CN103788184A - 含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用，含有2个亮氨酸重复单元抗菌肽其氨基酸序列如SEQ No.1所示。本发明首先根据亮氨酸重复单元的基序和抗菌肽的氨基酸组成特点，得到亮氨酸重复单元的氨基酸序列，并将重复单元串联，以提高其肽链长度和净电荷数目；然后使用多肽合成仪，进行固相合成法合成多肽粗品；最后将合成多肽使用高效液相色谱进行纯化，并利用电喷雾质谱法进行鉴定。本发明的有益效果：(1)该多肽是根据生物体广泛存在的亮氨酸重复单元为基础而设计得到，具有广谱抗菌活性；(2)该多肽由22个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。

Description

含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用。

背景技术

抗生素的应用提高了人类健康和动物生产效率。但耐药性菌株、药物残留等问题也随之出现，一直困扰着人类。由于产生药物残留及细菌耐药性问题，因此亟须发现新型抗菌制剂。抗菌多肽作为人体重要免疫组成部分具有重大的发展潜力，是科研工作者研究的热点。一般认为，抗菌肽是通过物理吸附等作用来破坏细菌的细胞膜，从而杀死细菌，因此细菌产生耐药性的几率较小。抗菌肽一般是由10至50个氨基酸所组成，净电荷一般在+2～+9范围内，疏水性氨基酸的比例可以达到50％或更多。

抗菌肽的上述结构和组成特征与许多蛋白质组成基序相似。亮氨酸重复单元为大家所广泛周知，因其富含疏水性残基亮氨酸而得名。亮氨酸重复单元广泛存在于包括动物、植物和微生物在内的超过60000种生物体蛋白质中。其中一种重要的亮氨酸重复单元的基序为：LxxLxLxxNxL，包含这些基序的蛋白质可以形成螺旋、折叠等多样的结构形式。因此，本发明以此基序作为基本单位，通过合成由单个亮氨酸重复单元及将2个亮氨酸重复单元串联的抗菌肽，从而设计得到全新的抗菌肽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用，本发明将具有亮氨酸重复单元的抗菌肽进行串联，从而得到全新的抗菌肽，以提高其抗菌效果。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

1、一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，序列如SEQ No.1所示。

2、如上所述的一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，制备方法如下：

(1)根据亮氨酸重复单元的基序LxxLxLxxNxL，将疏水性残基和正电荷残基充实到基序中去，从而得到亮氨酸重复单元的氨基酸序列(Leu)₁，序列如SEQNo.2所示；将这一重复单元串联，以提高其肽链长度和净电荷数目，得到含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽(Leu)₂，序列如SEQ No.1所示；

(2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成这两条多肽粗品；

(3)将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备。

3、如上所述的一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，采用美国临床实验室标准化研究所推荐的测定最小抑菌浓度(MIC)的方法，(Leu)₂的最小抑菌浓度为2-4μM，显示出很强的抑制革兰氏阴性和阳性菌生长的活性。从而为实现本发明目的更进一步提供含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。

本发明的有益效果：(1)该多肽是根据生物体广泛存在的亮氨酸重复单元为基础而设计得到，具有广谱抗菌活性；(2)该多肽由22个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。

附图说明

图1为抗菌肽(Leu)₁的质谱图。

图2为抗菌肽(Leu)₂的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：亮氨酸重复单元抗菌肽序列的设计

已知亮氨酸重复单元的基序为LxxLxLxxNxL，其中L为亮氨酸，x为任意氨基酸。抗菌肽的氨基酸组成特点主要为疏水性和净正电荷。因此，我们将疏水性残基和正电荷残基充实到基序中去，从而得到亮氨酸重复单元的氨基酸序列LeuArgArgLeuTrpLeuArgAlaAsnArgLeu。同时还将这一重复单元串联，以提高其肽链长度和净电荷数目，得到两条抗菌肽序列。如表1所示。

表1抗菌肽的氨基酸序列和分子量

实施例2：亮氨酸重复单元抗菌肽序列的合成

将表1所示两条多肽使用多肽合成仪合成，选用固相有机合成，采用Fmoc保护合成法，合成方向从C端到N端逐一进行，具体步骤如下：

(1)选取已经和C端第一个氨基酸连接的Wang树脂，即Fmoc-A(trt)-Wang(9-芴甲氧羧基-三甲基-A，其中A为C端第一个氨基酸)，使用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡15min左右以除去杂质；用含有20％哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，反应20min，洗涤树脂直至完全。用DMF清洗掉哌啶，剩余的固体悬浮物即是脱保护的A-Wang。用印三酮检测剂检查A-Wang脱保护的质量。

(2)将Fmoc-B(trt)-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-B，B为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)与上述得到的脱保护的Wang树脂进行缩合反应；然后再脱去Fmoc基团。按照这个程序依次从C端到N端逐个延伸，直至将整个肽链合成完毕，当最后一个氨基酸脱保护后，用DMF洗涤8次，再用乙醇和二氯甲烷(DCM)交叉洗涤8次。将三氟乙酸(TFA)∶三异丙基氯硅烷(TIS)∶水=95∶2.5∶2.5(体积比)进行混合，配制成为切割试剂与上述得到的多肽20℃下反应2h，把多肽从树脂上切割下来。旋转蒸发仪蒸发TFA，再加入10倍左右体积的预冷无水***沉淀多肽3h，析出白色粉末状固体。真空干燥，得到粗品多肽。

(3)将上述粗品多肽使用90％乙腈水溶液溶解，使用制备色谱柱进行纯化，分析型色谱柱检测纯度。半制备型高效液相色谱仪为Waters Delta Prep4000，制备色谱柱为Waters X-Bridge C_i8、5μm反相柱。洗脱液A为含有0.1％TFA的水溶液，B为含有0.1％TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm，洗脱方式为30％B～65％B的线性浓度梯度洗脱，流速为30mL／min。收集纯度高于95％的馏分，并冷冻干燥。分析型高效液相色谱仪为Agilent1100，分析型色谱柱为SepaxGP-C₁₈反相柱(4.6mm×150mm，5μm)，洗脱液A液为0.1％TFA的水溶液，B液为含0.1％TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。洗脱方式为50％B～75％B的线性浓度梯度洗脱，流速为1.0mL／min。

(4)多肽的质谱鉴定：将上述得到的多肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量与理论分子量一致。如图1和图2所示。使用高效液相色谱进行纯化，使得抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3：抗菌肽抗菌活性的测定

采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的测定最小抑菌浓度(MIC)的方法，同时针对抗菌肽的阳离子性的特征，进行了相应的改进。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个／mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含抗菌肽肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表2所示。从表2中可以看出，抗菌肽(Leu)₁的最小抑菌浓度为128μM或者大于128μM，没有或者显示很弱的抑菌活性；而(Leu)₂的最小抑菌浓度为2-4μM，显示出很强的抑制革兰氏阴性和阳性菌生长的活性。

表2抗菌肽的抑菌活性

Claims (3)

1.一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，其特征在于：序列如SEQ No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，其特征在于，制备方法如下：

(1)根据亮氨酸重复单元的基序LxxLxLxxNxL，将疏水性残基和正电荷残基充实到基序中去，从而得到亮氨酸重复单元的氨基酸序列(Leu)₁，序列如SEQNo.2所示；将这一重复单元串联，以提高其肽链长度和净电荷数目，得到含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽(Leu)₂，序列如SEQ No.1所示；

(2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成这两条多肽粗品；

(3)将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备。

3.一种如权利要求1所述的一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽的应用，其特征在于：在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。

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