CN114032337A - 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents
一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114032337A CN114032337A CN202111530572.7A CN202111530572A CN114032337A CN 114032337 A CN114032337 A CN 114032337A CN 202111530572 A CN202111530572 A CN 202111530572A CN 114032337 A CN114032337 A CN 114032337A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- seq
- sequence
- clo
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种多重核酸检测试剂盒，其可以在单管PCR反应体系中同时进行甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、I～IV型副流感病毒检测。基于该检测试剂盒还提出一种呼吸道病原体核酸检测方法，该方法能够以更简便的反应体系、更低的检测成本来对样品中的每一个靶基因序列进行准确有效地区分和测定，其检测特异性高、灵敏度高，检测结果易判读，有利于在实际检测中大量推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
呼吸道病原体感染是临床上常见的感染性疾病，呼吸道病原体可以通过空气传播，引起急性呼吸道疾病的病原体，具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点，可引起广泛的急性上呼吸道和下呼吸道疾病，严重危害人类的健康。
常见的呼吸道病原体有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、偏肺病毒、鼻病毒等。呼吸道感染性疾病具有相似的临床症状和流行特征，早诊断、早治疗、早隔离是防止的根本。呼吸道病原体检测技术有多种，主要方法有抗原检测、抗体检测、病毒分离培养、病毒核酸检测等。然而，通过临床特征和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的病原体种类。国内外大量文献和专利均已报道，采用病毒核酸检测方法进行呼吸道病毒的检测，相对于病毒培养鉴定和抗原抗体检测，具有检测快速、操作简捷、特异性好等显著优点。
美国专利US 6015664申请中公开了一种使用传统多重PCR扩增和线性反向探针杂交技术的核酸检测方法，其可以同时检测七种呼吸道病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型呼吸道合胞病毒、乙型呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型)。然而，传统多重PCR扩增法需要在同一个PCR体系中加入大量引物序列，容易产生大量的引物二聚体，影响PCR扩增和后续杂交的灵敏度和准确性。线性反向探针杂交检测技术也具有检测操作步骤繁琐、检测耗时长以及PCR产物污染实验室风险高等局限性。
Poritz等(PloS One.2011；6(10)：e26047)描述了一种基于巢氏多重PCR扩增和微流控芯片检测技术的核酸检测方法，其能够同时检测17种呼吸道病毒和3种呼吸道细菌的基因组，并被命名为FilmArray呼吸道症候群检测试剂盒。FilmArray检测试剂盒采用巢氏PCR技术来提高多重PCR的灵敏度和特异性。同时，微流控芯片技术的引入大幅度缩短了PCR扩增时间。FilmArray检测试剂盒虽然实现了对20种呼吸道病原体的闭管状态检测，但是其需要在试剂盒中集成102个PCR反应体系，并且每个PCR反应体系实际只检测1个病原体核酸序列。另外，FilmArray检测试剂盒本质上是基于单重PCR检测技术，其具有检测通量较低、检测成本较高的局限性。
中国专利申请CN 105936945 A中公开了一种基于传统多重PCR扩增和四色实时荧光检测技术的核酸检测方法，其能够同时检测4种呼吸道病毒(流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和人偏肺病毒)，实时荧光PCR技术受到实时荧光定量PCR仪检测荧光通道数量的限制，该方法只能在一个PCR反应中检测4种不同的病毒，难以满足种类繁多的呼吸道病毒检测需求。
综述所述，虽然已经报道了多种呼吸道病原体检测方法，但是都有各自的局限性。因此，仍然需要开发一种更为快速简便的高通量呼吸道病毒核酸检测方法。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提出一种多重核酸检测试剂盒。
包括如下技术方案：
一种多重核酸检测试剂盒，其特征在于，所述多重核酸检测试剂盒包括针对呼吸道病原体核酸序列的扩增引物组和检测探针组，所述扩增引物组包括CLO引物对(Convexloop oligo，CLO)，所述检测探针组包括T探针和B探针；所述CLO引物对用于扩增呼吸道病原体核酸序列，所述T探针包括靶序列区和人工序列区，T探针的靶序列区与呼吸道病原体核酸序列反向互补；所述呼吸道病原体选自甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、副流感病毒中的任意至少一种。
本发明的目的之一还在于提出上述多重核酸检测试剂盒在呼吸道病原体检测中的应用。
本发明的目的之一还在于提出一种呼吸道病原体核酸检测方法。
包括如下技术方案：
获取待测生物样本核酸；
采用上述多重核酸检测试剂盒对上述生物样本核酸进行PCR检测和熔解曲线分析。
本发明的发明人基于对呼吸道病原体的深入研究，研制出了一种更为快速简便、灵敏特异、稳定可靠的多重核酸检测试剂盒，该检测试剂盒可以在单管PCR反应体系中同时进行甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、副流感病毒I～IV型检测。
同时，发明人基于本发明制备得到的呼吸道病原体核酸检测试剂盒还提出一种呼吸道病原体核酸检测方法，该方法能够以更简便的反应体系、更低的检测成本来对样品中的每一个靶基因序列进行准确有效地区分和测定，其检测特异性好、灵敏度高，检测结果易判读，有利于在实际检测中大量推广应用。
附图说明
图1为本发明试剂盒中各引物探针的结构原理图。
图2为实施例1中本发明试剂盒对阳性质控品检测的部分结果，其中，A为FAM通道下的熔解曲线图，C为FAM通道下的扩增曲线图，B为VIC通道下的熔解曲线图，D为VIC通道下的扩增曲线图。
图3为实施例1中本发明试剂盒对阳性质控品检测的部分结果，其中，A为ROX通道下的熔解曲线图，C为ROX通道下的扩增曲线图，B为CY5通道下的熔解曲线图，D为CY5通道下的扩增曲线图。
图4为实施例3中采用病原体标准品对本发明试剂盒的灵敏度检测部分结果，其中，A为针对甲型流感病毒的熔解曲线图，D为针对甲型流感病毒的扩增曲线图，B为针对乙型流感病毒的熔解曲线图，E为针对乙型流感病毒的扩增曲线图，C为针对合胞病毒的熔解曲线图，F为针对合胞病毒的扩增曲线图。
图5为实施例3中采用病原体标准品对本发明试剂盒的灵敏度检测部分结果，其中，A为针对腺病毒的熔解曲线图，D为针对腺病毒的扩增曲线图，B为针对副流感病毒的熔解曲线图，E为针对副流感病毒的扩增曲线图，C为针对肺炎支原体的熔解曲线图，F为针对肺炎支原体的扩增曲线图。
图6为实施例3中采用病原体标准品对本发明试剂盒的灵敏度检测部分结果，其中，A为针对偏肺病毒的熔解曲线图，C为针对偏肺病毒的扩增曲线图，B为针对鼻病毒的熔解曲线图，D为针对鼻病毒的扩增曲线图。
图7为实施例4中本发明试剂盒的特异性检测实验组的结果，其中，A为24种交叉反应验证病原体的熔解曲线图，B为24种交叉反应验证病原体的扩增曲线图。
图8为实施例4中本发明试剂盒的特异性检测对照组的结果，其中，A为针对样本中的甲型流感病毒、肺炎支原体、腺病毒和内标的熔解曲线图，B为针对样本中的甲型流感病毒、肺炎支原体、腺病毒和内标的扩增曲线图。
图9为实施例5中本发明试剂盒对含有干扰物质样本的部分检测结果，其中，A为针对样本中的甲型流感病毒的熔解曲线图，C为针对样本中的甲型流感病毒的扩增曲线图，B为针对样本中的腺病毒的熔解曲线图，D为针对样本中的腺病毒的扩增曲线图。
图10为实施例5中本发明试剂盒对含有干扰物质样本的部分检测结果，其中，A为针对样本中的肺炎支原体的熔解曲线图，C为针对样本中的肺炎支原体的扩增曲线图，B为针对样本中的乙型流感病毒的熔解曲线图，D为针对样本中的乙型流感病毒的扩增曲线图。
图11为实施例5中本发明试剂盒对含有干扰物质样本的部分检测结果，其中，A为针对样本中的偏肺病毒的熔解曲线图，C为针对样本中的偏肺病毒的扩增曲线图，B为针对样本中的副流感病毒的熔解曲线图，D为针对样本中的副流感病毒的扩增曲线图。
图12为实施例5中本发明试剂盒对含有干扰物质样本的部分检测结果，其中，A为针对样本中的呼吸道合胞病毒的熔解曲线图，C为针对样本中的呼吸道合胞病毒的扩增曲线图，B为针对样本中的鼻病毒的熔解曲线图，D为针对样本中的鼻病毒的扩增曲线图。
图13为实施例6中本发明试剂盒中引物优化的部分检测结果，其中，A为针对甲型流感病毒的熔解曲线图，D为针对甲型流感病毒的扩增曲线图，B为针对乙型流感病毒的熔解曲线图，E为针对乙型流感病毒的扩增曲线图，C为针对合胞病毒的熔解曲线图，F为针对合胞病毒的扩增曲线图。
图14为实施例6中本发明试剂盒中引物优化的部分检测结果，其中，A为针对内标HBB内参基因的熔解曲线图，D为针对内标HBB内参基因的扩增曲线图，B为针对鼻病毒的熔解曲线图，E为针对鼻病毒的扩增曲线图，C为针对肺炎支原体的熔解曲线图，F为针对肺炎支原体的扩增曲线图。
图15为实施例6中本发明试剂盒中引物优化的部分检测结果，其中，A为针对腺病毒的熔解曲线图，D为针对腺病毒的扩增曲线图，B为针对I型副流感病毒的熔解曲线图，E为针对I型副流感病毒的扩增曲线图，C为针对II型副流感病毒的熔解曲线图，F为针对II型副流感病毒的扩增曲线图。
图16为实施例6中本发明试剂盒中引物优化的部分检测结果，其中，A为针对III型副流感病毒的熔解曲线图，D为针对III型副流感病毒的扩增曲线图，B为针对IV型副流感病毒的熔解曲线图，E为针对IV型副流感病毒的扩增曲线图，C为针对人偏肺病毒的熔解曲线图，F为针对人偏肺病毒的扩增曲线图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明的一些实施例提供了一种多重核酸检测试剂盒，其特征在于，所述多重核酸检测试剂盒包括针对呼吸道病原体核酸序列的扩增引物组和检测探针组，所述扩增引物组包括CLO引物对，所述检测探针组包括T探针和B探针；所述CLO引物对用于扩增呼吸道病原体核酸序列，所述T探针包括靶序列区和人工序列区，靶序列区与呼吸道病原体核酸序列反向互补；所述呼吸道病原体选自甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、副流感病毒中的任意至少一种。
在其中一些实施例中，上述多重核酸检测试剂盒包括以下任意至少一组组分：
第一组：针对甲型流感病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示，T探针序列如SEQ ID NO.27所示，B探针序列如SEQ IDNO.28所示；
第二组：针对乙型流感病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示，T探针序列如SEQ ID NO.29所示，B探针序列如SEQ IDNO.30所示；
第三组：针对呼吸道合胞病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示，T探针序列如SEQ ID NO.31所示，B探针序列如SEQ IDNO.32所示；
第四组：针对腺病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ IDNO.7～SEQ ID NO.8所示，T探针序列如SEQ ID NO.33所示，B探针序列如SEQ ID NO.34所示；
第五组：针对肺炎支原体的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQID NO.9～SEQ ID NO.10所示，T探针序列如SEQ ID NO.35所示，B探针序列如SEQ ID NO.36所示；
第六组：针对副流感病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQID NO.11～SEQ ID NO.18所示，T探针序列如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.40所示，B探针序列如SEQ ID NO.41所示；
第七组：针对鼻病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ IDNO.19～SEQ ID NO.20所示，T探针序列如SEQ ID NO.42所示，B探针序列如SEQ ID NO.43所示；
第八组：针对人偏肺病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQID NO.21～SEQ ID NO.22所示，T探针序列如SEQ ID NO.44所示，B探针序列如SEQ IDNO.45所示。
需要说明的是，上述“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等仅用于描述目的，用以区分所限定的物质，而不以任何方式限定次序或主次。
在其中一些实施例中，上述多重核酸检测试剂盒包括以上任意至少三组组分；优选为包括以上任意至少五组组分；更优选为包括以上八组组分。
在其中一些实施例中，上述多重核酸检测试剂盒，还包括通用引物对，所述通用引物对中的上游通用引物与CLO引物对中上游CLO引物的loop区一致；所述通用引物对中的下游通用引物与CLO引物对中下游CLO引物的loop区一致。进一步地，所述通用引物对序列如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.26所示。
在其中一些实施例中，上述通用引物可在PCR扩增的第3个循环之后，对前2个循环产生的所有PCR产物进行扩增，从而确保各靶标的扩增均一性。
在其中一些实施例中，上述多重核酸检测试剂盒，还包括针对内参核酸序列的扩增引物组和检测探针组；进一步地，所述内参为HBB基因。
在其中一些实施例中，上述多重核酸检测试剂盒，还包括以下组分：
第九组：针对HBB基因的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ IDNO.23～SEQ ID NO.24所示，T探针序列如SEQ ID NO.46所示，B探针序列如SEQ ID NO.47所示。
本发明的一些实施例提供了上述多重核酸检测试剂盒在呼吸道病原体检测中的应用。
在其中一些实施例中，上述试剂盒分型检测的呼吸道病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、副流感病毒中的任意至少一种。
本发明的一些实施例提供了一种呼吸道病原体核酸检测方法，其包括如下步骤：
获取待测生物样本核酸；
采用上述多重核酸检测试剂盒对上述生物样本核酸进行PCR检测和熔解曲线分析。
在其中的一些实施例中，通过对上述PCR反应得到的产物进行熔解曲线分析，从而判断反应体系中所存在的目标呼吸道病原体的核酸序列种类。
在其中一些实施例中，上述PCR检测的反应程序为降落PCR。
在其中一些实施例中，上述生物样本包括，但不限于血清、血浆、全血、痰液、拭子、灌洗液、新鲜组织、***固定石蜡包埋组织、尿液、细菌培养物、病毒培养物、细胞系培养物、人工合成的质粒。
在其中一些实施例中，上述生物样本核酸为核糖核酸时，反应体系还包括逆转录酶，反应程序还包括逆转录PCR程序。
实施例1呼吸道病原体核酸检测试剂盒的组成
1、引物和探针
本发明呼吸道病原体核酸检测试剂盒包括针对呼吸道病原体的核酸序列的扩增引物组和检测探针组，其中试剂盒中的扩增引物具体如下表1-1所示(“F”表示上游引物，“R”表示下游引物)，针对各呼吸道病原体的探针具体如下表1-2所示：
表1-1
表1-2
表格中“-”连接表示修饰基团的位置以及修饰基团的名称。
2、质控品
试剂盒中含有阴性质控品和阳性质控品，且阴阳性质控品与待测标本需要同步处理。阳性质控品由含甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、副流感病毒和内参基因片段的假病毒组成；阴性质控品由含内参基因片段的假病毒组成。阴阳性质控品购自复百澳(苏州)生物科技有限公司。
3、酶浓度
逆转录酶的浓度为5U/μL-15U/μL，逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)或Tth酶；DNA聚合酶为5U/μL-15U/μL，DNA聚合酶可以是Taq酶。
4、PCR体系
4.1引物配制：CLO-F1/CLO-R1～CLO-F12/CLO-R12和Up-F、Up-R，共26条；离心10,000rpm，3min；用TE溶解为100pmol/μL母液，按照下表1-3配制预混液：
表1-3
按上表配制得到的100μL预混液，CLO-F1/CLO-R1～CLO-F12/CLO-R12单条终浓度1.6pmol/μL，Up-F、Up-R单条终浓度16pmol/μL，标记为HXD-T。
4.2探针配制：T1/B1～T11/B12，共21条；离心10000rpm，3min；用TE溶解为100pmol/μL母液，按照下表1-4配制预混液：
表1-4
| 序号 | 组分 | 添加体积(μL) |
| 1 | T1～T12，12条 | 1.6 |
| 2 | B1～B12，9条 | 0.8 |
| 3 | TE溶液 | 73.6 |
按上表配制得到的100μL预混液，T1～T12单条探针的终浓度为1.6pmol/μL、B1～B12单条探针的终浓度为0.8pmol/μL，预混液标记为HXD-B。
4.3PCR反应体系配制，按照下表1-5配制PCR反应体系：
表1-5PCR反应体系配制信息表
配制完反应体系后，取待检样品、阴性对照、阳性对照加样量为5μL，振荡混匀，离心后上机。
5、PCR反应程序
PCR反应程序按照如下设置，使用降落PCR程序进行，前面6个循环，每增加1个循环，退火温度降低1℃。具体反应程序如下表1-6所示：
表1-6
6、结果分析
8种呼吸道病原体在各通道中的Tm值范围如下表1-7所示：
表1-7
阳性对照判读：应在FAM、VIC、ROX和CY5通道有熔解峰，分别对应为甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、副流感病毒和内参基因的熔解峰，判定阳性质控品合格。若其中有一种或以上没有熔解峰，则判定试剂失效；若出现除病原体之外的熔解峰，则判定当次检测存现污染。
其中合格阳性质控品采用本发明试剂盒的检测结果如图2-3所示。
阴性对照判读：在FAM、VIC、ROX通道无任何熔解峰，CY5通道有熔解峰，对应为内参基因的熔解峰，判定阴性质控品合格。若FAM、VIC、ROX通道出现有熔解峰，则判定当次检测存在污染。
待测样本判读：
1)在FAM、VIC、ROX通道，在特定病原体Tm参考值范围内有熔解峰时，则判定该病原体阳性；
2)当同时出现两个或以上熔解峰时，则判定该样本同时感染两种或以上病原体；
3)在FAM、VIC、ROX通道无熔解峰，CY5通道有熔解峰时，判定该样本无检测范围内的病原体感染；
4)若在FAM、VIC、ROX、CY5通道均无熔解峰，则判定该样本无效，建议重新采样或重新提取核酸后再检测。
例如部分检测结果如下表1-8所示，其检测结果对应分析如下：
表1-8
注：+表示有熔解峰，-表示无熔解峰，±表示有或无熔解峰，/表示该Tm值无检测靶标。
实施例2本发明呼吸道病原体核酸检测试剂盒对临床样本的检测
使用本发明呼吸道病原体核酸检测试剂盒，按照实施例1所述方法步骤，对收集的各咽拭子临床标本经核酸提取后进行检测，检测结果经统计后如下表2-1～2-9所示。对照方法为13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(PCR毛细电泳片段分析法)(国械注准20183400518)检测。
表2-1甲型流感病毒阴阳性统计表
表2-2乙型流感病毒阴阳性统计表
表2-3呼吸道合胞病毒阴阳性统计表
表2-4腺病毒阴阳性统计表
表2-5副流感病毒阴阳性统计表
表2-6肺炎支原体阴阳性统计表
表2-7偏肺病毒阴阳性统计表
表2-8鼻病毒阴阳性统计表
表2-9总体样本阴阳性统计表
以上统计数据说明本发明呼吸道病原体核酸检测试剂盒针对临床甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、副流感病毒样本均有良好的检测性能。
实施例3本发明试剂盒的灵敏度检测
使用本发明呼吸道病原体核酸检测试剂盒，按照实施例1所述方法步骤，对不同浓度梯度的标准品(购于广州邦德盛生物科技有限公司)进行检测，分析本发明试剂盒的检测灵敏度。检测结果如图4-6所示，对图中结果进一步分析后，统计得到本发明中试剂盒对各病原体的检测限如下表3-1所示：
表3-1
| 病原体 | 检测限 | 病原体 | 检测限 |
| 甲型流感病毒(IFVA) | 2.0TCID<sub>50</sub>/mL | 鼻病毒(RhV) | 500copies/mL |
| 乙型流感病毒(IFVB) | 2.0TCID<sub>50</sub>/mL | 副流感病毒(PIV) | 500copies/mL |
| 呼吸道合胞病毒(RSV) | 500copies/mL | 人偏肺病毒(hMPV) | 500copies/mL |
| 腺病毒(Adv) | 500copies/mL | 肺炎支原体(MP) | 500copies/mL |
实施例4本发明试剂盒的特异性检测
使用本发明的试剂盒检测可能发生交叉反应的常见呼吸道病原体，设置实验组和对照组，实验组为在24例咽拭子临床样本(试剂盒检测范围内阴性)中分别添加下表4-1中的呼吸道病原体作为待测样本，对照组为试剂盒检测范围内8种呼吸道病毒阳性的混合临床样本。检测结果如图7-8所示，显示实验组检测结果均为阴性，对照组检测结果均正常，表明表4-1的24种呼吸道病原体与本试剂盒不存在交叉反应。
表4-1交叉反应验证实验组呼吸道病原体(copies/mL)
实施例5干扰物质对本发明试剂盒的影响
制备实验组和对照组样本，其中往临床样本中分别加入一定比例的治疗药物作为实验组，未加入药物的为对照组，如常见抗感冒药、糖皮质激素、抗生素等，对本试剂盒的检测无影响。其中，分别检测了含有苯福林(100μg/mL)、羟甲唑啉(100μg/mL)、倍氯美松(50μg/mL)、***(100μg/mL)、氟尼缩松(10μg/mL)、曲安奈德(100μg/mL)、布***(50μg/mL)、莫米松(50μg/mL)、氟替卡松(50μg/mL)、盐酸组胺(50μg/mL)、鼻内活流感病毒疫苗(30μg/mL)、苯佐卡因(50μg/mL)、薄荷脑(32μg/mL)、扎那米韦(100μg/mL)、利巴韦林(100μg/mL)、奥司他韦(100μg/mL)、帕拉米韦(100μg/mL)、莫匹罗星(100μg/mL)、妥布霉素(50μg/mL)的样本。
各临床样本的实验组与对照组的检测结果如图9-12所示，结果表明，这些干扰物质对检测结果无影响，不影响本发明试剂盒的准确性。
实施例6引物探针的优化和组合验证
扩增反应体系中的引物探针，基于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间可能会形成二聚体，特别是存在3'端互补配对碱基时，易产生引物二聚体。在设计之初就应保证设计靶基因区段的保守性和降低不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计和筛选。
本发明中，发明人同时设计了多对引物进行比对研究，如下表6-1～6-8所示，同时检测相同的样本，实验结果如下图13～16所示，选择扩增效率较高的引物对作为优选的引物，从而可以更好地扩增各靶标病原体。
表6-1甲型流感病毒引物
表6-2腺病毒引物组
表6-3肺炎支原体引物
表6-4乙型流感病毒引物
表6-5偏肺病毒引物
表6-6副流感病毒引物
表6-7呼吸道合胞病毒引物
表6-8鼻病毒引物
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市金圻睿生物科技有限责任公司
<120> 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
attttggaca aagcgtctac gctgcatgta gtcatcactg agtcatcgcc tcgctcac 58
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acacagatct tgaggctttc atggaatcag cagagacggc aacttatata aagacaagac 60
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atcaggaaat gtagtcatca ctgagtcatc ggaacaacag c 41
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gctgagctca gcagagacgg caacttataa tggccttc 38
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aaacagacat aagcagctca gtaaatgtag tcatcactga gtcatcgctt ctctaggag 59
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttcattgact tgagatattg atgcatccag cagagacggc aacttatact catcagaa 58
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cgttgccggc cgagaaggat gtagtcatca ctgagtcatc gtgcgcaggt a 51
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gacttttgag gtggatccca tggacagcag agacggcaac ttatagccca ccctt 55
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
aatacatcta cccttaccgt tacagatgta gtcatcactg agtcatcgca tgtgagct 58
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ctaccgttaa cttctggtta aagcgctcca gcagagacgg caacttatac tcgttagca 59
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tgtatatcaa ctgtgttcaa ctccatgtag tcatcactga gtcatcggtt gatgaaaga 59
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cttgtctttt cttcagcaga gacggcaact tataccaagt tatc 44
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ttctgcagct atatgtagtc atcactgagt catcgtaatc acatc 45
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ggacatagtt cagcagagac ggcaacttat acgagcatct g 41
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tgtatatcaa ctgtgttcaa ctccatgtag tcatcactga gtcatcggtt gatgaaaga 59
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ttgcctttgt agtatattcc tggtccacag cagagacggc aacttataga tgggtataat 60
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tagattatcc caattatgta gtcatcactg agtcatcgtt ccaactgc 48
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
tcgactttaa acagcagaga cggcaactta taaagggtca cc 42
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
caatataagg aataaaaaga aacacggatg tagtcatcac tgagtcatcg cccaaagta 59
<210> 20
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
agacctgcat gtgcttgatt gtgagcagca gagacggcaa cttatatccg gcccct 56
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gggtggtatt gtaaaaatgc aggatgtagt catcactgag tcatcgcact gtttactac 59
<210> 22
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
aagccaccaa agcaccgaga ggcagcagag acggcaactt atatagtgca accatg 56
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gtggctcgaa tgtagtcatc actgagtcat cgtctgctca ct 42
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ggctgaggca gcagagacgg caacttatag gagaatgg 38
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
atgtagtcat cactgagtca tcg 23
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
cagcagagac ggcaacttat a 21
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
tacggcgacc accgagatat atgttcacgc tcaccgtgcc cagtcgcg 48
<210> 28
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
ggggatgttc tctattttgt attcttcatc tttcatatat ctcggtggtc gccgtaagaa 60
cat 63
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
ggcgaccacc tacacctgaa catcaaatgc ttcatgaaag ctcacacatc ttccgcg 57
<210> 30
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
ggggaagagt tctattctgt atgcgtacac gctttgatgt tcaggtgtag gtggtcgcca 60
actctt 66
<210> 31
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
gcgaccacct agatcacact atgacatgtt ccaatcatcc atgccagcag acgcg 55
<210> 32
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
ggggcggcct acgtgcgatc ggccgtccgg ctggccagct cttgtcatag tgtgatctag 60
gtggtcgcta ggccg 75
<210> 33
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
tgactacatg tctctatcga agtctttgac gtggtccgtg tgcacgcg 48
<210> 34
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
ggggtcggcg cctccgtcac gctgcactgc acattctggc tcgatagaga catgtagtca 60
gcgccga 67
<210> 35
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
agctgacaag gttcatgacg accattacca tgggtgatac cgccgcg 47
<210> 36
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
ggggtattac ggagacggtg ctccgtgtgg tcgtcatgaa ccttgtcagc tcgtaata 58
<210> 37
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
gtcttgaagt cctgtgggat tcccaatgtt aatcagagtg tttgcaatga tcgcg 55
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
gtcttgaagt cctgtgggat cattcaccag aagccagcat agatagagta cgcg 54
<210> 39
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
gtcttgaagt cctgtgggat gcatcatcag gcatagaaga tattgtactt gcgcg 55
<210> 40
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
gcggagatag acataactga gaattccatc attctcttta ggtcaaaccc attgcgcg 58
<210> 41
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
ggggctacgt ggtaagtgtt cagtcacgct cctttcgacc tgcgccgaat cccacaggac 60
ttcaagacaa cacgtag 77
<210> 42
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
tgttagagtg cgagtcgtca atatagaatg cggctaacct taaccccgcg cg 52
<210> 43
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
ggggggacgg atgtcttgat agttatagcc taattctata ttgacgactc gcactctaac 60
atccgtcc 68
<210> 44
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
gccagtgaac tggcagaccg tcctgcgaca cagcagcagg aattaatgtt gccgcg 56
<210> 45
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
ggggggccga gctccgcctg cgtcggagct acgccaactc ctttcaggac ggtctgccag 60
ttcactggcc tcggcc 76
<210> 46
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
ctacacgaca ctcttcctac aagctccgcc tcctgggttc acgcg 45
<210> 47
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
gggggtgaca tcgtgatact tctctactgt ctttttactg taggaagagt gtcgtgtaga 60
tgtcac 66
<210> 48
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
attagaacag caatacaaca aatgtagtca tcactgagtc atcggtattg gaac 54
<210> 49
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 49
cgacctctta tattatggaa tccagcagag acggcaactt atacagaggt at 52
<210> 50
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
ttgtgaccta agagtagtat atgtagtcat cactgagtca tcgatagacg ctat 54
<210> 51
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 51
tgacatctat gacaccttca gcagagacgg caacttatat tctgtgtatg gt 52
<210> 52
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
ctacgatgaa ctaagattga tgtatgtagt catcactgag tcatcggacc gtcccatac 59
<210> 53
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
cacactatat ctataccatc taacagcaga gacggcaact tataaatagt gaactg 56
<210> 54
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
agacaactat acacaacatt atgtagtcat cactgagtca tcgtgtaaca cg 52
<210> 55
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 55
tagataagaa ccgcaaacca gcagagacgg caacttatag aaatccattt g 51
<210> 56
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 56
gtagaagaaa gcatccataa tgcaggatgt agtcatcact gagtcatcgg tctgaaggtt 60
<210> 57
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 57
tctataccat ctatattcac ttatcagcag agacggcaac ttatagcgga gtgaggt 57
<210> 58
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 58
attatgtgaa gccttgaaca actccatgta gtcatcactg agtcatcggt ggctctat 58
<210> 59
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 59
cgtctatact ctctaattct tgcagcagag acggcaactt atatagcatt taccg 55
<210> 60
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 60
gccattatgt cctgaagaaa tgtagtcatc actgagtcat cggtctccaa cactct 56
<210> 61
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 61
ctatgtgaag ttgtgaatcc agcagagacg gcaacttata aatctcacgc t 51
<210> 62
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 62
cgtctctata cactaatctt actccatgta gtcatcactg agtcatcgca gcgtcagag 59
<210> 63
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 63
ccacaattca acaatccatg gtccacagca gagacggcaa cttataaata gtgaact 57
<210> 64
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 64
gcaatataca catgataaga tgtagtcatc actgagtcat cggacgcctg ca 52
<210> 65
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 65
gcagcgatct gaggtataac agcagagacg gcaacttata tatagcgaat a 51
<210> 66
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 66
tattactcgg actcggtgta tcagtaaatg tagtcatcac tgagtcatcg attcagccgc 60
tc 62
<210> 67
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 67
tcgtttgcta tttaggtgtc tatgcatcca gcagagacgg caacttatag tctgaaaccg 60
<210> 68
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 68
aacgaataca tcactacaag aaacacggat gtagtcatca ctgagtcatc gctgggcttc 60
ctt 63
<210> 69
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 69
atatgctata cagtctctat acacttgtga gcagcagaga cggcaactta tataaagatt 60
tatgtat 67
Claims (10)
1.一种多重核酸检测试剂盒，其特征在于，所述多重核酸检测试剂盒包括针对呼吸道病原体核酸序列的扩增引物组和检测探针组，所述扩增引物组包括CLO引物对，所述检测探针组包括T探针和B探针；
所述CLO引物对用于扩增呼吸道病原体核酸序列，所述T探针和B探针均包括靶序列区和人工序列区，所述靶序列区与呼吸道病原体核酸序列反向互补；
所述呼吸道病原体选自甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、副流感病毒中的任意至少一种。
2.根据权利要求1所述多重核酸检测试剂盒，其特征在于，包括以下任意至少一组组分：
第一组：针对甲型流感病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQID NO.1～SEQ ID NO.2所示，T探针序列如SEQ ID NO.27所示，B探针序列如SEQ ID NO.28所示；
第二组：针对乙型流感病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQID NO.3～SEQ ID NO.4所示，T探针序列如SEQ ID NO.29所示，B探针序列如SEQ ID NO.30所示；
第三组：针对呼吸道合胞病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQID NO.5～SEQ ID NO.6所示，T探针序列如SEQ ID NO.31所示，B探针序列如SEQ ID NO.32所示；
第四组：针对腺病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示，T探针序列如SEQ ID NO.33所示，B探针序列如SEQ ID NO.34所示；
第五组：针对肺炎支原体的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ IDNO.9～SEQ ID NO.10所示，T探针序列如SEQ ID NO.35所示，B探针序列如SEQ ID NO.36所示；
第六组：针对副流感病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ IDNO.11～SEQ ID NO.18所示，T探针序列如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.40所示，B探针序列如SEQ ID NO.41所示；
第七组：针对鼻病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ IDNO.19～SEQ ID NO.20所示，T探针序列如SEQ ID NO.42所示，B探针序列如SEQ ID NO.43所示；
第八组：针对人偏肺病毒的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ IDNO.21～SEQ ID NO.22所示，T探针序列如SEQ ID NO.44所示，B探针序列如SEQ ID NO.45所示。
3.根据权利要求1-2任一项所述多重核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括通用引物对，进一步地，所述通用引物对序列如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.26所示。
4.根据权利要求1-2任一项所述多重核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括针对内参核酸序列的扩增引物组和检测探针组；进一步地，所述内参为HBB基因。
5.根据权利要求4所述多重核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括以下组分：
第九组：针对HBB基因的CLO引物对、T探针和B探针，其中，CLO引物对序列如SEQ IDNO.23～SEQ ID NO.24所示，T探针序列如SEQ ID NO.46所示，B探针序列如SEQ ID NO.47所示。
6.权利要求1～5任一项所述多重核酸检测试剂盒在呼吸道病原体检测中的应用。
7.一种呼吸道病原体核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取待测生物样本核酸；
采用权利要求1～5任一项所述多重核酸检测试剂盒对上述生物样本核酸进行PCR检测和熔解曲线分析。
8.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于，所述PCR检测的反应程序为降落PCR。
9.根据权利要求7～8任一项所述多重核酸检测方法，其特征在于，所述生物样本包括，但不限于血清、血浆、全血、痰液、拭子、灌洗液、新鲜组织、***固定石蜡包埋组织、尿液、细菌培养物、病毒培养物、细胞系培养物、人工合成的质粒。
10.根据权利要求7～9任一项所述多重核酸检测方法，其特征在于，所述生物样本核酸为核糖核酸时，反应体系还包括逆转录酶，反应程序还包括逆转录PCR。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111530572.7A CN114032337A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
| PCT/CN2022/097194 WO2023109031A1 (zh) | 2021-12-14 | 2022-06-06 | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111530572.7A CN114032337A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114032337A true CN114032337A (zh) | 2022-02-11 |
Family
ID=80140736
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111530572.7A Pending CN114032337A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114032337A (zh) |
| WO (1) | WO2023109031A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023109031A1 (zh) * | 2021-12-14 | 2023-06-22 | 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
| CN117867180A (zh) * | 2024-03-12 | 2024-04-12 | 北京雅康博生物科技有限公司 | 用于检测呼吸道病原体的引物组合、试剂盒及应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2412718A1 (en) * | 2009-03-26 | 2012-02-01 | Xiamen Amoy Diagnostics Co., Ltd | Loop-shaped primer employed in nucleic acid amplification and the use thereof |
| CN102959092A (zh) * | 2011-01-11 | 2013-03-06 | Seegene株式会社 | 借助于探测和标记的寡核苷酸切割以及延长试验的靶核酸序列检测 |
| US20150284782A1 (en) * | 2007-07-11 | 2015-10-08 | Pathofinder Holding B.V. | Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample |
| CN107365769A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-11-21 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用 |
| CN110438124A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-12 | 合肥欧创基因生物科技有限公司 | 一种高通量检测探针及其熔解曲线检测方法及其应用 |
| CN111378789A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-07-07 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒 |
| CN112961910A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-06-15 | 上海邦先医疗科技有限公司 | 一种多种呼吸道病毒的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 |
| CN113736920A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-12-03 | 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 | 一种九项呼吸道病原体分子检测试剂盒及其使用方法和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130101952A (ko) * | 2012-02-02 | 2013-09-16 | 주식회사 씨젠 | Ｐｔｏ 절단과 연장-의존적 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출 |
| CN105483285A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-04-13 | 湖北民族学院 | 一种基于鸟嘌呤的超猝灭分子信标的构建及应用 |
| CN114032337A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-02-11 | 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
-
2021
- 2021-12-14 CN CN202111530572.7A patent/CN114032337A/zh active Pending
-
2022
- 2022-06-06 WO PCT/CN2022/097194 patent/WO2023109031A1/zh unknown
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150284782A1 (en) * | 2007-07-11 | 2015-10-08 | Pathofinder Holding B.V. | Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample |
| EP2412718A1 (en) * | 2009-03-26 | 2012-02-01 | Xiamen Amoy Diagnostics Co., Ltd | Loop-shaped primer employed in nucleic acid amplification and the use thereof |
| CN102959092A (zh) * | 2011-01-11 | 2013-03-06 | Seegene株式会社 | 借助于探测和标记的寡核苷酸切割以及延长试验的靶核酸序列检测 |
| CN107365769A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-11-21 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用 |
| CN110438124A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-12 | 合肥欧创基因生物科技有限公司 | 一种高通量检测探针及其熔解曲线检测方法及其应用 |
| CN111378789A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-07-07 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒 |
| CN112961910A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-06-15 | 上海邦先医疗科技有限公司 | 一种多种呼吸道病毒的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 |
| CN113736920A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-12-03 | 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 | 一种九项呼吸道病原体分子检测试剂盒及其使用方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YOSHIO SAITO等: "Design of a novel G-quenched molecular beacon: A simple and efficient strategy for DNA sequence analysis", CHEMCOMM, vol. 4, pages 4492 - 4494 * |
| 翟琨等: "基于双重猝灭原理的分子信标定量检测凝血酶", 分析化学, vol. 45, no. 10, pages 1462 - 1466 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023109031A1 (zh) * | 2021-12-14 | 2023-06-22 | 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
| CN117867180A (zh) * | 2024-03-12 | 2024-04-12 | 北京雅康博生物科技有限公司 | 用于检测呼吸道病原体的引物组合、试剂盒及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023109031A1 (zh) | 2023-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111321251B (zh) | 检测引起呼吸道感染的病原体并分型的组合物、试剂盒、方法及用途 | |
| WO2021174674A1 (zh) | 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒及方法 | |
| US20230090551A1 (en) | Composition, kit and method for detecting sars-cov-2 and use thereof | |
| EP3882364B1 (en) | Dual detection kit for 2019 novel corona virus | |
| WO2021155728A1 (zh) | 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒 | |
| CN108192996B (zh) | 一种用于甲型流感病毒检测及h1和h3分型的多重rt-rpa引物组合及其应用 | |
| CN110273027B (zh) | 诺如病毒gⅰ、gⅱ和gⅳ型核酸分型检测试剂盒及检测方法 | |
| CN102277455B (zh) | 猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒 | |
| WO2023109031A1 (zh) | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
| CN111500776A (zh) | 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法 | |
| WO2023109032A1 (zh) | 一种多重核酸检测***及其制备方法与应用 | |
| CN105543414B (zh) | 一种呼吸道合胞病毒a/b亚型多重荧光定量pcr检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法 | |
| CN111321253A (zh) | 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法 | |
| WO2023087868A1 (en) | Compositions, kits, methods for detecting and identifying pathogens that cause respiratory tract infections and use thereof | |
| CN110343784B (zh) | 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒 | |
| CN101921870B (zh) | 用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法及试剂盒 | |
| CN104846121A (zh) | 一种病毒三重荧光定量rt-pcr检测方法及其试剂盒 | |
| CN113930529A (zh) | 用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用 | |
| CN105936945B (zh) | 一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量pcr试剂盒 | |
| CN112961910A (zh) | 一种多种呼吸道病毒的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 | |
| CN116790815A (zh) | 检测偏肺病毒的试剂盒 | |
| CN114891928A (zh) | 一种麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的引物探针组合物和检测试剂盒 | |
| CN113215329A (zh) | 呼吸道7种亚型流感病毒多重pcr检测的引物、探针和试剂盒 | |
| CN113817870A (zh) | 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 | |
| CN112662811A (zh) | 一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |