CN103820517A - 调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴将新鲜或经浸润、软化后的干燥的青藏高原特有牛种牦牛wildyak的牦牛皮清洗干净，然后加碱浸泡，得到脱毛后的牦牛皮；⑵脱毛后的牦牛皮加水浸泡脱碱后清水冲洗，得到脱碱脱毛的牦牛皮；⑶脱碱脱毛的牦牛皮剪切成小块，然后加水焯皮，得到脱脂后的牦牛皮；⑷脱脂后的牦牛皮用水进行提取后过滤，弃去残渣，得到滤液；⑸滤液用水稀释后进行分离，即得4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液；⑹将4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液经浓缩、干燥，即得牦牛皮小分子胶原蛋白。本发明方法简单、效果显著，所制得的牦牛皮胶原蛋白分子量分布集中，具有调控机体能量代谢的功能。

Description

调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种胶原蛋白的制备方法，尤其涉及调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法。

背景技术

机体所需的能量来源于食物中的糖、脂肪和蛋白质，这些营养成分经消化转变成为可吸收的小分子营养物质而被吸收。人体大约有16%是蛋白质，而蛋白质中有35~45%的胶原蛋白，主要存在的部位有皮肤、肌肉、骨骼、牙齿等，胶原蛋白是人体骨骼、尤其是软骨组织中的重要组成成分。

乳酸脱氢酶（LDH）是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内，是催化丙酮酸与乳酸之间还原与氧化反应，丙酮酸当糖酵解速度超过有氧代谢速度时被还原为乳酸，是参与糖无氧酵解和糖异生的重要酶。

肌酸激酶 (CK)存在于心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。

三磷酸腺苷（ATP）直接供给能量的物质，PCr是主要的能量储备物质，生理情况下ATP可被线粒体肌酸激酶从线粒体内膜转移并形成PCr，PCr在需能部位再经胞质CK同工酶催化转为ATP以供利用。

牦牛是中国古老而又原始的牛种之一，是唯一能在青藏高原生态环境下生存繁衍的牛种，是青藏高原特有的优势畜种，具有独特的生态学特性及经济价值。经过千百年的自然选择与进化，形成了其独特的遗传性能和对高寒缺氧恶劣环境的适应能力，具有极强的抗逆能力、抗病能力、耐受性和适应性，能适应一般家畜不能适应的高海拔、高缺氧等严酷的高寒恶劣生态环境。牦牛体内含有许多抗疲劳、抗缺氧的生物活性物质。从牦牛皮中提取纯天然的小分子胶原蛋白，被机体吸收后被转化成参与机体能量代谢过程中所需酶类或参与到中间产物合成代谢过程中，在机体需要能量时能有效及时提供能量，有效降低乳酸含量，避免代谢产物对机体的损伤。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、效果显著的调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法。

为解决上述问题，本发明所述的调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜或经浸润、软化后的干燥的青藏高原特有牛种牦牛wild yak 的牦牛皮清洗干净，然后按其重量的2~3倍加入质量浓度为0.5~10%的碱，在温度为20~38℃的条件下浸泡2~72小时，得到脱毛后的牦牛皮；

⑵将所述脱毛后的牦牛皮按其重量的3~5倍加入水，在水温为20~30℃的条件下浸泡脱碱，重复1~4次，每次10~30分钟，然后清水冲洗，洗净残余毛屑，并测定pH值，得到脱碱脱毛的牦牛皮；

⑶将所述脱碱脱毛的牦牛皮剪切成3~5cm的小块，然后加入其重量5~20倍的水，在温度为40~60℃的条件下焯皮2~3次，得到脱脂后的牦牛皮；

⑷将所述脱脂后的牦牛皮用其质量8~12倍的水进行提取，2~10小时后过滤，弃去残渣，得到滤液；

⑸将所述滤液用其体积的5~50倍水稀释后，在分离温度为30~50℃的条件下进行分离，即得4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液；

⑹将所述4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液经浓缩、干燥，即得牦牛皮小分子胶原蛋白。

所述步骤⑴中的碱是指氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸氢钠溶液中的一种。

所述步骤⑸中的滤液分离为离心、膜分离、透析方法中的任意一种。

所述步骤⑹中的浓缩是指减压浓缩、吹干浓缩中任意一种。

所述步骤⑹中的干燥条件为喷雾干燥、冷冻干燥、微波干燥、烘箱干燥中的任意一种。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明以牦牛皮为原料，通过碱法脱毛处理牦牛皮，经过提取分离得到小分子胶原蛋白。采用该方法制得的牦牛皮胶原蛋白分子量分布集中，其分子量在4KDa，粒度为2.9nm，含量大于99.9%以上（参见表1、表2、图1、图2）。

表1：小分子胶原DLS动态光散射测定结果

注：Item为对同一批样品进行测定次数。

表2小分子胶原蛋白粒径峰值分布

2、对本发明所得的牦牛皮小分子胶原蛋白进行药效学实验：

⑴动物负重游泳实验结果：

选两个给药剂量（200 mg/kg/d、1.0 g/kg/d）组进行，将健康KM小鼠30只随机分成3组，雌雄各半，空白组按0.2 ml/10 g灌胃纯净水，连续给药七天。给药前后小鼠的体重、力竭游泳时间进行了比较分析，观察不同给药剂量小鼠力竭游泳时间及体重的影响（参见表3）。

表3 不同给药剂量对小鼠负重游泳实验的影响

与空白组比较：*P<0.05； **P<0.01。

⑵生化指标测定：

将健康KM小鼠30只，随机分成3组，雌雄各半，两个给药组（低、高）、空白对照组，给药七天。检测总蛋白（TP）、乳酸脱氢酶（LDH）、乳酸（LA）、肝糖元、肌糖元的含量（参见表4）。

表4  给药七天后对血生化指标的影响

与空白组比较：*P<0.05； **P<0.01。

不同给药剂量的抗疲劳实验，都可以延长小鼠的力竭游泳时间，生化指标的测定低、高2个剂量给药组小鼠的肝肌糖元储备具有显著的提升。因为在小鼠力竭运动时，糖元作为一种能量物质迅速为小鼠进行了能量供应，从而使小鼠的力竭游泳时间得到了增长（Coyle,Coggan et al. 1986）。

在小分子量胶原蛋白高剂量给药下明显降低LDH和CK含量，具有显著性作用。小鼠经消化吸收被机体转化成为能量储备物质如糖元及脂肪等，因此在剧烈型运动疲劳情况下能量储备充足却不能及时供应（Holloszy,Kohrt et al. 1998）；而小分子量范围在被机体消化吸收后在体内被转化成一些参与机体能量代谢过程中所需酶类或参与到中间产物合成代谢过程中去，从而使机体在及需能量供应时能有效供应能量，有效降低“疲劳因子”乳酸含量保护机体免受代谢产物导致的损伤。

因此，本发明所得的牦牛皮小分子胶原蛋白具有能量储备功能，需要时即时能量启动，对代谢产物乳酸具有清除功能。

3、本发明提取过程中不添加任何化学品，效果显著，能调节人体能量代谢，在机体需要能量时能有效及时提供能量，有效降低乳酸含量，避免代谢产物对机体的损伤，可用于生产食品、保健品、药品及生产各种固体制剂和液体制剂，尤其适合劳动强度大的人群食用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明小分子胶原蛋白的百分含量分布。

图2为本发明小分子胶原蛋白粒径含量分布。

具体实施方式

实施例1   调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜的牦牛皮清洗干净，然后按其重量的2倍加入质量浓度为0.5%的氢氧化钠溶液，在温度为38℃的条件下浸泡2小时，得到脱毛后的牦牛皮。

⑵将脱毛后的牦牛皮按其重量的3倍加入水，在水温为30℃的条件下浸泡脱碱，重复2次，每次30分钟，然后清水冲洗，洗净残余毛屑，并测定pH值，得到脱碱脱毛的牦牛皮。

⑶将脱碱脱毛的牦牛皮剪切成5cm的小块，然后加入其重量20倍的水，在温度为60℃的条件下焯皮2次，得到脱脂后的牦牛皮。

⑷将脱脂后的牦牛皮用其质量8倍的水进行提取，10小时后过滤，弃去残渣，得到滤液。

⑸将滤液用其体积的5倍水稀释后，在分离温度为30℃的条件下，采用孔径10，截留分子量为500的透析袋进行透析分离，即得4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液。

⑹将4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液经浓缩、冷冻干燥后，即得牦牛皮小分子胶原蛋白。

其中：浓缩是指减压浓缩，其条件为真空度0.07MPa，温度50℃。冷冻干燥条件是指温度-25℃预冷25分钟，-45℃、45MPa干燥60小时。

实施例2   调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

⑴将经浸润、软化后的干燥的青藏高原特有牛种牦牛wild yak 的牦牛皮清洗干净，然后按其重量的3倍加入质量浓度为8%的氢氧化钾溶液，在温度为25℃的条件下浸泡50小时，得到脱毛后的牦牛皮。

⑵将脱毛后的牦牛皮按其重量的5倍加入水，在水温为30℃的条件下浸泡脱碱，重复3次，每次30分钟，然后清水冲洗，洗净残余毛屑，并测定pH值，得到脱碱脱毛的牦牛皮。

⑶将脱碱脱毛的牦牛皮剪切成5cm的小块，然后加入其重量10倍的水，在温度为50℃的条件下焯皮3次，得到脱脂后的牦牛皮。

⑷将脱脂后的牦牛皮用其质量10倍的水进行提取，2小时后过滤，弃去残渣，得到滤液。

⑸将滤液用其体积的25倍水稀释后，在分离温度为50℃、压力为3.5KPa的条件下，采用100K醋酸纤维膜膜进行分离，即得4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液。

⑹将4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液经浓缩、喷雾干燥后，即得牦牛皮小分子胶原蛋白。

其中：浓缩是指吹干浓缩，其条件为温度15℃，浓缩时间60小时。喷雾干燥的条件是指喷雾流量23ml/min，进料温度40℃，进风温度175℃。

实施例3   调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜牦牛皮清洗干净，然后按其重量的2倍加入质量浓度为10%的氢氧化钠溶液，在温度为30℃的条件下浸泡72小时，得到脱毛后的牦牛皮。

⑵将脱毛后的牦牛皮按其重量的5倍加入水，在水温为20℃的条件下浸泡脱碱，重复4次，每次10分钟，然后清水冲洗，洗净残余毛屑，并测定pH值，得到脱碱脱毛的牦牛皮。

⑶将脱碱脱毛的牦牛皮剪切成4cm的小块，然后加入其重量10倍的水，在温度为40℃的条件下焯皮3次，得到脱脂后的牦牛皮。

⑷将脱脂后的牦牛皮用其质量9倍的水进行提取，8小时后过滤，弃去残渣，得到滤液。

⑸将滤液用其体积的35倍水稀释后，在分离温度为25℃的条件下以3000转/分钟速率离心分离30分钟，即得4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液。

⑹将4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液经浓缩、微波干燥至恒重后，即得牦牛皮小分子胶原蛋白。

其中：浓缩是指减压浓缩，其条件为真空度0.07MPa，温度50℃。微波干燥的条件是指功率1000W，干燥时间25分钟。

实施例4   调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜牦牛皮清洗干净，然后按其重量的3倍加入质量浓度为7%的碳酸氢钠溶液，在温度为20℃的条件下浸泡55小时，得到脱毛后的牦牛皮。

⑵将脱毛后的牦牛皮按其重量的4倍加入水，在水温为25℃的条件下浸泡脱碱，重复1次，每次20分钟，然后清水冲洗，洗净残余毛屑，并测定pH值，得到脱碱脱毛的牦牛皮。

⑶将脱碱脱毛的牦牛皮剪切成3cm的小块，然后加入其重量15倍的水，在温度为55℃的条件下焯皮2次，得到脱脂后的牦牛皮。

⑷将脱脂后的牦牛皮用其质量12倍的水进行提取，4小时后过滤，弃去残渣，得到滤液。

⑸将滤液用其体积的50倍水稀释后，在分离温度为50℃、压力为3.5KPa的条件下，采用100K醋酸纤维膜膜进行分离，即得4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液。

⑹将4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液经浓缩、干燥至恒重后，即得牦牛皮小分子胶原蛋白。

其中：浓缩是指减压浓缩，其条件为真空度0.07MPa，温度50℃。干燥的条件是指40~50℃恒温干燥箱干燥25小时。

实施例5   调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

⑴将经浸润、软化后的干燥的青藏高原特有牛种牦牛wild yak 的牦牛皮清洗干净，然后按其重量的2.5倍加入质量浓度为5%的碳酸氢钠溶液，在温度为28℃的条件下浸泡12小时，得到脱毛后的牦牛皮。

⑵将脱毛后的牦牛皮按其重量的3.5倍加入水，在水温为27℃的条件下浸泡脱碱，重复2次，每次25分钟，然后清水冲洗，洗净残余毛屑，并测定pH值，得到脱碱脱毛的牦牛皮。

⑶将脱碱脱毛的牦牛皮剪切成3cm的小块，然后加入其重量5倍的水，在温度为45℃的条件下焯皮2次，得到脱脂后的牦牛皮。

⑷将脱脂后的牦牛皮用其质量9倍的水进行提取，5小时后过滤，弃去残渣，得到滤液。

⑸将滤液用其体积的50倍水稀释后，在分离温度为50℃、压力为3.5KPa的条件下，采用100K醋酸纤维膜膜进行分离，即得4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液。

⑹将4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液经浓缩、干燥至恒重后，即得牦牛皮小分子胶原蛋白。

其中：浓缩是指减压浓缩，其条件为真空度0.07MPa，温度50℃。干燥的条件是指40~50℃恒温干燥箱干燥25小时。

Claims (5)

1.调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜或经浸润、软化后的干燥的青藏高原特有牛种牦牛wild yak 的牦牛皮清洗干净，然后按其重量的2~3倍加入质量浓度为0.5~10%的碱，在温度为20~38℃的条件下浸泡2~72小时，得到脱毛后的牦牛皮；

⑵将所述脱毛后的牦牛皮按其重量的3~5倍加入水，在水温为20~30℃的条件下浸泡脱碱，重复1~4次，每次10~30分钟，然后清水冲洗，洗净残余毛屑，并测定pH值，得到脱碱脱毛的牦牛皮；

⑶将所述脱碱脱毛的牦牛皮剪切成3~5cm的小块，然后加入其重量5~20倍的水，在温度为40~60℃的条件下焯皮2~3次，得到脱脂后的牦牛皮；

⑷将所述脱脂后的牦牛皮用其质量8~12倍的水进行提取，2~10小时后过滤，弃去残渣，得到滤液；

⑸将所述滤液用其体积的5~50倍水稀释后，在分离温度为30~50℃的条件下进行分离，即得4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液；

⑹将所述4Kda小分子的牦牛皮胶原蛋白溶液经浓缩、干燥，即得牦牛皮小分子胶原蛋白。

2.如权利要求1所述的调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中的碱是指氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸氢钠溶液中的一种。

3.如权利要求1所述的调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤⑸中的滤液分离为离心、膜分离、透析方法中的任意一种。

4.如权利要求1所述的调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤⑹中的浓缩是指减压浓缩、吹干浓缩中任意一种。

5.如权利要求1所述的调控机体能量代谢的牦牛皮小分子胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤⑹中的干燥条件为喷雾干燥、冷冻干燥、微波干燥、烘箱干燥中的任意一种。

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