CN103865919B - 一种改良的工业规模制造dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改良的工业规模制造DNA的方法，包括如下步骤：将十二烷基硫酸钠SDS解离后的DNA溶液，调节pH至碱性，静置1-2小时，离心收集清液，将清液调pH至7.0～7.5，再加入酒精沉淀，收集沉淀，洗涤干燥，即可获得所述的产品DNA。采用本发明的方法，可获得含量较高的DNA，而且本发明的方法，操作简单，适宜于工业化生产。
Description
技术领域：
本发明涉及一种制造高纯度DNA的方法。
背景技术：
小牛胸腺、鱼类***和植物种子的胚等含有丰富的DNA，是提取DNA的良好材料。从培养微生物着手，然后从微生物中提取DNA亦有报道，但尚未用于工业生产。故而，从小牛胸腺，或鱼类***（鱼白）提取DNA的方法是目前工业规模制造DNA的主要方法。
一般制备方法是首先将新鲜（或冰冻）小牛胸腺或鱼白先去除血水和***，在冰浴上切成小块，加缓冲液洗涤后用组织捣碎机（8000转/分-12000转/分）捣碎，用含0.14mol/L氯化钠的柠檬酸缓冲液，洗涤多次，去除核糖核蛋白，然后获得脱氧核糖核蛋白（或细胞核）。在工业制备时至少投料100KG或更多原料，故将只有几十克小牛胸腺或鱼白的血水、***去除干净是很困难的，特别是原料从外地，外单位采购时，一般都是冰冻的，里面夹杂杂质是必然的。另外组织捣碎机只能在实验室使用，这些都是工业生产难关。本发明根据动物细胞特别是小牛胸腺、鱼类***等动物细胞因为没有细胞壁，而且细胞较易破碎的特点。采用绞肉机破碎细胞，然后用缓冲液洗涤离心，很容易将脱氧核糖核蛋白或细胞核提取出来，血水可通过缓冲液洗涤时去除、***用10-80目尼龙网或钢丝网过滤便可留存在网上而去除。这样可克服原料处理不好而带来的影响。
在去蛋白时，由于考虑到成本和安全，工业生产一般不采用苯酚法提取DNA。大都采用SDS等去污剂使蛋白变性的方法。但此办法，由于工业生产规模大，不可能非常严格地在低温操作或保证DNA绝对不降解，工业制备DNA分子量相对要小一些。故而按照以前方法，在加入乙醇后，往往DNA沉淀不下来，而且得率和纯度很低。
DNA制备方法很多，但大都是实验室技术。例如文献（1）《生化实验方法和技术》（第二版，高等教育出版社）介绍的方法。即利用动物组织的脱氧核糖核蛋白可溶于水或盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L盐溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白以及其他杂质分开。分离得到脱氧核糖核蛋白后，再进一步将蛋白质等杂质除去。
经常采用的去除蛋白方法有三种：（1）用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离DNA。（2）用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。（3）苯酚法：用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相中，或存在于中间残留物中，蛋白质变性后停留在酚层内。由于苯酚能使蛋白质迅速变性，因而抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品，所以实验室除去蛋白的方法一般都采用苯酚法。
在采集小牛胸腺和鱼类***原料时，小牛胸腺往往会有较多***、血水等杂质，而鱼类***较为干净，杂质较少。故而国内外大都采用鱼类***提取DNA，一般国外产品可达85-90%含量，而国内一般只有70%左右。而用小牛胸腺制备因难度较高，故而未见产品供应。
发明内容：
本发明的目的是提供一种改良的工业规模制造高纯度DNA的方法，以克服现有技术存在的缺陷。
本发明的方法，包括如下步骤：
将十二烷基硫酸钠SDS解离后的DNA溶液，加入1-2mol/LNaOH，调节pH至碱性，优选的，pH为8.5～12.0，特别优选的为10.0、11.0，静置1-2小时，离心收集清液，加入1-2mol/LHCL，将清液调pH至7.0～7.5，优选7.0，再加入等量95%酒精沉淀，收集沉淀，洗涤干燥，即可获得所述的产品DNA，含量(W/W)可达91%。
所述DNA溶液的制备方法为常规的，如文献：“生化实验方法和技术”，（第二版，高等教育出版社）介绍的方法；
所述DNA来源于小牛胸腺、鱼类***（或鱼白）；
术语“加入等量95%酒精”，指的是pH7.0-7.5清液与95%酒精体积之比；
优选的，在制备脱氧核糖核蛋白时，考虑到沉淀量较多，工业生产时，可采用碟片式离心机；
而第二次去蛋白时沉淀量较少，离心时可采用高速管式离心机，这样可以获得较好效果，缩短操作时间，并提高收率。
根据DNA260nm和280nm紫外吸收比值（A260/A280）在1.9左右，以及当样品中蛋白质含量较高时比值会下降的原理。设计了以下实验，即分别将解离后DNA溶液pH调节至8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，沉淀蛋白，离心，回调pH，最终获得表1结果：
表1
| pH | 7.0 | 8.5 | 9.0 | 10.0 | 11.0 | 12.0 |
| 沉淀情况 | 不产生 | 产生 | 产生 | 产生 | 产生 | 产生 |
| A260/A280 | 1.43 | 1.65 | 1.71 | 1.83 | 1.73 | 1.60 |
| 收率% | / | 2.12 | 2.41 | 2.8 | 2.52 | 2.42 |
| 含量% | / | 80 | 85 | 88 | 86 | 79 |
在未调pH时，解离后DNA溶液A260/A280为1.43，若加入等量酒精，不产生DNA沉淀，无法获得最终DNA产品。而调节pH至碱性后就产生沉淀，离心去除沉淀后，调节至中性。溶液比值如表1所示明显提高，DNA的纯度显著上升，其中以pH10.0最佳，其比值可达1.83，接近DNA标准比值1.9，经酒精沉淀、干燥后最终收率2.8%（即100g新鲜小牛胸腺所得DNA产品为2.8g），含量达88%。
由此可见，采用本发明的方法，可获得含量较高的DNA，而且本发明的方法，操作简单，适宜于工业化生产。
具体实施方式：
实施例1从小牛胸腺提取DNA
取100Kg冰冻的小牛胸腺稍作融化（不能全部融化，解冻至***即可），放入绞肉机中绞2次，加入1000L缓冲液（其中含0.14mol/L氯化钠，0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，pH7.0），搅拌均匀，用20目不锈钢丝网将小牛胸腺溶液过滤去除***。然后用管式高速离心机离心，取得的沉淀用缓冲液再洗涤、离心如此重复二次。
将沉淀物放入绞肉机中绞2次，加入缓冲液800L（其中含0.14mol/L氯化钠，0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，pH7.0）；然后置于3000L提取罐中加入缓冲液使总体积为1400L，开动搅拌，转速为100转/分，并缓缓加入重量含量为5%的十二烷基磺酸钠6.3Kg，在室温中搅拌2小时，搅拌后加入氯化钠110Kg，继续搅拌10分钟。
加入2mol/LNaOH，将得到的溶液调PH至11，4-10℃，静置2小时，离心后，加入2mol/LHCL将清液调pH7.0，再加入1400L95%酒精，此时便产生沉淀；
倾去或吸取上清液，过滤，获得沉淀物，用体积浓度为50%的酒精洗涤2次，再过滤。将得到的沉淀，真空干燥，可制得2.54KgDNA，含量86%,A260/A280=1.81。
实施例2从鱼类***提取DNA
取10Kg冰冻鲑鱼***（鱼白）稍作融化，放入绞肉机绞碎，加入100L缓冲液（其中含0.14mol/L氯化钠，0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，pH=7.0）搅拌均匀，用40目尼龙网过滤去除***，然后用管式高速离心机离心。
以下步骤同实施例1（因原料量为实验例1的1/10，故加入试剂量也为实施例1的1/10）。
最终可得321gDNA，含量91%，A260/A280=1.85。
Claims (1)
1.一种改良的工业规模制造小牛胸腺DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
取100Kg冰冻的小牛胸腺解冻至***，放入绞肉机中绞2次，加入1000L缓冲液，搅拌均匀，用20目不锈钢丝网将小牛胸腺溶液过滤去除***，然后用管式高速离心机离心，取得的沉淀用缓冲液再洗涤、离心，如此重复二次；
将沉淀物放入绞肉机中绞2次，加入缓冲液800L；然后置于3000L提取罐中加入缓冲液使总体积为1400L，开动搅拌，转速为100转/分，并缓缓加入质量百分比为5％的十二烷基磺酸钠6.3Kg，在室温中搅拌2小时，搅拌后加入氯化钠110Kg，继续搅拌10分钟；
加入2mol/LNaOH，将得到的溶液调pH至11，4-10℃，静置2小时，离心后，加入2mol/LHCL将上清液调pH至7.0，再加入1400L95％酒精，产生沉淀；
倾去或吸取上清液，过滤，获得沉淀物，用体积浓度为50％的酒精洗涤2次，再过滤，将得到的沉淀，真空干燥；
所述缓冲液含0.14mol/L氯化钠，0.05mol/L柠檬酸钠，pH7.0。
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