CN103797114A - 生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法 - Google Patents

Abstract

在一个方面，本发明提供了一种生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法，所述方法包括所述重组酶在真核宿主细胞中的细胞内表达的步骤。

Description

生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法

技术领域

本发明涉及能够水解叶绿素和叶绿素衍生物的酶的生产。 

背景技术

叶绿素是一种绿色色素，其广泛发现于整个植物界，多存在于藻类和蓝藻细菌中。叶绿素是光合作用所必需的，并且是地球上发现的最丰富的有机金属化合物之一。因而许多来自植物的产品(包括食物和饲料)含有相当多的叶绿素。 

例如，得自含油种子(例如大豆、棕榈种子或油菜籽(卡诺拉油菜)、棉籽、葵花籽、葡萄籽和花生)的植物油通常含有一些叶绿素。然而，通常不期望植物油中存在高含量的叶绿素色素。这是因为叶绿素使油带上难看的绿色，并且在储存期间可引起油的氧化，从而导致油的变质。 

已采用各种方法以除去植物油中的叶绿素。在产油过程的多个阶段，包括种子破碎、油萃取、脱胶、碱处理和漂白步骤，都可除去叶绿素。然而，漂白步骤通常对于将叶绿素残留量降至可接受含量是最为有效的。在漂白期间，加热油并使其通过吸附剂以除去叶绿素和影响成品油外观和/或稳定性的其他有色化合物。用于漂白步骤的吸附剂通常为粘土。 

在可食用油加工行业中，采用上述步骤通常会将加工油中的叶绿素含量降至介于0.02至0.05ppm之间。然而，漂白步骤由于漂白粘土的夹带作用会增加加工成本和降低油产量。粘土的使用可能会将许多有用的化合物(例如类胡萝卜素和生育酚)也从油中除去。另外粘土的使用也很昂贵，这尤其是因为用过的粘土(即废料)的处理困难、危险(易于自燃)，因而处理成本高。因而已进行了用其他办法从油中除去叶绿素的尝试，例如使用叶绿素酶。 

在植物中，叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)被认为参与叶绿素降解，并催化叶绿素中酯键的水解而生成脱植基叶绿素和叶绿醇。WO 2006009676描述了可降低组合物中叶绿素污染的一种工业方法，例如用叶绿素酶处理植物油。此方法中产生的水溶性脱植基叶绿素也是绿色，但是可通过水萃取法或二氧化硅处理除去。 

叶绿素通常在用于产油的种子中以及从种子提取油的过程中部分降解。一种常见的修饰为卟啉(二氢卟酚)环失去镁离子形成称为脱镁叶绿素的衍生物(参见图1)。卟啉环上高极性镁离子的丢失导致脱镁叶绿素与叶绿素相比在理化性质上显著不同。通常在加工过程中，油中的脱镁叶绿素比叶绿素含量更丰富。脱镁叶绿素呈淡绿色，可通过与用于叶绿素类似的方法从油中除去，例如WO 2006009676中所述通过由具有脱镁叶绿素酶活性的酶催化的酯酶反应。在某些条件下，一些叶绿素酶能够水解脱镁叶绿素以及叶绿素，因此适于除去这两种污染物。脱镁叶绿素水解的产物为红色/褐色的脱镁叶绿酸和叶绿醇。脱镁叶绿酸也可由脱植基叶绿素(即叶绿素水解之后)失去镁离子生成(参见图1)。WO 2006009676教导了通过与脱植基叶绿素类似的方法(例如通过水萃取法或二氧化硅吸附)除去脱镁叶绿酸。 

脱镁叶绿素还可通过含油种子收获和储存期间植物酶的活性或者通过精制油期间的加工条件(即热)进一步降解为焦脱镁叶绿素(参见“Behaviour of Chlorophyll Derivatives in Canola Oil Processing”，JAOCS，Vol，no.9(Sept.1993)pages 837-841(“卡诺拉油加工过程中叶绿素衍生物的行为”，《美国油脂化学协会杂志》，第9卷，1993年9月，第837-841页))。一种可能的机制是脱镁叶绿素碳环上甲酯键的酶水解，然后不稳定中间体向焦脱镁叶绿素的非酶转化。据报道来自藜(Chenopodium album)的名为脱镁叶绿酸酶的28-29kDa酶能够催化脱镁叶绿酸上类似的反应，以产生不含叶绿醇的焦脱镁叶绿素衍生物，称为焦脱镁叶绿酸(参见图1)。焦脱镁叶绿酸比脱镁叶绿酸极性低，导致焦脱镁叶绿酸与脱镁叶绿酸相比具有降低了的水溶解度和增加了的油溶解度。 

取决于加工条件，在加工期间植物油中焦脱镁叶绿素可比脱镁叶绿素和叶绿素含量都更为丰富(参见表9中的Bailey’s工业用油和脂肪产品(2005年)的2.2卷，第6版，Fereidoon Shahidi、John Wiley和Sons编辑)。这部分地是由于在植物材料的收获和储存期间叶绿素中镁的丢失。如果使用90℃或更高温度下的长时间热处理，油中焦脱镁叶绿素的量可能会 增加并且可能高于脱镁叶绿素的量。也可通过在压榨和萃取之前加热含油种子以及精制过程中油脱胶和碱处理降低叶绿素含量。还观察到油中的磷脂可与镁络合，从而降低叶绿素的量。因而在许多植物油中与焦脱镁叶绿素(和脱镁叶绿素)相比，叶绿素为相对少量的污染物。 

因而需要大规模生产叶绿素酶和相关酶，特别是用于炼油的方法。来自普通小麦(Triticum aestivum)(小麦(wheat))的叶绿素酶已在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组地表达，如在Arkus et al(2005)，Arch.Biochem.Biophys 438：146-155(Arkus等人，2005年，《生物化学与生物物理学集刊》，第438卷，第146-155页)中所述。然而，通过此细菌表达方法获得的重组叶绿素酶的产率较低，通常为大约每升几毫克。 

仍然需要一种用于生产叶绿素酶和相关酶，特别是用于适合在植物油精炼中使用的酶的快速大规模表达的改进的方法。 

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种优选以高收率生产能够水解叶绿素或一种或多种叶绿素衍生物的重组酶的方法，其包括在宿主细胞(例如，微生物和/或真核宿主细胞)中进行细胞内表达重组酶的步骤。所述宿主细胞通常为真核生物，包括酵母，例如，酵母属(Saccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp)、汉逊酵母属(Hansenula)和丝状真菌，例如曲霉菌属(Aspergillus sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)以及金孢子菌属(Chrysosporium)。 

在一个实施例中，所述宿主细胞为真菌细胞，例如木霉属(Trichoderma)、曲霉菌属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、酵母属、镰刀菌属。优选宿主细胞来自木霉属，例如，里氏木霉(Trichoderma reesei)。 

在具体的实施例中，该重组酶具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性，例如，叶绿素酶活性。 

重组酶可包括选自GHSXGG(SEQ ID NO：36)、DPVXG(SEQ ID NO：37)和YGHXD(SEQ ID NO：38)的一种、两种或三种氨基酸序列。 

在一些实施例中，编码重组酶的基因来自植物，例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甘蓝(Brassica oleracea)、蓖麻(Ricinus communis)、银杏(Ginkgo biloba)、毛果杨(Populus trichocarpa)、葡萄(Vitis vinifera)、毛 竹(Phyllostachys heterocycla)、高粱(Sorghum bicolor)、橹豆(Glycine max)、发财树(Pachira macrocarpa)、普通小麦(Triticum aestivum)、甜橙(Citrus sinensis)、玉米(Zea mays)、藜(Chenopodium album)、北美云杉(Picea sitchensis)或藻类，例如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。 

该重组酶优选包含如在SEQ ID NO：1至18的任意一个中所定义的多肽序列，或其功能性片段或变体。所谓“功能性片段或变体”意指为功能性酶(例如，具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的酶)的片段或变体。通常，功能性片段或变体在至少50个氨基酸残基上与SEQ ID NO：1至18的任意一个具有至少75％的序列同一性。 

该重组酶优选由如在SEQ ID NO：19至35的任意一个中所定义的核酸序列、或其功能性片段或变体编码。所谓“功能性片段或变体”通常指编码功能性酶(例如，具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的酶)的片段或变体。通常，功能性片段或变体在至少50个核苷酸残基上与SEQ ID NO：19至35的任意一个具有至少75％的序列同一性。 

在一个实施例中，该方法还包括裂解所述宿主细胞并且从裂解物中回收所述重组酶。优选使用洗涤剂裂解宿主细胞。优选地，洗涤剂处理与热处理相结合以选择性地回收重组酶。在可供选择的实施例中，宿主细胞用有机酸处理以便例如杀灭该细胞。优选将有机酸处理与热处理步骤相结合。在另一个实施例中，通过均化任选结合洗涤剂、有机酸或热处理步骤裂解宿主细胞。 

在另一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含编码能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶的核酸序列，所述序列可操作地连接到适于引导酶在宿主细胞(例如，微生物和/或真核宿主细胞)中的细胞内表达的一个或多个控制序列。优选该表达载体适于在真核宿主细胞中表达酶。 

优选该表达载体包含如在SEQ ID NO：19至34的任意一个中所定义的核酸序列或其功能性片段或变体，所述功能性片段或变体在至少50个核苷酸残基上与SEQ ID NO：19至35的任意一个具有至少75％的序列同一性。 

在另一个方面，本发明提供了一种(例如，微生物的和/或真核的)宿主细胞，其包含如上所定义的表达载体。优选该宿主细胞为真菌细胞。 

在另一个方面，本发明提供了一种能够水解叶绿素或一种或多种叶绿素衍生物的重组酶，其可通过如上所定义的方法，例如通过将含有如上所定义的所关注的叶绿素酶基因的表达载体引入(例如，微生物的和/或真核的)宿主细胞中而获得。 

优选该重组酶包含如在SEQ ID NO：1至18的任意一个中所定义的多肽序列或其功能性片段或变体，所述功能性片段或变体在至少50个氨基酸残基上与SEQ ID NO：1至18的任意一个具有至少75％的序列同一性。 

附图说明

图1示出涉及本发明中所生产的叶绿素和衍生物以及酶的各反应。 

图2A示出了基于与AtCLH2和其他已知的和推定的叶绿素酶的蛋白质序列相似性的树状图。来自单子叶植物(禾本类，例如小麦、竹子、高粱、玉米)的叶绿素酶聚集在一起，而2个甘蓝(Brassica oleracea)叶绿素酶在两个分开的聚类中。 

图2B示出了来自多种叶绿素酶的氨基酸序列的比对。保守催化残基(Ser-His-Asp)由·表示。活性位点残基、天冬氨酸和组氨酸周围的保守基序是叶绿素酶独有的。含有活性位点丝氨酸的第一基序GHSXGG对于诸如脂肪酶的其他酯酶是通用的。 

图3示出了用于在真菌细胞(木霉属)中生产小麦叶绿素酶的表达构建体。强效的Cbh1启动子用于驱动具有和不具有不同的信号肽的叶绿素酶的表达。 

图4示出了用于普通小麦叶绿素酶表达的真菌菌株(1-12)的筛选。来自不同转化体的胞内细胞抽提物的SDS-PAGE显示不同表达水平的34kDa重组小麦叶绿素酶(箭头)。C＝作为对照的未转化菌株。 

图5示出了重组小麦叶绿素酶(核心)的细胞外积聚。SDS-PAGE示出了随着发酵时间而增加的叶绿素酶的细胞外沉积。 

图6示出了重组小麦叶绿素酶的细胞内积聚，其在69小时处显示出蛋白质产量峰值。 

图7示出了用于生产竹子叶绿素酶的表达构建体，并且SDS-PAGE示出了生产重组蛋白的不同转化体。菌株3、5、6、11、12、13、14、15、16、17和18示出了与针对小麦叶绿素酶的抗体交叉反应的条带。 

图8示出了用于转化真菌细胞的表达构建体。这些构建体含有编码来自芸苔属植物、蓖麻籽和橹豆的叶绿素酶的合成基因。 

图9示出了表达来自芸苔属植物(1-6)、蓖麻籽(7-14)和橹豆(15-23)的叶绿素酶的菌株的筛选。不同的转化体显示不同水平的重组蛋白。针对小麦叶绿素酶的抗体用于确定来自其他植物的叶绿素酶。 

图10示出了含有编码来自发财树和杨树的叶绿素酶的合成基因的构建体。与针对杨树叶绿素酶表达菌株33-40的较高水平表达相比，转化体#24-32显示针对发财树叶绿素酶的低表达水平。 

图11示出了具有针对来自葡萄的叶绿素酶基因的可检测表达水平的菌株41-49。 

图12-29示出了用于在里氏木霉中表达的叶绿素酶氨基酸序列。删除加下划线的氨基酸序列以生产蛋白质的截短形式。 

图30-46示出了采用优化用于在真菌生产宿主中表达的密码子编码叶绿素酶的合成基因序列。 

具体实施方式

在一个方面，本发明涉及酶(诸如，在微生物和/或真核细胞中的叶绿素酶)的细胞内表达。已惊奇地发现例如与已知的原核(细菌)表达方法相比，在诸如真菌的真核生物中的细胞内表达迅速导致活性酶的高收率。具体地讲，已表明在诸如真菌的真核生物中，细胞内表达较快并且得到比分泌到细胞外介质中更高的酶收率。 

真菌细胞膜由厚的、坚韧的和刚性的细胞壁围绕，所述细胞壁可阻止细胞内重组产物的提取。细胞壁由围绕细胞质膜的不同聚合物(甲壳质、葡聚糖和甘露糖蛋白)组成。可认为提取技术涉及苛刻的条件，其可能潜在地损坏所需的重组产物(减少其功能性)或减少重组蛋白的回收率和收率(在使用所需重组产物过程中减少工业效率和提高成本)。此外，诸如细胞壁酶解的一些提取方法可能被认为是昂贵的，而诸如珠子击打和搅拌的物理破裂 可引起发泡和样品发热。声波降解法由于噪音、样品发热和自由基的形成损坏所关注的蛋白质而被认为是次佳的。 

如果重组蛋白在宿主细胞中表达之后被分泌，则无需细胞裂解并且可直接从培养基回收酶。由于这些原因，分泌性表达通常被认为是生产在诸如真菌的微生物中的重组蛋白的优选的方法。相比之下，本发明惊人地证实了可使用在诸如真菌的真核生物中的细胞内表达迅速和高收率地生产重组叶绿素酶，并且使用简单和直接的方法可容易地从细胞回收完全功能性的酶。 

在一个方面，本发明涉及一种生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法。 

叶绿素和叶绿素衍生物

所谓“叶绿素衍生物”通常是指包含卟啉(二氢卟酚)环和叶绿醇基团(尾)的化合物，包括不含镁含叶绿醇的衍生物，诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。叶绿素和(含叶绿醇的)叶绿素衍生物通常为绿色，这是因为分子中存在卟啉(二氢卟酚)环。镁从卟啉环的丢失意味着脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素颜色上比叶绿素更呈现出偏褐色。 

以本发明方法生产的酶可水解叶绿素和含叶绿醇的叶绿素衍生物以从二氢卟酚环裂解叶绿醇尾部。叶绿素和叶绿素衍生物的水解通常得到诸如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的化合物，它们是不含叶绿醇的叶绿素衍生物。这些化合物仍包含有色卟啉环，脱植基叶绿素呈绿色而脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸则呈红棕色。 

叶绿素或叶绿素衍生物可为a或b形式。因而如本文所用，术语“叶绿素”包括叶绿素a和叶绿素b。类似地，当提及脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸时，兼指a和b形式。 

能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶

本发明的方法生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶。通常，“水解叶绿素或叶绿素衍生物”是指水解叶绿素或(含叶绿醇)叶绿素衍生物中的酯键，例如从叶绿素或叶绿素衍生物中的二氢卟酚环上裂解叶绿醇基团。因此该酶通常具有酯酶或水解酶活性。优选地该酶在油相中并且任选地在水相中也具有酯酶或水解酶活性。 

因而该酶可为，例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶。优选地，该酶能够水解叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素中的至少一种、至少两种或全部三种。在一个特别优选的实施例中，该酶具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性。 

以此方法生产的酶可以是具有可水解叶绿素或叶绿素衍生物的活性的任何多肽。所谓“酶”旨在涵盖对叶绿素或叶绿素衍生物具有水解活性的任何多肽，包括例如酶片段等。 

酶(叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶)活性测定

可使用任何合适的检测分析技术，例如基于本文所述的检测分析法，检测叶绿素或叶绿素衍生物的水解活性。例如，可使用基于荧光的技术检测水解活性。在一个合适的检测分析中，将要检测其叶绿素或叶绿素衍生物水解活性的多肽在存在底物的情况下温育，并且通过荧光测量法监测产物或底物含量。合适的底物包括例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素。可检测的产物包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸和/或叶绿醇。 

检测叶绿素或叶绿素衍生物水解的检测分析方法公开在例如Ali Khamessan et al.(1994)，Journal of Chemical Technology and Biotechnology，60(1)，pages 73-81(Ali Khamessan等人，1994年，《化学技术与生物技术杂志》，第60卷，第1期，第73-81页)；Klein and Vishniac(1961)，J.Biol.Chem.236：2544-2547(Klein和Vishniac，1961年，《生物化学杂志》，第236卷，第2544-2547页)；以及Kiani et al.(2006)，Analytical Biochemistry 353：93-98(Kiani等人，2006年，《分析生物化学》，第353卷，第93-98页)。 

作为另外一种选择，合适的检测分析可在加入推定的酶后基于底物或产物含量的HPLC检测和定量，例如基于如下所述的技术。在一个实施例中，检测分析可按Homero-Mendez et al.(2005)，Food Research International 38(8-9)：1067-1072(Hornero-Mendez等人，2005年，《国际食品研究》，第38卷，第8-9期，第1067-1072页)中所述进行。在另一个实施例中，可使用以下检测分析法： 

向pH 7.0的170μl mM HEPES中添加溶解于丙酮的20μl 0.3mM叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。将酶溶解于pH 7.0的50mM HEPES中。 将10μl酶溶液添加到190μl底物溶液以引发反应，并在40℃下温育不同时间。通过添加350μl丙酮终止反应。离心(在18,000g下离心2min)后，通过HPLC分析上清液，并确定(i)叶绿素和脱植基叶绿素(ii)脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸或者(iii)焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸的量。 

一单位酶活性定义为例如采用本文所述的检测分析方法，在40℃下每分钟水解一微摩尔底物(例如叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)的酶的量。 

在一些优选的实施例中，本发明方法中生产的酶按例如通过本文所述检测分析方法确定的，基于每克纯化酶的活性单位计，具有至少1000U/g、至少5000U/g、至少10000U/g或者至少50000U/g的叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性。 

在一个另外的实施例中，对叶绿素或叶绿素衍生物的水解活性可以使用EP10159327.5中描述的方法确定。 

叶绿素酶

在一个实施例中，该酶至少能够水解叶绿素。任何能催化叶绿素酯键水解以生成脱植基叶绿素和叶绿醇的多肽都可于该方法中生产。例如，可生产叶绿素酶(chlorophyllase)、叶绿素酶(chlase)或叶绿素脱植基叶绿素水解酶或具有相似活性的多肽(例如，叶绿素-脱植基叶绿素水解酶1或叶绿素酶1(chlase 1)，或者叶绿素-脱植基叶绿素水解酶2或叶绿素酶2(chlase 2)，分别参见例如NCBI P59677-1和P59678)。 

在一个实施例中，该酶在酶命名分类(E.C.3.1.1.14)中分类为叶绿素酶。在一个方面，叶绿素酶可为如WO 0229022或WO 2006009676中所述的酶。例如，拟南芥叶绿素酶可按例如NCBI条目NM 123753中所述使用。在另一个实施例中，叶绿素酶来自藻类，例如来自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)。 

在另一个实施例中，叶绿素酶来自小麦，例如来自小麦属(Triticum spp.)，尤其是来自小麦。在另一个实施例中，叶绿素酶来自衣藻属(Chlamydomonas spp.)，尤其是来自莱茵衣藻。 

脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶

在一个实施例中，该酶能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。例如，该酶可为脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)，例如在Schelbert et al.，The Plant Cell 21：767-785(2009)(Schelbert等人，《植物细胞》，第21期，第767-785页，2009年)中所述的酶。 

除脱镁叶绿素之外，PPH和相关酶也能够水解焦脱镁叶绿素。然而，PPH对叶绿素是惰性的。如在Schelbert等人的文献中所述，PPH直系同源基因通常存在于真核光合作用生物体。PPH代表在***发生上区别于叶绿素酶定义的α/β水解酶亚族，这两个族在序列同源性和底物上是不同的。 

在本发明的具体实施例中，该酶可为来自任何物种的任何已知PPH或它们的功能性变体或片段，或可衍生自任何已知的PPH酶。例如，在一个实施例中，酶可以是来自拟南芥的PPH(参见图8，NCBI登录号NP_196884、GenBank ID No.15240707)，或其功能性变体或片段。 

在另一些实施例中，该酶可为来自以下任何一种物种的PPH：拟南芥、毛果杨、葡萄、水稻(Oryza sativa)、玉米、烟草、团藻(Ostreococcus lucimarinus)、青绿藻(Ostreococcus taurii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、三角褐指藻、莱茵衣藻或微单胞菌属(Micromonas sp.)RCC299。例如，该酶可为包含氨基酸序列的多肽，或由核苷酸序列编码的多肽(在表1中所示的以下数据库条目之一中定义)，或者它们的功能性片段或变体： 

表1

生物体	登录号	Genbank ID
			拟南芥	NP_196884	15240707
毛果杨	XP_002314066	224106163
			葡萄	CAO40741	157350650
水稻(粳稻(japonica))	NP_001057593	115467988
			玉米	ACF87407	194706646
烟草	CAO99125	156763846
			团藻	XP_001415589	145340970
青绿藻	CAL50341	116000661
			小立碗藓	XP_001761725	168018382

 

三角褐指藻	XP_002181821	219122997
			莱茵衣藻	XP_001702982	159490010
微单胞菌属RCC299	ACO62405	226516410

变体和片段

水解叶绿素或叶绿素衍生物的已知序列的功能性变体和片段也可在本发明中生产。所谓“功能性”是指所述片段或变体保留着对叶绿素或叶绿素衍生物的可检测水解活性。通常，此类变体和片段表现出与已知的叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列的同源性，例如在至少约10、20、30、50、100、200、300、500或1000或更多个残基的区域上或在序列的整个长度上，与已知的叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶氨基酸序列具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。 

序列同一性的百分比可以用序列比较算法分析或通过肉眼检查确定。在一个方面，序列比较算法是BLAST算法，例如BLAST 2.2.2版算法。 

其他可以本方法制备的具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的酶，可以通过确定存在于例如已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列中的保守序列基序的存在性来鉴定。具有合适活性的多肽序列可以通过搜索基因组数据库，例如微生物组宏基因组数据库(美国能源部联合基因组研究所(JGI-DOE，USA))中这些基序的存在来鉴定。 

编码酶的核苷酸序列的分离

在本发明方法中，通过使用重组DNA技术在真核宿主细胞中表达来生产酶。可分离或构建编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列并且用于在宿主细胞中进行细胞内表达相应的多肽。 

例如，可用来自自然产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列已知，则可合成出经标记的寡核苷酸探针，并用它从由该生物制备的基因组库鉴定编码多肽的克隆。或者，可使用含有与另一已知的多肽的基因同源的序列的标记寡核苷酸 探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况中，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。 

在又一个另选方案中，编码该酶的核苷酸序列可以通过已确立的标准方法合成制备，例如Beucage S.L.et al(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869(Beucage S.L.人，1981年，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1869页)所描述的亚磷酰胺方法，或Matthes et al(1984)EMBO J.3，p 801-805(Matthes等人，1984年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第801-805页)所述的方法。在亚磷酰胺方法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接并克隆进适当的载体中。 

核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如US 4,683,202或Saiki R K et al，Science(1988)239，pp 487-491(Saiki R K等人，《科学》，1988年，第239卷，第487-491页)所描述。 

本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。该核苷酸序列可以是基因组或者合成或者重组起源，无论代表正义链还是反义链都可以是双链或单链。 

通常，编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列使用重组DNA技术制备。然而，在本发明的可供选择的实施例中，可以使用本领域熟知的化学方法来合成该核苷酸序列的全部或部分(参见Caruthers MH et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23(Caruthers MH等人，1980年，《核酸研究论文集系列》，第215-223页)和Horn T et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232(Horn T等人，1980年，《核酸研究论文集系列》，第225-232页))。 

酶序列的修饰

一旦分离了酶编码核苷酸序列，或者鉴定了推定的酶编码核苷酸序列，可能需要修饰选定的核苷酸序列，例如可能需要将该序列突变以制备根据本发明的酶。 

可用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点旁侧的核苷酸序列。合适的方法在Morinaga et al，Biotechnology(1984)2，p646-649(Morinaga等人，《生物技术》，1984年，第2卷，第646-649页))中有所公开。向酶编码核苷酸序列引入突变的另一种方法在Nelson and Long，Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151(Nelson和Long，《分析生物化学杂志》，1989年，第180卷，第147-151页)中有描述。 

可以例如使用市售的试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或者来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒，来随机引入突变，而不是如上所述进行定点诱变。EP 0 583 265提到了优化基于PCR的诱变的方法，也可将它们与诱变DNA类似物(如EP 0 866 796中描述的那些)组合使用。易错PCR技术适用于产生水解叶绿素和/或叶绿素衍生物的具有优选特性的酶变体。WO0206457提到了脂肪酶的分子进化。 

第三种获得新序列的方法是，用多种限制性内切核酸酶或者诸如Dnase I的酶将不相同的核苷酸序列片段化，然后重新组装出编码功能蛋白的完全核苷酸序列。或者，可以使用一条或多条不相同的核苷酸序列，并在完全核苷酸序列的重新组装过程中引入突变。DNA改组和家族改组技术适用于产生具有优选特性的酶变体。进行“改组”的合适方法可在EP0752008、EP1138763、EP1103606中找到。也可将改组与其他形式的DNA诱变进行组合，如US 6,180,406和WO 01/34835中所描述。 

因此，有可能在体内或体外对核苷酸序列作出多个定点突变或随机突变，并且随后通过各种方法筛选所编码的多肽的改进的功能性。例如，采用计算机和exo介导的(in silico and exo mediated)重组方法(参见WO 00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)，可进行分子进化，其中所产生的变体保留很低的与已知酶或蛋白质的同源性。由此获得的此类变体可以与已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶具有显著的结构相似性，但是具有非常低的氨基酸序列同源性。 

另外，作为一个非限制性例子，可将多核苷酸序列的突变或自然变体与野生型或其他突变或自然变体进行重组，以产生新的变体。也可以针对所编码的多肽的功能性改善对这种新的变体进行筛选。 

上述的和类似的分子进化方法的应用，使得可以在事先不知道蛋白质结构或功能的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明酶的变体，并使得可以生产非可预测但有利的突变或变体。在本领域中有许多将分子进化应用于优化或改变酶活性的例子，这些例子包括(但不限于)如下中的一种或多种：优化在宿主细胞中或体外的表达和/或活性，增加酶活性，改变底物和/或产物特异性，增加或减少酶或结构稳定性，改变优选环境条件，如温度、pH、底物下的酶活性/特异性。 

本领域技术人员会明白，使用分子进化工具，可对酶进行改变以改进酶的功能性。合适地，编码用本方法生产的酶(例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶)的核苷酸序列可以编码变体酶，即当与亲本酶比较时，变体酶可以包含至少一个氨基酸置换、缺失或***。变体酶保留至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％的与亲本酶的同一性。合适的亲本酶可以包括具有叶绿素和/或叶绿素衍生物的水解活性的任何酶。 

序列比较

在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应能提供和/或编码保留功能活性和/或增强酶活性的多肽。 

在本说明书的语境中，同源序列意指：包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。 

在本说明书的语境中，同源序列意指：包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。 

同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些可商购获得的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的％同源性。可以对连续序列计算％同源性，即一个序列与其他序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸直接与其他序列中相应的氨基酸比较，每次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对较短数目的残基上进行。 

尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个***或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的***和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中***“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。 

然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位打分***。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。 

最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是Vector NTI Advance^TM 11(英杰公司(Invitrogen Corp.))。其他可进行序列比较的软件的例子包括(但不限于)：BLAST软件包(参见Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology，4th Ed-Chapter 18(Ausubel等人，1999年，《精编分子生物学方案》，第4版，第18章)和FASTA(Altschul et al 1990 J.Mol.Biol.403-410(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第403-410页))。BLAST和FASTA均可供进行离线和在线搜索(参见Ausubel et al 1999，pages 7-58 to 7-60(Ausubel等人，1999年，第7-58至7-60页))。然而，对于一些应用，使用Vector NTI Advance^TM 11程序是优选的。称为BLAST 2  Sequences的新型工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第174卷第2期，第247-250页)和FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第177卷第1期，第187-188页))。 

尽管最终的同源性百分数(％)也可以同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见用户手册)。对于某些应用，优选使用Vector NTI Advance^TM 11程序包的默认值。 

作为另外一种选择，百分比同源性可用Vector NTI Advance^TM 11(英杰公司(Invitrogen Corp.))中的多比对功能，基于类似于CLUSTAL(Higgins DG and Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244(Higgins DG和Sharp PM(1988年)，基因，第73卷第1期，第237-244页))的算法计算。一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算，并产生数值结果。 

如果确定序列同一性时使用空位罚分，则可优选地使用程序的默认参数于成对比对。例如，以下参数是BLAST 2成对比对的当前默认参数： 

在一个实施例中，优选地核苷酸序列和/或氨基酸序列的序列同一性可以通过BLAST2(blastn)使用如上定义的打分参数设置确定。 

出于本发明的目的，同一性的程度是基于相同的序列元件的数目。根据本发明氨基酸序列的同一性程度可合适地通过本领域已知的计算机程序例如Vector NTI Advance^TM 11(英杰公司(Invitrogen Corp.))确定。对于成对比对，所使用的打分参数优选地为BLOSUM62，其中空位存在罚分为11，空位延伸罚分为1。 

合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸测定。合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。 

氨基酸突变

序列还可具有氨基酸残基的缺失、***或置换，该缺失、***或置换产生了沉默改变和导致功能等价的物质。可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性作出有意的氨基酸置换，只要该物质的二级结合活性得以保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的含不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸。 

可例如根据下表进行保守置换。第二列同一区组中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可彼此置换： 

本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代都用来指将现有的氨基酸残基用另选的残基进行交换)，即对等置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置 换成另一类残基，或者涉及到加入非自然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。置换还可通过非天然氨基酸进行。 

变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间***的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ et al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371(Simon RJ等人，《美国国家科学院院刊》，1992年，第89卷第20期，第9367-9371页)和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134(Horwell DC，《生物技术趋势》，1995年，第13卷第4期，第132-134页)。 

核苷酸序列

供在本发明中使用的核苷酸序列或者编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，可在其中包含合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可通过本领域可用的任何方法修饰。可进行此类修饰以提高核苷酸序列的体内活性或寿命。 

本发明还涵盖与本文所讨论的序列互补的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列等等。 

不与本发明的序列100％同源但处于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体，例如来自不同种群的个体制备的DNA文库来获得。此外，可获得存在于植物细胞的其他病毒/细菌或细胞同源物，特别是细胞同源物，此类同源物及其片段通常将能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。此类序列可通过如下方法获得：探测从其他植物物种制备的cDNA文 库或基因组DNA文库，并且在中等至高严格性条件下用包含随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针探测此类文库。可应用类似的考虑来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。 

变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用这样一种引物，该引物设计用于靶向变体和同源物内编码本发明序列内的保守氨基酸序列的序列。保守序列可例如通过将来自数种变体/同源物的氨基酸序列进行比对来预测。序列比对可用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。 

简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置并将在比从已知序列用单序列引物克隆序列所用的严格性条件低的严格性条件下使用。 

作为另外一种选择，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中这可能是有用的。为了引入限制多肽识别位点，或者为了改变被多核苷酸所编码的多肽的性质或功能，可能需要其他的序列改变。 

本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、备选的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记有显示标记的探针)，或者可将该多核苷酸克隆进载体中。这种引物、探针和其他片段将长为至少15个，优选至少20个，例如至少25、30或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明的多核苷酸所涵盖。 

根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。 

通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该过程的技术是本领域容易获得的。 

较长的多核苷酸将通常用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这将涉及到制备与焦脱镁叶绿素酶序列的需要进行克隆的区域侧接的一对引物(例如约15至30个核苷酸的引物)，使引物与从植物细胞获得的mRNA或cDNA接触，在能引起所需要的区域的扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合 物来分离)和回收扩增的DNA。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。 

核酸构建体

在本发明的一个实施例中，该方法包括将编码重组酶的核酸构建体(例如，表达载体)引入宿主细胞中的步骤。因而，本发明还提供了一种核酸构建体(例如，真核表达载体)，其包含编码能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶的核酸序列，所述序列可操作地连接到引导编码序列在真核宿主细胞中的表达的一个或多个控制序列。 

所谓“真核表达载体”意指载体能够引导重组酶在真核宿主细胞，优选真菌宿主细胞中的表达。换句话讲，该载体通常含有合适的调节和/或控制序列，所述序列在真核(例如，真菌)细胞中是功能性的。 

例如，控制序列可以是适当的启动子序列，例如，由真核(例如，真菌)宿主细胞识别以用于编码酶的多核苷酸的表达的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录控制序列。 

该启动子可以是在包括突变的、截短的和杂合启动子的真核(例如，真菌)宿主细胞中具有转录活性的任何核苷酸序列，并且可从编码与宿主细胞同源的或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。 

用于引导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的例子为获自米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、镰孢霉(Fusarium venenatum)淀粉转葡糖苷酶(WO 00/56900)、镰孢霉Daria(WO 00/56900)、镰孢霉Quinn(WO 00/56900)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡萄糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内葡聚糖酶I、里氏木霉内葡聚糖酶II、里氏木霉内葡聚糖酶III、里氏木霉内葡聚糖酶IV、里氏木霉内葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的基因的启动子和NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动 子的杂合体)；以及其突变的、截短的和杂合启动子。在一个优选的实施例中，启动子来自里氏木霉cbh1基因。 

在酵母宿主中，可用的启动子可获自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。针对酵母宿主细胞的其他可用的启动子由Romanos et al.，1992，Yeast 8：423-488(Romanos等人，1992年，《酵母》，第8卷，第423-488页)描述。 

控制序列还可以是合适的转录终止子序列，即由真核(例如，真菌)宿主细胞识别以终止转录的序列。通常，终止子序列可操作地与编码多肽的核苷酸序列的3′端连接。在本发明中可使用任何在真核(例如，真菌)宿主细胞中为功能性的终止子。 

用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子获自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。在一个优选的实施例中，终止子来自里氏木霉cbh1基因。 

用于酵母宿主细胞的优选的终止子获自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。针对酵母宿主细胞的其他可用的终止子由Romanos et al.，1992，supra(Romanos等人，1992年，同上)描述。 

控制序列还可以是适合的前导序列，即对于宿主细胞的翻译而言重要的mRNA非翻译区。通常，前导序列可操作地与编码多肽的核苷酸序列的5′端连接。在本发明中可使用任何在真核(例如，真菌)细胞中为功能性的前导序列。 

用于丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列获自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸异构酶的基因。用于酵母宿主细胞的合适的前导序列获自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。 

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，即，可操作地连接到核苷酸序列的3′端的序列，并且当转录时，该序列作为信号由宿主细胞识别以将聚腺苷酸残基添加到转录的mRNA中。在本发明中可使用任何在真核(例如，真菌)细胞中是功能性的聚腺苷酸化序列。 

用于丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列获自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、以及黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。 

对于酵母宿主细胞的可用的聚腺苷酸化序列由Guo and Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990(Guo和Sherman，1995年，《分子细胞生物学》，第15卷，第5983-5990页)描述。 

控制序列还可以是编码位于多肽的氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区域。所得的多肽被称为酶原或多肽原(或在一些情况下称为酵素原)。多肽原通常不是活性的并且可通过前肽从多肽原的催化或自动催化裂解转化成成熟的活性多肽。 

前肽编码区域可获自酿酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶(WO 2005121333)、白色念珠菌(Candida albicans)脂肪酶B(CLB)或南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CLB′)的基因。 

表达载体通常引导重组酶的细胞内表达。因此这意味着当引入到真核宿主细胞中时，载体导致不靶向分泌的重组酶的细胞质翻译，例如，重组酶主要积聚在细胞内(而不是被分泌或变成膜结合)。在一些实施例中，例如，由于酶在整个细胞膜的扩散或由于局部细胞裂解，一些重组酶可存在于细胞之外。然而，“细胞内表达”通常是指被编码的酶不靶向经由细胞固有的分泌通道而进行细胞外分泌的实施例。 

因而，表达载体通常不包含信号肽编码区域，使得表达出的被编码重组酶没有信号肽。信号肽为连接到多肽的氨基末端的氨基酸序列，该序列将被编码的多肽引导至细胞分泌通道中。因而根据本发明的实施例，在表达载体中信号肽编码区域的缺失引起重组酶的细胞内表达。 

针对酶的编码序列的5′端可固有地包含信号肽编码区域，该信号肽编码区域在翻译阅读框中自然地与编码酶的编码区域的片段相连。在一些实施例中，在***到表达载体之前，可将信号肽编码区域从自然序列删除。 

在一些实施例中，表达载体还包括允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达的调节序列。调节***的例子为促使基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。在酵母中，可使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调节序列。 

调节序列的其他例子为允许基因扩增的那些。在真核***中，这些包括在存在有氨甲蝶呤的情况下被扩增的二氢叶酸还原酶基因和用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码酶的核苷酸序列可操作地与调节序列连接。 

通常，表达载体包括编码酶的序列、启动子以及转录和翻译终止信号。上述的多种核酸和控制序列可接合在一起以生成重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点***或置换编码酶的核苷酸序列。在生成表达载体期间，编码序列位于载体中使得编码序列可操作地与适当的控制序列连接以用于表达。 

重组表达载体可以是能够便利地经受重组DNA过程并且能够引起核苷酸序列表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将通常取决于载体与其中引入了载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合的环状质粒。 

载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外的实体而存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如，质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。该载体可含有任何用于确保自体复制的元件。 

或者，该载体可以是当被引入到宿主细胞中时整合到基因组中并且与其被整合到的染色体一起被复制的载体。此外，可使用一起含有被引入到宿主细胞的基因组或转座子中的全部DNA的单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒。 

本发明的载体优选含有一个或多个可选标记物，所述标记物允许容易地选择转化细胞。可选标记物为一种基因，其产物提供了杀生体抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷体原养型等等。 

用于酵母宿主细胞的合适的标记物为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选标记物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰基-转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)以及其等同物。 

优选用于曲霉菌属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。 

本发明的载体可含有允许载体整合到宿主细胞基因组中或者在细胞中与基因组无关的载体自动复制的元件。为了整合到宿主细胞基因组中，该载体可取决于编码酶的多核苷酸序列或通过同源或非同源重组整合到基因组中的载体的任何其他元件。 

或者，该载体可含有另外的核苷酸序列，用于通过同源重组到宿主细胞的基因组中来引导在染色体中的精确位置处整合。为了增加在精确位置处的整合的可能性，整合元件应优选包含足量的核酸，例如，100至10000个碱基对、优选400至10000个碱基对、并且最优选800至10000个碱基对，其具有与相应的目标序列高度的同一性以提高同源重组的概率。 

整合元件可以是任何序列，所述序列与在真核(例如，真菌)宿主细胞的基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。 

为了自动复制，载体还可包括使得载体在所考虑的宿主细胞中自动复制的复制起点。该复制起点可以是介导在细胞中起作用的自动复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”在本文中定义为使得质粒或载体在体内复制的核苷酸序列。 

用于酵母宿主细胞的复制起点的例子为2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。用于丝状真菌细 胞的复制起点的例子为AMA1和ANS1(Gems et al.，1991，Gene 98：61-67(Gems等人，1991年，《基因》，第98卷，第61-67页)；Cullen et al.，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175(Cullen等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9163-9175页)；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883中所公开的方法而实现。 

编码酶的序列的不止一个拷贝可***宿主细胞中以增加基因产物的产量。可通过将至少一个额外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过将可扩增的可选标记基因包含到多核苷酸内而获得多核苷酸拷贝数的增加，其中可通过在存在适当可选试剂的情况下培养细胞而选择含有可选标记基因的扩增拷贝的细胞，从而选择额外的多核苷酸拷贝。 

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是为本领域的技术人员所熟知的。 

真核宿主细胞

在本发明的实施例中，真核宿主细胞使用编码重组酶的核苷酸序列转化，例如，如上所述。通常，将包含编码酶的序列的载体引入到宿主细胞中使得载体保持为染色体组成部分或如先前所述的自体复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何子代，其由于在复制期间发生的突变而不与亲本细胞相同。 

真核细胞优选选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。最优选地，真核宿主细胞来自真菌，即宿主细胞为真菌细胞。 

叶绿素酶在植物中自然地表达，但是在植物中的叶绿素酶的表达水平很低并且在生长期间受到严格调控。植物细胞作为用于产生重组叶绿素酶的宿主是次优选的，因为该酶涉及褪绿和衰老。 

本文所用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB  International，University Press，Cambridge，UK(Hawksworth等人，《安-贝氏菌物词典》，第8版，1995年，国际应用生物科学中心，英国剑桥大学出版社)中所定义)以及卵菌门(如Hawksworth et al.，1995，supra，page 171(Hawksworth等人，1995年，同 上，第171页)中所引用)以及所有的有丝***孢子真菌(Hawksworth et al.，1995，supra(Hawksworth等人，1995年，同上))。 

在一个实施例中，真菌宿主细胞为酵母细胞。酵母包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。酵母可如在《酵母的生物学和活性》(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980(Skinner，F.A.、Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编辑，社会应用细菌学，研讨会系列9，1980年)中所定义。例如，宿主细胞可选自假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)。更具体地讲，酵母宿主细胞可以是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。 

在另一个实施例中，真菌宿主细胞为丝状真菌细胞。丝状真菌包括真菌门和卵菌门亚群的所有丝状形式(如Hawksworth et al.，1995，supra(Hawksworth等人，1995年，同上)所定义)。丝状真菌通常特征在于菌丝壁由甲壳质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其他复杂的多糖组成。在一些实施例中，宿主细胞来自选自支顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filobasidium)、镰刀菌属、腐质霉属(Humicola)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、草 根霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)以及木霉属的属。 

在一些实施例中，宿主细胞选自泡盛曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、杆孢状镰孢菌(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢菌(Fusarium cerealis)、克鲁克威尔镰孢菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢菌(Fusarium negundi)、尖孢镰刀菌、多枝镰孢菌(Fusarium reticulatum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢菌(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、干腐病菌(Fusarium sulphureum)、念珠镰孢菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Chrysosporium lucknowense、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝菌、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉侧菌(Phlebia radiata)、杏鲍菇菌(Pleurotus eryngii)、斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。 

最优选地，宿主细胞来自里氏木霉。 

真菌细胞可通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁自身以已知的方式再生的方法而转化。或者，真菌可通过电穿孔或使用孢子的基因枪转化法而转化。 

用于曲霉菌属和木霉属宿主细胞转化的合适的方法在EP 238 023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474(Yelton等人，1984年，《美国国家科学院论文集》，第81卷，第1470-1474页)中有所描述。用于转化镰刀菌种的合适的方法在Malardier et al.，1989，Gene 78：147-156(Malardier等人，1989年，《基因》，第78卷，第147-156页)和WO 96/00787中有所描述。可使用由Becker and Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York(Becker和Guarente(Abelson，J.N.和Simon，M.I.编辑)，《酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法》，第194卷，第182-187页，纽约学术出版社公司)；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153：163(Ito等人，1983年，《细菌学杂志》，第153卷，第163页)；以及Hinnen et al.，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920(Hinnen等人，1978年，《美国国家科学院论文集》，第75卷，第1920页)中所述的方法转化酵母。 

生产方法

本发明方法可用于生产重组酶。该方法可包括以下步骤(a)在有益于生产酶的条件下培养真核宿主细胞；和(b)回收酶。 

在本发明的生产方法中，使用本领域熟知的方法在适于生产多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可在适当的培养基中和在允许多肽表达和/或分离的条件下，在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养和小规模或大规模发酵(包括连续式、间歇式、分批补料或固态发酵)培养细胞。 

使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包括碳和氮源以及无机盐。合适的培养基可得自商业供应商或可根据公布的组合物(例如，在美国模式培养物保藏所的目录中)制备。 

细胞裂解和细胞内叶绿素酶的回收

因为酶在宿主细胞中的细胞内制得，所以本发明的方法通常包括裂解宿主细胞和从裂解物回收重组酶的步骤。可使用诸如酶解、物理破裂(例如，珠子击打和搅拌)、声波降解法、均化和/或冻结/融化循环的方法执行 该步骤。例如在US 4,601,986、US 4,299,858和US 3,816,260中公开了用于细胞裂解的多种方法，包括热处理和酶法。 

在一个优选的实施例中，使用洗涤剂(例如，非离子型表面活性剂)裂解宿主细胞(例如，丝状真菌细胞，诸如木霉属和曲霉菌属菌丝)。例如，可使用商购的试剂或试剂盒，例如用于酵母细胞的CelLytic^TM Y细胞裂解试剂(得自密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)目录号C4482)执行细胞裂解步骤。 

非离子型表面活性剂包括羧酸酯，例如甘油酯和聚氧乙烯酯；无水山梨醇酯，例如，乙氧基化的无水山梨醇酯；聚氧乙烯表面活性剂，例如，醇乙氧基化物和烷基酚乙氧基化物；天然乙氧基化脂肪、油和蜡；脂肪酸的乙二醇酯；烷基多聚糖苷；羧酸酰胺类，例如，二乙醇胺缩合物、单烷醇胺缩合物，其包括椰子、月桂酸、油酸和硬脂酸单乙醇酰胺和单异丙醇酰胺、聚氧乙烯脂肪酸酰胺；脂肪酸葡糖酰胺；以及聚氧化烯嵌段共聚物。在一个优选的实施例中，非离子型表面活性剂包含十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)。 

在另一个实施例中，可使用有机酸处理杀灭和/或随后裂解所述宿主细胞。合适的有机酸包括例如苯甲酸、山梨酸、乙酸、柠檬酸、丙酸和甲酸。在一些实施例中，还可使用无机酸，例如，硫酸。在一个实施例中，可使用上述一种或多种酸以将包含宿主细胞的培养基的pH降低至例如小于pH 5，例如pH 3至5。通常，宿主细胞可在减小的pH下并且在20℃至40℃(例如约30℃)的温度下暴露于有机酸12小时至5天，例如约24小时至约3天。在一些实施例中，用有机酸处理导致细胞杀灭，并且可使用后续步骤(例如，热处理步骤)以形成细胞裂解。使用有机酸无需细胞裂解即可杀灭细胞的方法在例如结合分泌性蛋白的US 5,801,034中有所描述。如果细胞随后被裂解，则在本文中可使用类似方法回收细胞内的酶。 

可将洗涤剂或有机酸处理的使用与所选的pH条件、温度、缓冲组合物和离子强度相结合以有助于细胞裂解。技术人员可选择合适的条件，其可任选地与均化相结合以进行大规模产品回收。洗涤剂可有利地用于提取重组叶绿素酶并且可被施用于全细胞培养液。当结合热处理使用时，洗涤剂导致细胞裂解以及叶绿素酶的选择性回收，大多数的叶绿素酶为热稳定性酶。叶绿素酶的选择性释放对于提高产品经济效益和下游操作至关重要。 

可使用本领域已知的方法回收所得的酶。例如，可使用常规的方法，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀从营养培养基回收酶。 

可通过本领域已知的多种方法，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和层析、疏水色谱、层析聚焦和体积排阻色谱)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差别溶解法(例如，硫酸铵沉淀法)、SDS-PAGE、或提取法(参见，例如Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989(蛋白质纯化，J.-C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH出版社，纽约，1989年)纯化所述酶。 

可使用在本领域中已知的针对所述酶而言特定的方法检测该酶。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，上述的酶检测分析可用于测定如本文中所述的多肽的活性。 

现在将仅以举例的方式，参照如下非限制性实施例来描述本发明。 

实例

实例1：与已知的来自植物的叶绿素酶具有序列同一性/相似性的叶绿素酶基因的鉴定

进行实验以鉴定编码在公布的序列数据库中的已知的和推定的叶绿素酶的基因。几个功能化表征的叶绿素酶的基因和推导的氨基酸序列是已知的。这些已知的叶绿素酶的一些已单独地在大肠杆菌(E.coli)或作为融合蛋白(硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白融合)中表达。来自诸如拟南芥(AtCLH1，AtCLH2)、甘蓝(CLH1，CHL2，CHL3)、不同的柑橘类(Citrus)物种、银杏、普通小麦、藜的不同植物的叶绿素酶已被分离、在大肠杆菌中表达和生化表征。已知的叶绿素酶序列用作在关于国家生物技术信息中心(NCBI)的非冗余(nr)蛋白数据库的BLAST分析中的查询。从不同的植物中鉴定出多个推定的非典型叶绿素酶。 

表1示出了来自拟南芥(AtCLH2)的已知的叶绿素酶与不同的已知的和推定的植物叶绿素酶的氨基酸序列同一性。观察到36％至高达86％的序列同一性。AtCLH2与来自琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)(登录号D7MNK2)(未示出)的另一种叶绿素酶具有95％的序列同一性。然而，来自甘蓝CLH2(Q8GTM3)的叶绿素酶示出了高的序列同一性(86％)，而另 一种已知的甘蓝CLH1(Q8GTM4)与拟南芥CLH2具有44％的序列同一性。不同的已知的和推定的植物叶绿素酶之间存在广泛的序列同一性/相似性。 

在真菌表达宿主中表达的不同的植物叶绿素酶的比对示出了活性位点残基周围的保守区，所述活性位点残基被确定为催化三元体：丝氨酸(SER)、天冬氨酸(ASP)和组氨酸(HIS)。活性位点残基已在此前由BoCLH2的定点诱变(J Agric Food Chem.2010 Aug 11；58(15)：8651-7(《农业与食品化学》，2010年8月11日，第58卷，第15期，第8651-8657页)确定。两个已知的推定的非典型叶绿素酶的序列比对示出了活性位点残基周围的保守区的存在。三个标记基序：GHSXGG(SEQ ID NO：36)、DPVXG(SEQ ID NO：37)、YGHXD(SEQ ID NO：38)可用于通过搜索测序的基因组数据库、筛选元基因组文库或通过将这些氨基酸用作PCR中的简并寡核苷酸引物/探针以确定存在于含有叶绿素的不同生物体(例如植物、藻类和含有叶绿素的细菌)中的新基因而确定叶绿素酶超家族的新成员。GHSXGG基序包含作为脂肪分解酶(脂肪酶)通用的基序的活性位点丝氨酸残基，但是含有活性位点天冬氨酸和组氨酸的2个其他的基序DPVXG、YGHXD是叶绿素酶独有的。这3个标记基序当结合时可用作分析工具以确定来自植物、藻类和细菌的新的叶绿素酶候选物。 

实例2：来自植物(表1)和里氏木霉中的藻类的叶绿素酶的克隆和表达

可通过将含有编码植物(表2)和藻类叶绿素酶的每一个的合成基因的 

入门载体pDONR 221(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen，Corp.Carlsbad，CA，USA))与里氏木霉

目的载体pTrex3G(美国专利No.7,413,879)重组而制得用于生产来自不同植物和真菌(里氏木霉)中的藻类(衣藻属)的叶绿素酶的表达载体。目的载体pTrex3g基于大肠杆菌载体pSL1180(美国新泽西州皮斯卡特维的法玛西亚公司(Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ，USA))，该大肠杆菌载体pSL1180为具有延伸的多克隆位点的pUC118基于噬菌粒的载体(Brosius，J.(1989)，DNA 8：759(Brosius，J.，1989年，《DNA》，第8卷，第759页)，所述多克隆位点含有64个六聚物限制酶识别序列。该质粒被设计为Gateway目的载体(Hartley et al(2000)Genome Research 10：1788-95(Hartley等人，2000年，基因组研究，第10卷，第1788-1795页))以通过使用在里氏木霉cbh1基因的启动子区和终止子区之间的所需的开放阅读框的Gateway技术 (英杰公司(Invitrogen))允许***。其还含有构巢曲霉amdS基因以在里氏木霉的转化中用作选择性标记物。pTrex3g的尺寸为10.3kb并且***到pSL1180的多接头区域为以下DNA片段：a)来自里氏木霉cbh1基因的启动子区的2.2bp DNA片段；b)从英杰公司(Invitrogen)获得的1.7kb Gateway阅读框A盒，其在氯霉素抗性基因(CmR)和ccdB基因旁侧的任一端包含attR1和attR2重组位点；c)来自里氏木霉cbh1基因的终止子区的336bp DNA片段；以及d)含有具有其天然启动子和终止子区的构巢曲霉amdS基因的2.7kb DNA片段。 

表2.来自不同植物的叶绿素酶和数据库登录号。 

叶绿素酶基因源	登录号
		拟南芥At2CHL	Q9M7I7
甘蓝	Q8GTM3
		蓖麻	XP_002517075
毛果杨	B9HUR3
		银杏	Q7Y0K5
葡萄	XP002273926
		毛竹	FP092915
高粱	C5YN66
		橹豆	BAF43704
发财树	C1JZ62
		普通小麦	BT009214
甘蓝	Q8GTM4
		高粱	C5X5Z9
甜橙	Q9MV14
		玉米(玉蜀黍)	C0PCY5
藜	Q9LE89
		北美云杉	ACN40275

来自小麦和藻类的分泌形式的叶绿素酶

用于从小麦和衣藻分泌叶绿素酶的构建体通过将10个来自已知的木霉属分泌蛋白组的分泌蛋白的不同信号肽序列在用于叶绿素酶的细胞内沉积/分泌的叶绿素酶基因前面融合而形成。使用以下编码信号肽的序列，如表3所示： 

表3

使用叶绿素酶基因构建体转化真菌

通过电穿孔或使用孢子的基因枪或通过制备原生质体而将叶绿素酶基因构建体引入到生产宿主中，例如酵母(巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))和丝状真菌(曲霉菌属和木霉属)。 

使用基因枪转化(使用PDS-1000氦***(BioRad，目录号165-02257)的粒子轰击)方法将独立地含有所关注的叶绿素酶基因的每一个的表达载体转化成来自RL-P37(IA52)并且具有4个基因缺失(cbh1，cbh2，eg1，eg2)的里氏木霉宿主菌株。使用基因枪转化法的转化按如下进行： 

制备来自里氏木霉宿主菌株的孢子(大约5×10⁸个孢子/ml)的悬浮液。将100-200μL的孢子悬浮液涂到含有基本培养基乙酰胺的平板的中心。使孢子悬浮液在平板的表面上干燥。转化按照生产商的规程进行。简而言之，在微量离心管中将1mL的乙醇添加到60mg的M10钨粒子中，并且使悬浮液静置15秒。在15000rpm下使粒子离心15秒。除去乙醇并用无菌H2O洗涤粒子三次，然后添加1mL的50％(v/v)无菌甘油。将25μL的钨粒子悬浮液置于微量离心管中。在连续涡旋时，添加以下物质：5μL(100-200ng/μL)的质粒DNA、25μL的2.5M CaCl2以及10μL的0.1M亚精胺。将粒子离心3秒。移除上清液，用200μL的100％乙醇洗涤粒子并离心3秒。移除上清液，将24μL的100％乙醇添加到粒子中并且混合。移除等分的8μL的粒子并且置于保持在干燥器中的宏载体盘的中心上。一旦钨/DNA溶液已干燥则将宏载体盘连同带有孢子的基本培养基乙酰胺板置于轰击室中，根据生产商的规程进行轰击过程。在用钨/DNA粒子轰击接种的孢子后，将板在30℃下温育。 

叶绿素酶的表达和筛选

分选转化体并将其单独转移至乙酰胺琼脂板。在基本培养基乙酰胺板上生长5天后，将呈现稳定形态的转化体接种到10ml的YEG介质中，在28℃下摇动，生长2天。在生长2天后，将5mls的培养物用于接种到含有50mls的葡萄糖/槐糖限定培养基的250ml的烧瓶。葡萄糖/槐糖限定培养基(每升)包含5g(NH4)2SO4；33g PIPPS缓冲液；9g酪蛋白氨基酸；4.5gKH2PO4；1g CaCl2(无水)、1g MgSO4°7H2O；用50％NaOH调节至pH5.50，然后用足够的超纯水定容至966.5mL。在灭菌后，添加以下物质：5mL Mazu、26mL 60％葡萄糖/槐糖，以及2.5mL 400X里氏木霉痕量金属。 

将培养物在28℃下摇动并且温育4天。通过离心收集来自这些培养物的细胞和上清液。裂解细胞并且检测分析细胞蛋白提取物或在培养上清液中叶绿素酶的活性。蛋白提取物通过SDS-Page电泳和由免疫印迹确定的叶绿素酶特定蛋白带表征。小麦叶绿素酶抗体用于筛选产生不同叶绿素酶的转化体。抗体与测试的所有不同植物叶绿素酶交叉反应。 

重组叶绿素酶的大规模生产

为了大规模生产蛋白，将里氏木霉转化体在WO 2004/035070所述的发酵罐中培养。将来自罐的超滤浓缩液(UFC)或硫酸铵纯化的蛋白样品用于生化检测分析。 

具体地讲，使容纳有小麦叶绿素酶表达构建体的木霉属转化体I-7在标准的限定木霉属培养基中生长。将转化体在烧瓶中于34℃和pH 3.5下摇动并且预生长，直到去除葡萄糖。然后，开始葡萄糖/槐糖进料，温度从34℃变化至28℃，以及pH值从3.5变化至4。葡萄糖/槐糖用作cbh1启动子的诱导物。通过调节搅拌、压力和气流使DO％保持恒定。根据生产速率运行200小时。 

叶绿素酶检测分析

将脱镁叶绿素用作底物以测定所表达的重组叶绿素酶的活性。可如在EP10159327.5中所述进行检测分析。该检测分析取决于在稀释缓冲液中的脱镁叶绿素形成二聚体的情况，该二聚体抑制脱镁叶绿素的荧光信号。配制稀释缓冲液使得产生的脱镁叶绿酸不形成二聚体，并因而可通过荧光光谱法检测。根据标准酶定义活性单位PHEU(脱镁叶绿素酶单位)。 

结果

下文的表4示出了容纳有小麦叶绿素酶细胞内基因构建体(SMMI1-SMMI12)的重组菌株和含有融合至信号肽的叶绿素酶基因(SMMT2、T4和T6)的转化体的叶绿素酶活性测量。 

表4 

在摇瓶培养物中表达最高量的重组小麦叶绿素酶的转化木霉属菌株经受14升规模的大规模发酵150小时。该菌株容纳有小麦叶绿素酶细胞内基因构建体。离心全细胞培养液，通过SDS-PAGE分析分别来自细胞团块和上清液的细胞内和细胞外蛋白级分。 

来自14升规模发酵的培养上清液的无细胞提取物表明重组叶绿素酶同时存在于细胞外和细胞内。小麦叶绿素酶是积聚在真菌细胞外的最丰富的蛋白(参见图5)。在培养基中的叶绿素酶的细胞外积聚可通过以下可能性解释：1.叶绿素酶蛋白可穿过细胞质膜和细胞壁，2.随着菌丝的老化，细胞裂解的发生更易于导致细胞破损。使用celLytic缓冲液裂解细胞团块以检测叶绿素酶细胞内积聚所得的细胞内蛋白级分。如图6所示，SDS-PAGE表明了34kDa小麦叶绿素酶作为在真菌细胞内表达的主要蛋白的存在。 

上面说明书中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和精神的条件下对所描述的本发明方法和***作出多种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施例进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施例。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的所述模式的多种修改旨在处于如下权利要求书的范围内。 

Claims (16)

1.一种生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法，其包括所述重组酶在真核宿主细胞中的细胞内表达的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞为真菌细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞来自木霉属(Trichoderma)。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶为叶绿素酶。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶包括选自GHSXGG(SEQ ID NO：36)、DPVXG(SEQ ID NO：37)和YGHXD(SEQ ID NO：38)的一个或多个氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甘蓝(Brassica oleracea)、蓖麻(Ricinuscommunis)、银杏(Ginkgo biloba)、毛果杨(Populus trichocarpa)、葡萄(Vitis vinifera)、毛竹(Phyllostachys heterocycla)、高粱(Sorghumbicolor)、橹豆(Glycine max)、发财树(Pachira macrocarpa)、普通小麦(Triticum aestivum)、甜橙(Citrus sinensis)、玉米(Zea mays)、藜(Chenopodium album)、北美云杉(Picea sitchensis)或莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶包含如在SEQ ID NO：1至18的任意一个中所定义的多肽序列或其功能性片段或变体，所述其功能性片段或变体在至少50个氨基酸残基上与SEQID NO：1至18的任意一个具有至少75％的序列同一性。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶由在SEQID NO：19至35的任意一个中所定义的核酸序列或其功能性片段或变体编码，所述其功能性片段或变体在至少50个核苷酸残基上与SEQID NO：19至35的任意一个具有至少75％的序列同一性。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括裂解所述宿主细胞和从所述裂解物回收所述重组酶。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述宿主细胞暴露于洗涤剂、有机酸、均化和/或热处理。

11.一种真核表达载体，包含编码能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶的核酸序列，所述序列可操作地连接到适于引导所述酶在真核宿主细胞中的细胞内表达的一个或多个控制序列。

12.根据权利要求10所述的表达载体，包含如在SEQ ID NO：19至35的任意一个中所定义的核酸序列或其功能性片段或变体，所述其功能性片段或变体在至少50个核苷酸残基上与SEQ ID NO：19至35的任意一个具有至少75％的序列同一性。

13.一种真核宿主细胞，包含如权利要求10或权利要求11所述的表达载体。

14.根据权利要求12所述的宿主细胞，其为真菌细胞。

15.一种能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶，其通过如权利要求1至9中任一项所述的方法获得。

16.根据权利要求14所述的重组酶，其中所述重组酶包含如在SEQ IDNO：1至18的任意一个中所定义的多肽序列或其功能性片段或变体，所述其功能性片段或变体在至少50个氨基酸残基上与SEQ ID NO：1至18的任意一个具有至少75％的序列同一性。

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