CN103805536A - 一种解钾菌类芽孢杆菌g4及其在植物促生中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解钾菌类芽孢杆菌G4及其在植物促生中的应用，所述的解钾菌，分类命名为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）G4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2013548，保藏日期为2013年11月12日，保藏地址为中国武汉武汉大学。本发明从土壤中筛选到一株解钾菌，经鉴定为类芽孢杆菌属G4，该菌具有较强的解钾活性，接种到土壤中能改善土壤微环境，促进植物生长，可作为微生物肥料应用到农业生产中。

Description

一种解钾菌类芽孢杆菌G4及其在植物促生中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种解钾菌类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）G4及其在植物促生中的应用。

背景技术

据美国地质调查局统计，2008年世界钾矿储量83亿吨（以K₂O计，下同），基础储量180亿吨，主要分布在北美、欧洲、南美、中东和亚洲泰国等国家和地区,其中加拿大、俄罗斯、白俄罗斯、德国四国探明储量占世界总量的92%，全球现有钾资源可供开采230年以上。截止2008年，我国已探明的可溶性钾盐矿产地为40处，主要分布在青海、新疆等偏远的西部，其中经济储量仅为800万吨，可开采年限为4年，基础储量为4.5亿吨，占世界的2.5%。按照现在的开采速度，我国的钾肥可供开采66年。

我国不仅钾资源探明储量少，而且资源开采能力有限。我国开采的钾资源92%为卤水矿，在开发利用上存在诸多问题。（1）生产能力和产量低：每吨K₂O的开采需要引入淡水40吨，而中国钾矿大部分分布在淡水资源缺乏的西部地区，水资源的匮乏限制了企业生产规模的扩大。（2）开发利用水平低：目前我国钾盐开采主要是钾卤水矿，开采方法采用沟渠法，卤水经盐田晒制进行浮选富集。主要采用反浮选冷结晶技术和冷分解浮选技术，少数采用“兑卤脱钠—控速分解生产高浓度氯化钾”。加工工艺落后，使产品品位氯化钾低于90%，产品质量差，资源利用率低。（3）卤水综合利用程度低：卤水中同时含有钠、镁、锂、硼等资源，目前仅利用钾与钠资源，其他资源并未开发利用。（4）老卤随意排放，造成盐湖钾资源受到破坏：很多企业把老卤就地排入盐湖内，破坏了盐湖含钾卤水的组成，很多卤石已不能晒制，造成资源浪费。2011年，我国钾肥进口达600万吨，对外依赖度达到60%，我国的钾资源在短期供应和长期保障上都存在问题。

虽然我国可溶性钾的含量匮乏，但以钾长石为主的难溶性硅铝酸钾的含量却十分丰富，总储量近100亿吨。因此，利用难溶性硅铝酸钾开发可溶性钾肥成为了解决我国钾肥短缺的重要途径。现阶段，从难溶性钾盐中提取钾肥的的工艺主要有以下几种：如硫—氟混酸分解法、水热法、加压浸取法、硫酸加助剂低温分解法、焙烧法、熔盐浸取法、微生物法。近年来由工业性试验向工业规模生产化迈进的工艺主要有3种：水热化学法、微生物法、焙烧法。（1）水热化学法是指以钾长石为原料，通过水热化学反应，形成钾硅钙复合矿物肥料。刘善科等利用水热化学反应破坏了钾长石的三维骨架结构，使钾、铝、硅等释放出来形成水溶性物质。（2）焙烧法是指将富钾矿石与助剂混合，然后在一定温度下焙烧，形成可溶性钾盐。陈定盛等利用Na₂SO₄作为助剂，得出其添加量为2.94%，焙烧时间为2h，钾溶出率高达92～94%的最佳工艺条件。（3）微生物法是指将钾长石粉与解钾菌剂混合发酵，制成含有可溶性钾的有机微生物肥料。化学方法开发难溶性钾矿石具有能耗高、成本高、环境污染严重等缺点，而微生物法却具有污染小、成本低、生产工艺简单等特点，具有广阔的发展前景。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种解钾菌类芽孢杆菌G4，使其具有解离难溶性钾矿石能力。本发明的另一目的是提供所述解钾菌类芽孢杆菌G在植物促生中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种解钾菌，分类命名为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）G4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2013548，保藏日期为2013年11月12日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

所述的类芽孢杆菌G4在促进植物生长中的应用。

所述的类芽孢杆菌G4在提高土壤肥力、增加土壤微生物生物量和酶活中的应用。

所述的类芽孢杆菌G4在产生刺激植物生长的化学物质中的应用。

所述的类芽孢杆菌G4在增强作物抗逆性中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明从所采集的土样中筛选到一株解钾菌，经鉴定为类芽孢杆菌属G4，该菌具有较强的解钾活性，接种到土壤中能改善土壤微环境，促进植物生长，可作为微生物肥料应用到农业生产中。

附图说明

图1是类芽孢杆菌G4在硅酸盐细菌培养基上的菌落形态单菌光镜图（100×）；

图2是基于16S rDNA序列类芽孢杆菌G4的***发育进化树图。

图3是氮溶液标准曲线图；

图4是葡萄糖溶液标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1菌株的分离纯化

1）样品采集

土壤样品采自江西省高安市潘家村梨园，采用三点取样法，采集后放入冰箱内4℃保存。

2）解钾菌的初筛

采用稀释涂布平板法，将10^-3、10^-4、10^-5三个浓度梯度的土壤稀释液涂布到硅酸盐细菌初筛培养基上，30℃培养3～4d，挑取圆形、透明、表面湿润黏稠的大型菌落，进行平板划线纯化，反复进行3次，同时用显微镜观察菌落纯度，直至获得纯培养。

从硅酸盐细菌培养基平板上共初步筛选到52株菌，然后从中又挑选出菌落形态大、生长速度快的4株菌，依次命名为G1-G4，对这4株菌进行摇瓶解钾试验，测定其解钾效率，从中筛选高效解钾菌。

3）解钾菌的复筛

摇瓶培养：将种子液按5%接种量接种到50mL/250mL解钾复筛培养基，30℃、180r min^-1摇床培养7d。设加等量灭活种子液的对照处理，每个处理设3个重复。

发酵液的处理及解钾率的测定：发酵液的处理采用过氧化氢灰化法。取发酵处理液，用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定其中的钾离子的含量，然后计算出速效钾相对增加量，计算公式如下：

$a=\frac{\mathrm{\ρ}1-\mathrm{\ρ}0}{\mathrm{\ρ}0}\×100\%$

式中，a为速效钾相对增加率（%）；ρ1为样品中速效钾含量（mg L^-1）（接菌）；ρ0为样品中速效钾含量（mg L^-1）（接灭活菌）。

对初筛的4株菌进行发酵培养，7d后，测定其解钾效率，测定结果见表1。由下表1可以看出，4株菌的解钾效率存在比较大的差异，培养7d后，其解钾效率在1.78%～27.62%之间，G4的解钾效率最高，为27.62%，因此选择G4菌株做为研究对象，用于后续研究。

表1初筛菌株的钾离子相对增加量

备注：表中不同的小写字母代表差异显著，相同的代表不显著（下同）

实施例2菌株的鉴定

类芽孢杆菌G4的形态观察，G4菌株在硅酸盐细菌培养基上的菌落呈圆形，边缘整齐，透明凸起，表面湿润，菌落粘稠，菌落挑起时有弹性，可拉成丝，如图1所示。经革兰氏染色，G4为G+，菌体成椭圆形，产有椭圆形芽孢和肥大的荚膜。

对菌株G4进行16S rDNA的PCR扩增，0.75%琼脂糖凝胶电泳验证，得到一条1600bp左右的条带，将其测序，得到1575bp的序列，序列信息提交Genbank，获得登陆号KC465416，通过Ribosomal Database Project数据库，下载同源性较高的序列，利用MEGA4.0基于邻接法（Neighbor Joining method）构建菌株***发育进化树。由图2可以看出G4与Paenibacillus sabinae T49（DQ338446）聚与同一个分支上，序列相似性达99%，结合形态观察和生理生化特性，G4初步鉴定为类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）菌株，分类命名为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）G4，并将该菌株送交位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2013年11月12日，保藏号为CCTCC NO：M2013548。

实施例3解钾菌对不结球白菜促生作用的研究

菌液制备：取保存菌株，在硅酸盐培养基上进行划线活化。挑取活化菌落，转接于发酵液中（培养基选用种子液培养基），25℃、180r·min^-1震荡培养48h。离心发酵液，去除上层液体，用同体积的无菌水稀释菌体，混匀即为所需菌液。

播种处理：盆栽共设三个处理，CK（每盆加去离子水50mL），A5（每盆加菌液5mL＋45mL去离子水），A50（每盆加菌液50mL），菌液与水提前混合浇入盆中，种子（提前放入培养箱，进行水培催芽）隔夜播种，每盆播种10粒。等不结球白菜长到四叶期，进行间苗，每盆留苗3株，每个处理5盆，共15盆。盆栽期间注意施肥（不施钾肥），浇水，病虫害防治。30d后，采集不结球白菜植株进行测定。

1）对不结球白菜产量和品质的影响

具体包括：1）用卷尺测量不结球白菜的植株高度，用电子天平测量鲜重。2）不结球白菜叶绿素含量测定：采用直接浸取法，将植株叶片剪成宽约2mm的细条，称取0.5g样品放入50mL离心管中，然后加入10mL丙酮：乙醇（2:1）混合液，将离心管静置于暗处，16h后，取上清液测定A663和A645，叶绿素含量CT（mg/L）=Ca+Cb=8.02A663+20.2A645。3）不结球白菜维生素C含量测定：采用GB6195-86[92]中2，6-二氯靛酚滴定法。4）不结球白菜硝酸盐含量测定：采用NY/T1297-2007[93]中的紫外分光光度法。结果如表2所示。

表2对不结球白菜产量和品质的影响

从表2的结果可以看出，施用解钾菌G4的处理对不结球白菜各项生长指标的影响均好于对照。处理A50不结球白菜株高、鲜重、叶绿素含量、维生素C含量、硝酸盐含量与对照相比，差异达到显著水平（P<0.05），与A5相比，鲜重、叶绿素含量、维生素C含量有显著性差异（P<0.05）；A5与对照相比，株高、鲜重、维生素C含量、硝酸盐含量有显著性差异（P<0.05）。A50与对照相比，不结球白菜的株高、鲜重、叶绿素含量、维生素C含量分别增加了17.0%、36.4%、10.7%和33.3%，硝酸盐含量减少了19.0%；与A5相比，鲜重、叶绿素含量、维生素C含量分别增加了16.2%、9.3%和23.1%；A5与对照相比，不结球白菜的株高、鲜重、维生素C含量分别增加10.1%、17.3%和8.3%，硝酸盐含量减少了16.2%。

2）土壤微生物数量的影响

土壤微生物数量的测定选用平板计数法，选用的培养基：细菌为牛肉膏蛋白胨培养基，真菌为马丁氏培养基，放线菌为改良高氏一号培养基，硅酸盐细菌为硅酸盐培养基。方法：用无菌水对土样进行梯度稀释，选择合适浓度梯度的稀释液0.2mL涂布到相应的生理平板上，30℃培养。细菌平板培养2d后计数，真菌和放线菌平板培养3d后计数，硅酸盐细菌平板培养5d后计数。结果如表3所示。

表3接种菌株G4对土壤微生物数量的影响

从表3的数据中，可以看出接种菌株G4的两个处理A5与A50的土壤中细菌、放线菌、硅酸盐细菌的数量，相比于对照有显著提高。A50与对照相比，细菌、放线菌、硅酸盐细菌的数量分别增加了111.6%、159.3%、128.0%；A5与对照相比，细菌、放线菌、硅酸盐细菌的数量分别增加了97.3%、69.1%、79.3%，两者差异性均达到显著水平（P<0.05）；真菌数量都有所减少，A50相比于对照，真菌减少了45.6%，A5相比于对照，真菌减少了42.4%，两者差异性均达到显著水平（P<0.05）。

3）对土壤酶活性的影响

（1）土壤过氧化氢酶活性测定：取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3%H₂O₂溶液。同时设置无土对照试验（即以2mL蒸馏水代替2g土壤）和无基质对照试验（即以5mL蒸馏水代替5mL过氧化氢溶液），将三角瓶放在摇床上混匀，30min后，加入5mL3mol·L^-1硫酸，终止反应。将瓶中液体用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1mol·L^-1高锰酸钾滴定至粉红色出现，且半分钟不退色即为滴定终点。过氧化氢酶活性以30min后1g土壤消耗0.1mol·L^-1高锰酸钾的毫升数表示。

（2）土壤脲酶活性测定：称取5g土壤置于50mL三角瓶中。用1mL甲苯处理15分钟。往瓶中加入10mL10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。混匀后，将三角瓶放入37℃恒温箱中，静置24h。同时设立无土对照试验（即以5mL蒸馏水代替5g土壤）和无基质对照试验（即以10mL蒸馏水代替10mL尿素溶液）。24h后，取出三角瓶，摇匀，用滤纸过滤悬液。吸取1mL滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至20mL。然后加入4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。根据标准曲线（见图3）求出氨态氮含量。以每克土壤在37℃下24h内酶解尿素释放的NH₃-N的毫克数来表示脲酶活性。

（3）土壤蔗糖酶活性测定：称取5g土壤，置于50mL三角瓶中，加15mL8%蔗糖溶液、5mL pH5.5磷酸缓冲液、1mL甲苯，摇匀、塞紧，放于37℃恒温箱中，培养24h。同时设立无土对照试验（即以5mL蒸馏水代替5g土壤）和无基质对照试验（即以15mL蒸馏水代替15mL蔗糖溶液）。培养结束后，用滤纸过滤，取1mL滤液，按绘制标准曲线方法，测定并由标准曲线（见图4）计算出还原糖含量。土壤蔗糖酶活性，以1g土壤在37℃下24h释放出的葡萄糖毫克数来表示。

表4接种菌株G4对土壤酶活性的影响

从表4的数据中，可以看出接种菌株G4的两个处理A5与A50土壤的过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶活性，相比于对照都有所提高。A50与对照相比，过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶活性分别增加了5.17%、5.13%、6.59%，差异性均达到显著水平（P<0.05）；A5与对照相比，过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶活性分别增加了1.68%、2.62%、0.43%，且蔗糖酶活性差异达到显著水平（P<0.05）。

4）对土壤化学性状的影响

（1）土壤速效钾测定：采用NY/T889-2004^[94]中乙酸铵浸提-火焰分光光度计法。

（2）土壤缓效钾测定：采用NY/T889-2004中1mol/L热硝酸浸提-火焰分光光度计法。

表5接种菌株G4对土壤化学性状的影响

处理	速效钾（mg/kg）	缓效钾（mg/kg）
			CK	113.7±4.87b	408.8±3.96c
A5	121.5±2.48a	432.4±6.49b
			A50	125.2±2.08a	516.8±9.08a

由表5可以看出，A₅₀和A₅两个处理相比于对照，土壤速效钾和缓效钾含量都有显著提高，且差异性达到显著水平（P<0.05）。A₅₀与对照相比，土壤速效钾和缓效钾含量分别增加了10.1%和26.4%，与A₅相比，分别增加了3.05%和19.5%；A₅与对照相比，土壤速效钾和缓效钾含量分别增加了6.86%和5.77%。

Claims (5)

1.一种解钾菌，分类命名为类芽孢杆菌（Paenibacillussp.）G4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2013548，保藏日期为2013年11月12日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

2.权利要求1所述的类芽孢杆菌G4在促进植物生长中的应用。

3.权利要求1所述的类芽孢杆菌G4在提高土壤肥力、增加土壤微生物生物量和酶活中的应用。

4.权利要求1所述的类芽孢杆菌G4在产生刺激植物生长的化学物质中的应用。

5.权利要求1所述的类芽孢杆菌G4在增强作物抗逆性中的应用。

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