Tm值的调节】
本发明者就在PTOCE试验中借助CTO的序列是否能够调节延长双链体的Tm值进行了追加的实验。
为了本实验，本发明者在制模（templating）部位利用了具有互 不相同的序列的3种CTO。PTO不具有标记。3种CTO在其制模部位具有猝灭分子（BHQ-1）以及荧光报道分子（FAM）。PTO以及CTO的3’-末端用碳间隔区（carbon spacer）来阻断。
分别利用3种CTO实施了包含解链分析的PTOCE试验。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO以及CTO的序列如下：
NG-T5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-3
5’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：7）
NG-CTO-15’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T （FAM）]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：4）
NG-CTO-35’-[BHQ-1]TTTTTTTTTTCCTCCTCCAG[T （FAM）]AAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：8）
NG-CTO-45’-[BHQ-1]TTTTTTTTTTTTTTTTTTAG[T （FAM）]AAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：9）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记部位。）
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2）10pmole、PTO（SEQ ID NO：7）5pmole、CTO（SEQID NO：4、8或者9）2pmole、含有2.5mM MgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））1.6单元（unit）的20μl的最终体积实施了反应；将含有上 述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下60秒的过程反复进行了30次。反应后，将反应混合物冷却至35℃，在35℃下维持30秒后，通过从35℃慢慢加热至90℃，得到了解链曲线。通过在温度上升期间连续测定荧光来监测了双-链DNA的解离。解链峰值来源于解链曲线数据。
如图16所示，在有模板的情况下，在76.0℃、69.0℃或者64.5℃下检测出了峰值。各个峰值相当于借助于实验对象的CTO的延长双链体的预想Tm值。在无模板的情况下，没有检测出任何峰值。
这种结果表示，延长双链体的Tm值，能够借助CTO的序列来进行调节。
【实施例3：利用实时检测或者包含解链分析的PTOCE的靶核酸序列的检测】
本发明者就PTOCE试验以（i）实时PCR方式或者（ii）后-PCR解链分析方式是否能够检测靶核酸序列进行了实验；（i）PTO的切割以及PTO片段的延长，借助PCR过程，伴随了靶核酸的扩增，在各循环的指定温度检测了延长双链体的存在（包含在指定温度下的实时检测的PTOCE试验）；或者（ii）PTO的切割以及PTO片段的延长，借助PCR过程，伴随了靶核酸的扩增，借助后-PCR解链分析检测了延长双链体的存在（包含解链分析的PTOCE试验）。
上游引物参与借助于具有5’核酸酶活性的酶的PTO切割，并且还与下游引物一起参与借助于PCR过程的靶核酸序列扩增。对上游引物和下游引物的延长、PTO的切割以及PTO片段的延长，利用了具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。
延长双链体被设计成具有相互作用性双重标记。延长双链体的相互作用性双重标记由（i）被标记为报道分子以及猝灭分子的CTO、（ii）具有在延长反应期间***的猝灭-iso-dGTP以及报道分子和iso-dC残基的CTO、或者（iii）具有猝灭分子的PTO以及具有报道分子的CTO提供。PTO以及CTO的3’-末端用碳间隔区（carbon spacer）来阻断。
将淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因组DNA利用为靶模板。
【3-1.利用双重-标记CTO的PTOCE试验】
PTO不具有标记，CTO在其制模（templating）部位具有猝灭分子（BHQ-1）以及荧光报道分子（FAM）。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、PTO以及CTO的序列如下：
NG-F5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’（SEQ ID NO：10）NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-3
5’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：7）
NG-CTO-15’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T（FAM）]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ IDNO：4）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记（tagging）部位。）
【3-1-1.包含在指定温度下的实施检测的PTOCE试验】
用含有淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因组DNA100pg、下游引物（SEQID NO：10）10pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQID NO：2）10pmole（皮摩尔）、PTO（SEQ ID NO：7）5pmole（皮摩尔）、CTO（SEQ ID NO：4）2pmole（皮摩尔）、含有2.5mMMgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent Korea））1.6单元（unit）的20μl的最终体积实施了反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下60秒、以及在72℃下30秒的过程反复进行了60次。在各循环的60℃下检测了信号。在 延长双链体能够维持双-链的范围内，决定了检测温度。
如图17a所示，在有模板的情况下，检测出了靶信号（Ct31.36）。在无模板的情况下，没有检测出任何信号。
【3-1-2.包含解链分析的PTOCE试验】
在实施例3-1-1的反应后，将反应混合物冷却至35℃，在35℃下维持30秒后，通过从35℃慢慢加热至90℃，得到了解链曲线。通过在温度上升期间连续测定荧光来监测了双-链DNA的解离。解链峰值来源于解链曲线数据。
如图17b所示，在有模板的情况下，在相当于延长双链体的预想Tm值的76.0℃下检测出了峰值。在无模板的情况下，没有检测出任何峰值。由于在本标记方法中，非切割PTO以及CTO之间的杂交物不提供任何信号，因而没有检测出相当于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的峰值。
【3-2.利用具有猝灭-iso-dGTP以及iso-dC残基的报道-标记CTO的PTOCE试验】
PTO不具有标记。CTO在其5’-末端具有报道分子（FAM）以及iso-dC残基。在PTO片段的延长反应期间，被标记为猝灭分子（dabcyl）的iso-dGTP***到与iso-dC残基互补的位置。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、PTO以及CTO的序列如下：
NG-F5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’（SEQ ID NO：10）NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-1
5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：3）
NG-CTO-5
5’-[FAM][Iso-dC]CTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：11）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记（tagging）部位。）
【3-2-1.包含指定温度下的实时检测的PTOCE试验】
用含有淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）的基因组DNA100pg、下游引物（SEQ ID NO：10）10pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2）10pmole（皮摩尔）、PTO（SEQ IDNO：3）5pmole（皮摩尔）、CTO（SEQ ID NO：11）2pmole（皮摩尔）以及2X主混合液（Cat.No.A4100，Promega，USA，普洛麦格，美国）10μl的20μl最终体积实时了反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下60秒、在72℃下30秒的过程反复进行了60次以及将在72℃下30秒、在55℃下30秒的过程反复了5次。在各循环的60℃下检测了信号。在延长双链体能够维持双-链的范围内，决定了检测温度。
主混合液内具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶被利用与上游引物和下游引物的延长、PTO的切割以及PTO片段的延长。
如图18a所示，在有模板的情况下，检测除了靶信号（Ct33.03）。在无模板的情况下，没有检测出任何信号。
【3-2-2.包含解链分析的PTOCE试验】
在实施例3-2-1的反应后，将反应混合物冷却至35℃，在35℃下维持30秒后，通过从35℃慢慢加热至90℃，得到了解链曲线。通过在温度上升期间连续测定荧光来监测了双-链DNA的解离。解链峰值来源于解链曲线数据。
如图18b所示，在有模板的情况下，在相当于延长双链体的预想Tm值的70.0℃下检测出了峰值。在无模板的情况下，没有检测出任何峰值。由于在本标记方法中，非切割PTO以及CTO之间的杂交物不提供任何信号，因而没有检测出相当于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的峰值。
【3-3.利用猝灭-标记PTO以及报道-标记CTO的PTOCE试验】
PTO的5’-末端被标记为猝灭分子（BHQ-1）。CTO的3’-末端被标记为荧光报道分子（FAM）。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、PTO以及CTO的序列如下：
NG-F5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’（SEQ ID NO：10）NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-4
5’-[BHQ-1]ACGACGGCTTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：12）
NG-CTO-2
5’-CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[FAM]-3’（SEQ ID NO：6）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记（tagging）部位。）
【3-3-1.包含指定温度下的实时检测的PTOCE试验】
用含有淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）的基因组DNA100pg、下游引物（SEQ ID NO：10）10pmole（皮摩尔）、PTO（SEQID NO：12）5pmole（皮摩尔）、CTO（SEQ ID NO：6）2pmole（皮摩尔）、含有2.5mM MgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent Korea））1.6单元（unit）的20μl的最终体积实施了反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下60秒、在72℃下30秒的过程反复进行了60次。在各循环的60℃下检测了信号。在延长双链体能够维持双-链的范围内，决定了检测温度，上述温度高于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的Tm值。
如19a所示，在有模板的情况下，检测出了靶信号（Ct29.79）。在无模板的情况下，没有检测出任何信号。
【3-3-2.包含解链分析的PTOCE试验】
在实施例3-3-1的反应后，将反应混合物冷却至35℃，在35℃下维持30秒后，通过从35℃慢慢加热至90℃，得到了解链曲线。通过在温度上升期间连续测定荧光来监测了双-链DNA的解离。解链峰值 来源于解链曲线数据。
如19b所示，在有模板的情况下，在相当于延长双链体的预想Tm值的76.5℃下检测出了峰值。由于在本标记方法中，非切割PTO以及CTO之间的杂交物提供非-靶信号，因而在无模板的情况下，相当于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的Tm值的峰值，在48.0℃下被检测。
这种结果显示，能够借助包含实时检测或者解链分析的PTOCE来检测靶核酸序列。
【实施例4：借助于包含解链分析的PTOCE试验的多个靶核酸序列的检测】
并且，本发明者对包含解链分析的PTOCE试验利用相同种类的报道分子是否能够检测多个靶核酸序列进行了实验。
PTO的切割以及PTO片段的延长，伴随借助于PCR过程的靶核酸的扩增。延长双链体的存在，借助后-PCR解链分析（包含解链分析的PTOCE试验）来检测。
在试验期间形成的延长双链体被设计成具有相互作用性双重标记。延长双链体的相互作用性双重标记由被标记为其制模部位的报道分子以及猝灭分子的CTO提供。虽然CTO具有相同种类的荧光报道分子（FAM），但会生成具有相异的Tm值的延长双链体。PTO以及CTO的3’-末端用碳间隔区来阻断。
将淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）以及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）的基因组DNA利用为靶核酸。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、PTO以及CTO的序列如下：
NG-F5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’（SEQ ID NO：10）NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-3
5’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer] -3’（SEQ ID NO：7）
NG-CTO-15’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T（FAM）]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ IDNO：4）
SA-F5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3’（SEQ ID NO：13）
SA-R5’-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCTG-3’（SEQ ID NO：14）
SA-PTO-1
5’-AATCCGACCACGCATTCCGTGGTCAATCATTCGGTTTACG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：15）
SA-CTO-15’-[BHQ-1]TTTTTTTTTTTTTTTTTGCA[T （FAM）]AGCGTGGTCGGATT[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：16）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记（tagging）部位。）
用含有淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）的基因组DNA100pg、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）的基因组DNA100pg、下游引物（SEQ ID NO：10以及13）10pmole（皮摩尔）、各上游引物（SEQ ID NO：2以及14）10pmole（皮摩尔）、各PTO（SEQ ID NO：7以及15）5pmole（皮摩尔）、各CTO（SEQ ID NO：4以及16）2pmole（皮摩尔）、含有2.5mM MgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（SolgentKorea））1.6单元（unit）的20μl的最终体积实施了反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将将在95℃下30秒、在60℃下60秒、在72℃下30秒的过程反复进行了60次。反应后，在实施例3-1-1的反应后，将反应混合物冷却至35℃，在35℃下维持30秒后，通过从35℃慢慢加热至90℃，得到了解链曲线。通过在温度上升期间连续测定荧光来监测了双-链DNA的解离。解链峰值来源于解链曲线数据。
如20所示，在有模板的情况下，检测出多个靶信号（NG的Tm:75.5℃以及SA的Tm:63.5℃）。在无模板的情况下，没有检测出任何信号。
这些结果表示，包含解链分析的PTOCE试验，能够在相当于靶核酸的延长双链体具有相异的Tm值的条件下，通过利用相同种类的报道分子（e.g.FAM）来检测多个靶核酸。
【实施例5：微阵列中的对包含解链分析的PTOCE试验的评价】
本发明者追加实验了微阵列中的包含解链分析的PTOCE试验。PTO切割在个别容器中实施，将上述反应结果物的一部分移至CTO被固定化的微阵列。延长反应之后，通过解链分析检测了延长双链体的存在。
将具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶利用于上游引物的延长、PTO的切割以及PTO片段的延长。在试验期间形成的延长双链体被设计成具有单一标记。延长双链体的单一标记，由被标记为其5’-末端为荧光报道分子的Quasar570的PTO提供。PTO以及CTO的3’-末端用碳间隔区来阻断。CTO作为连接肽具有聚（T）5，利用位于其5’-末端的胺基（AminnoC7）固定在玻璃载玻片的表面。在其5’-末端具有荧光报道分子（Quasar570）的标记探针，利用位于其3’-末端的胺基，固定在玻璃载玻片。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO、CTO以及标记的序列如下：
NG-T5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTC TTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-5
5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCG TGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：17）
NG-CTO-S1
5’-[AminoC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAA GCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：18）
Marker5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3'（SEQ IDNO：19）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记（tagging）部位。）
制备CTO以及标记（SEQ ID NO：18以及19）时，利用了NSB9NHS载玻片（NSB浦项科技有限公司，韩国：NSB POSTECH，Korea）。将利用NSB测定点位缓冲液（NSB spotting buffer）溶解成最终浓度为10μM的CTO以及标记，利用PersonalArrayerTM16微阵列测定点位器（Microarray Spotter，博奥生物，中国：CapitalBio，China）印刷在NSB9NHS载玻片上。将CTO以及标记以2x1格式（双重点（duplicate spots））并行着测定点位（spotting），将如此制备的微阵列置于湿度约为85%的腔室培养了一宿。为了去除非-特异性地结合的CTO以及标记，在37℃下，用含有2x SSPE（0.3M氯化钠（sodium chloride）、0.02M磷酸氢钠（sodiumhydrogen phosphate）、2.0mM乙二胺四乙酸（EDTA：ETHYLENEDIAMINETETRAACETICACID））及7.0mM十二烷基硫酸钠（SDS：Sodium dodecyl sulfate）的pH7.4缓冲溶液中，对上述载玻片进行30分钟清洗之后用蒸馏水清洗。随后，利用载玻片离心分离器，将上述DNA-功能化的（DNA-functionalized）载玻片进行干燥，保管在4℃的暗室内以备后用。
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2）10pmole、PTO（SEQ ID NO：17）1pmole及含有2.5mM MgCl2的2X主混合液25μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））4单元（unit）的50μl的最终体积实施了切割反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进 行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在63℃下60秒的过程反复进行了30次。
将作为上述结果物的混合物30ul应用于组装在交联（cross-linked）了CTO（SEQID NO：18）的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。以原处（in situ）块方式使载玻片位于热循环仪（GeneproB4I，China）。为了解链分析，制备了6个相同的载玻片。在55℃下，实施了20分钟的延长反应。之后，在室温下，将如此制备的载玻片培养了1分钟。最终，将各载玻片分别在44℃下、52℃下、60℃下、68℃下、76℃或者84℃下用蒸馏水清洗了1分钟。利用共聚焦激光扫描仪Axon GenePix4100A（分子器件，美国：molecular Device，US），通过5-μm像素分辨率的扫描获取了图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro6.0软件（分子器件，美国：molecular Device，US）分析了荧光强度。就荧光强度而言，在去除周边本底后用点-中央值（spot-medians）表现。为了调查再现性，按每两个，对各点进行了测定点位。以反复的点的平均值表示了荧光强度。
如图21a以及21b所示，通过测定来自借助于相异的清洗温度而制备的点的荧光强度，得到了解链曲线。从上述解链曲线数据中决定了延长双链体的存在。
【实施例6：对微阵列中的包含实时检测的PTOCE试验的评价】
本发明者对微阵列中包含在指定温度下的实时检测的PTOCE试验进行了实验。
在CTO被固定化的微阵列上反复了PTO的切割以及PTO片段的延长。每个预定的循环在指定温度下检测了延长双链体的存在。
具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶被利用于上游引物的延长的延长、PTO的切割以及PTO片段的延长。
试验期间形成的延长双链体被设计为具有单一标记或者相互作用性双重标记。延长双链体的标记，由被标记为报道分子的PTO（报道-标记PTO）提供。延长双链体的相互作用性双重标记，由被标记为 报道分子以及猝灭分子的CTO（双重-标记CTO）提供。PTO以及CTO的3’-末端用碳间隔区来阻断。
CTO作为连接肽具有聚（T），CTO利用位于其5’-末端的胺基（AminnoC7）固定在玻璃载玻片表面。在其5’-末端具有荧光报道分子（Quasar570）的标记探针，利用位于其3’-末端的胺基，固定在玻璃载玻片。在指定温度下，测定了玻璃载玻片上的荧光强度。在延长双链体能够维持双-链形态的范围内，决定了检测温度。将对淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae，NG）的合成寡核苷酸利用为模板。
【6-1.利用报道-标记PTO的PTOCE试验】
PTO在其5’-末端具有作为荧光报道分子的Quasar570。CTO通过其5’-末端来实现固定化。在本标记方法中，在延长双链体能够维持双-链形态的范围内，决定检测温度。上述温度高于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的Tm值。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO、CTO以及标记的序列如下：
NG-T5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTC TTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-5
5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCG TGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：17）
NG-CTO-S1
5’-[AminoC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAA GCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：18）
Marker5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3'（SEQ ID NO：19）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记（tagging）部位。）
以与实施例5中利用的方案相同的方案实施了载玻片的制备。
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2）10pmole、PTO（SEQ ID NO：17）1pmole及含有2.5mM MgCl2的2X主混合液15μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））2.4单元（unit）的30μl的最终体积实施了切割反应；将上述全部混合物应用于组装在交联（cross-linked）了CTO（SEQ ID NO：18）的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。以原处（in situ）块方式使载玻片位于热循环仪（Genepro B4I，China）。为了循环分析，制备了5个相同的载玻片。如下实施了PTOCE反应：在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下60秒以及在55℃下60秒的过程实施了0循环、5循环、10循环20循环或者30循环。在根据各循环的数量的反应之后，将上述载玻片在64℃下用蒸馏水清洗了1分钟。利用共聚焦激光扫描仪AxonGenePix4100A（分子器件，美国：molecular Device，US），通过5-μm像素分辨率的扫描获取了图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePixpro6.0软件（分子器件，美国：molecular Device，US）分析了荧光强度。就荧光强度而言，在去除周边本底后用点-中央值（spot-medians）表现。为了调查再现性，按每两个，对各点进行了测定点位。以反复的点的平均值表示了荧光强度。
如图22a以及22b所示，在有模板的情况下，对靶核酸序列的荧光强度根据循环的数量而增加。（0循环_RFU：1,304±0.7；5循环_RFU：18,939±1,342.1；10循环_RFU：30,619±285.0;20循环_RFU：56,248±2,208.3；以及30循环_RFU：64,645±1,110.2）。在无模板的情况下，没有根据循环的数量而产生的荧光强度的变化。
【6-2.利用双重-标记CTO的PTOCE试验】
CTO通过其3’-末端实现固定化，并在制模部位具有猝灭分子（BHQ-2）以及荧光报道分子（Quasar570）。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO、CTO以及标记 的序列如下：
NG-T5’-
AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTC TTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）
NG-PTO-65’-ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQID NO：20）
NG-CTO-S2
5’-[BHQ-2]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T （Quasar570）]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGTTTTTTT
TTTT[AminoC7]-3’（SEQ ID NO：21）
Marker5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3'（SEQ ID NO：19）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记（tagging）部位。）
以与实施例5中利用的方案相同的方案实施了载玻片的制备。
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2）10pmole、PTO（SEQ ID NO：20）1pmole及含有2.5mM MgCl2的2X主混合液15μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））2.4单元（unit）的30μl的最终体积实施了切割反应；将上述全部混合物应用于组装在交联（cross-linked）了CTO（SEQ ID NO：21）的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。以原处（in situ）块方式使载玻片位于热循环仪（GeneproB4I，China）。为了循环分析，制备了5个相同的载玻片。如下实施了PTOCE反应：在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下60秒以及在55℃下60秒的过程实施了0循环、5循环、10循环20循环或者30循环。在根据各循环的数量的反应之后，将上述 载玻片在64℃下用蒸馏水清洗了1分钟。利用共聚焦激光扫描仪AxonGenePix4100A（分子器件，美国：molecular Device，US），通过5-μm像素分辨率的扫描获取了图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePixpro6.0软件（分子器件，美国：molecular Device，US）分析了荧光强度。就荧光强度而言，在去除周边本底后用点-中央值（spot-medians）表现。为了调查再现性，按每两个，对各点进行了测定点位。以反复的点的平均值表示了荧光强度。
如图23a以及23b所示，在存在模板的情况下，对靶核酸序列的荧光强度根据循环的数量增加。（0循环_RFU：28,078±460.3；5循环_RFU：35,967±555.1；10循环_RFU：44,674±186.0；20循环_RFU：65,423±2.1；以及30循环_RFU：65,426±2.8）。在无模板的情况下，没有根据循环的数量而产生的荧光强度的变化。
【实施例7：在微阵列中利用包含在指定温度下的终-点检测的PTOCE试验的多个靶核酸序列的检测】
本发明者追加实验了在微阵列中利用包含在指定温度下的终-点检测的PTOCE试验的多个靶核酸序列的检测。
PTO切割在个别容器中利用PCR过程来实施，将上述反应结果物的一部分移至CTO被固定化的微阵列。延长反应之后，通过终-点检测来检测了延长双链体的存在。
具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶被利用在上游引物和下游引物的延长、PTO的切割以及PTO片段的延长。
在试验期间形成的延长双链体被设计成具有单一标记。延长双链体的单一标记，由被标记为其5’-末端为荧光报道分子的Quasar570的PTO提供。PTO以及CTO的3’-末端用碳间隔区来阻断。
CTO作为连接肽具有聚（T）5，CTO利用位于其5’-末端的胺基（AminnoC7）固定在玻璃载玻片。在其5’-末端具有荧光报道分子（Quasar570）的标记探针，利用位于其3’-末端的胺基，固定在玻璃载玻片。
在指定温度下，测定了玻璃载玻片上的荧光强度。在延长双链体能够维持双-链的范围内决定了检测温度，上述温度高于非切割PTO以及CTO之间的杂交物的Tm值。利用了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）以及淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）的基因组DNA。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、PTO、CTO以及标记的序列如下：
NG-F5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’（SEQ ID5NO：10）
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）NG-PTO-5
5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCG TGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：17）
NG-CTO-S1
5’-[AminoC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAA GCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：18）
SA-F5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3’（SEQ ID NO：13）
SA-R25’-TTAGCTCCTGCTCCTAAACCA-3’（SEQ ID NO：22）
SA-PTO-25’-[Quasar570]AATCCGACCACGCTATGCTCATTCCGTGGTCAATCATTCGGTTTACG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：23）
SA_CTO-S1
5’-[AminoC7]TTTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCCCCA GCATAGCGTGGTCGGATT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：24）
Marker5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3'（SEQ ID NO：19）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记（tagging）部位。）
以与实施例5中利用的方案相同的方案实施了载玻片的制备。
用含有金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）和/或淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）的基因组DNA各100pg、下游引物（SEQ ID NO：10和/或13）各10pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2和/或22）各10pmole、PTO（SEQ ID NO：17和/或23）1pmole及含有2.5mM MgCl2的2X主混合液25μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））4单元（unit）的50μl的最终体积实施了切割反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在63℃下60秒的过程反复进行了60次。将作为上述结果物的混合物30μl应用于组装在交联（cross-linked）了CTO（SEQ IDNO：18以及24）的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。以原处（in situ）块方式使载玻片位于热循环仪（Genepro B4I，China）。在55℃下实施了20分钟延长反应。之后，在64℃下，将如此制备的载玻片用蒸馏水清洗了1分钟。在各个清洗之后，利用共聚焦激光扫描仪AxonGenePix4100A（分子器件，美国：molecular Device，US），通过10-μm像素分辨率的扫描获取了图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePixpro6.0软件（分子器件，美国：molecular Device，US）分析了荧光强度。就荧光强度而言，在去除周边本底后用点-中央值（spot-medians）表现。为了调查再现性，按每两个，对各点进行了测定点位。以反复的点的平均值表示了荧光强度。
如图24所示，在有金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）模板的情况下，检测出对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）的靶信号（RFU：65,192±198.7）。在有淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）模板的情况下，检测出对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）的靶信号（RFU：65,332±1.4）。在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）以及淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）的模板都有的情况下，对金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus，SA）的靶信号（RFU：65,302±0.7）以及对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）的靶信号（RFU：65,302±0.7）也均被检测出。
本发明涉及以下实施方式：
实施方式1、一种借助PTOCE试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（a），将所述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO进行杂交；所述上游寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与所述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；所述3’-靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’-标记部位不与所述靶核酸序列杂交；所述上游寡核苷酸位于所述PTO的上游；
步骤（b），在用于切割所述PTO的条件下，将所述步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；所述上游寡核苷酸或者其延长链诱导借助于具有所述5’核酸酶活性的酶的所述PTO的切割，这种所述切割放出包含所述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段；
步骤（c），将从所述PTO放出的所述片段与CTO进行杂交；所述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与所述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）制模部位，其包含与所述PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从所述PTO放出的所述片段与所述CTO的捕捉部位杂交；
步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延长反应；杂交于所述CTO的捕捉部位的所述片段，通过被延长来形成延长双链体，所述延长双链体具有根据（i）所述片段的序列和/或长度、（ii）所述CTO的序列和/或长度、或者（iii）所述片段的序列和/或长度和所述CTO的序列和/或长度可进行调节的Tm 值；
步骤（e），在规定范围的温度下，通过对所述延长双链体进行解链来提供表示所述延长双链体的存在的靶信号；所述靶信号由（i）与所述片段和/或所述CTO连接的至少一个标记、（ii）在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记、（iii）在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记和与所述片段和/或所述CTO连接的标记、或者（iv）嵌入标记来提供；以及
步骤（f），通过测定所述靶信号来检测所述延长双链体；所述延长双链体的存在表示所述靶核酸序列的存在。
实施方式2、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，通过解链分析来检测所述延长双链体的存在。
实施方式3、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，通过在经过所述步骤（e）中的解链之后实施杂交来提供表示所述延长双链体的存在的靶信号。
实施方式4、根据实施方式3所述的方法，其特征在于，所述延长双链体的存在是通过杂交分析来检测。
实施方式5、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，所述靶信号由与所述片段和/或所述CTO连接的至少一个的标记来提供。
实施方式6、根据实施方式5所述的方法，其特征在于，
所述片段或者所述CTO具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
所述步骤（e）中的所述延长双链体的解链，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来在所述步骤（e）中提供所述靶信号。
实施方式7、根据实施方式5所述的方法，其特征在于，
所述片段具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个；
所述CTO具有所述相互作用性双重标记中的剩余一个；
所述步骤（e）中的所述延长双链体的解链，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来在所述步骤（e）中提供所述靶信号。
实施方式8、根据实施方式5所述的方法，其特征在于，所述片段或者所述CTO具有单一标记，所述步骤（e）中的所述延长双链体的解链，诱导来自所述单一标记的信号的变化来在步骤（e）中提供所述靶信号。
实施方式9、根据实施方式5所述的方法，其特征在于，
在形成非切割PTO以及所述CTO之间的杂交物的情况下，所述标记位于所述杂交物在步骤（e）中不提供非-靶信号的范围内。
实施方式10、根据实施方式5所述的方法，其特征在于，
在形成非切割PTO以及所述CTO之间的杂交物的情况下，所述标记位于所述杂交物在步骤（e）中提供非-靶信号的范围内；
所述延长双链体的Tm值高于所述非切割PTO及所述CTO之间的所述杂交物的Tm值。
实施方式11、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，
所述靶信号由在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的单一标记来提供；
所述被***的单一标记与在所述延长反应期间***的核苷酸连接；
步骤（e）中的所述延长双链体的解链，诱导来自所述单一标记的信号的变化来提供步骤（e）中的所述靶信号。
实施方式12、根据实施方式11所述的方法，其特征在于，
在所述延长反应期间***的所述核苷酸具有第一非-天然碱基；
所述CTO具有核苷酸，该核苷酸具有对所述第一非-天然碱基有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基。
实施方式13、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，
所述靶信号由在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记和与所述片段和/或所述CTO连接的标记来提供，所述被***的标记与在所述延长反应期间***的核苷酸连接；
所述两个标记为报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
步骤（e）中的所述延长双链体的解链，诱导来自所述相互作用性 双重标记的信号的变化来提供步骤（e）中的所述靶信号。
实施方式14、根据实施方式13所述的方法，其特征在于，
在所述延长反应期间***的所述核苷酸具有第一非-天然碱基；
所述CTO具有核苷酸，该核苷酸具有对所述第一非-天然碱基有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基。
实施方式15、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，所述PTO和/或CTO因其3’-末端被阻断，因而防止延长。
实施方式16、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，所述上游寡核苷酸为上游引物或者上游探针。
实施方式17、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，所述上游寡核苷酸具有与所述PTO的3’-靶向部位部分重叠的序列。
实施方式18、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，所述上游寡核苷酸位于与所述PTO相邻近的部位，以能够诱导借助于具有5’核酸酶活性的所述酶的所述PTO的切割。
实施方式19、根据实施方式16所述的方法，其特征在于，所述上游引物通过其延长链来诱导借助于具有5’核酸酶活性的所述酶的所述PTO的切割。
实施方式20、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，所述捕捉部位在其5’-末端的一部分包含与所述PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的核苷酸序列。
实施方式21、根据实施方式20所述的方法，其特征在于，与所述PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的核苷酸序列为1-5核苷酸长度。
实施方式22、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，所述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者步骤（a）-步骤（f）的步骤。
实施方式23、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，步骤（a）-步骤（f）在一个反应容器或者个别反应容器中实施。
实施方式24、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，
所述方法是为了检测至少两种靶核酸序列而实施；
所述上游寡核苷酸包含至少两种寡核苷酸；
所述PTO包含至少两种PTO；
所述CTO包含至少一种CTO。
实施方式25、根据实施方式24所述的方法，其特征在于，所述至少两种PTO的5’-标记部位具有相同的序列。
实施方式26、根据实施方式24所述的方法，其特征在于，相当于所述至少两种所述靶核酸序列的所述延长双链体具有相异的Tm值。
实施方式27、根据实施方式24所述的方法，其特征在于，相当于所述至少两种所述靶核酸序列的所述至少两种所述靶信号由相异种类的标记提供。
实施方式28、根据实施方式24所述的方法，其特征在于，相当于所述至少两种所述靶核酸序列的所述至少两种所述靶信号由相同种类的标记提供。
实施方式29、根据实施方式28所述的方法，其特征在于，
相当于所述至少两种所述靶核酸序列的所述至少两种所述靶信号由相同种类的标记提供；
相当于所述至少两种所述靶核酸序列的所述延长双链体具有相异的Tm值。
实施方式30、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，
所述上游寡核苷酸为上游引物；
为了实现所述上游引物的所述延长，在步骤（b）利用模板-依赖性核酸聚合酶。
实施方式31、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，具有所述5’核酸酶活性的所述酶为具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶或者FEN核酸酶。
实施方式32、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，所述靶核酸序列包含核苷酸变异。
实施方式33、根据实施方式1所述的方法，其特征在于，所述CTO通过其5’-末端或者3’-末端在固相基质上实现固定化。
实施方式34、根据实施方式33所述的方法，其特征在于，所述靶信号由与所述片段连接的单一标记或者在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的单一标记来提供。
实施方式35、根据实施方式1至34中的任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在下游引物的存在下实施。
实施方式36、一种借助PTOCE试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（a），将所述靶核酸序列与包含上游引物以及下游引物的一对引物以及PTO进行杂交；所述上游引物以及所述下游引物分别包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与所述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；所述3’-靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’-标记部位则不与所述靶核酸序列杂交；所述PTO位于所述上游引物以及所述下游引物之间；所述PTO因其3’-末端被阻断，因而防止延长；
步骤（b），在用于延长所述引物以及切割所述PTO的条件下，将步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶相接触；在所述PTO与所述靶核酸序列杂交的情况下，所述上游引物被延长，所述延长链诱导借助于具有所述5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的所述PTO的切割，这种所述切割放出包含所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤（c），将从所述PTO放出的所述片段与CTO进行杂交；所述CTO沿着3’→5’方向包含（i）捕捉部位，其包含与所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）制模部位，其包含与所述5’-标记部位以及所述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从所述PTO放出的所述片段与所述CTO的所述捕捉部位杂交；
步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延长反应；杂交于所述CTO的所述捕捉部位的所述片段，通过被延长来形成延长双链体；所述延长双链体具有根据（i）所述片段的序列和/或长度、（ii）所述CTO的序列和/或长度、或者（iii）所述片段的所述序列和/或长度和所述CTO的所述序列和/或长度可进行调节的Tm值；
步骤（e），在规定范围的温度下，通过对所述延长双链体进行解链来提供表示所述延长双链体的存在的靶信号；所述靶信号由（i）与所述片段和/或所述CTO连接的至少一个标记、（ii）在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记、（iii）在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记和与所述片段和/或所述CTO连接的标记、或者（iv）嵌入标记来提供；以及
步骤（f），通过测定所述靶信号来检测所述延长双链体；所述延长双链体的存在表示所述靶核酸序列的存在。
实施方式37、根据实施方式36所述的方法，其特征在于，所述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者步骤（a）-步骤（f）的步骤。
实施方式38、根据实施方式36所述的方法，其特征在于，所述方法是为了检测至少两种靶核酸序列而实施。
实施方式39、根据实施方式38所述的方法，其特征在于，
相当于所述至少两种所述靶核酸序列的所述至少两种所述靶信号由相同种类的标记提供；
相当于所述至少两种所述靶核酸序列的所述延长双链体具有相异的Tm值。
实施方式40、一种借助PTOCE（PTO切割以及延长）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（a），将所述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO进行杂交；所述上游寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列； 所述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及（ii）5’-标记部位，其包含与所述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；所述3’-靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’-标记部位则不与所述靶核酸序列杂交；所述上游寡核苷酸位于所述PTO的上游；
步骤（b），在用于所述PTO的切割的条件下，将步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；所述上游寡核苷酸或者其延长链诱导借助于具有所述5’核酸酶活性的酶的所述PTO的切割，这种所述切割放出包含所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤（c），将从所述PTO放出的所述片段与CTO进行杂交；所述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）制模部位，其包含与所述PTO的所述5’-标记部位以及所述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从所述PTO放出的所述片段与所述CTO的所述捕捉部位杂交；
步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延长反应；杂交于所述CTO的所述捕捉部位的所述片段，通过被延长来形成延长双链体；所述延长双链体具有根据（i）所述片段的序列和/或长度、（ii）所述CTO的序列和/或长度、或者（iii）所述片段的所述序列和/或长度和所述CTO的所述序列和/或长度可进行调节的Tm值；所述延长双链体借助（i）与所述片段和/或CTO连接的至少一个标记、（ii）在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记、（iii）与所述片段和/或所述CTO连接的至少一个标记和在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记、或者（iv）嵌入标记来提供靶信号；以及
步骤（e），在所述延长双链体维持其双-链形态的指定温度下，通过测定所述靶信号来检测所述延长双链体，由此，所述延长双链体的存在表示所述靶核酸序列的存在。
实施方式41、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，由所述延长双链体提供的所述靶信号是在步骤（d）的延长期间被提供；
非切割PTO以及所述CTO之间的杂交物不提供非-靶信号。
实施方式42、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，
由所述延长双链体提供的所述靶信号是在步骤（c）中通过所述片段以及所述CTO的所述杂交来提供；
在步骤（d）中，形成所述延长双链体来维持靶信号；
由非切割PTO以及所述CTO之间的所述杂交物来提供非-靶信号；
所述指定温度高于比所述杂交物的Tm值减少10℃的温度。
实施方式43、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，所述靶信号由与所述片段和/或所述CTO连接的至少一个标记提供。
实施方式44、根据实施方式43所述的方法，其特征在于，
所述片段具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
步骤（c）中的所述片段以及所述CTO的杂交，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号；
由所述延长双链体来维持所述靶信号。
实施方式45、根据实施方式43所述的方法，其特征在于，
所述CTO具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
步骤（c）中的所述片段以及所述CTO的所述杂交，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供所述靶信号；
由所述延长双链体来维持所述靶信号。
实施方式46、根据实施方式43所述的方法，其特征在于，
所述CTO具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
在步骤（d）中，通过延长所述片段，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供所述靶信号。
实施方式47、根据实施方式43所述的方法，其特征在于，
所述片段具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个；
所述CTO具有所述相互作用性双重标记中的剩余一个；
步骤（c）中的所述片段以及所述CTO的所述杂交，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供所述靶信号；
由所述延长双链体来维持所述靶信号。
实施方式48、根据实施方式43所述的方法，其特征在于，
所述片段或者所述CTO具有单一标记；
步骤（c）中的所述片段以及所述CTO的所述杂交，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供所述靶信号；
由所述延长双链体来维持所述靶信号。
实施方式49、根据实施方式43所述的方法，其特征在于，
所述CTO具有单一标记；
在步骤（d）中，通过延长所述片段，诱导来自所述单一标记的信号的变化来提供所述靶信号。
实施方式50、根据实施方式43所述的方法，其特征在于，在形成非切割PTO以及所述CTO之间的杂交物的情况下，所述标记将位于所述杂交物在步骤（d）中不提供非-靶信号的范围内。
实施方式51、根据实施方式43所述的方法，其特征在于，
在形成非切割PTO以及所述CTO之间的杂交物的情况下，所述标记将位于所述杂交物在步骤（d）中提供非-靶信号的范围内；
所述延长双链体的Tm值高于所述非切割PTO及所述CTO之间的所述杂交物的Tm值。
实施方式52、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，
所述靶信号在所述延长反应期间由***在所述延长双链体内的单一标记来提供；
所述***的单一标记与在所述延长反应期间***的核苷酸连接；
在步骤（d）中，通过延长所述片段，诱导来自所述单一标记的 信号的变化来提供步骤（d）中的所述靶信号。
实施方式53、根据实施方式52所述的方法，其特征在于，
在所述延长反应期间***的所述核苷酸具有第一非-天然碱基；
所述CTO具有核苷酸，该核苷酸具有对所述第一非-天然碱基有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基。
实施方式54、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，
所述靶信号由在所述延长反应期间***在所述延长双链体内的标记和所述片段和/或与所述CTO连接的标记来提供；
所述***的标记与在所述延长反应期间***的核苷酸连接；
所述两个标记为报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
在步骤（d）中，通过延长所述片段，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供所述靶信号。
实施方式55、根据实施方式54所述的方法，其特征在于，
在所述延长反应期间***的所述核苷酸具有第一非-天然碱基；
所述CTO具有核苷酸，该核苷酸具有对所述第一非-天然碱基有着特异结合亲和性的第二非-天然碱基。
实施方式56、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，所述PTO和/或CTO因其3’-末端被阻断，因而防止延长。
实施方式57、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，所述上游寡核苷酸为上游引物或者上游探针。
实施方式58、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，所述上游寡核苷酸位于与所述PTO相邻近的部位，以能够诱导借助于具有5’核酸酶活性的所述酶的所述PTO的所述切割。
实施方式59、根据实施方式57所述的方法，其特征在于，所述上游引物通过其延长链来诱导借助于具有5’核酸酶活性的所述酶的所述PTO的所述切割。
实施方式60、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，所述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者步骤（a）-步骤（e）的步骤。
实施方式61、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，步骤（a）-步骤（e）在一个反应容器或者个别反应容器中实施。
实施方式62、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，
所述方法是为了检测至少两种靶核酸序列而实施；
所述上游寡核苷酸包含至少两种寡核苷酸；
所述PTO包含至少两种PTO；
所述CTO包含至少一种CTO。
实施方式63、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，所述上游寡核苷酸为上游引物，为了实现所述上游引物的所述延长，在步骤（b）中利用模板-依赖性核酸聚合酶。
实施方式64、根据实施方式40所述的方法，其特征在于，所述CTO通过其5’-末端或者3’-末端在固相基质上实现固定化。
实施方式65、根据实施方式64所述的方法，其特征在于，所述靶信号由与所述片段连接的单一标记或者在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的单一标记提供。
实施方式66、根据实施方式40至65中的任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在存在下游引物的情况下实施。
实施方式67、一种用于借助PTOCE试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包含：
（a）上游寡核苷酸；所述上游寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
（b）PTO；所述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与所述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；所述3’-靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’-标记部位不与所述靶核酸序列杂交；所述上游寡核苷酸位于所述PTO的上游；所述上游寡核苷酸或者其延长链诱导借助于具有5’核酸酶活性的酶的所述PTO的切割，这种所述切割放出包含所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分的片段；以及
（c）CTO；所述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列；以及（ii）制模部位，其包含与所述PTO的所述5’-标记部位以及所述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从所述PTO放出的所述片段与所述CTO的所述捕捉部位杂交；并且，与所述CTO的所述捕捉部位杂交的所述片段借助模板-依赖性核酸聚合酶而被延长来形成延长双链体。
实施方式68、根据实施方式67所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含具有5’核酸酶活性的酶。
实施方式69、根据实施方式67所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含模板-依赖性核酸聚合酶。
实施方式70、根据实施方式67所述的试剂盒，其特征在于，所述PTO和/或所述CTO具有至少一个标记。
实施方式71、根据实施方式67所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记。
实施方式72、根据实施方式67所述的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒还包含在所述延长反应期间***到所述延长双链体的标记，
所述PTO和/或所述CTO具有至少一个标记。
实施方式73、根据实施方式67所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含嵌入标记。
实施方式74、根据实施方式70所述的试剂盒，其特征在于，所述标记为单一标记或者相互作用性双重标记。
实施方式75、根据实施方式67所述的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒用于检测至少两种核酸序列；
所述上游寡核苷酸包含至少两种寡核苷酸；
所述PTO包含至少两种PTO；
所述CTO包含至少两种CTO。
实施方式76、根据实施方式67所述的试剂盒，其特征在于，所述CTO通过其5’-末端或者3’-末端在固相基质上实现固定化。
实施方式77、根据实施方式67至76中的任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含下游引物。
对本发明的优选实例进行了详细记述，可以进行根据本发明的原理的变形及修正，本发明的范围借助所附的权利要求和与其等同的内容而定义，这对于本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

Claims (24)

1.一种借助PTOCE(PTO切割以及延长)试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(a)，将所述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO(探测和标记寡核苷酸)进行杂交；所述上游寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述PTO包含：(i)3’-靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，其包含与所述靶核酸序列非互补的核苷酸序列；所述3’-靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’-标记部位则不与所述靶核酸序列杂交；所述上游寡核苷酸位于所述PTO的上游；
步骤(b)，在用于所述PTO的切割的条件下，将步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；所述上游寡核苷酸或者其延长链诱导借助于具有所述5’核酸酶活性的酶对所述PTO的切割，从而所述切割释放出包含所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，将从所述PTO释放出的所述片段与CTO(捕捉和制模寡核苷酸)进行杂交；所述CTO沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)制模部位，其包含与所述PTO的所述5’-标记部位以及所述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从所述PTO释放出的所述片段与所述CTO的所述捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用步骤(c)的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延长反应；杂交于所述CTO的所述捕捉部位的所述片段被延长，形成延长双链体；所述延长双链体具有根据(i)所述片段的序列和/或长度、(ii)所述CTO的序列和/或长度、或者(iii)所述片段的序列和/或长度和所述CTO的序列和/或长度可进行调节的Tm值；所述延长双链体借助(i)与所述片段和/或CTO连接的至少一个标记、(ii)在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记、(iii)与所述片段和/或所述CTO连接的至少一个标记和在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的标记、或者(iv)嵌入标记来提供靶信号；以及
步骤(e)，在所述延长双链体维持其双链形态的指定温度下，通过测定所述靶信号来检测所述延长双链体，由此，所述延长双链体的存在表示所述靶核酸序列的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，由所述延长双链体提供的所述靶信号是在步骤(d)的延长期间被提供；
未切割的PTO以及所述CTO之间的杂交物不提供非靶信号。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
由所述延长双链体提供的所述靶信号是在步骤(c)中通过所述片段以及所述CTO的所述杂交来提供；
在步骤(d)中，所述延长双链体的形成维持了靶信号；
其中未切割的PTO以及所述CTO之间的杂交物确实提供了非靶信号；
所述指定温度足以解离所述杂交物而去除非靶信号。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶信号由与所述片段和/或所述CTO连接的至少一个标记提供。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述片段具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
步骤(c)中所述片段以及所述CTO的杂交诱导了来自所述相互作用性双重标记的信号的变化，由此提供靶信号；
并且所述延长双链体维持所述靶信号。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述CTO具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
步骤(c)中的所述片段以及所述CTO的所述杂交诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供所述靶信号；
所述延长双链体维持了所述靶信号。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述CTO具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
在步骤(d)中，通过延长所述片段，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供所述靶信号。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述片段具有包含报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个；
所述CTO具有所述相互作用性双重标记中的剩余一个；
步骤(c)中的所述片段以及所述CTO的所述杂交，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供所述靶信号；
由所述延长双链体来维持所述靶信号。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述片段或者所述CTO具有单一标记；
步骤(c)中的所述片段以及所述CTO的所述杂交，诱导来自所述单一标记的信号的变化来提供所述靶信号；
由所述延长双链体来维持所述靶信号。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述CTO具有单一标记；
在步骤(d)中，通过延长所述片段，诱导来自所述单一标记的信号的变化来提供所述靶信号。
11.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标记被放置的程度是，在形成非切割PTO以及所述CTO之间的杂交物的情况下所述杂交物在步骤(d)中不提供非靶信号。
12.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述标记被放置的程度是，在形成非切割PTO以及所述CTO之间的杂交物的情况下所述杂交物在步骤(d)中提供非靶信号；
所述延长双链体的Tm值高于所述非切割PTO及所述CTO之间的所述杂交物的Tm值。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述靶信号在所述延长反应期间由***在所述延长双链体内的单一标记来提供；
所述***的单一标记与在所述延长反应期间***的核苷酸连接；
在步骤(d)中，通过延长所述片段，诱导来自所述单一标记的信号的变化来提供步骤(d)中的所述靶信号。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，
在所述延长反应期间***的所述核苷酸具有第一非天然碱基；
所述CTO具有核苷酸，该核苷酸具有对所述第一非天然碱基有着特异结合亲和性的第二非天然碱基。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述靶信号由在所述延长反应期间***在所述延长双链体内的标记和与所述片段和/或所述CTO连接的标记来提供；
所述***的标记与在所述延长反应期间***的核苷酸连接；
***到所述延长双链体内的所述标记和与所述片段和/或所述CTO连接的所述标记为报道分子以及猝灭分子的相互作用性双重标记；
在步骤(d)中，通过延长所述片段，诱导来自所述相互作用性双重标记的信号的变化来提供所述靶信号。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，
在所述延长反应期间***的所述核苷酸具有第一非天然碱基；
所述CTO具有核苷酸，该核苷酸具有对所述第一非天然碱基有着特异结合亲和性的第二非天然碱基。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上游寡核苷酸为上游引物或者上游探针。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括重复进行步骤(a)-步骤(b)、步骤(a)-步骤(d)或者步骤(a)-步骤(e)的步骤，并且在重复循环之间包括变性。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)-(f)在一个反应管内或几个分开的反应管内进行。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述方法是为了检测至少两种靶核酸序列而实施；
所述上游寡核苷酸包含至少两种寡核苷酸；
所述PTO包含至少两种PTO；
所述CTO包含至少一种CTO。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CTO通过其5’-末端或者3’-末端在固相基质上实现固定化。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶信号由与所述片段连接的单一标记或者在所述延长反应期间***到所述延长双链体内的单一标记提供。
23.根据权利要求1至22中的任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在存在下游引物的情况下实施。
24.一种用于实施权利要求1－23中任一项的方法、借助PTOCE(PTO切割和延长)试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包含：
(a)上游寡核苷酸；所述上游寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
(b)PTO(探测和标记寡核苷酸)；所述PTO包含：(i)3’-靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，其包含与所述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；所述3’-靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’-标记部位不与所述靶核酸序列杂交；所述上游寡核苷酸位于所述PTO的上游；所述上游寡核苷酸或者其延长链诱导借助于具有5’核酸酶活性的酶对所述PTO的切割，从而所述切割释放出包含所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分的片段；以及
(c)CTO(捕捉和制模寡核苷酸)；所述CTO沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与所述PTO的所述5’-标记部位或者所述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列；以及(ii)制模部位，其包含与所述PTO的所述5’-标记部位以及所述3’-靶向部位非互补的核苷酸序列；从所述PTO释放出的所述片段与所述CTO的所述捕捉部位杂交；并且，与所述CTO的所述捕捉部位杂交的所述片段借助模板依赖性核酸聚合酶而被延长来形成延长双链体。
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