CN103852579A - 一种人体血清Aβ的定量检测方法 - Google Patents

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    • G01N2800/2821—Alzheimer

Abstract

本发明公开了一种人体血清Aβ的定量检测方法，依次包括如下步骤：a)采用试剂盒预先配置铺有抗Aβ肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与控温和定速离心处理过的血浆样本中Aβ进行捕获性免疫反应，得反应复合物；b)所述反应复合物与抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗体进行二次抗原－抗体反应，得反应结合物；c）所述反应结合物经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定。本发明方法提高了Aβ检测灵敏度，简化样本处理以及操作程序，可供医院临床老年性痴呆病的实验诊断、对携带痴呆遗传史或痴呆危险基因人群,以及可疑隐匿患者进行疾病的筛查以及临床新药疗效观察/判定以及大专院校实验研究。

Description

一种人体血清Aβ的定量检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种人体血清Aβ的定量检测方法。
背景技术
Aβ（Amyloid peptide简称Aβ）是淀粉样前体蛋白经蛋白酶水解而产生的代谢产物。在正常脑细胞内有较少量的本底水平。但在病理条件下包括遗传淀粉样前体蛋白和水解酶基因突变以及环境污染或化学致癌物的作用可引起Aβ产物增加而导致Aβ的增高。Aβ增高和聚集在脑内形成老年斑，最终破坏脑记忆功能导致失智或老年性痴呆。因此Aβ作为老年学痴呆病的生物标记物是目前致力于开发的唯一检测方法。
由于Aβ是目前老年性痴呆病的关键致病因子和能反映病理发展过程的重要标志，国内外多年来一直致力于研究有效的Aβ检测方法和开发检测试剂盒，国内市场目前基本上是引进国际市场现有的Aβ检测试剂盒进行检测，近年来美国出售的Aβ检测试剂盒灵敏度较低，检测灵敏度的标准范围不适应亚洲人群，而且不能满足Aβ水平在疾病早期小幅升高的要求；目前日本市场出售的检测试剂盒灵敏度较高，但其价格不仅十分昂贵而且要求复杂的样本处理和特殊的检测技能；此外欧洲市场出售的Aβ检测试剂盒介于美国和日本，但存在着特异性不足，不够稳定和检测误差较大的弊病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种人体血清Aβ的定量检测方法，能够结合亚洲人群的生物特性，提高Aβ检测灵敏度，简化样本处理及操作程序。
本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种人体血清Aβ的定量检测方法，依次包括如下步骤：a)采用试剂盒预先配置铺有抗Aβ肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与控温和定速离心处理过的血浆样本中Aβ进行捕获性免疫反应，得反应复合物；b)所述反应复合物与抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗体进行二次抗原－抗体反应，得反应结合物；c）所述反应结合物经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定。
进一步地，所述步骤a)中的试剂盒包括盒体、盒盖和固定板，所述盒体内置放有十个试剂瓶和一个免疫检测板，所述十个试剂瓶和免疫检测板由试剂板分隔固定，所述每个试剂瓶上附设有说明标签，所述每个试剂瓶内封闭包装有试剂。
进一步地，所述试剂盒的盒体和盒盖由硬纸或塑料板制成，所述试剂板由硬纸或塑料泡沫制成。
进一步地，所述十个试剂瓶中分别装有：试剂I：人体Aβ淀粉样肽；试剂Ⅱ：NaH2PO4H2O·Na2HPO4缓冲溶液；试剂Ⅲ：NaN3·Block Ace·PBS溶液；试剂Ⅳ：NaH2PO4H2O·Na2HPO4溶液；试剂Ⅴ：BSA和Block Ace粉末；试剂Ⅵ：兔抗人的Aβ检测抗体；试剂Ⅶ：清洗免疫反应的平衡液；试剂Ⅷ：鼠抗兔的第二抗体；试剂Ⅸ：TMB显色反应溶液；试剂X：peroxidase溶液。
进一步地，所述装有试剂Ⅴ、试剂Ⅸ和试剂X的试剂瓶为棕色，其他试剂瓶为白色。
进一步地，所述试剂Ⅱ中NaH2PO4H2O·Na2HPO4浓度为20mM，EDTA浓度为2mM，NaCl浓度为400mM，BSA、CHAPS、Block Ace和NaN3浓度依次为0.2%、0.05%、0.4%和0.05%，溶液pH值为7.0；所述试剂Ⅲ中NaN3和Block Ace重量百分比浓度分别为10%和1%在PBS溶液中，溶液pH值为7.4；试剂Ⅳ中NaH2PO4H2O·Na2HPO4浓度为20mM，EDTA浓度为2mM，NaCl浓度为400mM、BSA浓度为1%，溶液pH值为7.0；所述试剂Ⅶ为NaCl、KCl、Na2HPO4·7H2O和KH2PO4的混合液，pH值为7.4。
进一步地，所述试剂Ⅴ中BSA和Block Ace两种粉末分装在各自的两个小管内，Block Ace粉末使用用前分别溶解在试剂Ⅱ和Ⅲ的溶液中，所述BSA粉末使用前分别溶解在试剂Ⅱ和Ⅳ的溶液中；所述试剂Ⅵ使用前溶于试剂IV的溶液中，并稀释至样本检测浓度；所述试剂Ⅶ的容量为250ml，使用前用双蒸水稀释1倍；所述试剂Ⅷ在使用用前在试剂Ⅳ的溶液中稀释至样本检测浓度。
进一步地，在采用所述试剂盒进行Aβ的定量检测之前先配置如下溶液：1）配制工作浓度的样本和标准品稀释液：取出冷藏的试剂Ⅱ,将10倍的25ml试剂II稀释至250ml；取出冷藏的试剂V，自然升至室温，将其中一小管0.5g BSA和一小管1g的Block Ace溶入稀释后的试剂Ⅱ中；2）配制工作浓度的缓冲基液：取出100ml的10xPBS加双蒸水至1L，检查pH值；3）配制封闭溶液：从试剂V中取出另一小管1g的Block Ace粉末溶入试剂Ⅱ溶到900ml的1xPBS再加100ml的NaN3配制成1X的Block Ace封闭溶液；4）配制工作浓度的抗体稀释溶液：取出10X的25ml的试剂Ⅳ，加入2475ml双蒸水配成1X的抗体稀释溶液，然后再加入另一小管0.5g的BSA粉末溶入到试剂工作浓度的抗体稀释溶液中。
进一步地，在配置好工作浓度的溶液后，对人体血清Aβ进行定量检测，包括如下步骤：1）取出冷藏铺有Aβ抗体和塑料盖膜封闭的免疫检测板，自然升至室温；2）准备定量检测Aβ的标准品：将试剂I的标准品Aβ溶于含有BSA和Block Ace的样本和标准品稀释液中；并将溶解液依次稀释至标准曲线的梯度浓度；3）准备待测样本：将待测血液样本在控温和定速离心后取出上清液，进行蛋白定量；4）用工作浓度的样本和标准品稀释液将收集的待测样本中的蛋白浓度统一稀释至一致浓度所需量；5）揭开免疫检测板的封闭膜，将工作浓度的样本和标准品稀释液加入免疫检测板上的96孔反应小槽内；将Aβ不同稀释浓度的标准品依次加入相应的小孔后，再将一致浓度蛋白浓度的待测样本加入检测反应小槽内；6）封闭96孔免疫检测板，将免疫检测板在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时；7）用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；8）加封闭溶液在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时；9）取出冷藏的试剂VI，自然升至室温；工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释至10ml；10）加稀释的Aβ检测抗体进反应小槽，在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时；11）用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽四次；12）取出冷藏的试剂Ⅷ的鼠抗兔的第二抗体，自然升至室温；用工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释；13）加稀释的A β检测抗体进反应小槽在定速震荡仪室温孵育0.5-1.5小时；14）用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；15）取出冷藏的的试剂Ⅸ和X，加温至37度；取试剂Ⅸ和试剂X均匀混合；加混合液至每个反应小槽内；根据显色从浅至深蓝色时，加入试剂Ⅸ，停止显色反应；将检测板置入分光光度计在450nm检测反应溶液的OD值；根据OD值和Aβ的标准曲线确定样本中Aβ的含量。
进一步地，所述步骤1）中定量测定标准曲线的梯度浓度为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.63pg/ml、7.86pg/ml、0pg/ml。
本发明对比现有技术有如下的有益效果：本发明提供的人体血清Aβ的定量检测方法，通过采用试剂盒预先配置铺有抗Aβ肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与血浆样本中Aβ进行捕获性免疫反应，然后与抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗体进行二次抗原－抗体反应，经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定；该方法结合亚洲人群的生物特性，提高了Aβ检测灵敏度，简化样本处理以及操作程序或提供外包服务来弥补国外现存试剂盒进行检测的缺点和不足，可供医院临床老年性痴呆病的实验诊断、对携带痴呆遗传史或痴呆危险基因人群,以及可疑隐匿患者进行疾病的筛查以及临床新药疗效观察/判定以及大专院校实验研究，操作者只要按照试剂盒说明书在使用时完成最后步骤的试剂配置，按设计的操作步骤实施将能检测包括血液，脑脊液，细胞培养液和脑组织提取液。简化了多种实验检测中的繁琐步骤，因此缩短了实验检测周期，节约财力物力和试验操作的时间，满足检测流程的简单化和检测结果的准确性。
具体实施方式
本发明提供的人体血清Aβ的定量检测方法，依次包括如下步骤：
步骤S1：采用试剂盒预先配置铺有抗Aβ肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与控温和定速离心处理过的血浆样本中Aβ进行捕获性免疫反应，得反应复合物；
步骤S2：所述反应复合物与抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗体进行二次抗原－抗体反应，得反应结合物；
步骤S3：所述反应结合物经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定。
步骤S1中的试剂盒包括盒体、盒盖和固定板，所述盒体内置放有十个试剂瓶和一个免疫检测板，其中十个试剂瓶和96孔免疫检测板由试剂板分隔固定，所述每个试剂瓶上附设有说明标签，所述每个试剂瓶内封闭包装有试剂。较佳地，所述试剂盒的盒体和盒盖由硬纸或塑料板制成，所述试剂板由硬纸或塑料泡沫制成。
十个试剂瓶具体构成如下：
试剂瓶1：白色塑料瓶，瓶内封闭包装着精确称量的人Aβ淀粉样肽（Aβ40和42）标准品，其净重为1ug/管；用于标准曲线的绘制。此为试剂I。
试剂瓶2：白色塑料瓶，瓶内装有按固定重量和配比的NaH2PO4H2O·Na2HPO4缓冲溶液，用于样本和标准品的溶解和稀释，其中NaH2PO4H2O·Na2HPO4为20mM，EDTA浓度为2mM，NaCl浓度为400mM，BSA、CHAPS、Block Ace和NaN3浓度依次为0.2%、0.05%、0.4%和0.05%，溶液pH值为7.0，容量为25ml（10X）；此为试剂Ⅱ。
试剂瓶3：白色塑料瓶，瓶内装有按固定重量和配比的NaN3·Block Ace·PBS溶液，其中NaN3和Block Ace重量百分比浓度分别为10%和1%在PBS溶液中，溶液pH值为7.4，用于降低非特异性Aβ检测信号；此为试剂Ⅲ。
试剂瓶4：白色塑料瓶，瓶内装有按固定重量和配比的NaH2PO4H2O·Na2HPO4的溶液。其中NaH2PO4H2O·Na2HPO4为20mM，EDTA浓度为2mM，NaCl浓度为400mM、BSA浓度为1%，溶液pH为7.0，25ml(10X)，用于Aβ检测抗体浓度的配置；此为试剂Ⅳ。
试剂瓶5：棕色塑料瓶，瓶内封闭包装着准确重量的BSA和Block Ace粉末，两种粉末分装在各自的两个小管内，Block Ace每管净重为1g，临用前分别溶解在试剂Ⅱ和Ⅲ的溶液中，BSA每管净重为0.5g，用于提高检测信号分辨率，使用前分别溶解在试剂Ⅱ和Ⅳ的溶液中，此为试剂V。
试剂瓶6：白色塑料瓶，瓶内封闭包装着精确含量的兔抗人Aβ淀粉样肽抗体25ul，用于样本的二次抗原－抗体反应以增加检测的灵敏度，使用前溶于试剂Ⅳ的溶液中，稀释至合适的样本检测浓度；此为试剂VI。
试剂瓶7：白色塑料瓶，瓶内装有按固定重量和配比清洗免疫反应的平衡液（10xPBS）即NaCl、KCl、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4，pH值为7.4，250ml，使用前将用双蒸水稀释至1X（1倍），此为试剂Ⅸ。
试剂瓶8：白色塑料瓶，瓶内封闭包装着精确含量的鼠抗兔的第二抗体25ul，用于放大检测的Aβ信号，使用前在试剂Ⅳ的溶液中稀释至合适的样本检测浓度；此为试剂Ⅷ。
试剂瓶9：棕色塑料瓶，瓶内封闭包装氧化还原反应的TMB溶液，可使第二抗体发生酶联反应，TMB溶液为25ml；此为试剂Ⅸ。
试剂瓶10:棕色塑料瓶，瓶内封闭包装氧化还原反应的peroxidase（氧化酶）溶液,与TMB溶液反应可根据反应物呈现的显色程度量化样本抗原含量的测定，此为试剂X。
在采用试剂盒进行人体血清Aβ的定量检测之前先配置如下工作浓度溶液：
1.配制工作浓度的样本和标准品稀释液：取出冷藏的试剂Ⅱ,将10倍的25ml试剂Ⅱ稀释至250ml(1X)；取出冷藏的试剂V，自然升至室温，将其中一小管0.5g BSA和一小管1g的Block Ace溶入稀释后的试剂Ⅱ中。
2.配制工作浓度的缓冲基液；取出100ml的10xPBS加双蒸水至1L，检查pH值。
3.配制封闭溶液：从试剂V中取出另一小管1g的Block Ace粉末溶入试剂Ⅱ溶到900ml的1xPBS再加100ml的NaN3配制成1X的Block Ace封闭溶液。
4.配制工作浓度的抗体稀释溶液：取出10X的25ml的试剂Ⅳ，加入2475ml双蒸水配成1X的抗体稀释溶液，然后再加入另一小管0.5g的BSA粉末溶入到试剂工作浓度的抗体稀释溶液中。
在配置好工作浓度的溶液后，对人体血清Aβ进行定量检测，具体包括如下步骤：
1.取出冷藏铺有Aβ抗体和塑料盖膜封闭的免疫检测板，自然升至室温。
2.准备定量检测Aβ的标准品：定量测定标准曲线的梯度浓度为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.63pg/ml、7.86pg/ml、0pg/ml。将试剂I的标准品Aβ溶于200ul含有BSA和Block Ace的样本和标准品稀释液中，将溶解液加入1.8ml配成1000pg/ml母液，取出1ml母液加1ml稀释液至500pg/ml，然后将250ul的500pg/ml加等量的稀释液依次稀释至标准曲线的梯度浓度。
3.准备待测样本：将待测血液样本在控温和定速离心后取出上清液，进行蛋白定量；
4.用工作浓度的样本和标准品稀释液将收集的待测样本中的蛋白浓度统一调整（稀释）至一致浓度所需量；
5.揭开免疫检测板的封闭膜，将25ul工作浓度的样本和标准品稀释液加入免疫检测板的96孔反应槽内。将Aβ不同稀释浓度的标准品100ul依次加入相应的反应槽后，再将100ul一致浓度蛋白浓度的待测样本加入检测反应小槽内；
6.封闭96孔免疫检测板，将免疫检测板在定速震荡仪室温孵育2小时或在4度无震荡过夜；
7.用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；
8.加100ul封闭溶液在定速震荡仪室温孵育2小时或在4度无震荡过夜；
9.取出冷藏的试剂Ⅵ（Aβ检测抗体），自然升至室温。工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释至10ml；
10.加100ul稀释的Aβ检测抗体进反应小槽，在定速震荡仪室温孵育2小时或在4度无震荡过夜；
11.用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽四次；
12.取出冷藏的Ⅷ抗体（鼠抗兔的第二抗体），自然升至室温，工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释至10ml；
13.加100ul稀释的Aβ检测抗体进反应小槽在定速震荡仪室温孵育1小时；
14.用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；
15.取出冷藏的的试剂Ⅸ和X，水浴加温至37度，取5.5ml试剂Ⅸ和5.5ml试剂X均匀混合，加100ul至每个反应小孔内；根据显色从浅至深蓝色时，加入试剂Ⅸ，停止显色反应；将检测板置入分光光度计在450nm检测反应溶液的OD值；根据OD值和Aβ的标准曲线定量样本中的Aβ的水平。
综上，本发明提供的人体血清Aβ的定量检测方法，通过采用试剂盒预先配置铺有抗Aβ肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与血浆样本中Aβ进行捕获性免疫反应，然后与抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗体进行二次抗原－抗体反应，经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定；该方法结合亚洲人群的生物特性，提高了Aβ检测灵敏度，简化样本处理以及操作程序或提供外包服务来弥补国外现存试剂盒进行检测的缺点和不足，可供医院临床老年性痴呆病的实验诊断、对携带痴呆遗传史或痴呆危险基因人群,以及可疑隐匿患者进行疾病的筛查以及临床新药疗效观察/判定以及大专院校实验研究，操作者只要按照试剂盒说明书在使用时完成最后步骤的试剂配置，按设计的操作步骤实施将能检测包括血液，脑脊液，细胞培养液和脑组织提取液。简化了多种实验检测中的繁琐步骤，因此缩短了实验检测周期，节约财力物力和试验操作的时间，满足检测流程的简单化和检测结果的准确性。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
a)采用试剂盒预先配置铺有抗Aβ肽结构N-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与控温和定速离心处理过的血浆样本中Aβ进行捕获性免疫反应，得反应复合物；
b)所述反应复合物与抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗体进行二次抗原－抗体反应，得反应结合物；
c）所述反应结合物经带有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗体进行显色反应后，由分光光度仪进行定量测定。
2.如权利要求1所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述步骤a)中的试剂盒包括盒体、盒盖和固定板，所述盒体内置放有十个试剂瓶和一个免疫检测板，所述十个试剂瓶和免疫检测板由试剂板分隔固定，所述每个试剂瓶上附设有说明标签，所述每个试剂瓶内封闭包装有试剂。
3.如权利要求2所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述试剂盒的盒体和盒盖由硬纸或塑料板制成，所述试剂板由硬纸或塑料泡沫制成。
4.如权利要求2所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述十个试剂瓶中分别装有：试剂I：人体Aβ淀粉样肽；试剂Ⅱ：NaH2PO4H2O·Na2HPO4缓冲溶液；试剂Ⅲ：NaN3·Block Ace·PBS溶液；试剂Ⅳ：NaH2PO4H2O·Na2HPO4溶液；试剂Ⅴ：BSA和Block Ace粉末；试剂Ⅵ：兔抗人的Aβ检测抗体；试剂Ⅶ：清洗免疫反应的平衡液；试剂Ⅷ：鼠抗兔的第二抗体；试剂Ⅸ：TMB显色反应溶液；试剂X：peroxidase溶液。
5.如权利要求4所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述装有试剂Ⅴ、试剂Ⅸ和试剂X的试剂瓶为棕色，其他试剂瓶为白色。
6.如权利要求4所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述试剂Ⅱ中NaH2PO4H2O·Na2HPO4浓度为20mM，EDTA浓度为2mM，NaCl浓度为400mM，BSA、CHAPS、Block Ace和NaN3浓度依次为0.2%、0.05%、0.4%和0.05%，溶液pH值为7.0；所述试剂Ⅲ中NaN3和Block Ace重量百分比浓度分别为10%和1%在PBS溶液中，溶液pH值为7.4；试剂Ⅳ中NaH2PO4H2O·Na2HPO4浓度为20mM，EDTA浓度为2mM，NaCl浓度为400mM、BSA浓度为1%，溶液pH值为7.0；所述试剂Ⅶ为NaCl、KCl、Na2HPO4·7H2O和KH2PO4的混合液，pH值为7.4。
7.如权利要求6所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述试剂Ⅴ中BSA和Block Ace两种粉末分装在各自的两个小管内，Block Ace粉末使用用前分别溶解在试剂Ⅱ和Ⅲ的溶液中，所述BSA粉末使用前分别溶解在试剂Ⅱ和Ⅳ的溶液中；所述试剂Ⅵ使用前溶于试剂IV的溶液中，并稀释至样本检测浓度；所述试剂Ⅶ的容量为250ml，使用前用双蒸水稀释1倍；所述试剂Ⅷ在使用用前在试剂Ⅳ的溶液中稀释至样本检测浓度。
8.如权利要求7所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，在采用所述试剂盒进行Aβ的定量检测之前先配置如下溶液：
1）配制工作浓度的样本和标准品稀释液：取出冷藏的试剂Ⅱ,将10倍的25ml试剂II稀释至250ml；取出冷藏的试剂V，自然升至室温，将其中一小管0.5gBSA和一小管1g的Block Ace溶入稀释后的试剂Ⅱ中；
2）配制工作浓度的缓冲基液：取出100ml的10xPBS加双蒸水至1L，检查pH值；
3）配制封闭溶液：从试剂V中取出另一小管1g的Block Ace粉末溶入试剂Ⅱ溶到900ml的1xPBS再加100ml的NaN3配制成1X的Block Ace封闭溶液；
4）配制工作浓度的抗体稀释溶液：取出10X的25ml的试剂Ⅳ，加入2475ml双蒸水配成1X的抗体稀释溶液，然后再加入另一小管0.5g的BSA粉末溶入到试剂工作浓度的抗体稀释溶液中。
9.如权利要求8所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，在配置好工作浓度的溶液后，对人体血清Aβ进行定量检测，包括如下步骤：
1）取出冷藏铺有Aβ抗体和塑料盖膜封闭的免疫检测板，自然升至室温；
2）准备定量检测Aβ的标准品：将试剂I的标准品Aβ溶于含有BSA和BlockAce的样本和标准品稀释液中；并将溶解液依次稀释至标准曲线的梯度浓度；
3）准备待测样本：将待测血液样本在控温和定速离心后取出上清液，进行蛋白定量；
4）用工作浓度的样本和标准品稀释液将收集的待测样本中的蛋白浓度统一稀释至一致浓度所需量；
5）揭开免疫检测板的封闭膜，将工作浓度的样本和标准品稀释液加入免疫检测板上的96孔反应小槽内；将Aβ不同稀释浓度的标准品依次加入相应的小孔后，再将一致浓度蛋白浓度的待测样本加入检测反应小槽内；
6）封闭96孔免疫检测板，将免疫检测板在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时；
7）用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；
8）加封闭溶液在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时；
9）取出冷藏的试剂VI，自然升至室温；工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释至10ml；
10）加稀释的Aβ检测抗体进反应小槽，在定速震荡仪室温孵育1-3小时或4度无震荡12-36小时；
11）用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽四次；
12）取出冷藏的试剂Ⅷ的鼠抗兔的第二抗体，自然升至室温；用工作浓度的抗体稀释溶液将其稀释；
13）加稀释的Aβ检测抗体进反应小槽在定速震荡仪室温孵育0.5-1.5小时；
14）用工作浓度的缓冲基液清洗反应小槽三次；
15）取出冷藏的的试剂Ⅸ和X，加温至37度；取试剂Ⅸ和试剂X均匀混合；加混合液至每个反应小槽内；根据显色从浅至深蓝色时，加入试剂Ⅸ，停止显色反应；将检测板置入分光光度计在450nm检测反应溶液的OD值；根据OD值和Aβ的标准曲线确定样本中Aβ的含量。
10.如权利要求9所述的人体血清Aβ的定量检测方法，其特征在于，所述步骤1）中定量测定标准曲线的梯度浓度为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.63pg/ml、7.86pg/ml、0pg/ml。
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