CN103923189A - 一种猪源抗菌肽的衍生肽ir2及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种猪源抗菌肽的衍生肽IR2及其制备方法和应用。猪源抗菌肽的衍生肽IR2的序列如SEQ ID No.1所示。本发明采用定点氨基酸片段截取和二元氨基酸序列叠加的方法，截取猪源PG-1转角部位6个氨基酸片段，并将带电荷氨基酸精氨酸和疏水性氨基酸异亮氨酸作为重复二元序列单元对称循环排列于该转角的两侧，获得IR1和IR2抗菌肽。IR2的抑菌活性强于IR1。IR2的治疗指数高达43.2，是猪源抗菌肽PG-1的216倍。通过该方法，在提高抗菌肽杀菌活性的情况下，大大降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，提高了其成为抗生素替代物的发展潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪源抗菌肽的衍生肽IR2及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是存在于生物体天然免疫防御***中的一类小分子多肽，参与机体的免疫防御功能，是机体抵御病原微生物侵袭的第一道屏障。自从1972年Boman等在惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)中第一次发现具有杀菌作用的多肽物质，并命名为天蚕素以来，人们相继从多种生物中分离鉴定出具有抑菌活性的多肽，并统称为抗菌肽。迄今为止，美国Nebraska大学医学中心建立的抗菌肽数据库(APD：the Antimicrobial Peptide Database)中收录的抗菌肽已经超过2000种，并不断有新的抗菌肽被补充进去。抗菌肽通常由12-50个氨基酸残基组成，分子量小于10kDa，大多数抗菌肽含有带正电荷的氨基酸，具有两亲性和阳离子性，对多种细菌、真菌、病毒、寄生虫甚至是癌细胞都有抑制作用，而且对机体自身的毒性非常低，极强的稳定性有利于大规模工业化生产。抗菌肽表现出很强的抗菌活性，尤其是对抗生素耐药菌株的抑制作用，使其成为现在抗生素替代产品研究中的热点。而且，抗菌肽的抑菌机制与抗生素不同，细菌不易产生耐药性，而且在动物体内无残留，对环境无污染，符合畜产品安全生产的需要，适合在饲料生产过程中使用，具有作为新一代绿色饲料添加剂的潜质。目前，对抗菌肽的开发与应用已经在畜牧生产和医药卫生领域广泛开展。
众所周知，抗生素的应用在带给人们极大利益的同时，它的滥用也给人类健康带来了越来越大的危害。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，而且，致病菌的种类也在不断增加。寻找全新类型的抗菌物是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽因为具有抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等特点，而被认为在医药、食品及畜牧业等领域有着广阔的应用前景。但与传统抗生素相比，天然抗菌肽的抗菌活性还不够理想、细胞毒性较高。因此，全新设计抗菌肽或分子改造已有天然抗菌肽是创造高活力抗菌肽的有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种衍生自猪源Protegrin-1的抗菌肽IR2及其制备方法和应用；该抗菌肽活性较高而细胞毒性相对较低。
本发明的目的通过如下技术实现：
1、一种猪源抗菌肽的衍生肽IR2，序列如SEQ ID No.1所示。
2、如上所述的一种猪源抗菌肽的衍生肽IR2，制备方法如下：
(1)以猪源抗菌肽PG-1序列中的β-转角部位氨基酸序列CRRRFC为基础，选用带电荷的精氨酸R和疏水性氨基酸I来延长PG-1转角部位的两端片层，设计得到了IR系列衍生肽：(IR)nH(RI)n-NH2，n＝1，2；H为PG-1的β-转角部位氨基酸序列CRRRFC，当n＝1时，衍生肽命名为IR1，序列如SEQ No.2所示；当n＝2时，衍生肽命名为IR2，序列如SEQ No.1所示；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到两条多肽；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备。
3、如上所述的一种猪源抗菌肽的衍生肽IR2的应用，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现IR2不但对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌，枯草芽孢杆菌、粪链球菌八种菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。综上所述，IR2是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
附图说明
图1为抗菌肽IR1的质谱图；
图2为抗菌肽IR2的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
抗菌肽的设计
猪源抗菌肽PG-1的氨基酸序列为：
Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val Gly Arg-NH2
1 5 10 15 18
通过截取PG-1的β-转角部位氨基酸序列CRRRFC(8-13氨基酸)，选用带电荷的精氨酸R和疏水性氨基酸I来延长PG-1转角部位的两端片层。通过截取PG-1β-转角部位氨基酸序列，使该转角两端分别连接IR或RI，设计得到了IR系列肽：(IR)nH(RI)n-NH2，(n＝1，2；H为PG-1的β-转角部位氨基酸序列CRRRFC)，当n＝1时，衍生肽命名为IR1；当n＝2时，衍生肽命名为IR2。衍生肽的氨基酸序列如表1所示。
表1衍生肽的氨基酸序列
IR1和IR2的电荷数分别为+6和+8，疏水值分别为-0.56和-0.40。将PG-1、IR1、IR2三条肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。通过该方法在提高抗菌肽杀菌活性的情况下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，提高了其成为抗生素替代物的发展潜力。
实施例2
固相化学合成法合成IR1和IR2两条抗菌肽
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水***，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水***洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95∶2.5∶2.5混合而成；
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30∶70～70∶30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3：抗菌肽抗菌活性的测定
1、抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2抗菌肽的抑菌活性
通过表2可以看出，IR1和IR2对于革兰氏阴性和阳性菌表现出不同层度的抑菌活性，并且IR2抑菌活性高于PG-1，说明通过在PG-1β转角末端对称连接2个氨基酸残基可提高抗菌肽的抑菌活性。
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。
表3抗菌肽溶血活性的测定
通过表3可以看出，IR1在检测范围内未表现出溶血活性，而IR2在128μM浓度时才表现出较低的溶血活性。
以上结果显示，在衍生肽中随着ArgIle(RI)或IleArg(IR)增加对称末端长度，其抗菌活性显著提高。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性。由表3可以看出，IR2具有较高的治疗指数，表明设计得到的IR2抗菌肽具有较高的替代抗生素的发展潜力。
Claims (3)
1.一种猪源抗菌肽的衍生肽IR2，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种猪源抗菌肽的衍生肽IR2，其特征在于，制备方法如下：
(1)以猪源抗菌肽PG-1序列中的β-转角部位氨基酸序列CRRRFC为基础，选用带电荷的精氨酸R和疏水性氨基酸I来延长PG-1转角部位的两端片层，设计得到了IR系列衍生肽：(IR)nH(RI)n-NH2，n＝1，2；H为PG-1的β-转角部位氨基酸序列CRRRFC，当n＝1时，衍生肽命名为IR1，序列如SEQ No.2所示；当n＝2时，衍生肽命名为IR2，序列如SEQ No.1所示；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到两条多肽；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备。
3.根据权利要求1所述的一种猪源抗菌肽的衍生肽IR2的应用，其特征在于，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
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