CN103768596B

CN103768596B - 用于肿瘤治疗的组合产品、其用途及相关方法

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Publication number: CN103768596B
Application number: CN201210393680.9A
Authority: CN
Inventors: 傅阳心
Original assignee: Suzhou Ding Fu Target Spot Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Suzhou Ding Fu target spot Bioisystech Co., Ltd
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2032-10-17
Also published as: CN103768596A

Abstract

本发明涉及生物医学领域。具体而言，本发明涉及用于治疗和/或预防肿瘤，尤其是肿瘤转移、复发的组合产品、其用途及相关方法。

Description

用于肿瘤治疗的组合产品、其用途及相关方法

技术领域

背景技术

肿瘤转移和复发是癌症发病率和死亡率居高不下的主要诱因之一。虽然手术、化疗和/或放疗通常能够控制原发性肿瘤的生长，但是，转移性的和复发性的肿瘤对于这些治疗经常是有抗性的。

抗体治疗

被批准用于癌症治疗的第一种抗体是于1997年被批准的利妥昔单抗(Rituximab，抗CD20)。现在有超过10种抗体被美国FDA批准用于癌症治疗。目前认为，抗体通过致癌信号阻断和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来抑制肿瘤生长[1]。很多这些抗体靶向肿瘤细胞表面上的致癌受体，例如肺癌、头颈癌和结肠直肠癌中的EGFR，或乳腺癌中的HER2。通常，肿瘤生长的抑制是通过诱导致癌信号阻断(通过与天然配体竞争)、破坏致癌受体信号途径或诱导肿瘤细胞调亡而实现的。抗体的另一个重要作用是通过Fc/FcR相互作用而介导的ADCC，其可以诱导FcR⁺细胞例如NK细胞和巨噬细胞杀死肿瘤细胞。在癌症患者中，FcR多态性直接影响对于抗体的治疗应答[2-4]。在缺失FcR的小鼠中，癌症治疗性抗体失去它们对于肿瘤生长的效应[1]。最近有报道指出，抗体诱导细胞调亡的能力很大程度上依赖于宿主细胞表达的FcR[5]。

关于抗体作用原理的很多结论都是来自体外细胞培养研究和异种移植物肿瘤模型，二者都忽略了适应性免疫(adaptiveimmunity)。因此直到最近为止，关于抗体是否能够诱导针对肿瘤的适应性免疫以及这是否对于治疗效应是必不可少的，仍然未明。证明抗体治疗能够诱导细胞免疫和体液免疫的研究日益增多。例如，曲妥珠单抗(Trastuzumab，抗Her2)治疗能够在患者中诱导抗肿瘤CTL[6]。类似地，证明了小鼠抗-EGFR抗体能够以CD4和CD8T细胞依赖性方式控制肿瘤转移。然而，抗体治疗通过何种机制产生活性的适应性免疫在很大程度上仍然是未知的。

单独通过抗体完全控制或消除肿瘤转移是极少的。多数抗体仅部分延迟疾病进程。因此，改善抗体治疗的效率是该领域中的重大问题。很多公司已经开发了增强抗体的致瘤阻断和ADCC能力的不同策略。本发明人认为，通过免疫调节子的组合来增强抗体治疗激发的适应性免疫是一个重要的方面。

B7-H1/PD1通路对肿瘤免疫抗性起作用

B7-H1是共抑制分子并且是B7家族的成员，它在肿瘤细胞、树突细胞和巨噬细胞上被诱导性地表达[11]。与肿瘤相关的B7-H1参与诱导肿瘤反应性T细胞的凋亡和CTL细胞毒性能力的破坏[12]。与此同时，树突细胞上表达的B7-H1被认为抑制T细胞的增殖及抑制T细胞产生细胞因子[13]。

PD-1是可诱导地表达于活化的T细胞上的抑制因子受体，它促进T细胞的失能、凋亡和衰竭(exhaustion)[14]。PD-1信号传导被认为是慢性感染(例如小鼠中的LCMV和人中的HIV和HCV)中抗原特异性T细胞衰竭的调节因子[15-18]。衰竭的T细胞的标志包括增殖功能和效应子功能的破坏[19]。数篇文献已经显示了B7-H1/PD1通路对于癌症中的T细胞衰竭起作用[20-22]。已显示阻断B7-H1/PD1信号传导可以恢复功能性T细胞应答并延缓肿瘤的生长[20,22,23]。因此，这些证据提示抑制B7-H1/PD-1信号传导有可能对于设计与辐射疗法的联合用药是有重要价值的。

OX40L/OX40通路促进抗肿瘤免疫应答

OX40是共刺激分子，是Treg细胞上组成型表达的和活化的T细胞上可诱导地表达的TNFR家族的成员[24]。OX40调节T细胞活化并与其它免疫刺激分子协同以***[25]。越来越多的证据表明：OX40啮合会消除肿瘤排斥中的Treg细胞的作用[26]。靶向OX40的激动剂抗体与化疗的组合治疗提供了强有力的抗肿瘤免疫，其伴随Treg细胞调亡和耗竭[27]。基于这些证据，本发明人推测OX40啮合可能会增强辐射所引发的免疫应答并抑制肿瘤。

CTLA4

CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞相关抗原4)，又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。基因重组的CTLA-4Ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。

发明内容

本发明提供了用于治疗和/或预防肿瘤，尤其是肿瘤转移、复发的新的组合产品，其包含：

（a）肿瘤抗原特异性抗体；和

（b）针对共抑制/共刺激分子的抗体。

在一个方面，所述肿瘤抗原特异性抗体可以是人源化单克隆抗体、嵌合抗体、heterominibody、或单链抗体。在一个实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤表面抗原。在一个实施方案中，所述抗体能特异识别和结合肿瘤表面抗原。

本发明的组合产品中的肿瘤抗原特异性抗体可以是抗体片段。能够特异结合抗原的抗体片段是本领域知晓的。优选地，所述抗体是足以识别肿瘤抗原的抗体片段，例如scFv。

本发明的组合产品中的肿瘤抗原特异性抗体包括但不限于针对以下肿瘤特异性抗原的抗体：HER2、CD20、EGFR。

在一个方面，本发明的组合产品中的针对共抑制/共刺激分子的抗体是针对共抑制分子B7-H1/PD1的阻断抗体。

在另一个方面，本发明的组合产品中的针对共抑制/共刺激分子的抗体是针对共刺激分子OX40的激活抗体。

在另一个方面，本发明的组合产品中的针对共抑制/共刺激分子的抗体是针对共刺激分子CTLA4的抗体。在特别的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体4F10。

在本发明的实施方式中，所述肿瘤可以是但不限于：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤和/或其细胞，例如乳腺癌细胞（如TUBO细胞）或Myc-Cap肿瘤细胞系。

在一个具体实施方式中，本发明的组合产品中所述肿瘤抗原特异性抗体和所述针对共抑制/共刺激分子的抗体向受试者分开施用，例如可以同时或相继地施用给受试者。在另一个实施方式中，本发明的组合产品中所述肿瘤抗原特异性抗体和所述针对共抑制/共刺激分子的抗体向受试者分开施用通过形成融合蛋白、化学缀合、和形成免疫脂质体中的一种或者多种方法相连。

在一个方面，本发明提供了用于治疗和/或预防肿瘤，尤其是肿瘤转移、复发的试剂盒，其包含：

（1）肿瘤抗原特异性抗体；

（2）针对共抑制/共刺激分子的抗体；和

用于施用组分（1）和（2）的说明书，其中所述组分（1）和（2）如上文所定义。

在另一个方面，本发明提供了肿瘤抗原特异性抗体和针对共抑制/共刺激分子的抗体在制备用于治疗和/或预防肿瘤，尤其是肿瘤转移、复发的药物中的用途，其中所述肿瘤抗原特异性抗体和针对共抑制/共刺激分子的抗体如上文所定义。

在其它的实施方式中，所述药物可以是适于直接施用在肿瘤位点的形式或者是适于全身性施用的形式。

附图说明

图1：通过全身性处理，多种抗体对于控制TUBO几乎无效应

在野生型Balb/c小鼠(n=5/组)的胁腹中皮下注射5x10⁵TUBO细胞。在第11天通过腹膜内方式以200μg抗-neu抗体7.16.4处理，在第12、15、18和21天以PBS(Ctr)或200μg抗体(如图所示)通过腹膜内方式处理。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

图2：肿瘤内递送抗体靶向肿瘤组织相对于全身性注射具有更强的效力。肿瘤内注射抗-CTLA-4显示出对于肿瘤排斥的有效作用。

在野生型Balb/c小鼠(n=5/组)的胁腹中皮下注射5x10⁵TUBO细胞。在第9、11、13、15、18和21天以PBS(Ctr)或100μg抗体(如图中所示)通过肿瘤内方式处理小鼠。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。在抗-CTLA4组中，所有的肿瘤均被排斥。

图3：组合治疗对于控制TUBO比单一治疗更加有效。

在野生型Balb/c小鼠(n=5/组)的胁腹中皮下注射5x10⁵TUBO细胞。在第11、14和17天通过肿瘤内方式以PBS(Ctr)、50μg单一抗体(如图中所示)或25μg抗-CTLA-4抗体4F10+25μg抗-Her2/neu抗体7.16.4(α-CTLA-4+7.16.4)处理小鼠。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

图4：多种类型的抗体与抗-neu抗体协同作用以使肿瘤消退。

在野生型Balb/c小鼠(n=5/组)的胁腹中皮下注射5x10⁵TUBO细胞。在第12和17天通过肿瘤内方式以PBS(Ctr)、100μg抗-Her2/neu抗体7.16.4(7.16.4)、或50ug抗-Her2/neu抗体7.16.4和50ug其它抗体(如图中所示)处理小鼠。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

图5：组合治疗对于淋巴瘤也具有优于单一治疗的效应

向BALB/c小鼠背部皮下移植1x10⁶的A20淋巴瘤细胞。在第11、13和16天通过肿瘤内方式给予PBS和抗体(如图中所示)。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

图6：组合治疗的抗肿瘤效应需要CD8+细胞。向BALB/c小鼠施以背部皮下移植1x10⁶的A20淋巴瘤细胞。在第16和22天通过肿瘤内方式以抗体处理小鼠(如图所示)。同时通过腹膜内方式施用耗竭抗体抗-CD4和抗-CD8(200ug)。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

具体实施方式

在本发明的情境中，“肿瘤”、“癌”或者“过度增殖性疾病”是指所有恶性或良性的瘤性细胞生长和增殖，包括所有转化的细胞和组织和所有癌性细胞和组织。

癌症的实例包括，但不限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或者淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌（例如，上皮鳞状细胞癌）、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌，包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或者子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌，以及头颈癌。癌症的其他实例在下面的“过度增殖性疾病”中列出。特别地，所述肿瘤选自：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤和/或其细胞，例如乳腺癌细胞（如TUBO细胞）或Myc-Cap肿瘤细胞系。

特别地，对于抗体而言，施用的剂量可以是0.1μg/kg到100mg/kg患者体重。例如0.1mg/kg到20mg/kg患者体重，1mg/kg到10mg/kg患者体重。通常，由于对外来多肽的免疫反应，人抗体在人体中比来自其他物种的抗体有更长的半寿期。从而，较低剂量的人抗体和较低频率的施用通常是可能的。此外，通过修饰，如脂化，增强抗体的摄入和组织穿透（例如，进入脑）可以减少抗体的剂量和施用频率。

根据本发明的组合产品可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲质、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。此类材料应当是非毒性的并且不应干扰活性成分的功效。此类材料可以包括，例如任何一种和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及生理学相容的物质等。药学上可接受的载体可以是例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在许多情况下，所述药物组合物中可以包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠将是优选的。药学上可接受的物质的还可以是湿润剂或少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲质，其增强抗体的保存期或效用。载体或其他材料的精确性质将取决于施用途径，所述施用途径可以是口服、局部、通过吸入或通过注射，例如静脉内。在一个实施方案中，所述药物组合物通过静脉内输注或注射进行施用。在另一优选实施方案中，所述药物组合物通过肌内或皮下注射进行施用。

用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或液体形式，例如含有惰性稀释剂或可同化的可食用载体。片剂可以包含固体载体例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或者二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。特异性结合成员（需要时，以及其他成分）还可包封在硬或软壳明胶胶囊内，压缩成片剂，或直接掺入受试者饮食中。对于口服治疗施用，活性成分可以与赋形剂相掺合，并以可吸收的片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式进行使用。为了通过除肠胃外施用以外的其他方式施用本发明的化合物，可能必需用防止其失活的材料包被所述化合物或将所述化合物与所述材料共施用。

对于静脉内注射，或在痛苦部位（例如肿瘤部位）注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的pK、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员将能够容易地例如使用等渗媒介物例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐林格注射液来制备合适的溶液。需要时，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲质、抗氧化剂和/或其他添加剂。

本发明的试剂或组合物可以单独地或与其他治疗相组合地同时或顺次施用，这取决于被治疗的病状。

下面的实施例仅用于进一步阐释本发明的内容，而不意欲在任何方面限制本发明。本领域技术人员将领会，可对下述具体实施方式进行修饰而仍不偏离所附的权利要求所要求保护的本发明的范围、精神和主旨。

在下面的所有实施例中，如无特别声明，均采用本领域技术人员惯常所用的方法、仪器、试剂和实验方案等。

在以下实施例中，抗-Her2/neu抗体7.16.4见Zhang,H.,Wang,Q.,Montone,K.T.,Peavey,J.E.,Drebin,J.A.,Greene,M.I.,andMurali,R.(1999).Sharedantigenicepitopesandpathobiologicalfunctionsofanti-p185(her2/neu)monoclonalantibodies.Exp.Mol.Pathol.67,15–25.

抗-mCD20抗体由JeffreyBrowning,Biogen提供。

下列抗体均购自BioXcell,WestLebanon,NH03784,USA

抗CTLA4抗体：4F10

OX40激活抗体：OX86

B7-H1/PD1阻断抗体：10F.9G2

抗CD40抗体：FGK45

抗TGFβ抗体：1D11.16.8

IL-10R抗体：1B1.3a

抗CD4抗体：GK1.5

抗CD8抗体：TIB210

实施例1：通过全身方式施用，多种抗体对于控制TUBO几乎无效应

在野生型Balb/c小鼠(n=5/组)的胁腹中皮下注射5x105TUBO细胞。在第11天通过腹膜内方式以200μg抗-neu抗体7.16.4处理，在第12、15、18和21天以PBS(Ctr)或200μg抗体(如图1所示)通过腹膜内方式处理。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。结果表明：通过全身性方式施用抗CD40抗体FGK45、抗CTLA4抗体4F10、OX40激活抗体OX86、B7-H1/PD1阻断抗体10F.9G2和抗TGFβ抗体1D11.16.8对于肿瘤生长几乎无抑制作用。

实施例2：肿瘤内递送抗体靶向肿瘤组织相对于全身性注射具有更强的效力。在野生型Balb/c小鼠(n=5/组)的胁腹中皮下注射5x105TUBO细胞。在第9、11、13、15、18和21天以PBS(Ctr)或100μg抗体(如图中所示)通过肿瘤内方式处理小鼠。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

如图2所示，在抗-CTLA4组中，所有的肿瘤均被排斥。结果表明，肿瘤内注射抗-CTLA-4显示出对于肿瘤排斥的有效作用。

实施例3：组合治疗对于控制TUBO比单一治疗更加有效。

在野生型Balb/c小鼠(n=5/组)的胁腹中皮下注射5x105TUBO细胞。在第11、14和17天通过肿瘤内方式以PBS(Ctr)、50μg单一抗体(如图中所示)或25μg抗-CTLA-4抗体4F10+25μg抗-Her2/neu抗体7.16.4(α-CTLA-4+7.16.4)处理小鼠。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

如图3所示，α-CTLA-4+7.16.4组即抗-CTLA4抗体与抗Her2/neu抗体7.16.4的组合显示出强有力的对于肿瘤生长的抑制，其抑制效应大于单独施用抗Her2/neu抗体7.16.4。

实施例4：组合治疗比单独的抗-neu对于抗肿瘤更加有效。

在野生型Balb/c小鼠(n=5/组)的胁腹中皮下注射5x105TUBO细胞。在第12和17天通过肿瘤内方式以PBS(Ctr)、100μg抗-Her2/neu抗体7.16.4(7.16.4)、或50ug抗-Her2/neu抗体7.16.4和50ug其它抗体(如图中所示)处理小鼠。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

如图4所示，抗Her2/neu抗体7.16.4与抗-CTLA4抗体4F10的组合、抗Her2/neu抗体7.16.4与抗-CD40抗体FGK45的组合、抗Her2/neu抗体7.16.4与抗-B7-H1/PD1阻断抗体10F.9G2的组合、抗Her2/neu抗体7.16.4与抗-IL-10R抗体1B1.3a的组合、抗Her2/neu抗体7.16.4与OX40激活抗体OX86的组合均抑制肿瘤的生长，其抑制效应大于单独施用抗Her2/neu抗体7.16.4。

实施例5：组合治疗对于淋巴瘤也具有优于单一治疗的效应

向BALB/c小鼠背部皮下移植1x106的A20淋巴瘤细胞。在第11、13和16天通过肿瘤内方式给予PBS和抗体(如图中所示)。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

如图5所示，抗-mCD20与抗-mCTLA4的组合显著抑制淋巴瘤的生长，其效应大于单独的抗-mCD20。

实施例6：组合治疗的抗肿瘤效应需要CD8+细胞。向BALB/c小鼠施以背部皮下移植1x106的A20淋巴瘤细胞。在第16和22天通过肿瘤内方式以抗体(如图所示)处理小鼠。同时通过腹膜内方式施用耗竭抗体抗-CD4（GK1.5）和抗-CD8（TIB210）（200μg）。每周2次测定肿瘤生长并进行比较。

如图6所示，在存在抗-CD4耗竭抗体GK1.5的情况下，抗-CD20或抗CD20+抗-CTLA4仍然对肿瘤具有明显抑制效应。但是，在存在抗-CD8耗竭抗体TIB210的情况下，抗-CD20或抗CD20+抗-CTLA4对肿瘤几乎无抑制效应。

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Claims

1.用于治疗和/或预防肿瘤的新的组合产品，其活性成分由：

(a)肿瘤抗原特异性抗体；和

(b)针对共抑制/共刺激分子的抗体组成；

其中肿瘤抗原特异性抗体和针对共抑制/共刺激分子的抗体的组合是针对HER2/neu的抗体和针对共刺激分子CTLA4的抗体的组合；

其中所述肿瘤是乳腺癌。

2.权利要求1的组合产品，其中所述肿瘤抗原特异性抗体是人源化单克隆抗体、嵌合抗体、heterominibody、或单链抗体，所述抗体能特异识别和结合肿瘤表面抗原。

3.权利要求1的组合产品，其中所述抗体是足以识别肿瘤抗原的抗体片段。

4.权利要求3的组合产品，其中所述的抗体片段为scFv。

5.权利要求1-4任一项的组合产品，其中所述肿瘤抗原特异性抗体和所述针对共抑制/共刺激分子的抗体向受试者分开施用。

6.权利要求1-4任一项的组合产品，其中所述肿瘤抗原特异性抗体和所述针对共抑制/共刺激分子的抗体同时或相继地施用给受试者。

7.用于治疗和/或预防肿瘤的试剂盒，其包含：

(1)肿瘤抗原特异性抗体；和

(2)针对共抑制/共刺激分子的抗体组成的活性成分；和

用于施用组分(1)和(2)的说明书；

其中所述肿瘤是乳腺癌。

8.肿瘤抗原特异性抗体和针对共抑制/共刺激分子的抗体在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途，

其中所述肿瘤抗原特异性抗体是针对HER2/neu的抗体；

其中所述针对共抑制/共刺激分子的抗体是针对共刺激分子CTLA4的抗体；

其中所述肿瘤是乳腺癌。