CN103813805A - Egfr靶向疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗神经障碍的组合物和方法。特别地，本发明涉及作为用于治疗神经障碍的临床靶的EGFR。

Description

EGFR靶向疗法
发明领域
本发明涉及用于治疗神经障碍的组合物和方法。特别地，本发明涉及作为用于治疗神经障碍的临床靶的EGFR。
发明背景
在神经损伤后的慢性和/或神经性疼痛是全世界主要的健康问题。神经性疼痛(NP)由躯体感觉***的原发性损害或疾病引起(                                                等人，
Figure 203209DEST_PATH_IMAGE002
Figure 45263DEST_PATH_IMAGE003
)。并不罕见地，它的严重性、慢性，和对于NP的目前药物疗法的不良的副作用与益处的比例(
Figure 440472DEST_PATH_IMAGE004
Figure 566429DEST_PATH_IMAGE005
Figure 388891DEST_PATH_IMAGE006
Figure 718241DEST_PATH_IMAGE007
)导致患者中的严重受损的躯体功能和心理功能(
Figure 399069DEST_PATH_IMAGE009
)。在一般人群中，NP的发生率估计为1% (
Figure 392433DEST_PATH_IMAGE010
Figure 946091DEST_PATH_IMAGE012
)，并且逐渐升高(Dworkin，同上)。所产生的中度到重度慢性NP的流行率为5% (
Figure 469477DEST_PATH_IMAGE013
Figure 210905DEST_PATH_IMAGE014
Figure 452531DEST_PATH_IMAGE015
)，使得它成为全世界常见和难克服的健康问题。
尽管NP有众多的病因，但与起源无关，它的持续机制看起来涉及神经元、神经胶质细胞和免疫细胞的相互作用(
Figure 789971DEST_PATH_IMAGE016
Figure 433442DEST_PATH_IMAGE017
)。这些细胞之间的通讯已归于经由丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白质家族的信号转导(
Figure 643975DEST_PATH_IMAGE018
Figure 372896DEST_PATH_IMAGE019
)。
神经性疼痛是通常伴随组织损伤的复杂的慢性疼痛状态。对于神经性疼痛，神经纤维自身可以是损害的、功能失调的或受损的。这些损害的神经纤维对其他疼痛中心发送不正确的信号。神经纤维损伤的影响包括在损伤部位和损伤周围区域处的神经功能中的变化。一些神经性疼痛研究表明非类固醇抗炎药例如萘普生(Aleve)或布洛芬(Motrin)的使用可减轻疼痛。一些人可能需要更强的止痛药例如含有***的那些。抗惊厥药和抗抑郁药看起来在一些情况下起作用。如果涉及另一种状况例如糖尿病，则对该病症的更佳管理可以缓和疼痛。
在难以治疗的情况下，疼痛专家可以使用侵入性或可植入装置疗法来管理疼痛。对涉及神经性疼痛生成的神经的电刺激也可以控制疼痛症状。
不幸的是，神经性疼痛通常对标准疼痛治疗响应不良，并且偶然地可以随着时间而变得更糟而不是变得更好。对于一些人，它可以导致严重的残疾。目前治疗的特征在于令人不满意的副作用与利益比。
因此，迫切需要靶向神经障碍例如神经性疼痛的另外疗法。
发明概述
本发明涉及用于治疗神经障碍的组合物和方法。特别地，本发明涉及作为用于治疗神经障碍的临床靶的EGFR。
相应地，在一些实施方案中，本发明提供了治疗具有神经障碍的受试者的方法，其包括给所述受试者施用抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂。在一些实施方案中，受试者显示出神经障碍的症状，并且所述施用所述试剂减少或调节所述神经障碍的症状。在一些实施方案中，所述试剂是与所述EGFR多肽特异性结合的抗原结合蛋白质。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白质选自贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、可那木单抗(conatumumab)、盖尼塔单抗(ganitumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)和扎鲁木单抗(zalutumumab)。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白质优选地选自西妥昔单抗或帕尼单抗。在一些实施方案中，所述试剂是小分子药物。在一些实施方案中，所述小分子药物选自阿法替尼(afatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)和凡德他尼(vandetanib)。在一些实施方案中，所述小分子药物优选地选自吉非替尼和厄洛替尼。在一些实施方案中，所述受试者在动物中。在一些实施方案中，所述动物是人。在一些实施方案中，所述受试者不具有癌症或先前未就癌症进行治疗。在一些实施方案中，所述神经障碍是神经性疼痛。在一些实施方案中，所述神经障碍选自疼痛、坐骨神经痛、多发性硬化、抑郁、痴呆、帕金森氏病、中风、轴突切断(axotomia)、和缺血或再灌注损伤、唐氏综合症和孤独症。在一些实施方案中，所述抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂与至少另外的治疗剂共施用。在一些实施方案中，所述至少另外的治疗剂选自非甾体抗炎药、甾体抗炎药、基于阿片类物质的药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗癫痫药、抗焦虑药和***类物质(cannibinoids)及其组合。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗神经障碍的方法，其包括给显示出神经障碍症状的受试者施用抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂，其中所述施用减少、调节或消除所述症状。在一些实施方案中，所述抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂与至少另外的治疗剂共施用。在一些实施方案中，所述至少另外的治疗剂选自非甾体抗炎药、甾体抗炎药、基于阿片类物质的药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗癫痫药、抗焦虑药和***类物质及其组合。
在一些实施方案中，本发明提供了抑制EGFR的至少一种生物学功能的试剂用于治疗神经障碍的用途。在一些实施方案中，所述神经障碍选自神经性疼痛、坐骨神经痛、多发性硬化、抑郁、痴呆、帕金森氏病、中风、缺血或再灌注损伤、轴突切断、唐氏综合症和孤独症。在一些实施方案中，所述试剂是与所述EGFR多肽特异性结合的抗原结合蛋白质。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白质选自贝伐珠单抗、西妥昔单抗、可那木单抗、盖尼塔单抗、马妥珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗、利妥木单抗、曲妥珠单抗和扎鲁木单抗。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白质优选地选自西妥昔单抗或帕尼单抗。在一些实施方案中，所述试剂是小分子药物。在一些实施方案中，所述小分子药物选自阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、来那替尼和凡德他尼。在一些实施方案中，所述小分子药物优选地选自吉非替尼和厄洛替尼。在一些实施方案中，所述抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂与至少另外的治疗剂共施用。在一些实施方案中，所述至少另外的治疗剂选自非甾体抗炎药、甾体抗炎药、基于阿片类物质的药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗癫痫药、抗焦虑药和***类物质及其组合。在一些实施方案中，所述施用或共施用减少或调节所述神经障碍的症状。
另外的实施方案在本文中描述。
附图说明
图1 a-d提供了根据本发明的治疗的图形描绘。a) 病例2。描绘患者右手中CRPS1的典型的异常的持久性的照片。用EGFR抑制剂西妥昔单抗的治疗缓解她的NP，但不影响潜在状况的血管舒缩的病理学。b) 病例3。在最初缓解后，由于NP背痛的复发，手术后六周获得的磁共振图像。图像证实在患者的第五腰椎神经根周围的病理学瘢痕组织形成。c和d) 病例4。在EGFR抑制之前c) 和之后d) 患者骨盆的计算机体层摄影术扫描。在扫描之间的间隔中，尽管不断生长的骨盆肿瘤日益侵入骶神经，但患者的NP仍得到完全缓解。
图2提供了在EGFR抑制引入前和后的BPI测量的图表。
定义
为了促进对本发明的理解，下文定义了许多术语和短语：
如本文使用的，术语“神经性疼痛”指通常伴随组织损伤的复杂的慢性疼痛状态。神经性疼痛包括但不限于下述症状和疾病状态：神经卡压(nerve impingement)、I型和II型复杂区域性疼痛综合征、三叉神经痛、幻痛、糖尿病神经病变、脊髓损伤和由于即癌症、烧伤和创伤的神经损害。
如本文使用的，术语“抑制EGFR的至少一种生物活性”指降低EGFR的任何活性(例如包括但不限于本文描述的活性)的任何试剂，其经由直接接触EGFR蛋白质，接触EGFR mRNA或基因组DNA，引起EGFR多肽的构象变化，降低EGFR蛋白质水平，或干扰EGFR与信号转导配偶体如不同潜在配体的相互作用，并且影响EGFR靶基因的表达，所述配体包括但不限于EGF、TGF-α、神经调节蛋白、NGF和/或受体(包括但不限于HER1、HER2、HER3和HER4)的同二聚体和异二聚体。抑制剂还包括通过拦截上游信号转导分子间接调节EGFR生物活性的分子。
如本文使用的，术语“siRNA”指小干扰RNA。在一些实施方案中，siRNA包含长约18-25个核苷酸的双链体或双链区；通常siRNA含有在每条链的3'末端处的约二到四个未配对的核苷酸。siRNA的双链体或双链区的至少一条链与靶RNA分子基本上同源或基本上互补。与靶RNA分子互补的链是“反义链”；与靶RNA分子同源的链是“有义链”，并且还与siRNA反义链互补。siRNA还可以含有另外的序列；此类序列的非限制性例子包括连接序列或环，以及茎及其他折叠结构。siRNA看起来作为关键中间物在无脊椎动物和脊椎动物中的RNA干扰的触发中，以及在植物中的转录后基因沉默过程中的序列特异性RNA降解的触发中发挥作用。
术语“RNA干扰”或“RNAi”指通过siRNA的基因表达的沉默或降低。它是通过在其双链区中与被沉默的基因的序列同源的siRNA起始的，在动物和植物中的序列特异性、转录后基因沉默过程。所述基因可以对生物而言是内源或外源的，以整合到染色体内存在或存在于未整合到基因组内的转染载体中。基因的表达是完全或部分抑制的。RNAi还可以视为抑制靶RNA的功能；靶RNA的功能可以是完全或部分的。
如本文使用的术语“表位”指与特定抗体进行接触的抗原部分。
当蛋白质或蛋白质片段用于免疫接种宿主动物时，蛋白质的很多区域可以诱导与蛋白质上的给定区域或三维结构特异性结合的抗体的生产；这些区域或结构被称为“抗原决定簇”。抗原决定簇可以与完整抗原(即，用于引起免疫应答的“免疫原”)竞争结合抗体。
当在提及抗体和蛋白质或肽的相互作用中使用时，术语“特异性结合”意指相互作用依赖于蛋白质上的特定结构(即，抗原决定簇或表位)的存在；换言之，抗体识别且结合特定蛋白质结构而不是一般而言的蛋白质。例如，如果抗体对于表位“A”是特异性的，则在含有标记的“A”和抗体的反应中含有表位A(或游离的未标记的A)的蛋白质的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
如本文使用的，当在提及抗体和蛋白质或肽的相互作用中使用时，术语“非特异性结合”和“背景结合”指不依赖于特定结构的存在的相互作用(即，抗体结合一般而言的蛋白质而不是特定结构例如表位)。
如本文使用的，术语“受试者”指其将成为特定治疗的接受者的任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等。一般地，术语“受试者”和“患者”在本文中提及人受试者中可互换使用。
如本文使用的，术语“非人动物”指所有非人动物包括但不限于脊椎动物例如啮齿类动物、非人灵长类动物、绵羊、牛、反刍动物、兔类动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类等。
术语“基因”指包含多肽、前体或RNA(例如rRNA、tRNA)生产所需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可以通过全长编码序列或通过编码序列的任何部分编码，只要保留全长或片段的所需活性或功能性质(例如酶促活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)。该术语还包含结构基因的编码区以及在任一末端上以约1 kb或更多的距离邻近定位在于编码区的5'和3'末端上的序列，从而使得该基因对应于全长mRNA的长度。定位在编码区的5'且存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。定位在编码区的3'或下游且存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语“基因”包含基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有由被称作“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列间断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可以含有调节元件例如增强子。内含子从核或初级转录物中去除或“剪切掉”；内含子因此不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译过程中起作用，以指定在新生多肽中的序列或氨基酸次序。
如本文使用的，术语“基因表达”指通过基因“转录”(即，经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转换成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程，且对于蛋白质编码基因，通过mRNA的“翻译”转换成蛋白质。基因表达可以在过程中的许多阶段进行调节。“上调”或“活化”指增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)的生产的调节，而“下调”或“抑制”指降低生产的调节。参与上调或下调的分子(例如转录因子)通常分别称为“激活物”和“阻遏物”。
“氨基酸序列”和术语例如“多肽”或“蛋白质”不意欲将氨基酸序列限制至与所述蛋白质分子相关的完整的、天然氨基酸序列。
如本文使用的，术语“天然蛋白质”是指不含由载体序列编码的氨基酸残基的蛋白质；即，天然蛋白质仅含有如蛋白质在自然界中发生的在其中发现的那些氨基酸。天然蛋白质可以通过重组方法产生或可以从天然存在的来源中分离。
如本文使用的，当提及蛋白质(如在“给定蛋白质的部分”中)时，术语“部分”指该蛋白质的片段。片段的大小可以在从四个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸的范围。
如本文使用的，术语“体外”指人工环境和在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可以由试管和细胞培养组成，但不限于此。术语“体内”指天然环境(例如动物或细胞)，和在天然环境内发生的过程或反应。
术语“测试化合物”和“候选化合物”指任何化学实体、药剂、药物等，其为用于治疗或预防身体机能的疾病、病、不适或病症(例如神经障碍)的候选物。测试化合物包含已知和潜在的治疗化合物。测试化合物可以使用本文描述的筛选方法通过筛选测定为治疗性的。在一些实施方案中，测试化合物包括反义化合物。
如本文使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。在一个含义中，它意欲包括得自任何来源的试样或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可以得自动物(包括人)且包含流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品例如血浆、血清等。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、水、结晶和工业样品。然而，此类例子不应解释为限制可应用于所述组合物和方法的样品类型。
发明详述
本发明涉及用于治疗神经障碍的组合物和方法。特别地，本发明涉及作为用于治疗神经障碍的临床靶的EGFR。
I. 治疗应用
本发明涉及用于治疗神经障碍的组合物和方法。特别地，本发明涉及作为用于治疗神经障碍的临床靶的EGFR。
EGF-MAPK-信号转导在神经元和神经胶质细胞中响应损伤或功能障碍而活化。EGFR的抑制可以中断负反馈环，从而减轻来自神经障碍的症状，如(疼痛、神经性疼痛、MS、抑郁、痴呆、帕金森氏病、中风、轴突切断等)。尤其在神经性疼痛中，神经纤维对于疼痛的病理致敏被抑制。
认为在中枢神经、脊神经和周围神经中，以及在周围神经胶质和中枢神经胶质例如星形细胞和许旺细胞中，经由三个途径ERK、p38和JNK，通过MAPK信号转导生成且持续归因于神经损伤的疼痛(
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)。此外，在神经元细胞、神经胶质细胞和免疫细胞之间的通讯是神经性疼痛中确定的致病因子(
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Figure 45875DEST_PATH_IMAGE023
)。在神经损伤后这些细胞的活化和细胞之间的通讯已显示依赖于通过EGFR潜在活化的MAPK信号转导，其在神经***中上调(
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等人，
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)。
MAPK信号转导途径的活化在神经疾病和神经性疼痛中具有确定的重要性。EGFR抑制有效阻断这些途径中的几个(JNK、RAS-MEK-ERK、STAT等)。本发明的实施方案提供了通过抑制EGFR治疗神经障碍的方法。本发明并不限于特定的神经障碍。例如，在一些实施方案中，本发明提供了抑制EGF受体以治疗下述的方法：疼痛、神经性疼痛、MS、抑郁、痴呆、帕金森氏病、中风、缺血和再灌注损伤、缺血性脑损伤和轴突切断。参见例如，
Figure 917251DEST_PATH_IMAGE030
等人，
Figure 655531DEST_PATH_IMAGE031
和
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等人，
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。还考虑本发明的试剂的施用可用于改善与遗传性病症(例如唐氏综合症和孤独症)相关的症状。
在本发明的实施方案开发过程期间进行的实验证实在具有神经性疼痛的患者中的显著、立即和重复性的疼痛减少，但没有肿瘤消退。这种效应曾在用西妥昔单抗治疗的患者中观察到。
相应地，本发明提供了利用抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂以减少、改善或调节与下述疾病或病症相关的一种或多种症状，或提供与下述疾病或病症相关的一种或多种症状的预防的方法：疼痛、神经性疼痛、坐骨神经痛、MS、抑郁、痴呆、帕金森氏病、中风、缺血和再灌注损伤、缺血性脑损伤、轴突切断、唐氏综合症和孤独症。
A. 抗体疗法
在一些实施方案中，本发明利用靶向EGFR的抗体。任何合适的抗体(例如单克隆、多克隆或合成的)都可以用于本文公开的治疗方法中。
在一些实施方案中，神经障碍例如神经性疼痛用抗原结合蛋白质进行治疗。合适的抗原结合蛋白质包括但不限于贝伐珠单抗、西妥昔单抗、可那木单抗、盖尼塔单抗、马妥珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗、利妥木单抗、曲妥珠单抗和扎鲁木单抗。在一些优选实施方案中，使用单克隆抗体西妥昔单抗(Eli Lilly and Company，New York，NY)。西妥昔单抗是重组嵌合人鼠免疫球蛋白G1抗体，其以比任一种内源配体更高的亲和力与表皮生长因子受体的细胞外结构域结合。这种结合抑制受体磷酸化和活化，并且它导致受体内化和降解。(
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)。西妥昔单抗得到许可以治疗癌症，并且最常用于在EGF信号转导途径中不含K-RAS突变的结肠直肠癌中。西妥昔单抗开发为抑制EGFR活化，导致几个途径，其中尤其是MAPK信号转导的进一步抑制。这种IgG1抗体用于结肠直肠癌中，以抑制通过配体EGF的活化，但因为它阻断EGFR，所以它同样抑制其他EGF结合配体的结合。在其他优选实施方案中，利用单克隆抗体帕尼单抗(Amgen，Thousand Oaks，CA)。
在优选实施方案中，抗原结合蛋白质是人源化抗体。用于人源化抗体的方法是本领域中公知的(参见例如美国专利号6,180,370、5,585,089、6,054,297和5,565,332；其中每件均通过引用并入本文)。
在优选实施方案中，基于抗体的治疗剂配制为如下所述的药物组合物。在优选实施方案中，本发明的抗体组合物的施用导致神经障碍的症状中的可检测降低。
B. RNA干扰和反义疗法
在一些实施方案中，本发明利用调节EGFR表达的试剂。例如，在一些实施方案中，本发明采用包含寡聚反义或RNAi化合物，特别是寡核苷酸(例如本文描述的那些)的组合物，用于在调节编码EGFR的核酸分子的功能，最终调节表达的EGFR量中使用。
1. RNA干扰(RNAi)
在一些实施方案中，RNAi用于抑制EGFR蛋白质功能。RNAi代表用于控制大多数真核生物包括人中的外源基因表达的进化上保守的细胞防御。RNAi一般通过双链RNA(dsRNA)触发，且响应dsRNA引起同源的单链靶RNA的序列特异性mRNA降解。mRNA降解的介体是小干扰RNA双链体(siRNA)，其通常通过细胞中的酶促切割由长dsRNA产生。siRNA一般长度约21个核苷酸(例如长度21-23个核苷酸)，并且具有特征在于二个核苷酸的3'突出端的碱基配对结构。在将小RNA或RNAi引入细胞内之后，认为序列递送到称为RISC(RNA诱导沉默复合物)的酶复合物。RISC识别靶且用核酸内切酶切割所述靶。应当指出如果将更大的RNA序列递送到细胞，则RNase III酶(切丁酶)将更长的dsRNA转换成21-23 nt的ds siRNA片段。
化学合成的siRNA已成为用于培养的体细胞中的哺乳动物基因功能的全基因组分析的有力试剂。除了其用于验证基因功能的价值外，siRNA还具有作为基因特异性治疗剂的极大潜力(通过引用并入本文的Tuschl和Borkhardt，Molecular Intervent. 2002；2(3):158-67)。
siRNA转染到动物细胞内导致特定基因的有力、长效转录后沉默(Caplen等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2001；98: 9742-7；Elbashir等人，Nature. 2001；411:494-8；Elbashir等人，Genes Dev. 2001；15: 188-200；和Elbashir等人，EMBO J. 2001；20: 6877-88，均通过引用并入本文)。关于使用siRNA执行RNAi的方法和组合物描述在例如美国专利6,506,559中，其通过引用并入本文。
siRNA在降低靶RNA的量方面非常有效，并且通过扩展(extension)，通常使蛋白质降低到无法检测的水平。沉默效应可以持续数月，并且是非常特异性的，因为靶RNA和siRNA中心区之间的一个核苷酸错配通常足以阻止沉默(Brummelkamp等人，Science2002；296:550-3；和Holen等人，Nucleic Acids Res. 2002；30:1757-66，两者均通过引用并入本文)。
siRNA设计中的重要因素是用于siRNA结合的可接近位点的存在。Bahoia等人(J. Biol. Chem., 2003；278: 15991-15997；通过引用并入本文)描述了称为扫描阵列的一类DNA阵列，以找到mRNA中用于设计有效siRNA的可接近位点。这些阵列包含大小在从单体到特定最大值的范围的寡核苷酸，通常为通过序列中每个碱基的逐步添加使用物理障碍(掩蔽物)合成的Comers。因此，阵列代表靶基因的区域的完全寡核苷酸互补体。靶mRNA与这些阵列的杂交提供了靶mRNA的这个区域的详尽可接近性概况。此类数据用于设计反义寡核苷酸(7聚体到25聚体的范围)，其中重要的是达到寡核苷酸长度和结合亲和力之间的妥协，以保留功效和靶特异性(Sohail等人，Nucleic Acids Res., 2001；29(10): 2041-2045)。用于选择siRNA的另外方法和关注描述在例如
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Figure 473686DEST_PATH_IMAGE038
和
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中，其中每件均全文通过引用并入本文。此外，用于在siRNA选择中使用的软件(例如MWG在线siMAX siRNA设计工具)是商购可得或可公开获得的。
在一些实施方案中，本发明利用包括平端(参见例如US20080200420，全文通过引用并入本文)、突出端(参见例如US20080269147A1，全文通过引用并入本文)、锁核酸(参见例如WO2008/006369、WO2008/043753和WO2008/051306，每件均全文通过引用并入本文)的siRNA。在一些实施方案中，siRNA经由基因表达或使用细菌递送(参见例如Xiang等人，Nature 24: 6(2006)和WO06066048，每件均全文通过引用并入本文)。
在其他实施方案中，利用shRNA技术(参见例如20080025958，全文通过引用并入本文)。小发夹RNA或短发夹RNA (shRNA)是产生紧密发夹弯(hairpin turn)的RNA序列，所述紧密发夹弯可以经由RNA干扰用于沉默基因表达。shRNA使用引入细胞内的载体，并且利用U6启动子以确保shRNA始终被表达。这种载体通常传递给子细胞，允许基因沉默被继承。shRNA发夹结构通过细胞机制切割成siRNA，所述siRNA随后与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合。这种复合物与mRNA结合且切割mRNA，所述mRNA匹配与之结合的siRNA。shRNA通过RNA聚合酶III转录。
2. 反义
在其他实施方案中，EGFR表达使用反义化合物进行调节，所述反义化合物与编码EGFR的一种或多种核酸和/或EGFR特异性杂交。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。靶核酸的功能通过与之特异性杂交的化合物的这种调节一般被称为“反义”。待干扰的DNA功能包括复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有关键功能，例如，如RNA易位到蛋白质翻译位点、来自RNA的蛋白质翻译、RNA剪接以获得一个或多个mRNA种类、和可以通过RNA参与或促进的催化活性。对靶核酸功能的此类干扰的总体效应是EGFR表达的调节。在本发明的背景下，“调节”意指基因表达中的增加(刺激)或降低(抑制)。例如，可以抑制表达以治疗神经障碍。
优选靶向特异性核酸用于反义。在本发明的背景下，将反义化合物“靶向”特定核酸是多步过程。该过程通常以鉴定待调节其功能的核酸序列开始。这可以是例如其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因(或由基因转录的mRNA)，或来自传染剂的核酸分子。在本发明中，靶为编码EGFR的核酸分子。靶向过程还包括测定在这种基因内用于使反义相互作用发生的一个或多个位点，从而产生所需效应例如蛋白质表达的检测或调节。在本发明的背景内，优选基因内位点是包含基因的开放读码框(ORF)的翻译起始或终止密码子区域。因为翻译起始密码子一般为5'-AUG(在转录的mRNA分子中；在相应DNA分子中的5'-ATG)，翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有的翻译起始密码子具有RNA序列5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG，并且5'-AUA、5'-ACG和5'-CUG已显示在体内起作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可以包含许多密码子序列，即使在每种情况下的起始子氨基酸一般为甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核生物和原核生物基因可以具有两个或更多个可选的起始密码子，其中任何一个都可以优先用于特定细胞类型或组织或特定组条件下的翻译起始。在本发明的背景下，“起始密码子”和“翻译起始密码子”指在体内用于起始由编码EGFR的基因转录的mRNA分子的翻译的一个或多个密码子。
基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可以具有三个序列(即，5'-UAA、5'-UAG和5'-UGA；相应DNA序列分别为5'-TAA、5'-TAG和5'-TGA)之一。术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”指此类mRNA或基因的部分，其包含在任一方向(即5'或3')从翻译起始密码子开始的约25-约50个连续核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”指此类mRNA或基因的部分，其包含在任一方向(即5'或3')从翻译终止密码子开始的约25-约50个连续核苷酸。
开放读码框(ORF)或“编码区”指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也是可以有效靶向的区域。其他靶区域包括5'非翻译区(5' UTR)，指的是从翻译起始密码子开始在5'方向的mRNA部分，并且因此包括在mRNA的5'-帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸或基因上的相应核苷酸，和3'非翻译区(3' UTR)，指的是从翻译终止密码子开始在3'方向的mRNA部分，并且因此包括在mRNA的翻译终止密码子和3'末端之间的核苷酸或基因上的相应核苷酸。mRNA的5'帽包含经由5'-5'三磷酸键与mRNA的最5'末端残基连接的N7-甲基化鸟苷残基。认为mRNA的5'帽区包括5'帽结构本身以及与帽相邻的前50个核苷酸。帽区也可以是优选靶区域。
尽管一些真核mRNA转录物是直接翻译的，但许多含有一个或多个被称为“内含子”的区域，其在翻译前从转录物中切除。剩余(和因此被翻译的)区域称为“外显子”，并且剪接在一起以形成连续mRNA序列。mRNA剪接位点(即内含子-外显子接合处)也可以是优选靶区域，并且在疾病中涉及异常剪接，或在疾病中涉及特定mRNA剪接产物的过生产的情况下是特别有用的。
在一些实施方案中，用于反义抑制的靶位点使用商购可得的软件程序(例如德国Biognostik，Gottingen；印度班加罗尔SysArris Software；英格兰利物浦Antisense Research Group，University of Liverpool；GeneTrove，Carlsbad，CA)进行鉴定。在其他实施方案中，用于反义抑制的靶位点使用PCT公开号WO0198537A2中所述的可接近位点法进行鉴定，该文献通过引用并入本文。
一旦已鉴定一个或多个靶位点，就选择与靶充分互补(即充分良好杂交且具有足够特异性)的寡核苷酸，以给出所需效应。例如，在本发明的优选实施方案中，反义寡核苷酸靶向起始密码子或接近起始密码子。
在本发明的背景下，就反义组合物和方法而言的“杂交”意指在互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键合，其可以是沃森-克里克(Watson-Crick)、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键形成而配对的互补核碱基。应当理解反义化合物的序列无需与其有待于特异性结合的靶核酸的序列是100%互补的。当化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能以引起效用丧失，并且因此在其中期望特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性处理的情况下，为在生理条件下，和在体外测定情况下，为在其中执行测定的条件下)，存在足够的互补性程度以避免反义化合物与非靶序列的非特异性结合时，反义化合物是特异性杂交的。
反义化合物通常用作研究试剂和诊断剂。例如，能够以特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸可以用于阐明特定基因的功能。反义化合物也例如用于区分生物途径的多个成员之间的功能。
反义的特异性和灵敏度也应用于治疗用途。例如，反义寡核苷酸已用作动物和人类中的疾病状态治疗中的治疗部分。反义寡核苷酸已安全且有效地施用于人，并且众多临床试验目前在进行中。因此确定寡核苷酸是有用的治疗模式，其可以经配置以用于治疗细胞、组织和动物尤其是人的治疗方案中。
虽然反义寡核苷酸是反义化合物的优选形式，但本发明包含其他寡聚反义化合物。依照本发明的反义化合物优选包含约8-约30个核碱基(即约8-约30个连接的碱基)，尽管本发明可以使用更长和更短的序列。特别优选的反义化合物是反义寡核苷酸，甚至更优选包含约12-约25个核碱基的那些反义寡核苷酸。
本发明的嵌合反义化合物可以形成为两个或更多个寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或如上所述的寡核苷酸模拟物的复合结构。
本发明还包括药物组合物和制剂，其包括如下所述的本发明的反义化合物。
C. 基因疗法
本发明考虑了用于在调节EGFR表达中使用的任何基因操作的使用。基因操作的例子包括但不限于基因敲除(例如使用例如重组从染色体中去除EGFR基因)、含或不含诱导型启动子的反义构建体的表达等。核酸构建体在体外或体内对细胞的递送可以使用任何合适方法进行。合适方法是将核酸构建体引入细胞内从而使得所需事件发生(例如反义构建体的表达)的方法。基因治疗也可以用于递送在体内表达(例如在通过诱导型启动子刺激后)的siRNA或其他干扰分子。
携带遗传信息的分子引入细胞内通过多种方法中的任何实现，所述方法包括但不限于裸DNA构建体的直接注射，用装载有所述构建体的金颗粒轰击，和使用例如脂质体、生物聚合物等的大分子介导的基因转移。优选方法使用衍生自病毒的基因递送媒介物，所述病毒包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒和腺伴随病毒。由于与逆转录病毒相比较的更高效率，衍生自腺病毒的载体是用于在体内将核酸分子转移到宿主细胞内的优选基因递送媒介物。腺病毒载体的例子和用于基因转移的方法描述于PCT公开WO 00/12738和WO 00/09675以及美国专利申请号6,033,908、6,019,978、6,001,557、5,994,132、5,994,128、5,994,106、5,981,225、5,885,808、5,872,154、5,830,730和5,824,544中，其中每件均全文通过引用并入本文。
载体可以以多种方式施用于受试者。例如，在本发明的一些实施方案中，使用直接注射将载体施用于细胞内。在其他实施方案中，经由血液或淋巴循环施用(参见例如PCT公开99/02685，其全文通过引用并入本文)。腺病毒载体的示例性剂量水平优选为加入灌注液中的108 - 1011载体颗粒。
D. 小分子疗法
本发明的一些实施方案利用抑制EGFR的一种或多种生物活性的小分子。小分子治疗剂使用本文描述的药物筛选方法进行鉴定。在一些实施方案中，在本发明中有用的小分子治疗剂包括但不限于阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、来那替尼和凡德他尼。在一些优选实施方案中，小分子是吉非替尼或厄洛替尼，商业名称分别为易瑞沙(Iressa) (AstraZeneca，London，UK)和特罗凯(Tarceva) (Genentech，South San Fransisco，CA) (
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)。
E. 药物组合物
本发明进一步提供了用于在上述方法中使用的药物组合物(例如包含调节EGFR的表达或活性的药学试剂)。本发明的药物组合物可以以许多方法施用，这取决于是需要局部治疗还是全身治疗，并且取决于待治疗的区域。施用可以是局部的(包括眼和向粘膜，包括***和直肠递送)、肺(例如通过粉末或气溶胶的吸入或吹入，包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮和经皮)、经口或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内例如鞘内或心室内施用。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括经皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药学载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可能是必需的或期望的。
用于经口施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒剂、栓剂或在水或非水介质中的溶液、胶囊、小袋(sachet)或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可能是期望的。
用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂及其他合适添加剂例如但不限于渗透增强剂、载体化合物及其他药学可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物还包括但不限于溶液、乳状液和含脂质体制剂。这些组合物可以由多种组分生成，所述组分包括但不限于预制成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。
可以方便地以单位剂型呈现的本发明的药物制剂可以根据制药工业中公知的常规技术进行制备。此类技术包括使活性药学试剂与一种或多种药学载体或赋形剂结合的步骤。一般而言，所述制剂通过下述进行制备：使活性成分与液体载体或精细分开的固体载体或两者均匀地且紧密地结合，并且随后，需要时，使产物成型。
本发明的药物组合物可以配制成许多可能剂型中的任何剂型，所述剂型例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以配制为在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或右旋糖酐。悬浮液还可以含有稳定剂。
本发明的组合物可以另外含有常规地见于药物组合物中的其他附加组分。因此，例如，组合物可以含有另外的相容的药学活性材料，例如，如止痒药、收敛剂、局部***或抗炎剂，或可以含有用于物理配制本发明的组合物的多种剂型的另外材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加时，此类材料不应不适当地干扰本发明组合物的组分的生物活性。所述制剂可以是稳定的，并且在需要时，与辅助试剂混合，所述辅助试剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味物质和/或芳香物质等，其不会有害地与制剂的一种或多种核酸相互作用。
给药取决于待治疗的疾病状态的严重性和响应性，其中疗程持续数天到数月，或直至实现治愈或实现疾病状态的减小。最佳给药方案可以由药物在患者体内的测量进行计算。施用医生可以容易地决定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可以取决于单个试剂的相对功效而变化，并且一般可以基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50或基于本文描述的实施例进行估计。一般而言，剂量为0.01 μg - 100 g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。治疗医生可以基于测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度来估计给药的重复率。在成功治疗后，可能期望使受试者经历维持疗法以预防疾病状态的复发，其中试剂以在0.01 μg - 100 g/kg体重范围的维持剂量施用，每天一次或多次到每20年一次。
F. 组合疗法
在一些实施方案中，本发明提供了包括与另外试剂(例如用于治疗神经障碍或神经性疼痛的试剂)组合的本文描述的一种或多种组合物(例如EGFR抑制剂)的治疗方法。本发明并不限于特定试剂。例子包括但不限于：抗炎剂例如NSAID和类固醇；阿片类物质止痛剂；抗抑郁药例如三环抗抑郁药(tricyclics)和5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)；抗惊厥药例如加巴喷丁；抗癫痫药；苯二氮卓类(benzodiazapines)；抗焦虑药例如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)；饮食补充剂例如α硫辛酸和苯磷硫胺；***类物质等。
用于组合疗法的有用试剂的类别包括例如非甾体抗炎药(NSAID)例如阿司匹林(Anacin、Ascriptin、Bayer、Bufferin、Ecotrin、Excedrin)、水杨酸胆碱和水杨酸镁(CMT、Tricosal、Trilisate)、水杨酸胆碱(Arthropan)、塞来昔布(Celecoxib)(Celebrex)、双氯芬酸钾(Cataflam)、双氯芬酸钠(Voltaren、Voltaren XR)、双氯芬酸钠和米索前列醇(Arthrotec)、二氯尼柳(Dolobid)、依托度酸(Lodine、Lodine XL)、非诺洛芬钙(Nalfon)、氟比洛芬(Ansaid)、布洛芬(Advil、Motrin、Motrin IB、Nuprin)、吲哚美辛(Indocin、Indocin SR)、酮洛芬(Actron、Orudis、Orudis KT、Oruvail)、水杨酸镁(Arthritab、Bayer Select、Doan's Pills、Magan、Mobidin、Mobogesic)、甲氯灭酸钠(Meclomen)、甲灭酸(Ponstel)、美洛昔康(Mobic)、萘丁美酮(Relafen)、萘普生(Naprosyn、Naprelan)、萘普生钠(Aleve、Anaprox)、奥沙普秦(Daypro)、吡罗昔康(Feldene)、罗非考昔(Vioxx)、双水杨酯(Amigesic、Anaflex 750、Disalcid、Marthritic、Mono-Gesic、Salflex、Salsitab)、水杨酸钠(多种非专利药物)、舒林酸(Clinoril)、托美丁钠(Tolectin)、伐地考昔(Bextra)；甾体抗炎药包括氢化可的松、***、甲泼尼龙、倍氯米松、倍氯米松、布***、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、曲安西龙等；和基于***剂的止痛剂包括但不限于芬太尼、氢***酮、***、***、羟考酮和羟***酮；抗抑郁药包括三环化合物例如安非他酮、去甲替林、地昔帕明、阿米替林、氧阿米替林、布替林、氯丙咪嗪、地美替林、二苯西平、二甲他林、度硫平(dosulepin)/度琉平(dothiepin)、多塞平、丙咪嗪、安咪奈丁、伊普吲哚、奥匹哌醇、噻奈普汀、曲米帕明、氧米帕明、洛非帕明、美利曲辛(melitracin)、美他帕明、硝沙西平、诺昔替林、哌泊非嗪、丙吡西平、普罗替林(protriptyine)和奎纽帕明，和SNRI例如度洛西汀、文法拉辛、去甲文拉法辛、米那普仑、左旋米那普仑、***、比西发定和SEP-227162；抗惊厥药例如普瑞巴林、加巴喷丁、卡马西平和奥卡西平与苯二氮卓类(例如阿普***、溴他西尼、溴西泮、溴替***、氯氮卓、西诺西泮、氯硝西泮、氯拉卓酸、氯噻西泮、氯噁***、地洛西泮、***、艾司***、依替***、氟硝西泮、氟西泮(flurazapam)、氟托西泮、哈拉西泮、凯他***、氯普***、劳拉西泮、氯甲西泮、美达西泮、咪达***、尼美西泮(nemetazepam)、硝西泮、去甲西泮、奥沙西泮、芬纳西泮、匹那西泮(pinazepaam)、普拉西泮、普瑞西泮、夸西泮、替马西泮、四氢西泮、***仑、氯巴占、DMCM、氟马西尼、右佐匹克隆、扎拉普隆、唑吡坦和佐匹克隆)；选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)例如西酞普兰、达帕西汀、依地普仑、氟西汀、氟伏沙明、吲达品(indalpin)、帕罗西汀、舍曲林和齐美利定；和***类物质例如δ-9-四氢***酚和***隆。
III. 药物筛选应用
在一些实施方案中，本发明提供了药物筛选测定(例如用于筛选抑制EGFR的药物)。本发明的筛选方法利用EGFR。例如，在一些实施方案中，本发明提供了筛选改变(例如降低)EGFR表达的化合物的方法。所述化合物或试剂可以通过例如与启动子区相互作用来干扰转录。所述化合物或试剂可以干扰由EGFR产生的mRNA(例如通过RNA干扰、反义技术等)。所述化合物或试剂可以干扰EGFR生物活性上游或下游的途径。在一些实施方案中，候选化合物是针对EGFR的反义或干扰RNA试剂(例如寡核苷酸)。在其他实施方案中，候选化合物是与EGFR特异性结合且抑制其生物学功能的抗体或小分子。
在一种筛选方法中，通过使化合物与表达EGFR的细胞接触，且随后测定候选化合物对表达的作用，从而评估候选化合物就其改变EGFR表达的能力。在一些实施方案中，通过检测由细胞表达的EGFR mRNA水平，测定候选化合物对EGFR表达的作用。mRNA表达可以通过任何合适方法进行检测。
在其他实施方案中，候选化合物对EGFR表达的作用通过测量由EGFR编码的多肽水平进行测定。表达的多肽水平可以使用任何合适方法进行测量。
特别地，本发明提供了用于鉴定调节物的方法，即候选物或测试化合物或试剂(例如抗体、蛋白质、肽、拟肽、类肽、小分子或其他药物)，其与EGFR结合，并且对例如EGFR表达或活性具有抑制作用，或对例如EGFR底物的表达或活性具有刺激或抑制作用。因此鉴定的化合物可以用于在治疗方案中直接或间接调节靶基因产物(例如EGFR)的活性，以阐明靶基因产物的生物学功能，或鉴定破坏正常靶基因相互作用的化合物。抑制EGFR活性或表达的化合物用于治疗神经障碍。
本发明的测试化合物可以使用本领域已知的组合文库法中的众多方法中的任何方法获得，包括生物文库；类肽文库(具有肽功能性，但具有新型非肽主链的分子文库，所述分子对酶促降解有抵抗力但仍保持生物活性；参见例如Zuckennann等人，J. Med. Chem. 37: 2678-85 [1994])；可空间寻址的平行固相或液相文库；需要解卷积的合成文库法；‘一珠一化合物’文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。生物文库和类肽文库方法优选与肽文库一起使用，而其他四种方法可应用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12:145)。
用于合成分子文库的方法的例子可以在本领域中找到，例如DeWitt等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 [1993]；Erb等人，Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91:11422 [1994]；Zuckermann等人，J. Med. Chem. 37:2678 [1994]；Cho等人，Science 261:1303 [1993]；Carrell等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]；Carell等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994]；和Gallop等人，J. Med. Chem. 37:1233 [1994]。
化合物文库可以存在于溶液中(例如Houghten，Biotechniques 13:412-421 [1992])，或珠(Lam，Nature 354:82-84 [1991])、芯片(Fodor，Nature 364:555-556 [1993])、细菌或孢子(美国专利号5,223,409；通过引用并入本文)、质粒(Cull等人，Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869 [1992])或噬菌体上(Scott和Smith，Science 249:386-390 [1990]；Devlin Science 249:404-406 [1990]；Cwirla等人，Proc. NatI. Acad. Sci. 87:6378-6382 [1990]；Felici，J. Mol. Biol. 222:301 [1991])。
实验
提供下述实施例以便证实且进一步举例说明本发明的特定优选实施方案和方面，并且不应解释为限制其范围。
实施例1
具有转移性结肠癌的68岁男性患有由于对其坐骨神经的骨盆复发性卡压的神经性疼痛。经过数年，在缓解这种疼痛的尝试中，他用强力阿片类镇痛药、抗癫痫药、抗抑郁药、抗炎剂、放射疗法、化学疗法、高压氧和针灸进行治疗。这些治疗仅是少量有效的，并且剂量递增受副作用限制。
约三年后，在使其骨盆肿瘤萎缩的另外一次努力中，患者给予XELOX化学疗法(卡培他滨和奥沙利铂)和EGFR抗体西妥昔单抗的组合，并且从而缓解其疼痛。在这个治疗开始时，患者需要200mg***(dolcontin)/24小时。在两次治疗后，在他的第一次随访预约时，他报告实际上已停止所有***剂使用。四个月后获得的骨盆MRI显示其骨盆肿瘤大小没有变化，尽管神经性骨盆疼痛在那时完全消失。
在后续治疗暂停过程中，患者的疼痛复发，并且他需要更高剂量的***剂。然而，在XELOX和西妥昔单抗的每次后续再引入时，重复镇痛应答并且疼痛在四到五小时内完全或几乎完全消失。
在用XELOX和西妥昔单抗治疗22个月后，患者的肺转移进展，并且化学疗法和抗体治疗都停止。在后续数月期间，患者的疼痛急剧增加，并且他的贮藏(depot)***剂剂量上升至320mg/24小时，没有满意的效果。在疼痛恶化约四个月后，在没有任何针对肿瘤的治疗的情况下，在缓解其疼痛的尝试中恢复西妥昔单抗单一疗法450 mg i.v./250mg/m2。再一次，在第一次西妥昔单抗输注后数小时内，患者的疼痛显著改善，并且他能够在后续四周内将其贮藏***剂剂量减半。
对于接下来的20个月，虽然他的癌症明确进展，但患者继续大约每12天接受西妥昔单抗输注用于疼痛缓解。尽管来自其转移性疾病的症状和并发症的发展，慢性骨盆神经性疼痛继续由西妥昔单抗最佳控制。
为了测试这种相当昂贵的药物治疗的镇痛作用是否是剂量依赖性的，患者给予20%的正常西妥昔单抗剂量(患者不知道这种变化)，这导致无镇痛作用。西妥昔单抗剂量因此增加至先前有效剂量，并且他继续约每12天接受输注，其中有效镇痛在4-5小时内达到，持续正好在2周以内。在新输注前的末几天过程中，患者需要更高剂量的***剂，但这可以在后续西妥昔单抗输注后立即再次减少至约三分之一的剂量。
在开始西妥昔单抗单一疗法用于止痛后八个月，骨盆的MRI显示令人不快的损伤的增加。尽管这个发现，西妥昔单抗继续具有所述显著镇痛应答，并且患者能够维持好得多的生活质量。
实施例2
本发明人近期报道了使用西妥昔单抗治疗直肠癌患者中的NP中的经历(
Figure 864347DEST_PATH_IMAGE043
Figure 234149DEST_PATH_IMAGE044
)，所述西妥昔单抗是针对表皮生长因子(EGF)受体的单克隆抗体，因此抑制MAPK信号转导(
Figure 124744DEST_PATH_IMAGE045
Figure 233384DEST_PATH_IMAGE046
Figure 842219DEST_PATH_IMAGE047
)。尽管骶丛神经的进行性骨盆肿瘤侵入，但患者在西妥昔单抗输注后仅数小时重复经历NP的显著缓解，表明直接的抗NP效应。
因为EGFR抑制剂已在临床试验中广泛测试，并且是具有最初暂时和可管理的副作用的批准肿瘤学药物，所以本发明人已对具有慢性、虚弱和治疗抗性NP的五个患者提供这种治疗(
Figure 78029DEST_PATH_IMAGE048
Figure 869715DEST_PATH_IMAGE050
等人，
Figure 965847DEST_PATH_IMAGE051
Figure 739768DEST_PATH_IMAGE052
)。
病例系列：
自从2011年12月以后，本发明人已使用静脉内(西妥昔单抗、帕尼单抗)和经口(吉非替尼)EGFR抑制剂就剧痛和长期NP治疗三个非癌症患者、一个膀胱癌患者和一个胰腺癌患者，参见表1。三个非癌症患者中的两个(病例2和3)和两个癌症患者(病例4和5)在24小时内响应，如简式简明疼痛量表(BPI)(21，22)中的记载，具有最剧烈疼痛从9到1的平均降低，参见图2。在第一次EGFR抑制时服用镇痛药用于其NP的三个患者(病例2、4和5)已能够显著减少剂量。对于已响应治疗的那些人，迄今为止的随访是7-148天。
表1. 患者的基线特征
*在患者第一次西妥昔单抗输注时仍使用的治疗
#根据疼痛检测工具，19-38之间的得分构成超过90%可能的神经性疼痛组分。(16)。
对治疗的应答：
要求患者每天正好在EGFR抑制前和过程中完成简式BPI，以便记录其神经性疼痛，并且因此帮助本发明人判断他们的应答且指导治疗决定。患者的得分概括于图2中。
病例1给予三次的每周西妥昔单抗输注。治疗对患者的NP无作用，并且在第3次剂量后，治疗中断(数据未显示)。
病例2给予总共六次的每周西妥昔单抗输注(图2，红色箭头)。在第一个西妥昔单抗剂量后24小时内，患者经历完全疼痛缓解，这持续直到下一次输注时。在三次的每周西妥昔单抗输注后，伴随继续应答，尝试用单克隆抗体帕尼单抗的治疗(图2，蓝色箭头)。由于它的药物代谢动力学性质，这种细胞外EGFR抑制剂每两周施用一次。它因此在简化用于患者的治疗程序的尝试中给予。然而，患者在帕尼单抗输注当晚报告重度疼痛的复发。她在次日接受治疗上成功的西妥昔单抗输注。在总共六次西妥昔单抗输注后，EGFR抑制转换为经口小分子抑制剂吉非替尼，从而使得患者可以在假期自由出国旅游。
吉非替尼在末次西妥昔单抗输注后数天开始，并且患者在转换为片剂后未经历疼痛复发。目前为他的第一个吉非替尼剂量后15周和第一次西妥昔单抗输注后21周，患者的NP持续完全消除。EGFR抑制对伴随CRPS1的血管舒缩症状无作用。然而，疼痛缓解已允许患者顺从密集的物理疗法，这先前受极端水平的疼痛妨碍。因此，看起来存在水肿的间接改善，否则，所述水肿使她的状况复杂化，并且可以导致永久残废。
病例3给予两次的每周西妥昔单抗输注(图2，红色箭头)。同样在第一次输注后数小时内，患者的重度和持续性疼痛显著减少，并且在以后数天，NP完全消失。在他的第二个西妥昔单抗剂量后，患者等待开始新治疗直至疼痛复发。在十一天西妥昔单抗洗出后，他的NP开始复发。
在该阶段，患者转换为吉非替尼片剂(图2，绿色箭头)。他的疼痛在经口治疗的前两天继续增加。然而，从第三个吉非替尼剂量开始，疼痛逐渐改善至与他用西妥昔单抗经历的一样良好的水平。患者的NP如此受西妥昔单抗和吉非替尼良好控制，从而使得他可以重新开始他的体力活动户外生活方式。然而，患者在开始吉非替尼后一个月发展肺炎。呼吸困难在肺炎治疗后持续，并且不能排除间质性肺病(ILD)。因此停止吉非替尼(参见图2)并且NP在三天后复发。随后给予帕尼单抗剂量，并且NP在当晚减小，并且他再次没有疼痛。当约三周后他的疼痛复发时，尝试批准用于治疗NP的药物普瑞巴林。他先前用同样批准用于治疗NP的加巴喷丁治疗失败，但由于围绕ILD可能性的不确定性，认为在用经口EGFR抑制剂的进一步治疗前准许以常规治疗的尝试。患者响应普瑞巴林，并且继续在19周随访时是无疼痛的。
病例4在用加巴喷丁、阿米替林、扑热息痛、类固醇的组合治疗和逐渐增加至1800 mg的24小时***等价剂量未能控制其NP后，给予西妥昔单抗。在EGFR抑制剂输注后数小时内，患者在过去六个月内首次经历其NP的完全缓解。在第一次西妥昔单抗治疗后仅三天，他的***剂和加巴喷丁剂量减少50%，受限于担心可以与这些物质的突然停止相关的脱瘾症状和反弹效应。在下一个计划治疗时，将西妥昔单抗转换为经口吉非替尼(图2，绿色箭头)。来自NP的完全缓解维持通过这个转变且维持到该转变之后，以及尽管骨盆神经的进行性肿瘤侵入(参见图1)。他的神经性疼痛到目前(18周随访)继续被吉非替尼完全缓解。
病例5在她用姑息性吉西他滨就转移性胰腺癌治疗的同时接受帕尼单抗。尽管具有有症状的癌症，但向下辐射至其左腿的慢性幻肢痛是她的主诉。她已发展出残端萎缩、挛缩和疼痛，这阻止了她的假肢使用。因此，她限制于轮椅。在帕尼单抗输注后数小时内，她的幻肢痛降低至50%(参见图2)。她以后需要较少的爆发性疼痛的药物治疗，能够睡到天亮，并且她的健康相关生活质量(QOL)得到改善。最剧烈疼痛强度在更密集的物理疗法后回到基线水平，但在第二次帕尼单抗输注后一天内再次有效缓解(迄今随访三周)。
讨论
本发明人提出NP的有效减轻为EGFR抑制剂的潜在类效应(class effect)，因为所有三种测试的药物都是有效的。NP在具有不同疼痛潜在机制的两个非癌症患者和两个癌症患者中的成功镇痛治疗与本发明人先前报道中所述的效应一致。提供这种治疗的五个患者中的四个在对标准治疗抗拒的长期NP后经历急剧和快速的镇痛应答。
细胞外(西妥昔单抗和帕尼单抗)和细胞内(吉非替尼) EGFR抑制都导致完全NP缓解。
关于真正药物效应的进一步支持源自EGFR抑制剂药物代谢动力学和病例3中的临床观察之间的关联。患者的疼痛在其末次西妥昔单抗输注后11天和帕尼单抗后大约20天复发的事实与这些药物的半衰期一致(
Figure 638826DEST_PATH_IMAGE055
Figure 950859DEST_PATH_IMAGE056
)，并且与来自本发明人先前报告的病例的观察一致(
Figure 58940DEST_PATH_IMAGE058
Figure 129664DEST_PATH_IMAGE059
)。此外，患者的疼痛对经口药物比西妥昔单抗和帕尼单抗二者的静脉内施用更慢响应的事实支持EGFR抑制的假定原因和直接效应。
病例2报告在抗EGFR抗体帕尼单抗输注后仅数小时疼痛的急剧增加。近期研究已证实西妥昔单抗和帕尼单抗阻碍彼此的EGFR结合(
Figure 245388DEST_PATH_IMAGE060
等人
Figure 85168DEST_PATH_IMAGE061
Figure 565828DEST_PATH_IMAGE062
Figure 169853DEST_PATH_IMAGE063
)。这可能可以导致西妥昔单抗由帕尼单抗置换，并且因此引起病例2中观察到的快速疼痛复发。这些患者中采用的所有抗EGFR药物都开发为抑制癌症中的EGFR1活化，并且其中尤其是通过EGF的MAPK信号转导。观察到的效应可能是由于EGF的抑制，但通过阻断EGFR1，这些药物也具有抑制其他EGFR1结合配体的潜力(
Figure 26951DEST_PATH_IMAGE064
Figure 658920DEST_PATH_IMAGE065
Figure 310482DEST_PATH_IMAGE066
)，其为直接地或通过抑制人表皮生长因子受体(HER)家族异二聚化(
Figure 667383DEST_PATH_IMAGE067
Figure 62592DEST_PATH_IMAGE068
Figure 673702DEST_PATH_IMAGE069
)。正是在这方面的兴趣，近期已提出神经调节蛋白1-ErbB3-ErbB2复合物为大鼠中神经损伤诱导的三叉神经性疼痛的因果机制(
Figure 761743DEST_PATH_IMAGE070
Figure 841826DEST_PATH_IMAGE071
Figure 40726DEST_PATH_IMAGE072
)。
几种受体酪氨酸激酶(RTK)具有活化MAPK信号转导的潜力，已提出将其作为用于针对NP以及其他慢性神经疾病的治疗的靶(Ji 2009，同上；
Figure 765286DEST_PATH_IMAGE074
)。在神经损伤后，神经元上调HER受体家族成员(Scholz，同上；
Figure 91597DEST_PATH_IMAGE077
Figure 583758DEST_PATH_IMAGE078
)，从而潜在增加其MAPK信号转导(Ji，2009，同上)级联的活化。这可以导致神经性疼痛三元组(neuropathic pain triad)中的细胞之间的进一步相互作用(Scholz，同上)。因此，本发明人先前已假设通过西妥昔单抗直接抑制神经元或神经胶质细胞中的MAPK信号转导 (
Figure 372853DEST_PATH_IMAGE079
Figure 913556DEST_PATH_IMAGE080
)。
神经调节蛋白是神经性疼痛三元组的重要调节剂(
Figure 619344DEST_PATH_IMAGE081
Figure 57333DEST_PATH_IMAGE083
)。NP模型大鼠中的神经调节蛋白1同种型的表达变化表明EGFR和NP之间的联系(Kanzaki H，Mizobuchi S，Obata N，等人，
Figure 136148DEST_PATH_IMAGE084
)。此外，神经调节蛋白信号转导途径已显示为西妥昔单抗功效的生物标记(Oliveras-Ferraros C，Vazquez-Martin A，Queralt B，等人，
Figure 953242DEST_PATH_IMAGE086
Figure 231777DEST_PATH_IMAGE087
Figure 114282DEST_PATH_IMAGE088
)。
在导致严重受损的躯体和心理社会功能的剧痛NP多个月后，所有四个应答患者几乎立即重新获得先前无法想象的QOL。
实施例3
具有转移性结肠癌(仅转移至其肺)的72岁患者开始使用帕尼单抗单一疗法的第三线治疗。她在第一次输注后14天前来她的第一次随访预约，并且自发报告在其第一次帕尼单抗输注后24小时内，她已经历间歇性坐骨神经痛的完全缓解，她此前患有间歇性坐骨神经痛已超过六个月。她随后已接受两个另外剂量(以2周间隔)，并且在随访五周时保持无疼痛。她将其坐骨神经痛回顾性描述为间歇性的，在10点量表上分级6-8，并且直到用EGFR抑制剂的治疗开始时，疼痛在大多数日子存在，有时极大限制她的活动和灵活性。自从治疗开始以后，疼痛未复发，并且她报告她的生活质量得到显著改善。对这种状况的先前治疗包括扑热息痛、NSAID和苯二氮卓类。她不再需要镇痛药，并且在她的药物治疗中不存在并发干预或其他变化。
上述说明书中提及的所有出版物、专利、专利申请和登记号都全文通过引用并入本文。尽管本发明已结合具体实施方案进行描述，但应当理解要求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体实施方案。事实上，本发明的所述组合物和方法的多种修饰和变化对于本领域普通技术人员将是显而易见的，并且预期在下述权利要求的范围内。

Claims (28)

1.一种治疗具有神经障碍的受试者的方法，其包括给所述受试者施用抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂。
2.权利要求1的方法，其中所述受试者显示出神经障碍的症状，并且所述试剂的所述施用减少或调节所述神经障碍的症状。
3.权利要求1的方法，其中所述试剂是与所述EGFR多肽特异性结合的抗原结合蛋白质。
4.权利要求3的方法，其中所述抗原结合蛋白质选自贝伐珠单抗、西妥昔单抗、可那木单抗、盖尼塔单抗、马妥珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗、利妥木单抗、曲妥珠单抗和扎鲁木单抗。
5.权利要求3的方法，其中所述抗原结合蛋白质选自西妥昔单抗或帕尼单抗。
6.权利要求1的方法，其中所述试剂是小分子药物。
7.权利要求6的方法，其中所述小分子药物选自阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、来那替尼和凡德他尼。
8.权利要求6的方法，其中所述小分子药物选自吉非替尼和厄洛替尼。
9.权利要求1的方法，其中所述受试者是动物。
10.权利要求1的方法，其中所述动物是人。
11.权利要求10的方法，其中所述神经障碍是神经性疼痛。
12.权利要求10的方法，其中所述神经障碍选自疼痛、坐骨神经痛、多发性硬化、抑郁、痴呆、帕金森氏病、中风、轴突切断、和缺血或再灌注损伤、唐氏综合症和孤独症。
13.权利要求1的方法，其中所述抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂与至少另外的治疗剂共施用。
14.权利要求13的方法，其中所述至少另外的治疗剂选自非甾体抗炎药、甾体抗炎药、基于阿片类物质的药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗癫痫药、抗焦虑药和***类物质及其组合。
15.一种治疗神经障碍的方法，其包括给显示出神经障碍症状的受试者施用抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂，其中所述施用减少、调节或消除所述症状。
16.权利要求15的方法，其中所述抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂与至少另外的治疗剂共施用。
17.权利要求16的方法，其中所述至少另外的治疗剂选自非甾体抗炎药、甾体抗炎药、基于阿片类物质的药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗癫痫药、抗焦虑药和***类物质及其组合。
18.抑制EGFR的至少一种生物学功能的试剂用于治疗神经障碍的用途。
19.权利要求18的用途，其中所述神经障碍选自神经性疼痛、坐骨神经痛、多发性硬化、抑郁、痴呆、帕金森氏病、中风、缺血或再灌注损伤、轴突切断、唐氏综合症和孤独症。
20.权利要求18或19的用途，其中所述试剂是与所述EGFR多肽特异性结合的抗原结合蛋白质。
21.权利要求20的用途，其中所述抗体选自贝伐珠单抗、西妥昔单抗、可那木单抗、盖尼塔单抗、马妥珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗、利妥木单抗、曲妥珠单抗和扎鲁木单抗。
22.权利要求21的用途，其中所述抗体优选地选自西妥昔单抗或帕尼单抗。
23.权利要求18或19的用途，其中所述试剂是小分子药物。
24.权利要求23的用途，其中所述小分子药物选自阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、来那替尼和凡德他尼。
25.权利要求24的用途，其中所述小分子药物优选地选自吉非替尼和厄洛替尼。
26.权利要求18-25中任一项的用途，其中所述抑制EGFR多肽的至少一种生物学功能的试剂与至少另外的治疗剂共施用。
27.权利要求26的用途，其中所述至少另外的治疗剂选自非甾体抗炎药、甾体抗炎药、基于阿片类物质的药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗癫痫药、抗焦虑药和***类物质及其组合。
28.权利要求18-27中任一项的用途，其中所述施用或共施用减少或调节所述神经障碍的症状。
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