CN103805673B - 一种利用转基因酵母混合发酵生产秸秆乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用转基因酵母混合发酵生产秸秆乙醇的方法，所用的转基因酵母可以将秸秆的纤维素、木聚糖分别降解为葡萄糖、木糖并将它们原位发酵为乙醇，不需要另外提供纤维素酶、木聚糖酶；纤维素、木聚糖降解与发酵同步进行。本发明的优点在于：无需另外加入纤维素酶、木聚糖酶，利用该转基因酿酒酵母、转基因树干毕赤酵母、转基因休哈塔假丝酵母即可实现秸秆纤维素原料的同步酶水解－发酵从而生产乙醇，可大幅度降低秸秆纤维素乙醇的生产成本，推动秸秆纤维素乙醇替代石油燃料的进程。

Description

一种利用转基因酵母混合发酵生产秸秆乙醇的方法
技术领域
本发明涉及发酵工程和基因工程领域，尤其是使用转基因酿酒酵母和转基因树干毕赤酵母等混合发酵，将秸秆等纤维质原料经同步酶水解－发酵工艺，降解为葡萄糖、木糖然后转化为乙醇的方法，所述的重组酿酒酵母可分泌三种纤维素酶、转基因树干毕赤酵母、转基因休哈塔假丝酵母可以分泌3种木聚糖酶，可以利用木糖发酵生产乙醇。并且，上述菌株经过筛选驯化，对乙醇、乙酸、糠醛的耐受性较好。
背景技术
随着石化燃料由短缺变成枯竭，能源危机是人类面临的共同问题。2006年6月，我国出台《可再生能源发展专项资金管理暂行办法》，明确重点扶持发展以秸秆等非粮食资源制取的生物乙醇燃料。开发替代粮食资源生产纤维乙醇，是解决燃料乙醇原料成本高的根本出路。
中国专利申请200880119451.X公开了能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的细菌和使用该细菌生产生物乙醇的方法，但是，该工艺不能直接使用秸秆，只能利用葡萄糖、木糖、甘露糖，将秸秆转化为葡萄糖，其成本远大于由葡萄糖转化为乙醇。此外，所用菌种的乙醇耐受低，导致工艺的乙醇含量低，平均浓度仅为3.83%,。
中国专利申请201110135607.7，公开了利用低温纤维素酶同步糖化发酵生产乙醇的工艺方法，然而，由于使用了纤维素酶，致使生产成本大幅度提高，而且，不能利用木糖，使秸秆转化乙醇得率低，缺乏市场竞争力。
中国专利申请200710012382.X，公开了一种酶解秸秆生产燃料酒精的方法，加入秸秆重量1-5％的微生物复合酶菌液，对秸秆中可利用的纤维素、半纤维素进行分解，使其转化为糖。但是，该技术仅用了酿酒酵母，只能利用葡萄糖，秸秆整体利用率低；此外，由于所用的复合酶菌液效率低，需发酵长达10-15天，生长周期长，大幅度增加了生产成本，降低了竞争力。
中国专利申请201210540604.6，公开了一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，该技术只能利用葡萄糖，并且使用了低温纤维素酶。使得生产成本大幅度增加。
中国专利申请201110460248.2，公开了纤维素酵母、双菌种酿酒酵母组合物及纤维素乙醇的发酵方法，由于使用了多种酶，生产成本高。而且，所用的酿酒酵母，只能利用葡萄糖，不能利用木糖，秸秆整体利用率低。
本发明人提出的专利ZL200710107687.9，公开了一种利用重组酿酒酵母生产纤维素乙醇的方法，但是，该方法只能利用葡萄糖，不能利用木糖，而且，仅表达了一种木聚糖酶，因而不能将木聚糖完全降解为木糖。这些不足，限制了该方法的竞争力。
目前，生产秸秆乙醇成本高的主要问题在于纤维素酶及木聚糖酶生产成本高、木糖没有利用、酵母对秸秆预处理中的有毒物质耐受性低等，需要解决这些问题，才能大幅度降低生产成本，使秸秆乙醇具有市场竞争力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以直接转化秸秆的纤维素、木聚糖为葡萄糖、木糖并将它们发酵为乙醇的工艺，不需要另外提供纤维素酶、木聚糖酶，所用菌株对秸秆预处理降解液中的乙酸、糠醛有较高耐受力，对产物乙醇也有较高耐受力。
用转基因酿酒酵母和转基因的可利用木糖的酵母（例如树干毕赤酵母）混合发酵，并且同步酶水解－发酵秸秆等纤维质原料生产乙醇的技术，可以实现上述工艺。
所述的转基因酿酒酵母可分泌三种纤维素酶：葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶。所述的转基因的可利用木糖的酵母可以分泌外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和木糖苷酶，并具有利用木糖转化为乙醇的能力。
在秸秆等植物纤维素中，纤维素、半纤维素以及木质素的含量比为4：3：3，半纤维素的主要成份是木聚糖，约为85～90％，木聚糖水解产物是木糖。充分利用纤维素原料中的木糖发酵生产酒精，能使秸秆植物纤维素原料的酒精发酵的产量在原有的基础上增加25％。因此，酵母利用木糖发酵生产乙醇是大幅度提高秸秆整体利用率、决定秸秆植物纤维资源生产乙醇经济可行的关键因素之一。
目前已发现能利用木糖的菌种有两百多种,但能发酵木糖产乙醇的菌种就几十种,而被认为最具有工业价值的菌种为休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)、嗜鞣管囊酵母(Pachys-olentannophilus)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)
将秸秆中的纤维素和木聚糖降解为葡萄糖和木糖，需要纤维素酶和木聚糖酶，而酶的成本占秸秆乙醇成本>70％，是制约秸秆乙醇商业化进程的关键因素。纤维素酶、木聚糖酶的协同作用，解除半纤维素包裹后，才能彻底分解纤维素，将其最大限度的降解为可发酵糖。生产秸秆乙醇，通常要进行预处理以除去半纤维素和木质素的包裹，以提高纤维素、半纤维素的转化率，在秸秆预处理中会产生乙酸、糠醛等对酵母有毒物质。因此，为了降低秸秆乙醇成本，本发明提出以下措施：
(1)发酵过程中同时将葡萄糖和木糖均转化为乙醇，可望提高产量25％，所以应采用能够利用葡萄糖和木糖的菌株混合发酵，从而将葡萄糖和木糖都转化为乙醇；
（2）采用可以分泌纤维素酶、木聚糖酶的菌株发酵，从而省去高昂的酶成本。通过基因工程可以将纤维素酶基因和木聚糖基因转入相应酵母，得到可以分泌纤维素酶和木聚糖酶的酵母；随着基因工程的技术发展，将外源基因在酿酒酵母、休哈塔假丝酵母、树干毕赤酵母等酵母中表达，是可以实现的。
（3）选育耐受乙醇好、耐受乙酸、糠醛好的菌株，从而可以得到较高的乙醇浓度，并且大幅度减少秸秆预处理降解液脱毒成本，且发酵效率高。通过筛选驯化，可以得到这样的菌株。
纤维素酶是一种多组分的复合酶，包括葡聚糖内切酶（EG）,葡聚糖外切酶（或称纤维二糖水解酶）（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）等3种主要组分。在天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠3种酶的协同作用才能完成。酿酒酵母不能降解纤维素，只能利用葡萄糖。在酿酒酵母中要转入葡聚糖内切酶,葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶3种酶基因，从而构建可以分泌纤维素酶的酿酒酵母，它可以将纤维素转化为葡萄糖，进而发酵为乙醇。由此省去了高昂的纤维素酶成本。
同样，木聚糖酶也是一种多组分的复合酶，包括外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和木糖苷酶，将木聚糖降解为木糖过程中，也需要3种酶的协同作用才能完成。
休哈塔假丝酵母、树干毕赤酵母等可以利用木糖，将木糖发酵为乙醇，因此是将木糖转化为乙醇的理想菌株。但是，它们只能利用木糖，而不能利用木聚糖，需要将木聚糖降解为木糖后，方可利用。如果将外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和木糖苷酶在树干毕赤酵母、休哈塔假丝酵母中表达，使其具有降解木聚糖为木糖的能力，则转基因树干毕赤酵母、休哈塔假丝酵母就可以将木聚糖降解为木糖，进而原位转化为乙醇，由此省去了高昂的木聚糖酶成本。
将上述转基因酿酒酵母（表达纤维素酶）与转基因树干毕赤酵母、休哈塔假丝酵母（表达木聚糖酶），混合培养，即可直接使用秸秆发酵生产乙醇，且同时利用葡萄糖和木糖转化为乙醇。
所用的酿酒酵母和树干毕赤酵母、休哈塔假丝酵母，应该经过驯化选育，得到耐受乙醇、乙酸、糠醛均较好的菌株，使得其在秸秆预处理降解液中有较高的耐受力，可以较好的发挥产乙醇能力。
因此，将三个纤维素酶基因同时转入酿酒酵母中，构建一种能同时分泌三种纤维素酶的酿酒酵母工程菌；将三个木聚糖酶基因同时转入树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）中，构建一种能同时分泌三种木聚糖酶的树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）工程菌，直接将秸秆中的纤维素、木聚糖转化为葡萄糖、木糖，并同时将其发酵为乙醇。对于降低秸秆乙醇生产成本，促进秸秆乙醇的工业化进程具有重要意义。
本发明的技术方案如下：
1、酿酒酵母和树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）筛选驯化
用汽爆秸秆预处理液分别对酿酒酵母和树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）进行筛选驯化，同时筛选乙醇耐受度高的菌株。通过筛选驯化，得到对乙酸、糠醛、乙醇耐受好的酿酒酵母和树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）菌株。
2、构建转基因酿酒酵母
（1）构建重组表达载体构
　　将葡聚糖内切酶基因eg1、纤维二糖水解酶基因cbh1和β-葡萄糖苷酶基因bglc与合适的载体和启动子连接，构建成三基因重组表达载体；
（2）电转化法转化酿酒酵母；
（3）进行阳性转化子的筛选
利用重组子本身带有的抗生素抗性基因或者是氨基酸、尿嘧啶缺陷的选择性培养基进行筛选。其次，进行PCR检测、Southernblot对选择出的菌株进一步鉴定筛选，最终筛选出同时含有三个纤维素酶基因的酿酒酵母阳性转化子，可以分泌3种纤维素酶。
3、构建转基因树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母等）酵母
（1）构建重组表达载体构
　　将外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和木糖苷酶与合适的载体和启动子连接，构建成三基因重组表达载体；
（2）电转化法转化毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）酵母；
（3）进行阳性转化子的筛选
利用重组子本身带有的抗生素抗性基因或者是氨基酸、尿嘧啶缺陷的选择性培养基进行筛选。其次，进行PCR检测、Southernblot对选择出的菌株进一步鉴定筛选，最终筛选出同时含有三个木聚糖酶基因的树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）阳性转化子，可以分泌3种木聚糖酶。
4、转基因酿酒酵母、树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）混合同步酶水解发酵秸秆生产乙醇
　应用上述转基因酿酒酵母、转基因树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母），以秸秆等纤维质为原料，采用汽爆预处理秸秆，进行同步酶水解－发酵，将秸秆转化葡萄糖、木糖，进而原位发酵为乙醇。由于温度、pH、秸秆浓度、转基因酿酒酵母与转基因树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）的比例，氮源、培养时间等对乙醇产率、发酵速度均有较大影响，所以，需要用响应面法进行优化的试验设计，以确定较优的转化发酵工艺条件。而且，由于是混合培养，2种酵母对发酵条件的要求不同，所以，需通过优化试验设计，得到对2种酵母综合较优的工艺条件。
本发明的优点在于：
（1）本发明的转基因酿酒酵母，可同时分泌三种纤维素酶到胞外，即葡聚糖内切酶（EG）、纤维二糖水解酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）；本发明的转基因树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母），可同时分泌三种木聚糖酶到胞外，即外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和木糖苷酶，不需要另外提供酶，从而大幅度降低秸秆乙醇的生产成本。同时，由于纤维素酶和木聚糖同时作用，可以大幅度提供纤维素、木聚糖的转化率，提高乙醇得率。
（2）本发明的重转基因酿酒酵母，转基因树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）可将纤维素直接转化成葡萄糖，将木聚糖转化为木糖，同时将葡萄糖、木聚糖原位转化成乙醇；
（3）本发明的一种用重组酵母混合发酵，不需另外加入酶，直接转化秸秆等纤维质原料生产乙醇的方法，可以大幅度降低秸秆乙醇的生产成本，推动秸秆乙醇替代石油燃料的进程，具有广阔的应用前景。
本工艺的设想，是经历了大量试验，创造性劳动，才得到的。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
具体实施方式
实施例1酿酒酵母和树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）筛选驯化
用汽爆秸秆预处理液分别对酿酒酵母和树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）进行筛选驯化，同时筛选乙醇耐受度高的菌株。通过筛选驯化，得到对乙酸、糠醛、乙醇耐受好的酿酒酵母和树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）菌株。
具体实验条件如下：
汽爆条件，温度160-200℃，时间，3-20分钟，压力，1.1-1.8MP，因为汽爆条件对纤维素、木聚糖降解及转化率以及乙酸、糠醛产生量均有影响，所用，用响应面法进行了优化，得到了较优的汽爆条件为，时间：5-8分钟；压力：1.3-1.5MP；温度：165-180℃。
驯化筛选所得到酿酒酵母菌株kdn-6，kdn-31、kdn-59、树干毕赤酵母菌株kds-3、kds-9、kds-75、休哈塔假丝酵母菌株kdx-10、kdx-13、kdx-21在汽爆预处理液中生长良好，对乙醇耐受力均大于15％，葡萄糖、木糖利用率均大于89%。.
实施例2构建转基因纤维素酶酿酒酵母1
载体pYEX-BX（7.1kb）（含有Ampr，URA3和leu2三个选择标记）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子（GAPDHP）和终止子(GAPDHT)、信号肽编码序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信号肽序列（XYNSEC），构建重组表达载体Ⅰ，其表达序列框为GAPDHP-XYNSEC-cbh1-GAPDHT-GAPDHP-XYNSEC-eg1-GAPDHT-GAPDHP–GLUSEC-bglc-GAPDHT，命名为pYEX-BX-GAPDH-ECBHl。采用电击转化法将构建好的重组表达载体转化到酿酒酵母kdn-6；根据所转入重组表达载体上带有的选择性标记，将转化后的酵母细胞涂布在含有氨苄霉素或卡那霉素的培养基上或者是在营养缺陷型的固体培养基平板上，如果转化成功，酵母细胞将获得抗生素抗性或者是营养缺陷型抗性，在相应的选择性培养基上将会长出含有重组子的单菌落。然后，提质粒进行PCR扩增，双酶切进行检测转化子中是否同时含有eg1,cbh1和bglc三个纤维素酶基因，最终筛选出同时含有三种纤维素酶基因的酿酒酵母阳性转化子，命名为zkdn-6。
实施例3纤维酶转基因酿酒酵母2
载体pYEX-BX（7.1kb）（含有Ampr，URA3和leu2三个选择标记）、磷酸甘油酸激酶基因启动子（PGKP）和终止子（PGKT）、信号肽编码序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信号肽序列（XYNSEC），构建重组表达载体Ⅱ，其表达序列框为PGKP-XYNSEC-cbh1-PGKT-PGKP-XYNSEC-eg1-PGKT-PGKP-PGKP-GLUSEC-bglc-PGKT,命名为pYEX-BX-PGK-ECBHl;采用电击转化法将构建好的重组表达载体转化到酿酒酵母kdn-59；根据所转入重组表达载体上带有的选择性标记，将转化后的酵母细胞涂布在含有氨苄霉素或卡那霉素的培养基上或者是在营养缺陷型的固体培养基平板上，如果转化成功，酵母细胞将获得抗生素抗性或者是营养缺陷型抗性，在相应的选择性培养基上将会长出含有重组子的单菌落。然后，提质粒进行PCR扩增，双酶切进行检测转化子中是否同时含有eg1,cbh1和bglc三个纤维素酶基因，最终筛选出同时含有三种纤维素酶基因的酿酒酵母阳性转化子，命名为zkdn-59。
实施例4纤维素酶转基因酿酒酵母3
载体Yeplac195（5.24kb）(含有Kanr和URA3两个选择标记)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子（GAPDHP）和终止子(GAPDHT)、Rhizopusoryzae的葡萄糖淀粉酶基因信号肽(GLUSEC)，构建重组表达载体Ⅲ,其表达序列框为GAPDHP-XYNSEC-cbh1-GAPDHT-GAPDHP-XYNSEC-eg1-GAPDHT-GAPDHP–GLUSEC-bglc-GAPDHT，命名为Yeplac-GAPDH-ECBHl。采用电击转化法将构建好的重组表达载体转化到酿酒酵母kdn-31；根据所转入重组表达载体上带有的选择性标记，将转化后的酵母细胞涂布在含有氨苄霉素或卡那霉素的培养基上或者是在营养缺陷型的固体培养基平板上，如果转化成功，酵母细胞将获得抗生素抗性或者是营养缺陷型抗性，在相应的选择性培养基上将会长出含有重组子的单菌落。然后，提质粒进行PCR扩增，双酶切进行检测转化子中是否同时含有eg1,cbh1和bglc三个纤维素酶基因，最终筛选出同时含有三种纤维素酶基因的酿酒酵母阳性转化子，zkdn-31。
实施例5构建转基因木聚糖酶树干毕赤酵母1
载体pYEX-BX（7.1kb）（含有Ampr，URA3和leu2三个选择标记）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子（GAPDHP）和终止子(GAPDHT)、信号肽编码序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信号肽序列（XYNSEC），构建重组表达载体Ⅰ。采用电击转化法将构建好的重组表达载体转化到树干毕赤酵母菌株kds-3；根据所转入重组表达载体上带有的选择性标记，将转化后的酵母细胞涂布在含有氨苄霉素或卡那霉素的培养基上或者是在营养缺陷型的固体培养基平板上，如果转化成功，酵母细胞将获得抗生素抗性或者是营养缺陷型抗性，在相应的选择性培养基上将会长出含有重组子的单菌落。然后，提质粒进行PCR扩增，双酶切进行检测转化子中是否同时含有三种木聚糖酶基因，最终筛选出同时含有三种木聚糖酶基因的树干毕赤酵母阳性转化子，命名为zkds-3。
实施例6构建转基因木聚糖酶树干毕赤酵母2
载体pYEX-BX（7.1kb）（含有Ampr，URA3和leu2三个选择标记）、磷酸甘油酸激酶基因启动子（PGKP）和终止子（PGKT）、信号肽编码序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信号肽序列（XYNSEC），构建重组表达载体Ⅱ，采用电击转化法将构建好的重组表达载体转化到树干毕赤酵母菌株kds-9；根据所转入重组表达载体上带有的选择性标记，将转化后的酵母细胞涂布在含有氨苄霉素或卡那霉素的培养基上或者是在营养缺陷型的固体培养基平板上，如果转化成功，酵母细胞将获得抗生素抗性或者是营养缺陷型抗性，在相应的选择性培养基上将会长出含有重组子的单菌落。然后，提质粒进行PCR扩增，双酶切进行检测转化子中是否同时含有三种木聚糖酶基因，最终筛选出同时含有三种木聚糖酶基因的树干毕赤酵母阳性转化子，命名为zkds-9。
实施例7构建转基因木聚糖酶树干毕赤酵母3
载体Yeplac195（5.24kb）(含有Kanr和URA3两个选择标记)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子（GAPDHP）和终止子(GAPDHT)、Rhizopusoryzae的葡萄糖淀粉酶基因信号肽(GLUSEC)，构建重组表达载体Ⅲ,。采用电击转化法将构建好的重组表达载体转化到树干毕赤酵母菌株kds-75；根据所转入重组表达载体上带有的选择性标记，将转化后的酵母细胞涂布在含有氨苄霉素或卡那霉素的培养基上或者是在营养缺陷型的固体培养基平板上，如果转化成功，酵母细胞将获得抗生素抗性或者是营养缺陷型抗性，在相应的选择性培养基上将会长出含有重组子的单菌落。然后，提质粒进行PCR扩增，双酶切进行检测转化子中是否同时含有三种木聚糖酶基因，最终筛选出同时含有三种木聚糖酶基因的树干毕赤酵母阳性转化子，zkds-75。
实施例8构建转基因木聚糖酶休哈塔假丝酵母1
　　载体pYEX-BX（7.1kb）（含有Ampr，URA3和leu2三个选择标记）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子（GAPDHP）和终止子(GAPDHT)、信号肽编码序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信号肽序列（XYNSEC），构建重组表达载体Ⅰ。采用电击转化法将构建好的重组表达载体转化到休哈塔假丝酵母菌株kdx-10；根据所转入重组表达载体上带有的选择性标记，将转化后的酵母细胞涂布在含有氨苄霉素或卡那霉素的培养基上或者是在营养缺陷型的固体培养基平板上，如果转化成功，酵母细胞将获得抗生素抗性或者是营养缺陷型抗性，在相应的选择性培养基上将会长出含有重组子的单菌落。然后，提质粒进行PCR扩增，双酶切进行检测转化子中是否同时含有三种木聚糖酶基因，最终筛选出同时含有三种木聚糖酶基因的树干毕赤酵母阳性转化子，命名为zkd-10。
实施例9构建转基因木聚糖酶休哈塔假丝酵母2
　　载体pYEX-BX（7.1kb）（含有Ampr，URA3和leu2三个选择标记）、磷酸甘油酸激酶基因启动子（PGKP）和终止子（PGKT）、信号肽编码序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信号肽序列（XYNSEC），构建重组表达载体Ⅱ，;采用电击转化法将构建好的重组表达载体转化到休哈塔假丝酵母菌株kdx-13；根据所转入重组表达载体上带有的选择性标记，将转化后的酵母细胞涂布在含有氨苄霉素或卡那霉素的培养基上或者是在营养缺陷型的固体培养基平板上，如果转化成功，酵母细胞将获得抗生素抗性或者是营养缺陷型抗性，在相应的选择性培养基上将会长出含有重组子的单菌落。然后，提质粒进行PCR扩增，双酶切进行检测转化子中是否同时含有三种木聚糖酶基因，最终筛选出同时含有三种木聚糖酶基因的树干毕赤酵母阳性转化子，命名为zkdx-13。
实施例10构建转基因木聚糖酶休哈塔假丝酵母3
载体Yeplac195（5.24kb）(含有Kanr和URA3两个选择标记)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子（GAPDHP）和终止子(GAPDHT)、Rhizopusoryzae的葡萄糖淀粉酶基因信号肽(GLUSEC)，构建重组表达载体Ⅲ。采用电击转化法将构建好的重组表达载体转化到休哈塔假丝酵母菌株kdx-21；根据所转入重组表达载体上带有的选择性标记，将转化后的酵母细胞涂布在含有氨苄霉素或卡那霉素的培养基上或者是在营养缺陷型的固体培养基平板上，如果转化成功，酵母细胞将获得抗生素抗性或者是营养缺陷型抗性，在相应的选择性培养基上将会长出含有重组子的单菌落。然后，提质粒进行PCR扩增，双酶切进行检测转化子中是否同时含有三种木聚糖酶基因，最终筛选出同时含有三种木聚糖酶基因的树干毕赤酵母阳性转化子，zkdx-21。
实施例11　转基因酿酒酵母、树干毕赤酵母混合发酵转化玉米秸秆生产乙醇
（1）秸秆预处理
取玉米秸秆200g,粉碎，过20目筛，汽爆预处理，蒸汽加热1.5min至压强达1.45MP,维持7min，冷却，至压力为2bar，取出秸秆原料，用50°C水洗涤5次，过滤，得120g处理后的玉米秸秆，备用。
（2）菌种培养
菌株：转基因酿酒酵母zkdn-31、树干毕赤酵母zkds-3。
斜面培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,20;酵母浸膏,3;琼脂，20；麦芽汁，3；pH6.5，温度30±1°C
种子培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,30;酵母浸膏，1；玉米浆，2;(NH4)SO4,7.5;K2HPO4,3.5;MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1M柠檬酸缓冲液，pH6.5，38°C，培养30h，转速150rpm
接种量：按每100ml转化液接种1.0g菌体（以干菌体计），2种酵母，各自分别培养。
（3）秸秆转化为乙醇
发酵液组成(g/l):酵母浸膏,0.2；玉米浆，2.5;(NH4)2SO4,7.5;K2HPO4,3.5;尿素，1；MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1;预处理的秸秆,170，0.05M柠檬酸缓冲液，置250ml摇瓶中，用2MNaOH调pH6.6。
发酵液灭菌后，加入转基因酿酒酵母、树干毕赤酵母菌种共计1.0g（以干菌体计），转基因酿酒酵母zkdn-6与树干毕赤酵母zkds-9之比为1：0.8。0.1gTween80(g/l)，发酵液总体积为100ml，在38°C，发酵48-60h,乙醇浓度达140.7g/L，葡萄糖、木糖利用率>89%。
由于温度、pH、秸秆浓度、转基因酿酒酵母与转基因树干毕赤酵母（或休哈塔假丝酵母）的比例，氮源、培养时间等对乙醇产率、发酵速度均有较大影响，所以，需要用响应面法进行优化的试验设计，以确定较优的转化发酵工艺条件。而且，由于是混合培养，2种酵母对发酵条件的要求不同，所以，需通过优化试验设计，得到对2种酵母综合较优的工艺条件。
本实施例的条件即为进行大量优化试验后得到的。
实施例12　转基因酿酒酵母、树干毕赤酵母混合发酵转化玉米秸秆生产乙醇
（1）秸秆预处理
玉米秸秆5吨,粉碎，过20目筛，汽爆预处理，蒸汽加热1.5min至压强达1.35MP,维持5.5min，冷却，至压力为2bar，取出秸秆原料备用。
（2）菌种培养
菌株：转基因酿酒酵母zkdn-6、树干毕赤酵母zkds-9。
斜面培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,20;酵母浸膏,3;琼脂，20；麦芽汁，3；pH6.5，温度30±1°C
种子培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,50;酵母浸膏，1；玉米浆：2;(NH4)SO4,7.5;K2HPO4,3.5;MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1M柠檬酸缓冲液，pH6.5，36°C，培养30h，转速150rpm
接种量：10％，种子液/发酵液，体积比，多级种子液培养，转基因酿酒酵母zkdn-6与树干毕赤酵母zkds-9之比为1：1。
（3）秸秆转化为乙醇
发酵液组成(g/l):酵母浸膏,0.3；玉米浆，3;(NH4)2SO4,7.5;K2HPO4,3.5;尿素，1；MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1;汽爆预处理的秸秆,分批补料投入，保持浓度为200-230g/L，0.05M柠檬酸缓冲液，用2MNaOH调pH6.6.0。
在30M3工业发酵罐进行发酵，发酵液灭菌后，加入转基因酿酒酵母、树干毕赤酵菌种，接种量：8％，种子液/发酵液，体积比，转基因酿酒酵母zkdn-6与树干毕赤酵母zkds-9之比为1：1。在36°C，发酵48-55h,乙醇浓度达150.1g/L，葡萄糖、木糖利用率>90%。
本实施例为中试规模的试验，由实施例11放大到30M3工业发酵罐，是实验室小试放大到中试规模，技术难度很大，经历大量的试验，不是常规实验工作所能解决。
实施例13转基因酿酒酵母、休哈塔假丝酵母混合发酵转化稻草秸秆生产乙醇
（1）秸秆预处理
取稻草150g,粉碎，过20目筛，汽爆预处理。取出秸秆原料，用50°C水洗涤5次，过滤，得105g处理后的稻草秸秆，备用。
（2）菌种培养
菌株：转基因酿酒酵母zkdn-6、休哈塔假丝酵母zkdx-10。
斜面培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,20;酵母浸膏,3;琼脂，20；麦芽汁，3；pH6.5，温度30±1°C
种子培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,50;酵母浸膏，2;玉米浆，2；(NH4)SO4,7.5;K2HPO4,3.5;MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1M柠檬酸缓冲液，pH6.5，30°C，培养30h，转速150rpm
接种量：按每100ml转化液接种共计1.0g菌体（以干菌体计），转基因酿酒酵母zkdn-6与休哈塔假丝酵母zkdx-10之比为1：0.92。
（3）秸秆转化为乙醇
发酵液组成(g/l):酵母浸膏,0.5；玉米浆，2.5;(NH4)2SO4,7.5;K2HPO4,3.5;尿素，1；MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1;预处理的稻草秸秆,165，0.05M柠檬酸缓冲液，置250ml摇瓶中，用2MNaOH调pH6.5.0。
发酵液灭菌后，接壤转基因酵母，接种量：8％，种子液/发酵液，体积比，转基因酿酒酵母zkdn-6与休哈塔假丝酵母zkdx-10之比为1：0.92。0.1gTween80(g/l)，发酵液总体积为100ml，在30°C，有氧发酵24-48h,乙醇浓度达138.2g/L，葡萄糖、木糖利用率>92%。
实施例14　转基因酿酒酵母、树干毕赤酵母混合发酵转化玉米秸秆生产乙醇
（1）秸秆预处理
取玉米秸秆5000吨,粉碎，过20目筛，汽爆预处理，蒸汽加热1.5min至压强达1.35MP,维持5min，冷却，至压力为2bar常压，取出秸秆原料备用。
（2）菌种培养
菌株：转基因酿酒酵母zkdn-59、树干毕赤酵母zkds-75。
斜面培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,20;酵母浸膏,3;琼脂，20；麦芽汁，3；pH6.5，温度30±1°C
种子培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,50;酵母浸膏，1；玉米浆：2;(NH4)SO4,7.5;K2HPO4,3.5;MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1M柠檬酸缓冲液，pH6.5，35°C，培养30h，转速150rpm
接种量：10％，种子液/发酵液，体积比，转基因酿酒酵母zkdn-59与树干毕赤酵母zkds-75之比为1：0.9，多级种子液培养。
（3）秸秆转化为乙醇
发酵液组成(g/l):酵母浸膏,0.3；玉米浆，3;(NH4)2SO4,7.5;K2HPO4,3.5;尿素，1；MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1;预处理的秸秆,分批补料投入，保持浓度为180-210g/L，0.05M柠檬酸缓冲液，用2MNaOH调pH6.60。
在300M3工业发酵罐进行发酵，发酵液灭菌后，加入转基因酿酒酵母、树干毕赤酵菌种，接种量：8％，种子液/发酵液，体积比，转基因酿酒酵母zkdn-59与树干毕赤酵母zkds-75之比为1：0.9。在35°C，无氧发酵40-50h,乙醇浓度达150.3g/L,，葡萄糖、木糖利用率>93%。
本实施例为工业规模的试验，由实施例12放大到300M3工业发酵罐，是从中试放大至批量生产规模，工作难度很大，经历大量的试验，不是常规实验工作所能解决。
实施例15　转基因酿酒酵母和休哈塔假丝酵母混合发酵转化玉米秸秆生产乙醇
（1）秸秆预处理
玉米秸秆5000吨,粉碎，过20目筛，汽爆预处理，蒸汽加热1.5min至压强达1.35MP,维持5min，冷却，至压力为2bar常压，取出秸秆原料备用。
（2）菌种培养
菌株：转基因酿酒酵母zkdn-31、休哈塔假丝酵母zkdx-13。
斜面培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,20;酵母浸膏,3;琼脂，20；麦芽汁，3；pH6.5，温度30±1°C
种子培养基组成（g/L）及培养条件：葡萄糖,50;酵母浸膏，1；玉米浆：2;(NH4)SO4,7.5;K2HPO4,3.5;MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1M柠檬酸缓冲液，pH6.5，353°C，培养30h，转速150rpm
接种量：10％，种子液/发酵液，体积比，转基因酿酒酵母zkdn-59与树干毕赤酵母zkds-75之比为1：0.8。多级种子液培养。
（3）秸秆转化为乙醇
发酵液组成(g/l):酵母浸膏,0.3；玉米浆，3;(NH4)2SO4,7.5;K2HPO4,3.5;尿素，1；MgSO4·7H2O,0.75;CaCl2·2H2O,1;预处理的秸秆,分批补料投入，保持浓度为150-180g/L，0.05M柠檬酸缓冲液，用2MNaOH调pH6.2。
在300M3工业发酵罐进行发酵，发酵液灭菌后，加入转基因酿酒酵母、树干毕赤酵菌种，接种量：8％，种子液/发酵液，体积比，转基因酿酒酵母zkdn-59与树干毕赤酵母zkds-75之比为1：0.8。在33°C，有氧发酵35-45h,乙醇浓度达150.3g/L，葡萄糖、木糖利用率>92%。
由实施例14到本实施例，实验规模没有变化，只是菌株改变了，所以，工作难度相对较小。

Claims (2)

1.一种利用转基因酵母混合发酵生产秸秆乙醇的方法，其特征在于转基因酵母可以将秸秆的纤维素、木聚糖分别降解为葡萄糖、木糖并将它们原位发酵为乙醇，不需要另外提供纤维素酶、木聚糖酶，纤维素、木聚糖降解与发酵同步进行；所述的转基因酵母为转基因酿酒酵母、转基因树干毕赤酵母、转基因休哈塔假丝酵母；转基因酿酒酵母同时转入了葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶基因，可以分泌葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶；转基因树干毕赤酵母、转基因休哈塔假丝酵母均同时转入了外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和木糖苷酶基因，可以分泌外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和木糖苷酶，转基因树干毕赤酵母、转基因休哈塔假丝酵母可以利用木糖发酵乙醇。
2.权利要求1所述方法，其特征在于将转基因酿酒酵母与转基因树干毕赤酵母、转基因休哈塔假丝酵母混合发酵，发酵条件为：转基因酿酒酵母与转基因树干毕赤酵母、转基因休哈塔假丝酵母之比为1：0.8-1，发酵温度为30-38℃，发酵时间为24-60h，汽爆预处理的秸秆分批补料投入发酵罐，保持秸秆浓度为150-230g/L，pH为6.2-6.6；发酵液组成按g/l表示为:酵母浸膏,0.3；玉米浆，2.5-3;(NH4)2SO4,7.5;K2HPO4,3.5;尿素，1；MgSO4·7H2O，0.75；CaCl2·2H2O，1。
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