CN103773714B - 一种光合细菌在海水养殖水质改善中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物在海水养殖水质改善中的应用领域，具体的说是一种光合细菌SC01及其应用。光合细菌为类球红细菌(Rhodobacter？sphaeroides)，已于2013年9月25日在中国微生物保存中心保藏，保藏编号为CGMCC？No.8248。所述光合细菌可应用于处理海水养殖过程中产生的污染物。本发明所述的菌株具有筛选方法简单易行，生产及储运方便，使用效果明显等特点。具有良好的应用前景。

Description

一种光合细菌在海水养殖水质改善中的应用

技术领域

本发明涉及微生物在海水养殖水质改善中的应用领域，具体的说是一种光合细菌SC01及其应用。

背景技术

我国的海水养殖业经过数十年的迅猛发展，在沿海经济乃至国民经济发展中起着举足轻重的作用，伴随海水养殖业的迅猛发展，养殖过程中的病害以及养殖废水的处理问题日益突出，成为制约行业健康可持续发展的瓶颈之一。特别是养殖废水长期得不到有效处理而直接排海。由于养殖后的海水中，饵料残留、养殖生物的粪便等导致的海水中氨氮、亚硝氮、磷酸盐等营养成分丰富，随意排海容易引起藻类等有害生物的滋生。当环境条件合适时，一些繁殖迅速的赤潮藻类的爆发，常常引起海水中含氧量的急剧下降，造成养殖海区的养殖生物大量死亡，同时，由于养殖废水中含有抗生素、清洁剂、杀菌剂等有害物质，随意排海有可能造成近岸甚至近海生物多样性减少或消失，引起海底荒漠化等一系列严重生态问题。

因此，基于微生物技术开发一些能够用于海水养殖的，既有利于养殖生物健康，有能够进行养殖水质改良的微生态制剂，可以大大缓解上述问题的产生及发展。从而有利于降低养殖消耗，减少排海风险，增加农民收入，促进行业的长期稳定和可持续发展。

光合细菌一类能够以光作为能源、在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的硫化物、氨等有机物作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。光合细菌是地球上最早出现具有原始光能合成体系的原核生物。在长期的进化过程中，光合细菌形成了自己独特的代谢***，在新型药物、功能酶类、以及环境治理方面具有潜在的科研和应用价值。

在水产养殖方面，人们已经开始利用光合细菌进行养殖水质的改善和病害控制方面的实践，但缺乏***的理论指导。对于菌种选择、光合细菌的使用量，使用时机等方面目前尚没有***的理论指导，在生产及使用过程中仍存在较大的盲目性。

发明内容

本发明提供光合细菌SC01及其在海水养殖水质改善中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种光合细菌SC01，光合细菌分类学命名为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)，已于2013年9月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.8248。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述菌株培养方式为：

1）采样及处理：分别取大菱鲆育苗厂厂区排水沟底层海水、池壁附着物、池底污泥、育苗及养殖池底层海水、附着物、池壁及池底残留的污泥5-10g，加入50-100ml的灭菌海水，置于150-300ml的无菌三角瓶中，充分震荡10-15min，去除杂草、岩石等大颗粒物质，制备成样品悬浊液。

2）富集培养：取样品悬浊液5-8mL，加入含有35-50mL的无菌富集培养液（KH₂PO₄0.025-0.5g/L，酵母膏0.5-1.5g/L，胰蛋白胨0.02-0.05g，CaCl0.03-0.08g，NaAc0.5-1.5g/L，NH₄Cl0.1-0.3g/L，MnSO₄0.025-0.05g，MgSO₄0.025-0.05g，FeSO₄0.002-0.005g，pH值6.8-7.4，用蒸馏水定容至1000mL）的100-150ml三角瓶中,加入10-15ml石蜡油，封口膜封口。28-30℃,1500-3000lux光照培养。每48h观察培养液颜色变化。此富集培养过程持续至30-60天。

3）分离培养：当富集培养液明显呈现红色，取2-5ml，加入30-50ml的液体分离培养基（K₂HPO₄0.025-0.5g/L，KH₂PO₄0.025-0.5g/L，酵母膏0.5-1.5g/L，NaAc0.5-1.5g/L，NH₄Cl0.1-0.3g/L，Glu谷氨酸0.002-0.005g，pH值6.8-7.4，用蒸馏水定容至1000mL），28-30℃，1500-3000lux光照，150-300rpm震荡培养3-5d。此时培养液经肉眼观察变成深红色，取50-200ul该培养液涂布在固体分离培养基平板上。选择红色菌落，重复划线分离，至得到菌落形态一致的纯培养物，命名为SC01并保存。经生理生化及16srDNA分析，确定SC01为一株类球光合细菌。

该光合细菌是一种类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)。革兰氏染色为阴性，无芽孢，无荚膜。在LB平板上，菌落成红色，圆形，中间凸起，光滑湿润。

本发明光合细菌从大菱鲆育苗厂分离获得。该光合细菌革兰氏染色为阴性，无芽孢，无荚膜。在LB平板上，菌落成红色，圆形，中间凸起，光滑湿润。对获得的菌株进行16SrDNA序列测定，采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，取PCR产物2～5μl进行1wt%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测.用琼脂糖凝胶纯化试剂盒（购自大连宝生物公司）切胶回收1.5kb大小的PCR产物进行测序分析。菌株的16SrDNA序列测序结果登录GenBank，并用BLAST与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比较，将得到的相似菌株的16SrDNA，利用MEGA4.0软件，构建***发育树，分析各分离菌株的进化地位。经鉴定：是一种为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)。于2013年9月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.8248。该菌株16SrDNA的GenBank登陆号为：KF791043。

光合细菌SC01的应用，所述光合细菌可应用于处理海水养殖过程中产生的污染物。

将所述光合细菌施加于养殖海水中进而改善海水养殖用水的进水及排放水，同时提高海水养殖生物的存活率。

本发明所具有的优点：本发明所述的光合细菌从山东省烟台市的大菱鲆育苗厂分离获得。该光合细菌对大菱鲆等主要经济动物养殖过程中因饵料残留、粪便等引起的水质恶化后的处理具有良好的效果。对低曝气量或无曝气下主要养殖动物的生存具有重要意义。可用于水产养殖过程中水质的改善以及养殖废水的处理，具有良好的应用前景。

具体实施方式

围绕本发明所述的菌株及具体实施方式做详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

光合细菌的筛选

实施例1光合细菌的筛选及培养

1）采样及处理：分别取大菱鲆育苗厂厂区排水沟底层海水、池壁附着物、池底污泥、育苗及养殖池底层海水、附着物、池壁及池底残留的污泥8g，加入100ml的灭菌海水，置于300ml的无菌三角瓶中，充分震荡15min，去除杂草、岩石等大颗粒物质，制备成样品悬浊液。

2）富集培养：取样品悬浊液5mL，加入含有50mL的无菌富集培养基（KH₂PO₄0.5g/L，酵母膏1.5g/L，胰蛋白胨0.05g，CaCl0.05g，NaAc1.0g/L，NH₄Cl0.2g/L，MnSO₄0.05g，MgSO₄0.025g，FeSO₄0.002g，pH值7.2，用蒸馏水定容至1000mL）的150ml三角瓶中,加入10ml石蜡油，封口膜封口。28℃,2000lux光照培养。每48h观察培养液颜色变化。此富集培养过程持续至30天。

3）分离鉴定：当富集培养液明显呈现红色，取2ml，加入50ml的液体分离培养基（K₂HPO₄0.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，酵母膏1.5g/L，NaAc1.0g/L，NH₄Cl0.2g/L，谷氨酸0.005g，pH值7.4，用蒸馏水定容至1000mL），28℃，2000lux光照，300rpm振荡培养3d，此时培养液经肉眼观察变成深红色，取100ul该培养液涂布在固体分离培养基平板（K₂HPO₄0.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，酵母膏1.5g/L，NaAc1.0g/L，NH₄Cl0.2g/L，谷氨酸0.005g，琼脂粉10g，pH值7.4，用蒸馏水定容至1000mL。）上，28℃，2000lux光照，倒置培养7d，选择红色菌落，重复在上述固体培养基上划线分离，至得到菌落形态一致的纯培养物，命名为SC01并保存。经生理生化及16srDNA分析，确定SC01为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)。于2013年9月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.8248。

4）快速培养：取50ul-80℃冻存的SC01接种至10ml快速培养基（K₂HPO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.25g/L，酵母膏3.0g/L，NaAc2.0g/L，NH₄Cl1.0g/L，pH值6.8，用陈海水（静置沉淀14天后去除沉淀物）定容至1000mL。）中，28℃，300rpm，自然光照下培养120h至OD₆₀₀到1.0，以此作为种子液，按照5%（体积比）接种量将种子液接种于快速培养基中，28℃，150rpm，自然光照下培养120h。

实施例2：SC01对养殖海水中氨氮等有害物质的影响

分别取0、0.1、0.5、2、5、10mlOD₆₀₀至1.0的SC01培养液，分别添加至50L海水的暂养池中，其中，以为投加SC01培养液组非对照组，每个养殖池中放入10条身体全长为6-8cm的健康大菱鲆。室内正常光照，每天常规颗粒饲料添加量按每条鱼0.5-0.8g，分3次投加。分别于添加SC01后的第4、18、28、40h取水样，测试水中pH，氨氮、亚硝氮、溶氧、活性硫酸盐含量的变化（参见表1），由表1中可见在所测试的各个时间点，各养殖池的pH和溶氧变化不明显。但随着养殖过程的进行，养殖水体中氨氮，亚硝氮，活性磷酸盐的含量逐渐升高。

同时由表1可知随时间的推移各种有害物质在海水中的含量逐渐升高，尤其以氨氮最为明显。在投加量为0.1、0.5、2.0mlSC01培养液的养殖池中，海水的各项检测指标均小于未投加SC01培养液的对照组，说明适量SC01的存在有利于养殖水体中氨氮、亚硝氮及活性磷酸盐的控制。但当SC01的投加量增到5-10ml时，海水中的各监测指标不降反升，甚至高于未投加SC01培养液的对照组。可见由于加入的细菌数量太多，而细菌的代谢物及菌体本身反而使得水体被二次污染。

表1SC01对养殖海水中有害物质的影响

NH₄-N（μg/L）

NO₂-N（μg/L）

PO₄-P（μg/L）

实施例3：在无曝气条件SC01下对大菱鲆死亡率的影响

取0、0.1、0.5、2、5、10mlOD₆₀₀至1.0的SC01培养液，分别添加至含有50L海水的暂养池中，以未投加SC01培养液组为对照组，每个养殖池中分别放入10条体长为6-9cm，平均体重为6-8g的健康大菱鲆苗。室内正常光照，每个养殖池每分钟通气量为6-8L，常规颗粒饲料的投加量按照每天每鱼0.8-1.0g，于每天7:00、13:00、19:00分三次投加。添加SC00148h后，对所有实验组和对照组都停止曝气5-8h，观察养殖鱼类的死亡情况（参见表2）。在不通气条件下，养殖池中的溶解氧含量迅速下降。在停止曝气后5h内，没有添加SC01的养殖池中的大菱鲆苗很快全部死亡，而在添加SC01培养液的养殖池内大菱鲆苗的死亡时间明显推迟；大菱鲆苗的存活率与SC01加入量存在直接相关：在停止曝气后的8h内，加入量为1%的暂养池中大菱鲆苗无一死亡；加入量为4%的暂养池中大菱鲆苗的死亡率为20%。而当SC01的添加量小于0.2%或大于10%时，没能对大菱鲆苗起到很好的保护效果。因此在合适的浓度下，SC01的存在能消耗养殖池中的食物残渣、粪便等有机物，避免氨氮等有害物质浓度过高引起养殖生物的死亡。但过多SC01的存在又可能导致细菌代谢产物或副产物的集聚，对养殖生物不利。因此在实际使用过程要特别注意使用浓度，避免过犹不及。

表2无曝气条件下大菱鲆苗在8h的死亡率

Claims (3)

1.一种光合细菌SC01，其特征在于：光合细菌为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)，已于2013年9月25日在中国微生物保存中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.8248。

2.一种权利要求1所述的光合细菌SC01的应用，其特征在于：所述光合细菌应用于处理海水养殖过程中产生的污染物。

3.按权利要求2所述的光合细菌SC01的应用，其特征在于：将所述光合细菌施加于养殖海水中进而改善海水养殖用水的进水及排放水，同时提高海水养殖生物的存活率。