CN103805530A - 一种微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的方法 - Google Patents

一种微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的方法 Download PDF

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本发明属于生物制剂制备技术领域，特别涉及一种微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的方法。采用的菌株是Catenulispora acidiphila。其工艺如下：(1)培养基中的营养采用碳源和氮源，其中碳源可为葡糖糖、淀粉、糊精、饴糖，氮源可为蛋白胨、花生粉、黄豆粉、牛肉膏、鱼粉，此外还需添加无机盐；(2)使用该生产菌株，可通过摇瓶二级发酵的方法，获得其次生代谢产物-二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯，具体过程包括：原始菌种的活化、摇瓶种子的制备、摇瓶发酵、发酵液和菌丝体的后处理、提取纯化制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯。本发明首次利用微生物发酵获得二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯，并通过核磁共振及X-ray单晶衍射证明其结构，为代替传统有机合成和植物提取提供了新方法。

Description

一种微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的方法
技术领域：
本发明属于生物制剂制备技术领域，特别涉及一种微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的方法。 
背景技术：
研究发现，二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯(4，4′-diphenylmethane-bis(methyl)carbamates，DPMC)是中药桑白皮(Cortex Mori)的微量成分(郑兆广，王汝上，汤丹，等.桑白皮化学成分的研究.天然产物研究与开发，2011，23，399-400，403.)，桑白皮为桑科植物桑Morusalba L.的干燥根皮，性甘、寒，近几年的药理学研究表明桑白皮具有降血糖血压、利尿、镇咳平喘、抗HIV抗肿瘤等方面的活性(吴志平，谈建中，顾振纶.中药桑白皮化学成分及药理活性研究进展.中国野生植物资源，2004，23(5)，10-12)；作为有效化学成分之一的DPMC已经引起关注，进一步研究表明，DPMC对治疗糖尿病肾病有良好的效果，证明了其具有降血糖的功能，为糖尿病及其并发症患者提供了新的治疗候选药物(朱荃，石兴华，汤丹，等.一种治疗糖尿病肾病的药物组合及其制备方法和应用.国际公布号：WO 2010/081263A1)。另外，DPMC可用于制备二苯甲烷二异氰酸酯(MDI)，MDI是生产聚氨酯的重要原料，而聚氨酯广泛应用于生产聚氨酯硬泡、合成革、聚氨酯弹性体等领域，也是粘接剂、涂料和纤维等多种产品的原料；由于其性能优异，在世界范围内需求量增长；我国的聚氨酯工业也在持续快速发展，年需求增长率持续在10％以上，使得世界各大化工企业纷纷新建工厂和扩大产能。目前DPMC的来源包括植物提取分离和化学合成。植物提取分离存在产率低、受资源限制的不足；而化学合成过程中会使用硝基苯、盐酸等危险性化学试剂，对石油化工产品依赖严重，且对环境有较大的危害(谢可卫，项曙光，韩方煌.苯氨基甲酸甲酯合成二苯甲烷二氨基甲酸甲酯的研究进展.化学工业与工程技术，2008，29(4)，37-42.)。本发明首次从微生物发酵产物中分离得到了DPMC，为制备该化合物提供了新的方法。 
发明内容：
本发明提供了一种微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯(DPMC)的方法，包括原始菌种的活化、摇瓶种子培养、以及提取纯化的各种步骤。 
本发明所述的菌种平板活化是指打开保存的冻干管，挑取菌种后均匀涂布在平板培养基上，于28℃培养7天。 
本发明所述的摇瓶种子培养是指采用菌株生长所需的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，挖取适量菌体，转移到种子摇瓶中，在恒温振荡培养箱内振荡培养，210rpm，28℃，培养5天获得摇瓶种子。 
本发明所述的发酵是指采用菌株生长所需的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌，按照一 定的接种量比例(5-10％，以发酵体积为基准)，转入摇瓶种子，在恒温振荡培养箱内振荡培养，210rpm，28℃，培养11-13天，获取菌株发酵次生代谢产物。 
本发明所述的发酵液后处理方法是发酵液放瓶后，在室温、常压下，使用转速为4000rpm的离心机离心10分钟，弃发酵上清液，收集菌丝体，用10倍量的80％丙酮水溶液悬浮菌丝体，超声提取30分钟，该过程重复三次，合并提取液，减压浓缩至不含丙酮后，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层经减压浓缩至干，得粗提物，后经硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相高效液相制备色谱得到纯品二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯。 
本发明的优点是： 
1.可替代植物来源，提供二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯(DMPC)的新资源。 
本发明为首次使用微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯，可替代从桑白皮提取分离(每千克干燥桑白皮只能获得4.5mg DMPC)，因此更有利环保、不破坏生态平衡，并且可在发酵过程中控制其产量(初步发酵每升可达1.5mg)，不受地域与季节变化的影响。 
2.与化学合成相比具有危险性小、绿色环保的优点，且发酵法所用原料可再生。 
本发明通过微生物发酵法获得DMPC，可避免硝基苯、盐酸等危险性化学试剂的使用，绿色环保；另外，发酵法所使用的原料为可再生资源，降低了对石油化工产品的依赖。 
3.可快速获得DMPC，生产周期短，过程简洁，适于大规模生产。 
本发明通过微生物发酵法获得DMPC，生产周期短，且微生物次生代谢产物种类比较少，DMPC为主产物，提取分离纯化过程比较容易，可较快去除杂质获得纯品。 
本发明中的菌种保藏信息： 
保藏单位名称：德国微生物菌种保藏中心 
保藏编号：DSM 44928 
菌种分类名称：Catenulispora acidiphila 
具体实施方式：
本发明提供一种微生物发酵法制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的方法，是利用从德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)获得的菌株Catenulispora acidiphila，通过微生物发酵法制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯。 
实施例1：本发明所述微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的生产工艺 
一、培养基： 
1.固体培养基： 
酵母提取物4.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，琼脂20.0g/L，pH    自然值 
2.摇瓶种子、发酵培养基： 
豆粉5g/L，可溶性淀粉15g/L，蛋白胨15g/L，甘油15g/L，NaCl 5g/L，pH    自然值 
二、发酵生产 
1.菌种的平板活化：打开菌种脱脂牛奶冻干管，挑取少量稀释于无菌蒸馏水中，然后吸取适量均匀涂布于平板培养基上，在28℃下培养5-7天，转至4℃冰箱保存。 
2.摇瓶种子培养：经活化好的平板菌种挖块接种到每个种子培养瓶中，在28℃下恒温振荡培养，210rpm，5天，无染杂菌即可。 
3.发酵：发酵培养基配方如上，灭菌后，将培养好的种子，按照5％的接种量(以发酵体积为基准)，转入发酵瓶中，共计发酵10L，210rpm，28℃下振荡培养12天。 
4.终止发酵后，将发酵液在室温、常压下，使用转速为4000rpm的离心机离心10分钟，弃发酵上清液，收集菌丝体，用10倍量的80％丙酮水溶液悬浮菌丝体，超声提取30分钟，该过程重复三次，合并提取液减压浓缩得水相，水相经等体积的乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层经减压浓缩得粗提物，后经硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相高效液相制备色谱得到纯品二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯15mg。 
实施例2：本发明所述的微生物来源的二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯结构鉴定 
经质谱、核磁共振和X-ray单晶衍射确定其结构为二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯(4，4′-diphenylmethane-bis(methyl)carbamates，DPMC)，分子式：C17H18N2O4，分子量314，结构式如下： 
Figure BSA00000819123800031
式I.DMPC化学结构式 
表1.化合物DMPC的1H(500MHz)和13C NMR(100MHz)数据(in DMSO-d6) 
Figure BSA00000819123800032
Figure BSA00000819123800041
式II.DMPC晶体化学结构式 
晶体数据：C17H18N2O4；Mr 314.33g mol-1；absorption coefficient＝0.096mm-1；space groupP2(1)/c；triclinic，α＝5.1389(4)
Figure BSA00000819123800042
b＝31.402(2)
Figure BSA00000819123800043
c＝9.7516(7)
Figure BSA00000819123800044
α＝90.00°，β＝93.9530(10)°，γ＝90.00°；V＝1569.9(2)
Figure BSA00000819123800045
Z＝4；F(000)＝664；λ(MoKα)＝0.71073
Figure BSA00000819123800046
Dx＝1.330g em-3，Tmin/Tmax：0.9627/0.9914；reflections/parameters：2767/210；goodness of fit on F2：1.004；R1 and wR2[I＞2σ(1)]：0.0471and 0.0910，resp.；R1 and wR2(all data)：0.0932and 0.1038，resp。 

Claims (5)

1.微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的菌株，其特征在于：采用的是Catenulispora acidiphila，菌株保藏号是DSM 44928。
2.一种如权利要求1所述的菌种Catenulispora acidiphila的培育方法，其特征在于：摇瓶种子的制备：灭菌前培养基为自然pH，接菌环接种生产菌株，转数180-210rpm，温度为25-28℃，培养时间4-5天。
3.根据权利要求2所述的菌种Catenulispora acidiphila的培育方法，其特征在于：摇瓶发酵工艺为：灭菌前培养基为自然pH，按照5-10％的接种量(以发酵体积为基准)接种，转数180-210rpm，温度为25-28℃，培养时间11-13天。
4.一种利用微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的方法，其特征在于：所使用的生产菌为Catenulispora acidiphila，其工艺如下：
(1)培养基：种子和发酵培养基中的营养采用碳源和氮源，其中碳源可为葡糖糖、淀粉、糊精、饴糖，氮源可为蛋白胨、花生粉、黄豆粉、牛肉膏、鱼粉，此外还需添加无机盐。
(2)发酵工艺：使用该生产菌株，可通过摇瓶二级发酵的方法，获得其代谢产物一二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯，具体过程包括：原始菌种的活化、摇瓶种子的制备、摇瓶发酵、发酵液和菌丝体的后处理、提取纯化二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯。
5.根据权利要求4所述的一种利用微生物发酵制备二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯的方法，其特征在于：其发酵后的处理工艺如下：
发酵液放瓶后，在室温、常压下，使用转速4000rpm的离心机离心10分钟，收集菌丝体，加入10倍量的80％丙酮水溶液，超声提取30分钟，该过程重复三次，合并提取液减压浓缩得水相，水相经等体积的乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层经减压浓缩得粗提物，后经硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相高效液相制备色谱得到纯品二苯基甲烷二氨基甲酸甲酯。
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Title
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