MX2012000086A

MX2012000086A - Peptidos derivados de soricidi y metodos para la la deteccion de canceres trpv-6 y suministro de farmaco.

Info

Publication number: MX2012000086A
Application number: MX2012000086A
Authority: MX
Inventors: John M Stewart
Original assignee: Soricimed Biopharma Inc
Priority date: 2009-06-26
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2012-06-12
Also published as: CA2766272C; WO2010148501A1; US20150182644A1; US10064964B2; JP2012530725A; US20220175977A1; EP2445932A1; US20190209717A1; CA2766272A1; EP2445932B1; EP2445932A4; US20100329983A1; BRPI1012675A2; ES2670588T3; US11090396B2; JP5836940B2

Abstract

Se describen péptidos de unión a TRV6 derivados de soricidin, y compuestos o composiciones de los mismos, y su uso en la detección y diagnóstico de cáncer. También se describen métodos para detectar y presentar cáncer utilizando los compuestos de la invención. Los compuestos que contienen péptidos de unión a TRPV6 son útiles para el suministro de agentes de diagnóstico y terapéuticos a células o tumores que expresan TPP V6.

Description

PÉPTIDOS DERIVADOS DE SORICIDIN Y MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE CÁNCERES TRPV-6 Y SUMINISTRO DE FÁRMACO Campo de la Invención La presente invención se refiere a la detección y diagnóstico de cánceres que expresan el Vaniloide Potencial de Receptor Temporal 6 (TRPV6). Ciertas modalidades de la presente invención también se refieren a compuestos que enlazan TRPV-6 que dirigen células que expresan TRPV6 para utilizarse en diagnóstico o suministro de fármacos.

Antecedentes de la Invención Soricidin (acceso NCBI no. P0C2C6) es un péptido paralítico de 54 aminoácidos aislado de la glándula salival submaxilar de la Musaraña de Cola Corta del Norte (Blarina brevicauda). La Patente Norteamericana No. 7,119,168 (incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia) describe soricidin, su actividad paralizante y la utilidad del péptido para condiciones tales como tratamiento de dolor y enfermedad neuromuscular. La Patente Norteamericana No. 7,273,850 (incorporada a la presente invención como referencia) describe que soricidin tiene actividad paralizante, y entre otras cosas, proporciona datos de que inhibe la captación de calcio en dos líneas de célula de cáncer de ovario.

Un grupo de canales de ión de calcio implicados en cáncer son los canales de Potencial de Receptor Temporal (TRP) que se encuentran en los invertebrados y vertebrados. Los miembros Vaniloides del Potencial de Receptor Temporal (TRPV) de la superfamilia TRP, fueron nombrados después de que se descubrió que se activan en la presencia de vaniloides (capsaicin de pimientos picantes, por ejemplo). Los primeros cuatro de estos receptores probados (TRPV1 , TRPV2, TRPV3 y TRPV4) todos respondieron a capsaicin y también fueron responsables de detectar cambios en la temperatura y otras señales ambientales. Los dos restantes de la subfamilia TRPV, TRPV5 y TRPV6, se encontraron en forma predominante en el tipo epitelial o tejidos derivados, y fueron responsables del flujo del ión de calcio dentro de la célula. La Patente Norteamericana No. 7,7205,108 describe genes que codifican TRPV 8, 9 y 10 y su uso como biomarcadores para cáncer y en métodos de diagnóstico y terapéuticos asociados.

TRPV6 se identificó como responsable de importar calcio en tejidos epiteliales del intestino y por lo tanto la captación de calcio procedente de la dieta. Estos canales también mostraron estar presentes en una cantidad de los tejidos en diversas cantidades, pero en forma más notable en célula epitelial intestinal, riñon, placenta y páncreas. La expresión de TRPV6 se midió como altamente elevada en algunos tejidos de cáncer, y en algunas líneas de célula de cáncer de ovario, seno, próstata y leucemia conocidas. (Peng y asociados, 2000; Zhuang y asociados, 2002).

Por consiguiente, existe la necesidad de compuestos y métodos asociados para detectar células que expresan TRPV6. También existe la necesidad de composiciones y métodos con la capacidad de dirigir células que expresan TRPV6 para el suministro de agentes útiles para el diagnóstico o tratamiento de cáncer.

Breve Descripción de la Invención El inventor de la presente invención, ha sintetizado compuestos que enlazan a los canales de ión de calcio TRPV6. Estos compuestos tienen al menos una parte que tiene una identidad de secuencia con una cadena continua de aminoácidos de los péptidos C-terminales de soricidin. En ciertos casos, el componente de péptido representa todo el compuesto, aunque en otros casos el péptido es un componente del compuesto, por ejemplo, si el compuesto comprende péptido conjugado para un fármaco o una etiqueta detectable.

No se ha sabido previamente que la estructura de soricidin que proporciona la actividad de inhibición de canal de calcio, estuviera separada de la estructura que origina la actividad paralizante. Los conjugados fluorescentes de los compuestos aquí descritos, enlazan a células que expresan proteína TRPV6 en experimentos de localización conjunta con anticuerpos TRPV6. TRPV6 ha mostrado estar sobre-expresada en una cantidad de muestras de tejido de cáncer y líneas celulares.

Los compuestos que enlazan TRPV6 son útiles para identificación de cáncer, así como para dirigir actividad de fármacos cáncer a células que expresan TRPV. Un aspecto adicional incluye el uso de anticuerpos TRPV6 en la identificación y diagnóstico de cáncer, así como para dirigir la actividad de fármaco anti-cáncer a células que expresan TRPV. Además, los compuestos de enlace TRPV6 etiquetados en forma fluorescente han mostrado ser útiles para generación de imágenes, identificación de tumores in vivo. Los péptidos que enlazan TRPV6 aquí descritos, también han mostrado ser útiles para dirigir biomoléculas de células que expresan TRPV6, tal como células de tumor.

Por consiguiente, algunas modalidades incluyen un compuesto que comprende un péptido de enlace de Vaniloide Potencial de Receptor Temporal 6 (TRPV6)-conjugado a una biomolécula. Opcionalmente, el compuesto puede comprender todo o parte de un péptido con la secuencia de aminoácido EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR (SEC ID NO:1). En una modalidad, el compuesto comprende 9 a 27 aminoácidos de la SEC ID NO:1. En una modalidad, el compuesto comprende una parte contigua de la secuencia C-terminal de SEC ID NO:1. En una modalidad, el compuesto comprende al menos 9 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:1, al menos 10 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:1 o más de 10 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:1. En una modalidad, el compuesto comprende un péptido de enlace TRPV6 con al menos el 70%, al menos el 80%, o al menos 90% de identidad con uno de HPSKVDLPR, KEFLHPSKVDLPR o EGKLSSNDTEGGLC KEFLHPSKVDLPR (SEC ID NO:1). En algunas modalidades, el péptido de enlace TRPV6 comprende la secuencia de aminoácido HPSKVDLPR o KEFLHPSKVDLPR.

En algunas modalidades, se proporciona un compuesto que comprende un anticuerpo para TRPV6 conjugado con una biomolécula.

En una modalidad, el compuesto comprende una biomolécula con una etiqueta detectable. En algunas modalidades, la biomolécula está etiquetada en forma fluorescente, radioactiva o inmunológica. En una modalidad, la etiqueta detectable comprende un agente de contraste de generación de resonancia magnética (MRI). En una modalidad, la etiqueta detectable es óxido de hierro super paramagnético (SPIO).

En una modalidad, la biomolécula es un agente terapéutico. Opcionalmente, el agente terapéutico es un agente anti-cáncer, por ejemplo un fármaco a base de taxano, fármaco tipo antraciclina o un fármaco a base de platin.

En algunas modalidades, la biomolécula es una molécula de fármaco pequeño, oligosacárido, anticuerpo, epítope de anticuerpo, agrupación no metálica, molécula etiquetada en forma radioactiva, fármaco a base de taxano, fármaco tipo antraciclina, fármaco a base de platin, antibiótico, fármaco anticáncer, antifúngico, antiviral, o anti-retroviral, o complejo de boro, epítope para un anticuerpo endógeno o administrado en forma terapéutica, un péptido u oligosacárido y señalización que recluta células inmune, por ejemplo, células T-asesinas.

En una modalidad, el péptido de enlace TRPV6 y la biomolécula se unen a través de un espaciador. En una modalidad, el péptido de enlace TRPV6 se conjuga para más de una biomolécula o para más de un tipo de biomolécula.

También se incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto que contiene un péptido de enlace TRPV6 tal como aquí se describe y un transportador farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, la composición farmacéutica comprende un péptido de enlace TRPV6 conjugado para una biomolécula, o a una pluralidad de biomoléculas.

Una modalidad incluye un método para detectar una proteína TRPV6 en una muestra, en donde el método comprende contactar la muestra con un péptido de enlace TRP que comprende toda o parte de un péptido que comprende EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR (SEC ID NO: 1) y detectar el péptido de enlace TRPV6. En una modalidad, el péptido de enlace TRPV6 es detectado utilizando un anticuerpo que enlaza en forma selectiva el péptido de enlace TRPV6.

Otra modalidad incluye un método para detectar una proteína TRPV6 en una muestra, en donde el método comprende contactar la muestra con un compuesto que comprende un péptido de enlace TRPV6 conjugado para una biomolécula y posteriormente detectar la biomolécula. Por ejemplo, en una modalidad, la biomolécula es un fluoróforo y el compuesto que comprende el péptido de enlace TRPV6 se detecta detectando el fluoróforo.

Una modalidad adicional incluye el uso de compuestos aquí descritos para detectar TRPV6 en una muestra. En una modalidad, la muestra es un fluido corporal tal como sangre, saliva u orina.

En algunas modalidades, se relacionan con métodos para identificar cáncer en una muestra de un sujeto, en donde el método comprende detectar el mARN TRPV6 o proteína en la muestra, y comparar la cantidad de mARN TRPV6 o proteína en la muestra con una muestra control, en donde una cantidad incrementada de mARN TRPV6 o proteína en la muestra en comparación con el control, indica con cáncer. En una modalidad, la muestra es un fluido corporal. En algunas modalidades, la proteína TRPV6 se detecta in vivo, ex vivo o in vitro. La proteína TRPV6 se puede detectar utilizando los compuestos aquí descritos o anticuerpos dirigidos a TRPV6. En algunas modalidades, el mARN TRPV6 se detecta utilizando PCR, RT-PCR o RT-PCR cuantitativo de tiempo real. En algunas modalidades, el cáncer es un cáncer de etapa temprana, tal como cáncer etapa I o etapa II.

En algunas modalidades, el sujeto puede ser un mamífero, tal como un humano. La muestra puede comprender un fluido corporal, excreta, muestra de tejido, muestra de tumor o microvesícula. En una modalidad, el fluido corporal es sangre, orina, saliva, plasma, fluido cerebroespinal, moco, secreciones vaginales, linfa o fluido pleural.

En algunas modalidades, los métodos aquí descritos se utilizan para identificar cáncer de seno, cáncer de ovario, cáncer de sangre, cáncer de cerebro, cáncer retinal, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer glial, leucemia o cáncer endometrial. En una modalidad, el cáncer es cáncer metastático o cáncer metastático de nodo linfático.

En una modalidad, los métodos aquí descritos se utilizan para diagnosticar la etapa de cáncer. En algunas modalidades, el método incluye comparar la cantidad de mARN TRPV6 o proteína en una muestra con una muestra de control o muestras que tienen cáncer de etapa I, II, III o IV.

En otra modalidad, los métodos aquí descritos se utilizan para graduar los tumores o células de cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de ovario. En una modalidad, los métodos aquí descritos que identifican sujetos con cáncer de ovario grado I.

En una modalidad adicional, se incluye un método para fabricar uno o más de los compuestos aquí descritos, en donde el método comprende conjugar una biomolécula para un péptido de enlace TRPV6 o para un anticuerpo TRPV6. En una modalidad, el péptido de enlace TRPV6 se conjuga en forma covalente a una biomolécula. Por ejemplo, en una modalidad el péptido de enlace TRPV6 comprende toda o parte de la SEC ID NO:1 y la biomolécula se adhiere a través del tio de cisteína que corresponde a la posición 14 en la SEC ID NO:1. En una modalidad, la biomolécula se conjuga al péptido a través de una maleimida activada.

Aún otra modalidad incluye un método para suministrar una biomolécula a una célula que expresa TRPV6, en donde el método comprende contactar la célula con un compuesto que comprende un péptido de enlace TRPV6 conjugado para una biomolécula o un anticuerpo TRPV6 conjugado para una biomolécula. En una modalidad, la biomolécula comprende una etiqueta detectable o un agente terapéutico. El paso de contactar la célula con el compuesto puede ocurrir in vivo, in vitro o ex vivo. En algunas modalidades la célula que expresa TRPV6 comprende un tejido, tumor o microvesícula.

Las modalidades adicionales incluyen equipos para detectar TRPV6 en una muestra, en donde los equipos comprenden reactivos para llevar a cabo los métodos aquí descritos e instrucciones para uso. Otras modalidades incluyen equipos para diagnosticar cáncer, reactivos para llevar a cabo los métodos aquí descritos e instrucciones para uso.

En otro aspecto, se proporciona un método para identificar un tumor de cáncer en un sujeto. En una modalidad, el tumor de cáncer sobreexpresa TRPV6. En algunas modalidades, el método comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende un péptido de enlace TRPV6 o un anticuerpo para TRPV6 tal como aquí se describe. El péptido de enlace TRPV6 o anticuerpo para TRPV6, se detecta posteriormente, indicando la presencia de TRPV6. En una modalidad, el péptido de enlace TRPV6 se detecta, detectando una biomolécula conjugada para el péptido. Opcionalmente, las regiones del sujeto con niveles incrementados de TRPV6 se identifican posteriormente, en donde los niveles incrementados de TRPV6 son indicativos de un tumor. En una modalidad, los niveles de TRPV6 se comparan con un nivel de control, tal como los observados en el tejido no cancerígeno, un nivel de control predeterminado, o un nivel promedio tomado del sujeto. En una modalidad, TRPV6 se detecta in vivo, por ejemplo detectando una etiqueta fluorescente conjugada para el péptido de enlace TRPV6 o anticuerpo para TRPV6. En una modalidad, el TRPV6 se detecta utilizando generación de imagen de resonancia magnética (MRI) y un agente de contraste MRI conjugado para un péptido de enlace TRPV6. En algunas modalidades, el tumor de cáncer es un tumor de próstata, un tumor de seno, o un tumor de ovario.

Otras características y ventajas de la presente invención podrán ser apreciadas de la siguiente sección detallada. Deberá quedar entendido, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades preferidas de la presente invención, se proporcionan únicamente a manera de ilustración, ya que los expertos en la técnica podrán apreciar diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la presente invención, a partir de la descripción detallada.

Breve Descripción de las Figuras Las modalidades de la presente invención a continuación serán descritas con relación a los dibujos, en los cuales: La figura 1, es el dibujo de una línea que muestra la ubicación de los nodos linfáticos en el ratón. La acumulación significativa del compuesto SorC13-Cy5.5 y el compuesto SorC27-Cy5.5 durante 4 horas después de inyección i.v. de 100 ug de cada una de los péptidos etiquetados en ratones CD1 fue observada en los siguientes nodos etiquetados en la figura 1:1. Nodos cervicales superfaciales; 4. Nodos axilares; 5. Nodos branquiales; 8. Nodos mesentéricos; 9. Nodos inguinales.

La figura 2, muestra la distribución del compuesto SorC13-Cy5.5 en ratones CD1 4 horas después de inyección i.v. El eje Y es el porcentaje de la fluorescencia total medida en todos los tejidos.

La figura 3, muestra la distribución del compuesto SorC27-Cy5.5 en ratones CD1 4 horas después de inyección i.v. El eje Y es la fluorescencia total medida en cada tejido.

La figura 4, muestra la distribución del compuesto SorC13-Cy5.5 en ratones CD1 después de inyección i.v. con el tiempo, después de perfusión para lavar los fluidos. El eje Y es el porcentaje de la fluorescencia total medida en todos los tejidos. La captación con el porcentaje más alto (de fluorescencia total) del compuesto SorC13-Cy5.5, se observó en el hígado, pulmón y riñon. El nodo linfático no se muestra debido a que la perfusión lava la linfa. El Panel A muestra la distribución 4 horas después de inyección i.v. y el Panel B 24 horas después de inyección i.v.

La figura 5, muestra la inmuno-localización de TRPV6 en células de cáncer de ovario (SKOV-3). Las células SKOV-3 son transfectadas con una proteína de fusión TRPV6-GFP. Tanto TRPV6 como TRPV6-GFP endógeno fueron detectados con una combinación de un anticuerpo primario para la región N-terminal TRPV6 y un anticuerpo secundario para IgG etiquetado con FITC (una etiqueta fluorescente verde). Una célula en el campo muestra una co-localización de proteína TRPV6-GFP transfectada, fluorescente en forma brillante, y el anticuerpo para TRPV6. Las otras células (no transfectada) en el campo muestran la fluorescencia color rojo de la aglutinina de germen de trigo que marca la membrana celular, y la fluorescencia color verde de la inmunolocalización que indica el anticuerpo secundario etiquetado con FITC utilizado para detectar el anticuerpo anti-TRPV6 primario.

La figura 6, muestra la co-localización de proteína TRPV6 expresada en células HEK-293 con anticuerpo para TRPV6 y con SorC27-cy5.5. Las células HEK293 no transfectadas con el vector de expresión TRPV6 no muestran fluorescencia cuando se incuban con SorC27-cy5.5 (figura 6A, control negativo). La figura 6B muestra células con imágenes con anticuerpo TRPV verde, en tanto que la figura 6C muestra el mismo campo de células con imágenes con SorC27-cy5.5 color rojo. La figura 6D muestra ambas imágenes super-impuestas y la co-localización de TRPV6 y SorC27-cy5.5 en células transfectadas con vector TRPV6.

La figura 7, muestra la co-localización de SorC27-cy5.5 y anticuerpos TRPV6 etiquetado en forma fluorescente en línea de célula de cáncer de próstata PC-3. La serie de imágenes A muestra A1: inmunofluorescencia de anticuerpo TRPV6, A2: etiquetado con SorC27-cy5.5 y A3: traslape de A1 y A2. La serie de imágenes B muestra células PC-3 en la misma secuencia que en la serie A, pero ahora transfectadas con un vector de expresión TRPV6 para incrementar el nivel de TRPV6 expresado mediante las células. Ambas series de imágenes muestran la co-localización de SorC27-cy5.5 y TRPV6. El nivel de inmunofluorescencia TRPV6 y fluorescencia SorC27-cy5.5 ambos se incrementan en las células transfectadas con expresión TRPV6 incrementada mostrada en las series 7B de las figuras, en comparación con células en la serie 7A de las figuras.

La figura 8, muestra la co-localización de SorC27-cy5.5 y anticuerpos TRPV6 etiquetado en forma fluorescente en línea de célula de cáncer de seno T 47D. La serie de imágenes A muestra A1 :inmunofluorescencia, A2: etiquetado con SorC27-cy5.5 y A3: traslape de A1 y A2. La serie B de imágenes muestra células PC-3 en la misma secuencias que serie A, pero ahora transf ectadas con un vector de expresión TRPV6 para incrementar el nivel de TRPV6 expresado mediante las células. Ambas serie de imágenes muestran la co-localización de SorC27-cy5.5 y TRPV6. El nivel de inmunof luorescencia TRPV6 y fluorescencia SorC27-cy5.5, ambos se incrementan en las células transf ectadas con una expresión TRPV6 mayor mostrada en la serie 8B de las figuras en comparación con células en la serie 8A de las figuras.

La figura 9, muestra la co-localización de SorC27-cy5.5 y anticuerpos TRPV6 etiquetado en forma fluorescente en línea de célula de cáncer de ovario SKOV-3. La serie de imágenes A muestra A1: inmunofluorescencia, A2: etiquetado con SorC27-cy5.5 y A3: traslape de A1 y A2. La serie B de imágenes muestra células PC-3 en la misma secuencia que la serie A, pero ahora transfectada con un vector de expresión TRPV6 para incrementar el nivel de TRPV6 expresado por las células. Ambas serie de imágenes muestran la co-localización de SorC27-cy5.5 y TRPV6. El nivel de inmunofluorescencia TRPV6 y fluorescencia SorC27-cy5.5, ambos incrementaron las células transfectadas con una mayor expresión de TRPV6 mostrada en las series 9B de las figuras en comparación con las células de la serie 9A de las figuras.

La figura 10, muestra la detección PCR del cADN TRPV6 presente en bibliotecas cADN elaboradas de ARN total extractado de una cantidad de biopsias de tumor de ovario humano. Columna 1: En blanco; 2: LTL320 TRPV6; 3: LTL320 ß-actina; 4: LTL317 TRPV6; 5: LTL317 ß-actina, 6: LTL269 TRPV6; 7: LTL269 ß-actina, 8: escalera de 100 pares base; 9: control negativo TRPV6; 10: control negativo ß-actina. La clasificación de las densidades de banda de los 3 amplicones TRPV6 según lo reportado en la tabla 1 es de: LTL320 ( + ); LTL317 ( + + + ); LTL269 ( + + + + ). El amplicón TRPV6 tiene aproximadamente 370 pares base y el amplicón ß-actina tiene 50 pares base.

La figura 11, muestra la detección PCR del cADN TRPV6 presente en bibliotecas de cADN elaboradas de ARN total extractado en una cantidad de líneas de célula de cáncer de ovario humano. Columna 1 -En blanco; 2- escalera de 100 pares base; 3-Control positivo; 4- OVCAR3; 5- SKOV3 6A-OVC13 degradado en forma no adecuada, 6B repetición OVC13 que muestra cierta señal TRPV6; 7-HEYC2; 8-OV2008; 9--Control negativo; 10-escalera de 100 pares base. El amplicón TRPV6 tiene al menos aproximadamente 370 pares base. Las columnas 7 y 8 fueron aisladas de tamaños de muestra muy pequeñas (bajo control celular) y por lo tanto muestran señales débiles.

La figura 12A, muestra la detección PCR de cADN TRPV6 presente en bibliotecas cADN elaboradas de ARN total extractado de una cantidad de líneas de células de cáncer de seno humano. Columna 1: HCC 1954 ß-actina; 2: T47D ß-actina; 3: CF10A ß-actina; 4: escalera de 100 pares base; 5: HCC1954 TRPV6; 6: T 47D TRPV6; 7: muestra contaminada; 8: control positivo TRPV6 de un vector de expresión que contiene TRPV6 (pcAGGS-TRPV6). La figura 12B muestra la detección PCR de cADN TRPV6 presente en bibliotecas cADN elaboradas de ARN total extractado de línea de cáncer de seno humano MB423 (hacia la derecha de la escalera de 100 pares base). El amplicón TRPV6 es de aproximadamente 370 pares base.

La figura 13 muestra detección PCR del cADN TRPV6 presente en bibliotecas cADN elaboradas de ARN total extractado de una línea de célula de cáncer de próstata humana (PC-3). El amplicón TRPV6 tiene aproximadamente 370 pares base. La escalera de peso molecular es una escalera de 100 pares base. Columna 1: En blanco; Columna 2: PCR de biblioteca cADN de células PC-3; Columna 3: en blanco; Columna 4: escalera MW; Columna 5: en blanco.

La figura 14, es un manchado Western que muestra la detección de sobre-expresión de proteína TRPV6 en extractos de líneas de célula de cáncer de ovario, seno y próstata humano. Columna 1: Peso molecular estándar; 2: en blanco; 3: HEP G2 (control positivo); 4: Línea de célula de cáncer de seno T 47D; 5: Línea de célula de cáncer de ovario SKOV-3; 6: Línea de célula de cáncer de próstata PC-3. En la columna 3, el Usado HEP G2 (hepatoblastoma) muestra dos bandas:la banda superior es TRPV6 que no ha sido glucosilada, en tanto que el TRPV6 completamente glucosilado se muestra en la segunda banda. El TRPV6 es glucosilado es producido en alto nivel en los tres tipos de célula de cáncer. La desglucosilación del TRPV6 enlazado con membrana ha mostrado atrapar el canal de ión en la membrana, e incrementar la actividad del canal (Lu y asociados, 2008).

Las figuras 15A, 15B, 15C y 15D son manchados Western que muestran la detección de la proteína TRPV6 en extracto de 18 muestras de tumor de ovario humano. Cada paciente/tumor por separado se menciona como un código alfanumérico. En todas las secciones, la fecha de la parte superior a la derecha de la imagen indica la posición de la forma glucosilada de TRPV6, en tanto que la flecha inferior indica la posición de la forma desglucosilada de la proteína TRPV6. La figura 15A: Columna 1: estándar de peso molecular; 2: LTL-175; 3: LTL-205; 4: LTL-234; 5: LTL-237; 6: LTL-246; 7: HEP G2 (control positivo); 8: estándar de peso molecular. Figura 15B: Columna 1: estándar de peso molecular; 2: LTL-247; 3: LTL-258; 4: LTL-259; 5; LTL-260; 6: LTL-269; 7: HEP G2 (control positivo); 8: estándar de peso molecular. Figura 15C: Columna 1: estándar de peso molecular; 2: LTL-273; 3: LTL-284; 4: LTL-290; 5: LTL-300; 6: PC-3; 7: en blanco; 8: estándar de peso molecular. Figura 15D: Columna 1: estándar de peso molecular; 2: LTL-305; 3: LTL-315; 4: LTL-317; 5: LTL-320; 6: PC-3; 7: en blanco 8: estándar de peso molecular. El PC-3 fue una carga de proteína pequeña (50 ug) que coincide con la carga de proteína de biopsia de tumor de ovario (50 ug) y muestra una señal muy débil, escasamente visible en 15D (por ejemplo ver la figura 14, columna 3 para HEP G2 y columna 6 para PC-3). El TRPV6 desglucosilado, atrapado es la forma predominante observada en cada muestra de tumor de ovario probada. Las bandas en el control HEP-G2 están muy desvanecidas con esta cantidad de proteína cargada, e indican en forma adicional la sobre-expresión de TRPV6 en las biopsias probadas.

La figura 16, es un manchado Western que muestra la detección de proteína TRPV6 sobre-expresada en extractos de glioblastoma humano (U87MG), colon de humano (CaCo-2) y células de carcinoma pancreático (Panel). Columna 1: Marcadores de peso molecular con la banda delgada clara en 75 kDa; 2: células U87MG; 3: células CaCo-2; 4: células Pand en 2 pasajes de cultivo; 5: células Pand en 5 pasajes de cultivo; 6: células Pand en 7 pasajes de cultivo. En las últimas tres columnas, el incremento del número de pasajes parece incrementar la cantidad de TRPV6 desglucosilado. La banda superior es la forma glucosilada del canal de iones y la banda inferior es la forma desglucosilada de TRPV6.

La figura 17, muestra la calibración de la graduación para calificaciones inmunohistoquímicas de microformacion de tejido (IHC) con imágenes de muestra representativas correspondientes.

La figura 18, muestra el porcentaje de rebanadas de microformación de tejido que fueron negativas para manchado de anticuerpo TRPV6 o tuvieron una calificación de intensidad de manchado de = 1 para muestras de tejido de ovario normal en comparación con muestras de tejido de adenocarcinoma papilar seroso con cáncer grado I, grado II, o grado III. El 100% de las muestras de tejido de adenocarcinoma papilar seroso tuvieron una calificación de intensidad de mancha de = 1, en comparación únicamente con aproximadamente 24% de los tejidos de ovario normal.

La figura 19, muestra la detección de inmunohistoquímica de TRPV6 en muestras de microformación de tejidos de ovario normal, así como en muestras de carcinoma papilar seroso Grados I, II y III. Las calificaciones de intensidad de manchado de anticuerpo TRPV6 (-, -/ + , +, + + , + + + o + + + + ) también se proporcionan para cada muestra.

La figura 20, muestra la co-localización de anticuerpos para TRPV6 y SorC27-cy5.5 etiquetado en forma fluorescente en una muestra de microformación de tejido de adenocarcinoma papilar seroso grado II. El panel A muestra una biopsia de tumor de ovario manchada con un anticuerpo para TRPV6 en tanto que el Panel B muestra la misma muestra manchada con el péptido etiquetado en forma fluorescente SOR-C27-cy5.5.

La figura 21, muestra la localización dependiente del tiempo de SorC27-cy5.5 en modelos de ratón de xenoinjerto de tumores de cáncer de ovario (figura 21A) y próstata (figura 21 B). La figura 21C muestra imágenes 3-D de un ratón que indica el plano de observación (izquierdo), una imagen de una rebanada de 2 mm del ratón en el centro (media) y una imagen que muestra una rebanada perpendicular a través del centro de los tumores (derecha) para tumores tanto de ovario (SKOV-3; superior) como de próstata (DU 145; inferior).

La figura 22, muestra la expresión mARN TRPV6 relativa a controles saludables en muestras de (A) de ovario, próstata (B) y seno (C) .

La figura 23, muestra la localización de un agente de aumento MRI conjugado para el péptido de enlace TRPV6 SorC27 (SPIO-SorC27) para tumores de ovario derivados de SKOV-3 xenoinjertados en ratones desprotegidos CD-1. El panel A muestra el tumor indicado mediante la flecha color blanco antes y 24 horas después de la inyección de gránulos de control SPIO. El panel B muestra el tumor antes de (flecha blanca) y 24 horas después de la inyección con SPIO-SorC27 y la localización del agente de contraste para el sitio del tumor (flecha color blanca punteada).

La figura 24, muestra el análisis RT-PCR de la cantidad de mARN TRPV6 aisladas de muestra de sangre de controles saludables y pacientes con cánceres de próstata (figura 24A), seno (figura 24B) y ovario (24C) en diferentes etapas de cáncer. RT-PCR de mARN TRPV6 distingue fácilmente sujetos con cáncer de etapa I de controles saludables.

La figura 25, muestra la cantidad de mARN TRPV6 determinada mediante RT-PCR en plasma de sangre de mujeres saludables en comparación con mujeres con cáncer de ovario ya sea etapa I o etapa II. Los datos representan las lecturas de densidad de banda integradas de amplicones de las muestras.

Las muestras fueron determinadas por triplicado en cada muestra. Los niveles TRPV6 tanto de Etapa I (p < 0.0001) como Etapa II (p = 0.047) fueron estadísticamente más grandes en forma significativa que los observados en plasma de mujeres saludables.

La figura 26A, muestra datos de manchado Western para los niveles de proteína TRPV6 en muestras de plasma en sangre de mujeres saludables en comparación con mujeres con cáncer de ovario etapa I y etapa II. La figura muestran la densidad de banda cuantificada del manchado de anticuerpo TRPV6. Los niveles TRPV6 tanto de Etapa I (p = 0.0001) como Etapa II (p = 0.0210) fueron significativamente más altos que los observados en plasmas de mujeres saludables. La figura 26B, compara la densidad de banda de Manchados Western de plasma saludable y los datos combinados de etapa I y II data (cáncer de ovario de "etapa temprana"). El plasma de pacientes con cáncer etapa I y etapa II combinados, contenían cantidades significativamente mayores en forma estadística de proteína TRPV6, y mujeres saludables (p = 0.0006).

Descripción Detallada de la Invención El inventor de la presente invención ha determinado que la expresión del canal de calcio TRPV6 se activa en ciertas células, tal como células de cáncer de ovario, y que esta sobre-expresión es indicativa de cáncer. La presente descripción proporciona nuevos métodos para detectar la sobre-expresión de TRPV6 para identificación y/o diagnóstico de cáncer. La aplicación también proporciona nuevos compuestos y métodos que dirigen la proteína TRPV6 o células que expresan TRPV6, tal como células de cáncer.

En una modalidad, el inventor de la presente invención sintetizó compuestos que enlazan a los canales de calcio y en particular a los canales de calcio TRPV6. Los compuestos de enlace TRPV6 aquí descritos tienen identidad de secuencia con parte de soricidin, pero no exhiben actividad paralizante. Es sorprendente que los compuestos retienen la actividad de enlace TRPV-6 en la ausencia de actividad paralizante. No se ha sabido previamente que soricidin tenga dos dominios funcionales en su estructura, una parte que enlaza los canales de calcio, y la otra parte que enlaza los canales de sodio. Tampoco se ha sabido que los péptidos puedan ser preparados de modo que separen la actividad de detección/enlace del canal de calcio de la actividad paralizante de enlace del canal de sodio.

El inventor de la presente invención ha determinado que es un dominio N-terminal de soricidin que tiene la función paralítica y un dominio C-terminal que tiene la función de inhibición del canal de calcio, y más específicamente la actividad de enlace TRPV6. El truncado de soricidin en el N-terminal, produjo en forma exitosa péptidos que retienen la actividad de enlace/detección de canal de calcio sin exhibir actividad paralizante. Por consiguiente es más probable que los compuestos enlacen a TRPV6 in vivo, debido a que los canales de sodio no pueden enlazar a los compuestos y los eliminan de la circulación. Asimismo, ahora se obtiene la actividad de enlace del canal de calcio sin el efecto secundario no deseado del enlace de canal de sodio, lo cual evita la parálisis y otros efectos secundarios potenciales. La naturaleza es sorprendente de las modalidades aquí descritas se enfatiza considerando que, aunque las proteínas grandes bif uncionales y las enzimas son comunes en sistemas biológicos, la bifuncionalidad inherente es un fenómeno muy raro en péptidos pequeños, particularmente cuando un extremo del péptido enlaza a los canales de calcio y el otro extremo del péptido enlaza a los canales de sodio. Los reportes en la literatura de bifuncionalidad, normalmente resultan de la producción artificial, por ejemplo, en donde dos péptidos han sido fusionados en forma química (Anes y asociados, 2006; Yamamoto y asociados, 2008).

Los compuestos aquí descritos, normalmente tienen un componente de péptido que tiene la mitad de la longitud de soricidin, o es más corto. En una modalidad, el péptido retiene la actividad de enlace TRPV6. En algunas modalidades, el componente de péptido es la totalidad del compuesto, aunque en otras modalidades, es un componente del compuesto, por ejemplo, si el compuesto comprende un péptido conjugado para un fármaco o una etiqueta detectable. En una modalidad, el péptido de enlace TRPV6 comprende todo o parte de un péptido que comprende EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR (denominado "SorC27"; SEC ID NO:1). El péptido de enlace TRPV6 comprende opcionalmente una parte contigua de SEC ID NO:1. En algunas modalidades, el péptido de enlace TRPV6 comprende una parte contigua de la secuencia C-terminal de SEC ID NO:1. Opcionalmente, el péptido de enlace TRPV6 comprende al menos: 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos de la SEC ID NO:1. En algunas modalidades, el compuesto comprende un péptido de enlace TRPV6 que tiene al menos 50% de identidad en toda su longitud, con una parte de SEC ID NO:1. En algunas modalidades, el compuesto comprende el péptido de enlace TRPV6 que tiene al menos el 70%, 80% ó 90% de identidad en toda su longitud con una parte de SEC ID NO:1. En algunas modalidades, el péptido de enlace TRPV6 comprende opcionalmente, consiste esencialmente o consiste en la secuencia de aminoácido: HPSKVDLPR (llamada "SorC9"; aminoácidos nos. 19-27 de SEC ID NO:1), KEFLHPSKVDLPR (llamada "SorC13"; aminoácidos nos. 15-27 de SEC ID NO:1) o EG KLS S N DTE GGLC KEFLHPSKVDLPR ("SorC27"; SEC ID NQ: 1). La secuencia de aminoácido SorC9 9 HPSKVDLPR contiene tres cargas positivas en pH fisiológico que se espera interactúen con los cuatro ácidos aspárticos cargados en forma negativa que están presentes en la entrada de canal de calcio del tetrámero TRPV6 (den Dekker y asociados, 2003).

En algunas modalidades, los péptidos de enlace TRPV6 normalmente tienen 35 ó 30 aminoácidos o menos, opcionalmente menos de: 27, 25, 20, 15 ó 13 aminoácidos de longitud, aunque opcionalmente al menos 9 aminoácidos de longitud. El péptido de enlace TRPV6 comprende opcionalmente al menos 9-13, 10-15, 15-20, 20-25 ó 20-27 aminoácidos. En algunas modalidades, los aminoácidos pueden agregarse a los péptidos de enlace TRPV6 aquí descritos. Se puede hacer fácilmente péptidos más largos, agregando una variedad de aminoácidos adicionales a la secuencia SorC27 para elaborar un péptido de enlace TRPV6 que podría ser de hasta, por ejemplo, 30, 35, 40 ó 45 aminoácidos de longitud (por ejemplo, aminoácidos adicionales que corresponden a la secuencia de aminoácido de soricidin, tal como uno o más de los aminoácidos que están en forma inmediata hacia el segmento N-terminal de SorC27 en soricidin (SILARPAELNTETCILEC SEC ID NO:2), una secuencia objetivo, u otros aminoácidos) o más largo.

En algunas modalidades, los compuestos comprenden el péptido de enlace TRPV6 conjugado a una biomolécula, que es opcionalmente una segunda proteína o péptido, ya sea directamente o a través de un espaciador. En algunas modalidades, la molécula espaciadora puede ser una sustancia que contiene carbono. Por ejemplo, el espaciador puede ser un péptido corto, tal como 3 aminoácidos (Gly-Gly-Gly) o más, o una cadena de carbono, por ejemplo, (CH2)n en donde n es opcionalmente igual 1 a 5, 1 a 10, o más de 10. En otras modalidades, el espaciador es opcionalmente un polímero, por ejemplo Polietilénglicol (PEG), una azúcar, un lípido o similares.

Tal como se observó anteriormente, un péptido de enlace TRPV6 de la presente invención tendrá actividad de enlace de canal de calcio. Los péptidos que tienen dicha actividad son identificados fácilmente con cualesquiera ensayos conocidos adecuados para medir el enlace de los péptidos con TRPV6. Por ejemplo, en una modalidad, un péptido que tiene una actividad de inhibición de canal de calcio es opcionalmente identificado como determinando que el péptido reduce la actividad de canal de calcio o reduciendo (por ejemplo, inhibiendo parcial o completamente) el flujo de calcio a través de los canales de calcio. La actividad de enlace TRPV6 también puede ser medida utilizando métodos tales como: calcifluoros internalizados (tal como FURA-2am); sujeción de parche de célula completa para medir la inhibición de las corrientes de calcio en forma electrofisiológica; ensayos de enlace de equilibrio que utilizan péptidos etiquetados con etiquetas detectables tal como etiquetas radioactivas o fluorescentes; y/o determinación RMN de péptidos "enlazados" y "no enlazados". En algunas modalidades, los péptidos de enlace TRPV6 también tienen i) bloqueo de canal de calcio y ¡i) carencia de actividad paralizante.

La actividad de enlace de canal de calcio se identifica opcionalmente utilizando una línea de célula ya disponible (por ejemplo, líneas de célula de riñon embriónico humano HEK293) transfectadas con un vector de expresión para TRPV6. Dichas células transfectadas son fácilmente alicuotadas y almacenadas (normalmente a una temperatura de -80°C) hasta que se requiere. Este proporciona una separación de célula transfectada estándar, para probar la detección de los canales de ión de calcio en las células para probar la inhibición de estas actividades del canal de ión. Opcionalmente los péptidos tienen una constante de inhibición de equilibrio menor a: 1000 nM, 150 nM o 100 nM en modelos de célula LNCaP, HEK293 o SKOV-3. Por ejemplo, la constante de disociación de equilibrio (Kd) para SorC27 es de 140 nM y para SorC13 es de 100 nM en un modelo LNCaP. Con base en una relación lineal con el número de aminoácidos, el Kd de SorC9 se espera que sea de aproximadamente 90 nM.

Los péptidos de enlace TRPV6 aquí descritos se incluyen opcionalmente a análogos de los péptidos antes mencionados. Los análogos de la proteína de la presente invención incluyen opcionalmente, pero no se limitan a secuencias de aminoácido que contienen una o más sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o mutaciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácido pueden ser de naturaleza conservada o no conservada. Las sustituciones de aminoácido conservadas implican reemplazar uno o más aminoácidos de los péptidos de la presente invención con aminoácidos de carga, tamaño y/o hidrofobicidad similar. Cuando únicamente se elaboran sustituciones conservadas, el análogo resultante debe ser funcionalmente equivalente. Las sustituciones no conservadas implican reemplazar uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos que poseen características de carga, tamaño y/o hidrofobicidad disimilar. El análogo es opcionalmente un peptoide, el cual es una poliglicina N-sustituida con grupos R de aminoácidos adheridos al átomo N. Otro análogo es opcionalmente un péptido sintetizado a partir de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos naturales.

Una o más inserciones de aminoácido se introducen opcionalmente en las secuencias de péptido de enlace TRPV6 de la presente invención. Las inserciones de aminoácido consisten en péptidos de aminoácidos simples o aminoácidos secuenciales que fluctúan por ejemplo de 2 a 15 aminoácidos de longitud.

Las eliminaciones consisten en la eliminación de uno o más aminoácidos, o partes separadas de la secuencia de aminoácido del péptido. Los aminoácidos eliminados pueden o no estar contiguus.

El análogo de un péptido de enlace TRPV6 de la presente invención se prepara opcionalmente introduciendo mutaciones en una secuencia de nucleótido que codifica el péptido. Las mutaciones en las secuencias de nucleótido construidas para expresión de análogos de una proteína de la presente invención, conserva la estructura de lectura de las secuencias de codificación. Además, las mutaciones no crearán preferentemente regiones complementarias que puedan hibridar para producir estructuras de mARN secundarias, tal como lazos u horquillas, que podrían afectar de manera adversa la traducción del mARN.

Las mutaciones se introducen opcionalmente en lugares particulares, sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia muíante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligadura a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligadura, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o eliminación de aminoácidos deseadas.

Como alternativa, se emplean procedimientos de mutagénesis específica del sitio dirigida por oligonucleótido, para proporcionar un gen alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, eliminación o inserción requerida. La eliminación o truncación en péptido de la presente invención también se logra fácilmente utilizando sitios de endonucleasa de restricción convenientes adyacentes a la eliminación deseada. En forma subsecuente a la restricción, los sobresalientes se pueden llenar y religar el ADN. Los métodos de ejemplo para elaborar las alteraciones que se establecen anteriormente se describen en la Publicación de Sambrook y asociados, (Sambrook J y asociados, 2000. Clonación Molecular: Manual de Laboratorio (Tercera Edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Además, los análogos de un péptido de enlace TRPV6 de la presente invención se preparan fácilmente mediante síntesis química utilizada en técnicas conocidas en la química de proteínas, tal como síntesis de fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154) o síntesis en solución homogénea (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I y II, Thieme, Stuttgart). Los péptidos de enlace TRPV6 de la presente invención también incluyen péptidos que tienen identidad de secuencias con el péptido de la presente invención, péptidos mutados y/o truncaciones de la misma tal como se describe en la presente invención. Dichos péptidos tienen secuencias de aminoácido que corresponden a secuencias de ácido nucleico que hibridan bajo condiciones de hibridación estricta (ver descripción de condiciones de hibridación estricta en la presente invención) con una sonda utilizada para obtener un péptido de la presente invención. Los péptidos que tienen la identidad de secuencia con frecuencia tendrán las regiones que son características de la proteína.

Otros péptidos útiles de la presente invención, comprende opcionalmente, consisten esencialmente en, o consisten en una secuencia de aminoácido con al menos: 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 95% de identidad de secuencia con toda o parte de la SEC ID NO:1 aquí descrita, en donde el péptido tiene actividad de enlace TRPV6. La identidad de secuencia normalmente se evalúa mediante la búsqueda avanzada del programa BLAST versión 2.1 (parámetros tal como se describió anteriormente; Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Herramienta de búsqueda de alineación local básica", J. Mol. Biol. 215:403-410). BLAST es una serie de programas que están disponibles en línea a través de Centro Nacional para Formación de Biotecnología de los Estados Unidos (National Library of Medicine Building 38A Bethesda, MD 20894). La búsqueda Blast avanzada se establece para parámetros por omisión. Las referencias para el Programa Blast incluyen: Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Herramientas de búsqueda de alineación local básica" J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, DJ. (1993) "Identificación de regiones de codificación de proteína mediante búsqueda de similitud de bases de datos", Nature Genet. 3:266-272.; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) "Aplicaciones de servidor BLAST de red", Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., Madden, T.L, Scháffer, AA, Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, DJ. (1997) "Con brecha BLAST y PSI-BLAST: una nueva generación de programas de búsqueda de base de datos de proteína", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402); Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) "PowerBLAST: Una nueva aplicación BLAST de red para análisis y anotación de secuencia interactiva o informática". Genome Res. 7:649-656). En una modalidad adicional, se proporciona un compuesto que comprende un anticuerpo para el TRPV6 conjugado para una biomolécula.

Preparación de Anticuerpos En un aspecto, los anticuerpos para TRPV6 son útiles de acuerdo con las modalidades aquí descritas. En otro aspecto, los anticuerpos para los péptidos de enlace TRPV6, o anticuerpos para los compuestos que comprenden los péptidos de enlace TRPV6, son útiles para identificar la presencia del péptido en una muestra de prueba. Cualquier método para etiquetar el anticuerpo que pueda reportarse en la densidad/ubicación del péptido puede ser útil (por ejemplo, péptido etiquetado, radioactiva o péptido etiquetado, fluorescente). El anticuerpo normalmente es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. Los anticuerpos también son valiosos para inmuno-purificación de péptidos. Por ejemplo, se puede contactar una muestra biológica con el anticuerpo bajo condiciones que permiten la formación de un complejo inmunologico, entre el anticuerpo y un péptido reconocido por el anticuerpo, y detectar la presencia o ausencia del complejo inmunologico, mediante lo cual la presencia del péptido de la presente invención se detecta en la muestra. La presente invención también incluye composiciones, que incluyen preferentemente el anticuerpo, un medio adecuado para la formación de un compuesto inmunologico entre el anticuerpo y un péptido reconocido por el anticuerpo, y un reactivo con la capacidad de detectar el complejo inmunologico para confirmar la presencia de TRPV6, los péptidos de enlace TRPV6 de la presente invención o péptidos similares.

Para reconocer los péptidos de enlace TRPV6 de la presente invención, se pueden generar anticuerpos contra un rango de epítopes únicos a través de los péptidos. Opcionalmente, para reconocer los compuestos que comprenden los péptidos de enlace TRPV6, se pueden generar anticuerpos contra el rango de epítopes únicos en el compuesto.

Los anticuerpos monoclonales y poitclonales se preparan de acuerdo con la descripción en la presente solicitud, y técnicas conocidas en el arte. Para ejemplos de métodos de preparación y usos de anticuerpos monoclonales, ver las Patentes Norteamericanas Nos. 5,688,681, 5,688,657, 5,683,693, 5,667,781, 5,665,356, 5,591 ,628, 5,510,241 , 5,503,987, 5,501,988, 5,500,345 y 5,496,705 que están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia. Los ejemplos de la preparación y usos de anticuerpos policlonales se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,512,282, 4,828,985, 5,225,331 y 5,124,147, las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente invención, incluye fragmentos de los mismos que también reaccionan en forma específica con TRPV6 o un péptido de enlace TRPV6 de la presente invención. Los anticuerpos se pueden fragmentar utilizando técnicas convencionales, y los fragmentos clasificados para utilidad en la misma forma a la descrita anteriormente. Por ejemplo, los fragmentos, F(ab')2 pueden ser generados mediante tratamiento, enlazando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante puede tratarse para reducir puentes de disulfuro para producir los fragmentos Fab'.

En una modalidad, se puede detectar una proteína TRPV6 en una muestra contactando una muestra con los péptidos de enlace TRPV6 y posteriormente detectando el péptido de enlace TRPV6 con un anticuerpo que enlaza en forma selectiva el péptido de enlace TRPV6. En algunas modalidades el anticuerpo enlazado selectivamente al péptido de enlace TRPV6 o compuesto de la presente invención, pero no enlaza a soricidin.

Compuestos del Péptido de Enlace TRPV6 Conjugados con una Biomolécula Las modalidades aquí descritas incluyen compuestos novedosos que comprenden un péptido de enlace TRPV6 conjugado a una biomolécula. Tal como se utiliza en la presente invención, una "biomolécula" incluye cualquier átomo o molécula que sea detectable a través de medios químicos, biológicos o físicos, o exhiba actividad química o biológica. En algunas modalidades, la "biomolécula" comprende una molécula inorgánica tal como agrupaciones de boro y nanoestructuras de hierro, oro, plata y níquel. En una modalidad, la biomolécula comprende una etiqueta detectable o un agente terapéutico. En una modalidad, la biomolécula es una parte del compuesto que se puede distinguir del componente de enlace TRPV6 del compuesto.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "conjugado para una biomolécula" se refiere al enlace del péptido TRPV6 con una biomolécula. En algunas modalidades, el enlace es el resultado de un enlace químico entre un péptido de enlace TRPV6 y una biomolécula. En una modalidad, el enlace es un enlace covalente. El péptido de enlace TRPV6 también puede conjugarse a una biomolécula a través del uso de tecnologías genéticas recombinantes, y en donde una secuencia de ácido nucleico codifica el péptido de enlace TRPV6 y una biomolécula de proteína. En algunas modalidades, la molécula de enlace TRPV6 se enlaza directamente a una biomolécula. En otras modalidades, se utiliza un espaciador para enlazar el péptido de enlace TRPV6 con la biomolécula. En algunas modalidades, una molécula de enlace TRPV6 también puede ser modificada en forma química de modo que comprenda una biomolécula, tal como mediante etiquetado radioactivo del péptido de enlace TRPV6. En una modalidad la biomolécula se conjuga al péptido de enlace TRPV6 a través de un enlace que puede ser hidrolizado mediante enzimas hidrolíticas generales.

Los compuestos y composiciones aquí descritos, se pueden utilizar para detectar o enlazar la proteína TRPV6 in vivo, in vitro o ex vivo. En algunas modalidades, los compuestos incluyen una biomolécula que comprende una etiqueta detectable. Cualquier sistema de etiquetado biomolecular conocido en la técnica, también puede ser utilizado para etiquetar en forma detectable los péptidos de enlace TRPV6 aquí descritos. En algunas modalidades, la etiqueta se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, compuesto bioluminiscente, compuesto quimioluminiscente, compuesto fluorescente, un quelato de metal y una enzima. En algunas modalidades, la biomolécula puede comprender un etiquetado fluorescente, radioactivo o inmunológico.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "etiqueta fluorescente" o "fluoróforo" se refiere a una molécula o parte que puede absorber energía de una longitud de onda específica y volver a emitir energía en una diferente longitud de onda específica. Por ejemplo, los ejemplos de etiquetas fluorescentes se incluyen pero no se limitan a, Cy2, FluorX, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Rojo de Texas o Rodamina. En algunas modalidades, el compuesto incluye más de una biomolécula conjugada a péptidos de enlace TRPV6.

Los compuestos aquí descritos se pueden utilizar para suministrar biomoléculas para diagnóstico o terapéuticamente útiles para tumores, tejidos o células que producen TRPV6. En algunas modalidades, el compuesto incluye una biomolécula que se puede detectar mediante una Tomografía de Emisión de Positrones (PET), detección radiométrica o mediante Generación de Imagen de Resonancia (MRI).

En una modalidad, las biomoléculas conjugadas para péptido de enlace TRPV6 incluyen nano agrupaciones metálicas. En algunas modalidades, agrupaciones metálicas, tal como SPIO (óxido de hierro superparamagnético) proporcionan una detección muy sensible utilizando SPIO (Generación de Imagen de Resonancia Magnética) que se puede utilizar para detección primaria de tumores, tejidos y células con alto contenido de TRPV6. Tal como se muestra en el Ejemplo 28 y la figura 23, el péptido de enlace TRPV6, SorC27, conjugado para SPIO, dirige los tumores y se puede utilizar para identificar tumores de cáncer in vivo.

En algunas modalidades, los compuestos y métodos aquí descritos permiten el estimado de un volumen de tumor o seguir el cambio en el volumen de tumor durante el curso de tratamiento de cáncer. Las microvesículas trasladadas de tumores con alto contenido de TRPV6 y presentes en un fluido corporal, también se detectan fácilmente mediante conjugados de péptidos de enlace metalo-TRPV6.

En otra modalidad, los péptidos de enlace TRPV6 se conjugan con biomoléculas que son radiomoléculas, tal como biomoléculas que contienen 18F. Estos compuestos dirigen tumores, células o tejidos que expresan TRPV6, y permiten la detección in vitro, ex vivo o in vivo utilizando escaneo PET (Tomografía de Emisión de Positrones) de tumores, células o tejidos que expresan TRPV6 (Cheng y asociados. J. Nucí. Med. 48:987-994, 2007). En forma similar, las microvesículas trasldadas de tumores con alto contenido de TRPV6 y presentes en la sangre, otros fluidos corporales y excreta, se pueden detectar mediante derivados-18F de los péptidos de enlace TRPV6.

En una modalidad adicional, los péptidos de enlace TRPV6 conjugados con biomoléculas que contienen 125l, dirigen los compuestos a tumores, células o tejidos que expresan TRPV6, in vitro, ex vivo o in vivo para permitir la detección utilizando métodos radiométricos de estos tumores, células o tejidos (Bolton y asociados. Biochem. J., 133, 529-539, 1973). En forma similar, las microvesículas trasladadas de tumores con alto contenido de TRPV6 y presentes en la sangre, otros fluidos corporales y excreta, se pueden detectar utilizando los compuestos aquí descritos.

En algunas modalidades, los compuestos aquí descritos incluyen una biomolécula que es un agente terapéutico. Tal como se utiliza en la presente invención, un "agente terapéutico" es una sustancia utilizada en el tratamiento, curación, prevención o supresión de una enfermedad, trastorno o condición médica. También se puede utilizar un agente terapéutico en el tratamiento, cura, prevención o supresión de cualesquiera síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o condición médica.

En algunas modalidades, el agente terapéutico es un agente anti-cáncer. Los ejemplos de agentes anti-cáncer incluyen, pero no se limitan a fármacos a base de taxano, fármacos a base de platin, antraciclinas (por ejemplo, doxorrubicina, ciclofosfamida) , inhibidores de topoisomerasa II (por ejemplo, etoposido), agentes de alquilación (por ejemplo, ifosfamida) alcaloides de plantas (por ejemplo, vinorelbina) y antimetabolitos (por ejemplo, fluorouracilo) .

En algunas modalidades, la biomolécula es una molécula de fármaco pequeña, oligosacárido, anticuerpo, epítope de anticuerpo, agrupación nanometálica, molécula de etiqueta en forma radioactiva, fármaco a base de taxano, fármaco tipo antraciclina, fármaco a base de platin, antibiótico, fármaco anticáncer, anti-f úngico, anti-viral o anti-retroviral o complejo de boro.

En algunas modalidades, el compuesto comprende un péptido de enlace TRPV6 adherido a una biomolécula a través de un espaciador. En una modalidad, la biomolécula es una proteína o péptido y el compuesto es una proteína de fusión del péptido de enlace TRPV6 y la biomolécula. Opcionalmente, la proteína de fusión incluye un espaciador de péptido entre y el péptido de enlace TRPV6 y la biomolécula.

La presente invención también incluye un ácido nucleico aislado que codifica un péptido de enlace TRPV6 de la presente invención, tal como un ácido nucleico que codifica la SEC ID NO:1 o uno de sus fragmentos aquí descritos. La presente invención también se refiere a anticuerpos aislados contra un péptido de la presente invención. En una modalidad, el anticuerpo enlaza en forma selectiva de manera opcional a un péptido de la presente invención, pero no enlaza a soricidina.

Compuestos de los Anticuerpos TRPV6 Conjugados para una Biomolécula En otro aspecto, se proporcionan compuestos que comprenden un anticuerpo TRPV6 conjugado a una biomolécula. Estos compuestos se pueden generar y utilizar tal como se describe en la presente invención, para compuestos que comprenden péptidos de enlace TRPV6 conjugado para una biomolécula. Por ejemplo, los anticuerpos TRPV6 se pueden conjugar para una biomolécula, tal como una etiqueta detectable o agente anti-cáncer, ya sea directamente o a través de un espaciador.

Tal como se muestra en los Ejemplos 3 y 25, los anticuerpos para TRPV6 y los péptidos de enlace TRPV6 etiquetados en forma fluorescente, SorC27-cy5.5 se localizan en conjunto en células HEK293 que expresan TRPV6 recombinante, así como en muestras de adenocarcinoma papilar seroso Grado II.

Detección de TRPV6 Los compuestos aquí descritos se enlazan a canales de calcio TRPV6 y en algunas modalidades son útiles para identificar canales de calcio en células, tejidos, tumores o microvesículas. En algunas modalidades, los péptidos son útiles para identificar células, tumores, tejidos o microvesículas que no expresan TRPV6. En una modalidad adicional, los péptidos son útiles para identificar o etiquetar células, tejidos o tumores o microvesículas que expresan grandes cantidades de canales de calcio. En una modalidad, los compuestos aquí descritos son útiles para cuantificar la cantidad de TRPV6 en una muestra.

Por consiguiente, algunas modalidades aquí descritas incluyen un método para detectar una proteína TRPV6 en una muestra, en donde el método comprende contactar la muestra con un compuesto de enlace TRP tal como aquí se describe, y detectar el compuesto de enlace TRPV6. En una modalidad, el compuesto de enlace TRPV6 puede ser detectado utilizando un anticuerpo que enlaza en forma selectiva al péptido de enlace TRPV6.

Los compuestos aquí descritos que incluyen una etiqueta detectable también son útiles para detectar proteína TRPV6 o células, tejidos, tumores o microvesículas que expresan la proteína TRPV6. Por consiguiente, las modalidades aquí descritas incluyen métodos para detectar una proteína TRPV6 en una muestra, en donde los métodos comprenden contactar la muestra con cualesquiera de los compuestos que comprenden una biomolécula detectable aquí descrita, y detectar la biomolécula conjugada para el péptido de enlace TRPV6.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "muestra" se refiere a una muestra biológica representativa de un organismo o parte de un organismo. Los ejemplos de muestras incluyen pero no se limitan a, fluidos biológicos, sangre, muestras de tejido, biopsias de tejido, muestras tomadas de cultivo de tejido, fluidos biológicos, extractos de tejido, células recolectadas en forma reciente, microvesículas y Usados de células que han sido incubadas en cultivos celulares. Una "muestra" también se puede referir a un área o volumen definido de un organismo, in vivo o ex vivo, tal como un volumen de muestra o área para generación de imagen de resonancia magnética. En una modalidad, la muestra es una muestra in vitro de un sujeto, tal como una muestra de sangre tomada del sujeto.

Tal como se utiliza en la presente invención, la frase "contactar la muestra", normalmente incluye, pero no se limita a, mezclar o incubar un compuesto tal como aquí se describe con la muestra, y la muestra puede incluir componentes adicionales tales como un amortiguador, solución o reactivo de prueba. El término "contactar la muestra" también incluye inyectar o administrar un compuesto aquí descrito, a un organismo.

Identificación y Diagnóstico de Cáncer TRPV6 ha mostrado estar sobreexpresada en una cantidad de líneas de célula de cáncer. Los compuestos de enlace TRPV6 aquí descritos por consiguiente son útiles para detectar células que tienen TRPV6 sobreexpresada y por consiguiente la identificación o diagnóstico de tumores o cáncer in vivo, ex vivo o in vitro.

Los compuestos de enlace TRPV6 aquí descritos han mostrado enlazar a, y localizarse en conjunto con TRPV6 in vitro. Tal como se muestra en la figura 6 y el Ejemplo 3, un compuesto que comprende SorC27 conjugado para una etiqueta fluorescente infrarroja, enlaza a TRPV6 expresada en células HEK293 mediante transfección de las células con un vector de expresión, pero no para células HEK293 en un vector transfectado que expresa TRPV6. La figura 6 también muestra que el compuesto de enlace TRPV6 se localiza junto con un anticuerpo etiquetado en forma fluorescente para TRPV6. Las figuras 7 a 9 muestran en forma adicional que SorC27 se localiza junto con TRPV6 en una línea de célula de cáncer de próstata PC-3, línea de célula de cáncer de seno T 47D y línea de célula de cáncer de ovario SKOV-3.

TRPV6 se expresa en muestras tomadas de biopsias de tumor de ovario humano. Tal como se muestra en la figura 10 y Ejemplo 4, las transcripciones TRPV6 fueron identificadas en bibliotecas de cADN de biopsias de tumor de tejido de ovario humano. La cantidad de TRPV6 en cada muestra se estimó y también se midió en forma cuantitativa mediante densitometría con respecto a los niveles para el gen de mantenimiento ?-actin. La tabla 1, proporciona el tipo de tumor, proporción de TRPV6/ -actin y nivel TRPV6 cualitativo de 18 pacientes con tumores de ovario.

Tabla 1: Cantidades relativas de transcripciones TRPV6 en 18 biopsias de tumor de ovario humano detectadas mediante PCR de bibliotecas cADN producidas a partir de tumores, y una proporción de la densidad de banda integrada del amplicón TRPV6 a la del gen de mantenimiento D-actin.

El cADN TRPV6 también fue identificado en una cantidad de bibliotecas de cADN preparadas a partir de extractos de ARN total de líneas de célula de cáncer de ovario humano que incluyen OVCAR3, SKOV3, OVC13, HEYC2 y OV2008 tal como se muestra en la figura 11.

La expresión TRPV6 también fue determinada en relación con la expresión del gen de mantenimiento ß-actin en una serie de líneas de cáncer de seno incluyendo T47D, HCC1954 y MB468, tal como se muestra en la figura 12A y 12B. En la tabla 2 se muestran los resultados del estado del mARN TRPV6 con respecto a una cantidad de líneas de célula de cáncer de seno y líneas de células de cáncer de ovario.

Tabla 2: Estado del mARN TRPV6 de líneas de célula de cáncer de seno y ovario humano El cADN TRPV6 también fue detectado en una biblioteca cADN elaborada de una línea de célula de cáncer de próstata humana tal como se muestra en la figura 13.

Además, los niveles de proteína TRPV6 mostraron estar sobreexpresados en una cantidad de diferentes líneas de célula de cáncer y muestras de tumor de ovario tal como se muestra en las figuras 14 a 16 y el Ejemplo 5.

Por consiguiente, las modalidades aquí descritas incluyendo un método para identificar o diagnosticar cáncer en una muestra de prueba de un sujeto, en donde el método comprende detectar el mARN TRPV6 o proteína en la muestra de prueba y opcionalmente comparar la cantidad del mARN TRPV6 o proteína en la muestra de prueba con una muestra de control. En una modalidad, una cantidad incrementada del mARN o proteína TRPV6 en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control, es indicativa de cáncer. En una modalidad, el incremento mínimo de al menos 10% es indicativo de cáncer. En otra modalidad, una cantidad incrementada de al menos: 20%, 50% o 100% de mARN o proteína en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control es indicativo de cáncer. En algunas modalidades, un incremento de 3 veces la cantidad de mARN o proteína TRPV6 en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control, es indicativo de cáncer. Los ejemplos de tejidos en donde TRPV6 puede estar presente en el control son colon, riñon, próstata y seno. En otros tejidos, tal como cualesquiera tejidos derivados de endotelio, TRPV6 no se expresa en lo absoluto, de modo que la detección de la presencia del mARN o proteína TRPV6 en la muestra de prueba es indicativa de la presencia de cáncer. Opcionalmente, dichos métodos se llevan a cabo en dichos tejidos, mediante la detección de TRPV6 en la muestra de prueba, sin utilizar tampoco una comparación con la muestra de control.

Los tumores con alto contenido de TRPV6 son casi exclusivamente de origen epitelial, aunque algunas líneas de célula de cáncer de próstata tal como DU145 no expresan TRPV6. Los tipos de cánceres que tienen alto contenido de TRPV6, incluyen, pero no se limitan a, cánceres de ovario, seno, próstata, hígado endometrial, glial, colon, pancreático y leucemia.

En algunas modalidades, el sujeto es un mamífero, tal como un humano. En algunas modalidades, los métodos aquí descritos se utilizan in vivo, ex vivo o in vitro.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "muestra de control" incluye cualquier muestra que pueda ser utilizada para establecer una base o nivel normal, y puede incluir muestras tomadas de personas o tejidos saludables. En algunas modalidades, la "muestra de control" es un control estandarizado predeterminado. En algunas modalidades, la "muestra de control" es un valor, umbral o rango predeterminado.

Tal como se utiliza en la presente invención, la frase "identificación de cáncer" incluye la detección de células en una muestra de un sujeto, que han perdido los mecanismos de control normal, y tienen un crecimiento proliferativo no regulado. Opcionalmente, la "identificación de cáncer" en una muestra de un sujeto, puede referirse a diagnosticar cáncer en el sujeto.

En alguna modalidad, los métodos aquí descritos se pueden utilizar para proporcionar información adicional con respecto al tumor o cáncer. La determinación de la etapa o tipo de cáncer incluye normalmente, la determinación de información con respecto a la etapa de cáncer (por ejemplo, etapa de tumor) o tipo de cáncer. En una modalidad, la etapa de cáncer se determina tal como se sabe en la técnica, utilizando el sistema de Tumor, Nodo, Metástasis (TNM). T (para Tumor) se refleja en el tamaño de tumor primario y en donde se localiza; N (para nodo) se refleja en si el tumor se ha dispersado al nodo linfático; y M (para Metástasis) refleja si el cáncer tiene metástasis (Ver por Ejemplo la Publicación de AJCC Cáncer Staging Manual, Séptima Edición (2010) publicado por Springer-Verlag Nueva York, incorporada a la presente invención como referencia). Por ejemplo, en una modalidad, el cáncer es cáncer de ovario y se pueden utilizar los siguientes lineamientos de generación de etapas.

Etapa I (en ovarios): T1, NO, MO con sub-etapas I A, B, C (en donde N y M permanecen en "0").

Etapa II (en uno o ambos ovarios, invasión pélvica): T2, NO, M0 con sub-etapas II A, B, C (en donde N y M permanecen en "0") Etapa III (en ovarios, región pélvica y disperso en área peritoneal >2cm: T3 NO, MO con sub-etapas III A, B, C (en donde N y M permanecen en "0"); Etapa IIIC (en la linfa): T, N1, MO Etapa IV (dispersión a órganos distantes): cualquier T, cualquier N, M1 Opcionalmente, los métodos aquí descritos son útiles para caracterizar en forma adicional un tumor, proporcionando un estimado del volumen de tumor, ubicación de tumor o tipo de tumor. En algunas modalidades, el diagnóstico de cáncer incluye obtener información de respuesta de terapia, tal como para determinar el resultado de un curso de terapia anti-cáncer en el tamaño de tumor, normalmente medido como el volumen de tumor.

Tal como se muestra en el Ejemplo 24, los niveles de TRPV6 son más altos en muestras de tejido de sujetos con cáncer en comparación con muestras de tejido normal. Más específicamente, la figura 18 y la tabla 3 muestran que las muestras de micro-formación de tejido de adenocarcinoma papilar seroso Grado I, II y III, exhibieron mayor expresión de TRPV6 en comparación con muestras de tejido de ovario normal. Los niveles de TRPV6 son útiles para distinguir entre cánceres de grado I de etapa temprana en comparación con muestras normales. Por consiguiente, la detección de TRPV6, utilizando anticuerpos o utilizando péptidos de enlace TRPV6 aquí descritos es útil para identificar o diagnosticar sujetos con cáncer o con una mayor probabilidad de desarrollar cáncer. Opcionalmente, los niveles de expresión TRPV6 son útiles para graduar cánceres o identificar formas de cáncer más agresivas.

En algunas modalidades, los métodos aquí descritos se utilizan para identificar o diagnosticar cáncer de seno, cáncer de ovario, cáncer de sangre, cáncer de cerebro, cáncer retinal, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer glial o cáncer endometrial .

En una modalidad, la medición de la expresión del gen trpv6, a través de la medida de la cantidad de mARN TRPV6 o transcripciones de cADN correspondientes producidas en la muestra o línea celular, proporciona una herramienta de diagnóstico con la cual se identifica cáncer en una muestra. En algunas modalidades, la presencia de una cantidad de mARN TRPV6 o transcripciones en una muestra de un sujeto, se utiliza para diagnosticar o indicar la etapa de cáncer en el sujeto. Por ejemplo, la figura 24 muestra que los niveles relativos de mARN TRPV6 en la sangre, son significativamente mayores en sujetos con cáncer en comparación con niveles en controles saludables. Por consiguiente, en una modalidad, la presencia o cantidad de mARN TRPV6 o transcripciones en una muestra de un sujeto, es útil para identificar cáncer en un sujeto. En una modalidad, la presencia o cantidad de mARN TRPV60 transcripciones en una muestra es útil para identificar cáncer de ovario, seno o próstata en un sujeto.

Tal como se muestra en la figura 25, la cantidad relativa de proteína TRPV6 también es mayor en muestras de plasmas de sujetos con cáncer de ovario tal como I o II, en comparación con controles saludables. Por consiguiente, en una modalidad, la detección de proteína TRPV6 es útil para identificar cáncer en un sujeto. Por ejemplo, en una modalidad, los niveles de proteína TRPV6 en una muestra de prueba de un sujeto, se comparan con niveles de proteína TRPV6 en un muestra correspondiente de un control saludable, en donde los mayores niveles de TRPV6 en la muestra de prueba son indicativos de cáncer. En una modalidad, la muestra de prueba es una muestra de sangre o plasma, y un nivel de TRPV6, que es dos veces tan alto con el nivel en una muestra correspondiente de un control saludable, es indicativo de cáncer.

Tal como se establece en el Ejemplo 1 y las figuras 1 a 3, los péptidos de enlace TRPV6 se localizan en forma predominante en nodos linfáticos, aunque también en pulmón, hígado y riñon, los cuales son sitios comunes en donde se localiza un cáncer metastático. Por consiguiente, los péptidos de enlace TRPV6 aquí descritos son útiles para detectar y enlazar a cáncer metastático, incluyendo glioblastomas y cánceres que han sido dispersados al pulmón, hígado, riñon, bazo, páncreas y médula ósea.

Los péptidos y los compuestos aquí descritos son particularmente útiles para detectar y enlazar a metástasis de nodo linfático. El término "metástasis de nodo linfático" incluye opcionalmente cáncer de pulmón (Mujoomdar y asociados, 2007), cáncer gástrico, carcinoma cervical (Lyshchik y asociados, 2007), carcinoma de vulva (Vernooij y asociados, 2007), cáncer endometrial (Aalders y asociados, 2007), carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello (Veness y asociados, 2007), cáncer de esófago y garganta, carcinoma nasofaríngeo (Ma y asociados, 2007), cáncer gastrointestinal (Wind y asociados, 2006), cáncer de vesícula, cáncer de cerebro (Mujoomdar y asociados, 2007), cáncer de tiroides, cáncer de seno, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de célula glial y cáncer colorrectal. Los péptidos de la presente invención por consiguiente son útiles para detectar cáncer en un mamífero, en cualesquiera de las etapas de cáncer I, II, III o IV.

Los péptidos de enlace TRPV6 y composiciones aquí descritas, también son útiles para detectar canales TRPV6 intactos presentes en microvesículas trasladadas de tumores, que circulan en la sangre o células de cáncer que circulan en la sangre. En algunas modalidades, las microvesículas mudan de piel de tumores que expresan TRPV6, células de cáncer que circulan en fluidos corporales o excreta, se detectan mediante métodos a base de PCR (por ejemplo RT-PCR o Q-RT-PCR) o métodos a base de anticuerpos (por ejemplo manchado Western, detección inmunofluorescente en biopsias o cuerpos, tal como células o microvesículas en fluidos corporales o excreta). Por ejemplo, las microvesículas intactas derivadas de células de tumor y presentes en un fluido corporal o excreta pueden mostrar una población de canales TRPV6 cuando se tratan con anticuerpos TRPV6 o péptidos de enlace TRPV6 conjugados con una biomolécula detectable. Por ejemplo, las figuras 24 a 26 muestran que las muestras de sangre y plasma tomadas de sujetos con cáncer, incluyendo cáncer etapa I, tienen niveles significativamente mayores de mARN o proteína TRPV6 en comparación con controles saludables. Los fluidos corporales de prueba, tal como sangre o plasma para mARN o proteína TRPV6, o por consiguiente proporciona una prueba relativamente simple de la detección de etapa temprana de cáncer, en comparación con, por ejemplo, detección de tumores y biopsias para prueba de tumores con respecto a la presencia de células de cáncer.

Los anticuerpos desarrollados para los péptidos de enlace TRPV6 son útiles para detectar el péptido de enlace TRPV6/complejo TRPV6 en tumores, tejidos o células in vitro o ex vivo, etiquetando los anticuerpos de péptido de enlace TRPV6 con una entidad detectable (etiqueta fluorescente, etiqueta radioactiva, etc.)- En forma similar, las microvesículas trasladadas de tumores con alto contenido de TRPV6 y presentes en fluidos corporales y excreta, son detectadas fácilmente mediante dichos anticuerpos conjugados de péptidos de enlace TRPV6.

Suministro de Fármaco y Métodos de Fabricación Los péptidos de enlace TRPV6 y compuestos aquí descritos son útiles para suministrar biomoléculas para tumores, células o tejidos que expresan TRPV6. Tal como se muestra en los ejemplos 26 y 28, los péptidos de enlace TRPV6 tienen la capacidad de dirigir células que expresan TRPV6 y suministros compuestos a sitios de tumor ¡n vivo.

Por consiguiente, una modalidad incluye un método para fabricar un compuesto farmacéutico, conjugando una biomolécula para un péptido de enlace TRPV6. Las biomoléculas son parcialmente conjugadas para los péptidos de enlace TRPV6 o anticuerpos para los péptidos de enlace TRPV6, a través de métodos conocidos en la técnica, tal como los establecidos en los Ejemplos 1, 11-13, 16, 19-23, 26 y 28.

Las biomoléculas pueden ser conjugadas para el péptido de enlace TRPV6 enlazando ya sea directa o indirectamente el péptido de enlace TRPV6 a la biomolécula. En una modalidad, el péptido de enlace TRPV6 se conjuga Cy5.5 en el tiol de cisteína simple a través de una reacción activada por maleimida. En otras modalidades, la biomolécula se enlaza a cualesquiera del término C o término N del péptido. En otras modalidades, la biomolécula se enlaza a través de cualquier otro sitio molecular adecuado, tal como una cadena lateral de un grupo funcional del péptido.

La biomolécula también puede conjugarse para un péptido de enlace TRPV6 a través de modificación química tal como mediante una ligadura de éster o una ligadura de amida. Varios métodos para conjugar péptidos para una biomolécula se describen por ejemplo en la Publicación de Peng Li y asociados, Biopolymers 87: 225-230, 2007; Patente Norteamericana No. 6,348,317; y Solicitudes Norteamericanas Nos. 20070218502 y 20070020264.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para fabricar un compuesto farmacéutico, en donde el método comprende conjugar una biomolécula a un anticuerpo TRPV6.

Otra modalidad incluye un método para suministrar una composición farmacéutica a una célula que expresa TRPV6, en donde el método comprende contactar la célula con un compuesto que comprende i) un péptido de enlace TRPV6 conjugado para una biomolécula y ii) un transportador. Los métodos de suministro de una composición farmacéutica incluyen métodos para suministrar las composiciones que comprenden los péptidos de enlace TRPV6 aquí descritos.

En una modalidad, los compuestos comprenden opcionalmente un péptido de enlace TRPV6 alterado en forma química para suministrar agrupaciones nano-metálicas a tumores, tejidos o células (por ejemplo, nano-partículas de oro, nano-esferas, nano-tubos u otras nano-construcciones) que, cuando se irradian con radiación electromagnética, se calientan y exterminan células en los alrededores de la agrupación metálica.

En otra modalidad, el compuesto comprende péptidos de enlace TRPV6 que son alterados químicamente para suministrar agrupaciones de boro (por ejemplo closo-boro, una agrupación que contiene 12 átomos de boro) la cual, cuando se irradia con neutrones térmicos lentos, produce partículas alfa energéticas que exterminan células circundantes. Otros compuestos comprenden péptidos de enlace TRPV6 de la presente invención alterados en forma química para suministrar a tumores, células o tejidos que producen TRPV6, antígenos que sirven para reclutar los anticuerpos pre-existentes a los tumores, tejidos o células con alto contenido de TRPV6. Esto a su vez, puede marcar cánceres para destrucción mediante el sistema de célula inmune.

Los compuestos aquí descritos también son útiles para suministrar a tumores, células o tejidos que producen TRPV6, antígenos novedosos hacia los cuales se desarrollan en forma específica anticuerpos monoclonales y se administran con el resultado de ser anticuerpos de etiquetado de cánceres con alto contenido de TRPV6. Esto puede marcar cánceres para destrucción a través del sistema de célula inmune.

Los compuestos aquí descritos también son útiles para suministrar moléculas etiquetadas en forma radioactiva, adheridas en forma covalente que suministran una dosis de radiación terapéutica a tumores, tejidos o células con alto contenido en canales TRPV6.

Los compuestos descritos, suministran opcionalmente a tumores, células, o tejidos que producen TRPV6, terapéuticos adheridos en forma covalente tal como los fármacos a base de taxano, fármacos tipos antraciclina, fármacos a base de latín u otras moléculas terapéuticas. Los métodos y compuestos aquí descritos también son útiles para suministrar antibióticos, anti-fúngicos, anti-virales y anti-retrovirales o cualquier otro fármaco terapéutico, a células que expresan TRPV6 o a nodos linfáticos, pulmón, hígado y/o riñon.

Detección de Tumores de Cáncer en un Sujeto Tal como se muestra en los ejemplos 26 y 28 y en las figuras 21 y 23 correspondientes, la detección de TRPV6 puede ser utilizada para identificar un tumor de cáncer en un sujeto in vivo. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "identificación de un tumor de cáncer" se refiere a localizar o detectar una región en una muestra o sujeto que tiene un tumor de cáncer. Tal como se utiliza en la presente invención, un "tumor de cáncer" se refiere a un neoplasma o una lesión sólida formada mediante el crecimiento anormal de células que han perdido el mecanismo de control normal, y tienen un crecimiento proliferativo no regulado. Una cantidad de cánceres han mostrado sobreexpresar TRPV6, y por consiguiente generar tumores con alto contenido de TRPV6 (ver Ejemplos 4 y 5). Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona un método para detectar un tumor de cáncer, en donde el método comprende administrar a un sujeto un compuesto que comprende un péptido de enlace TRPV6 o un anticuerpo para TRPV6. Preferentemente, los compuestos también incluyen una etiqueta detectable que facilita la detección de TRPV6 en el sujeto. Por ejemplo, en una modalidad, el péptido de enlace TRPV6 es SorC27, y la etiqueta detectable es Cy5.5. En otra modalidad, el péptido de enlace TRPV6 se conjuga a un agente de contraste de generación de imagen de resonancia magnética (MRI), tal como un óxido de hierro superparamagnético y se utiliza MRI para detectar regiones en una muestra o sujetos con niveles incrementados de TRPV6. Las regiones del sujeto que exhiben niveles incrementados de TRPV6 son indicativas de un tumor con alto contenido de TRPV6 en dicha región. Los modelos matemáticos que comparan la distribución de TRPV6 a través del sujeto son aplicados fácilmente para identificar regiones específicas del sujeto que tienen niveles incrementados de TRPV6 que son indicativos de un tumor con alto contenido de TRPV6. En algunas modalidades, se utiliza un nivel promedio de TRPV6 observado en un sujeto, para normalizar los niveles TRPV6 e identificar las regiones específicas con una expresión incrementada de TRPV6. En otras modalidades, los niveles de TRPV6 se comparan con un nivel de control pre-estandarizado o con niveles observados en regiones correspondientes en sujetos conocidos por no contener tumores de TRPV6 con alto contenido de TRPV6.

Un experto en la técnica apreciará una cantidad de técnicas de generación de imagen y etiquetas detectables correspondientes como adecuadas para detectar tumores con alto contenido de TRPV6 de acuerdo con la presente descripción. Por ejemplo, los péptidos de enlace TRPV6 son etiquetados opcionalmente en forma radioactiva y detectados utilizando un contador de centelleo. Como alternativa, los péptidos de enlace TRPV6 se etiquetan en forma fluorescente y se detectan utilizando un sistema de detección óptica. En una modalidad, los péptidos de enlace TRPV6 se conjugan con un agente de contraste. Tal como se utiliza en la presente invención, un "agente de contraste" es una sustancia utilizada para aumentar el contraste de estructuras de células dentro de una muestra de un sujeto en generación de imagen médica. En una modalidad, el agente de contraste es un agente de contraste MRI, tal como un agente que altera el tiempo de relajación T1 o T2 de los protones localizados en forma cercana. Los ejemplos de los agentes de contraste MRI incluyen gadolinio paramagnético, manganeso paramagnético u óxido de hierro paramagnético (SPIO).

Propiedades Adicionales de los Péptidos Los péptidos de enlace TRPV6 de los compuestos aquí descritos, tal como SorC13 y SorC27, normalmente son estables en solución acuosa a una temperatura de 4°C durante al menos 3 semanas sin cambio en la pureza, tal como se mide mediante HPLC. En la forma de sólidos secos, los péptidos normalmente son estables a una temperatura de -80°C durante al menos 1.5 años.

Los péptidos de enlace TRPV6 también evitan efectos adversos mayores de los farmacéuticos relacionados con la capacidad que tiene una sustancia de atravesar la barrera protectora del sistema nervioso central, la barrera de sangre-cerebro. La incapacidad de los péptidos de la presente invención para atravesar esta barrera protectora, evitan la toxicidad potencial al sistema nervioso central.

Los péptidos de la presente invención, particularmente los péptidos más cortos, tal como SorC13, normalmente son menos antigénicos. Los péptidos que tiene un número de aminoácidos igual o menor a los del corte empírico para antigenicidad (considerado normalmente como 13 aminoácidos para péptidos en general), poseen no antigenicidad.

Algunas modalidades incluyen los tipos empacados previamente que comprenden parte o todos los reactivos necesarios para llevar a cabo cualesquiera de los métodos aquí descritos. Opcionalmente, los equipos pueden incluir una o más muestras de control. En algunas modalidades, la muestra de control es conocida por expresar o contener TRPV6 (un control positivo). En otras modalidades, la muestra de control es un control negativo que es conocido por no expresar o contener TRPV6. En una modalidad adicional, la muestra de control es conocida por expresar o contener un cierto nivel de TRPV6 o que corresponde a un tipo o etapa específica de cáncer. En algunas modalidades, los equipos incluyen al menos un compuesto que comprende un péptido de enlace TRPV6 tal como aquí se describe, y una solución amortiguadora. En algunas modalidades, los equipos pueden incluir cebadores de ácido nucleico para amplificar o detectar el mARN TRPV6 en una reacción de cadena de polimerasa. En algunas modalidades, los equipos también incluyen nucleótidos, enzimas o amortiguadores útiles en el método de la presente invención, así como marcadores electroforéticos, tal como una escalera de pares base. En algunas modalidades, los equipos incluirán instrucciones detalladas para llevar a cabo los métodos aquí descritos .

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran modalidades de la presente invención y no limitan el alcance de la misma.

EJEMPLO 1: Distribución de Tejido de SorC13 y SorC27 SorC13 y SorC27 fueron etiquetados con la sonda casi infrarroja, Cy5.5. SorC13 fue etiquetada en lisina-1 y lisina-8 con la sonda fluorescente infrarroja cy5.5, a través de la reacción con el proceso activado por éster Cy5.5 NHS. SorC27 fue etiquetado en el tiol de cisteína simple con reacción activada por maleimida Cy5.5. Los péptidos etiquetados fueron purificados con una combinación de cromatografía de exclusión por tamaño y HPLC. La etiqueta, Cy5.5, fluoresce en la región infrarroja después de excitación con un láser de exploración. El láser de energía baja tiene la capacidad de penetrar al animal en aproximadamente 1 cm, y por lo tanto, explorando las posiciones de prone y supina, la presencia de péptidos etiquetados puede ser cuantificada en tres dimensiones.

Los péptidos etiquetados-Cy5.5 fueron inyectados en forma intravenosa en ratones CD1 (4 para cada compuesto) en 100 g por animal en 100 µ?, y los animales tuvieron generación de imágenes en vivo utilizando un sistema de generación de imagen óptica, Optix eXplorer (GE Healthcare Systems) en diferentes puntos de tiempo (30 minutos, 90 minutos, 4 h). Algunos animales fueron observados a las 24 horas después de la perfusión para eliminar la sangre (y linfa).

La bio-distribución de los péptidos etiquetados en diferentes órganos y tejidos fue visualizada y cuantificada en forma relativa mediante análisis de generación de imagen óptica. Este protocolo permite la visualización de la localización de los péptidos etiquetados, y como cambia la ubicación con el tiempo. La figura 1 muestra la ubicación de los nodos linfáticos en un ratón. Los nodos que acumularon los péptidos etiquetados son indicados mediante la línea 1 (nodos cervicales superficiales), línea 4 (nodos axilares), línea 5 (nodos braquiales), línea 8 (nodos mesentéricos) y línea 9 (nodos inguinales). Las figuras 2, 3 y 4 muestran las cantidades de péptidos etiquetados en diversos órganos in vivo. Combinados, estos experimentos muestran que: • Ninguno de los pépt¡dos-C se movió a través de la barrera sangre-cerebro.

• SorC13 y SorC27 etiquetados se localizan predominantemente en nodos linfáticos, pulmón, hígado y riñon.

· SorC13 y SorC27 etiquetados fueron aún detectables en estos tejidos después de perfusión en 24 horas.

• La medida del tiempo de vida de fluorescencia en diversos órganos, mostró que el metabolismo de los péptidos etiquetados parece estar en el hígado y riñon, ya que Cy5.5 tiene un tiempo de vida más corto que los aductos de péptido/Cy5.5.

• Los péptidos de enlace TRPV6 tienen la capacidad de dirigir TRPV6 con un "cargo" enlazado a los péptidos que se pueden suministrar a estos tejidos.

EJEMPLO 2: Co-localización de Anticuerpos TRPV6 y TRPV6 Etiquetado en Forma Fluorescente Expresado en Células de Cáncer Humano Tal como se muestra en la figura 5, TRPV6 expresado en línea de célula de cáncer (SKOV-3) o en muestras ex vivo, se detecta opcionalmente utilizando un anticuerpo primario para la proteína TRPV6, seguido de un anticuerpo secundario, el cual es en sí mismo, detectable. En forma adicional, los cánceres se detectan fácilmente utilizando los péptidos de enlace TRPV6 conjugado o etiquetados con una molécula detectable. Como alternativa, un anticuerpo desarrollado para los péptidos de enlace TRPV6 se etiqueta fácilmente con una entidad detectable tal como una etiqueta fluorescente o etiqueta radioactiva.

Asimismo, un anticuerpo para los péptidos de enlace TRPV6 se desarrolló y utilizó fácilmente en una forma inmunoquímica tradicional para tejidos (in vitro), tumores, células o microvesículas.

EJEMPLO 3: Co-Localización de Péptidos de Enlace TRPV6 y Anticuerpos para TRPV6 en Células HEK269 Las células HEK-293 fueron transfectadas con vector de expresión TRPV6 e incubadas con anticuerpos etiquetados en forma fluorescente para los péptidos N-terminal de TRPV6, así como SorC27 etiquetado en forma fluorescente (SorC27-cy5.5) . Las células HEK-293 que no fueron transfectadas con un vector de expresión TRPV6, también se incubaron con anti-TRPV6 y SorC27-cy5.5 etiquetado en forma fluorescente como un control negativo (figura 6A) .

Tal como se muestra en las figuras 6B a 6D, SorC27-cy5.5 se enlazó a TRPV6 tal como se indica mediante la localización conjunta de SorC27-cy5.5 y anti-TRPV6. Este experimento muestra que los compuestos aquí descritos dirigen y enlazan a TRPV6 y además, que los compuestos que comprenden un péptido de enlace TRPV6 conjugado a una biomolécula, se localizan en forma efectiva para células que expresan TRPV6. EJEMPLO 4: Expresión de mARN TRPV6 en Líneas de Célula de Cáncer y Bíopsias de Tumor como un Diagnóstico para Cáncer y para Generar Etapas de Cáncer Tal como se muestra en las figuras 10 a 13, la reacción de cadena de polimerasa con cebadores dirigidos hacia transcripciones TRPV6, detecta la activación del mARN TRPV6 en bibliotecas cADN producidas de extractos de ARN total de células de cáncer o biopsias de tumores cancerosos humanos.

Con el objeto de cuantificar la cantidad relativa de transcripciones TRPV6 en una muestra, las transcripciones también fueron amplificadas y detectadas para el gen de mantenimiento D-actin y la proporción observada de D-actin TRPV6 fue registrada.

En efecto se encuentra un mecanismo común en todos los tipos de cáncer aquí referenciados, ya que todos son derivados de tejidos epiteliales. Peng y asociados mostró en cáncer de próstata, que las cantidades normalizadas de mARN TRPV6 fueron aproximadamente 2 veces mayores en muestras de sujetos con calificaciones de Gleason de 5 a 7 en comparación con muestras con hiperplasia benigna, y aproximadamente 3 veces más en muestras con calificaciones de Gleason de 8 a 9.

Las figuras 10 a 13 muestran un incremento significativo en la expresión de TRPV6 en muestras de líneas de cáncer, tal como cáncer de ovario. Los métodos aquí descritos que detectan los niveles ya sea de mARN o proteína TRPV6, por consiguiente son útiles para generar las etapas de cáncer, tal como cáncer de ovario.

EJEMPLO 5: Análisis de Proteína TRPV6 en Células de Cáncer Se utilizó manchado Western utilizando anticuerpos desarrollados para TRPV6, para detectar la expresión de proteína TRPV6 en una cantidad de células de cáncer.

Tal como se muestra en la figura 14, la proteína TRPV6 estuvo sobre-expresada en extractos de líneas de células de cáncer de ovario (SKOV-3), seno (T47D) y cáncer de próstata (PC-3) en comparación con extractos de línea de célula de control de hepatoblastoma HEP G2 conocida por expresar TRPV6.

Las figuras 15A a 15D, muestran que los extractos de tumores de ovario de humano también sobre-expresan proteína TRPV6 y que TRPV6 está activada en tumores de ovario.

La figura 16 muestra que TRPV6 se sobre-expresa en células de glioblastoma humano (U87MG), colon humano (CaCo-2) y carcinoma pancreático (Panel). Además, el grado de des-glucosilacion en Pand, incrementa con números en incremento de pasaje en cultivo.

En forma colectiva los datos de las figuras 14 a 16, muestran que la proteína TRPV6 está sobreexpresada en una cantidad de células de cáncer y muestras de tumor de ovario. EJEMPLO 6: Uso de Anticuerpos TRPV6 para Determinar Etapas de Cáncer Los anticuerpos para TRPV6 se utilizan para determinar la etapa de un tumor (por ejemplo, tumores de ovario) utilizando métodos de ¡nmunolocalización. Las microf ormaciones de tejido de tumores de ovario con etapas asignadas, fueron sondeadas con anticuerpos TRPV6 etiquetados en forma fluorescente.

Resultados Los experimentos muestran que, conforme progresa la etapa del tumor de la etapa I a la etapa IV existe un incremento en la densidad de la señal de inmunof luorescencia, lo que indica un incremento en la población de canales TRPV6 en los tejidos.

EJEMPLO 7: Uso de Péptidos de Enlace TRPV6 Etiquetados en Forma Fluorescente para Determinar Etapas de Cáncer Los péptidos de enlace TRPV6 etiquetados en forma fluorescente con útiles para determinar la etapa de un tumor, mediante incubación directa de la Microformaciones de Tejido (TMA) con el reactivo de péptido. El compuesto SorC27-cy5.5 se incuba con células de un sujeto y se comparan los niveles de fluorescencia con niveles de muestras de tumor con etapa de control.

Resultados Los experimentos muestran que, conforme progresa la etapa del tumor de Etapa I o Etapa IV, esto es un incremento en la intensidad de la señal fluorescente debido al enlace del compuesto etiquetado, que comprende etiquetado-SorC27 con cy5.5 para la población incrementada de canales TRPV6.

EJEMPLO 8: Uso de Anticuerpos Etiquetados en Forma Fluorescente para Compuestos que Comprenden los Péptidos de Enlace TRPV6, para Determinar Etapas de Cáncer Los anticuerpos etiquetados en forma fluorescente para péptidos de enlace TRPV6 se utilizan para detectar péptidos de enlace TRPV6 enlazado a canales TRPV6 de una microformación de tejido de cáncer de ovario validada.

Resultados Después de incubar el TMA con uno de los péptidos de enlace TRPV6, y posteriormente implementando un anticuerpo sujetado en forma fluorescente desarrollado contra los péptidos de enlace TRPV6, existe una correlación positiva entre la intensidad de la señal fluorescente con la etapa del cáncer de Etapa I a Etapa IV.

EJEMPLO 9: Péptidos de Enlace TRPV6 Etiquetados en Forma Fluorescente que Enlazan a Tumores con Alto Contenido de TRPV6 Xenoinjertados en Ratones Los ratones xenoinjertados con tumor con alto contenido de TRPV6 de ovario (células SKOV-3) se inyectaron con el péptido de enlace TRPV6 etiquetado en forma fluorescente SorC27-cy5.5.

Resultados Los tumores de ovario que sobreexpresan el canal TRPV6 se detectan in vivo mediante compuesto SorC27-cy5.5 , después de la administración a ratones en los cuales se xenoinjertaron tumores TRPV6 (por ejemplo, tumores de ovario). La masa de tumor xenoinjertada con alto contenido de TRPV6 derivada de células SKOV-3, se puede distinguir claramente del tejido de fondo como fuertemente fluorescente en los rayos infrarrojos. EJEMPLO 10: Uso de Péptidos de Enlace TRPV6 etiquetados con Óxido de Hierro Súper Paramagnético (SPIO) Para Detectar Células que Producen TRPV6 Se incubó un compuesto que comprende péptido de enlace TRPV6 conjugado con Óxido de Hierro Súper Paramagnético, tal como SPIO-SorC27, con células SKOV-3 (positivas TRPV6) y células HEK293 (negativas TRPV6) . Posteriormente se generaron imágenes de las células, utilizando generación de Imagen de Resonancia Magnética.

Resultados Las células SKOV-3 que sobre-expresan el canal TRPV6 se detectaron in vitro mediante agentes de aumento MRI tal como SPIO-SorC27. Las células SKOV-3 con alto contenido de TRPV6 se pueden distinguir claramente de las células HEK293 negativa-TRPV6 mediante señales de resonancia magnética fuertemente aumentadas y generación de imagen.

EJEMPLO 11: Péptidos de Enlace TRPV6 Etiq uetados-SPIO que Enlazan a Tumores que Expresan TRPV6, pero no a Tumores Negativos-TRPV6 A los ratones xenoinjertados con tumor de ovario con alto contenido de SKOV-3 TRPV6 se les administró SPIO-SorC27 y se generó la imagen utilizando Generación de Imagen de Resonancia Magnética.

Resultados Los resultados muestran que los péptidos de enlace TRPV6 conjugados con SPIO enlazan a tumores con alto contenido de TRPV6 de la línea de célula de cáncer de ovario humano SKOV-3, y se pueden generar imágenes utilizando Generación de Imagen de Resonancia Magnética. Los experimentos muestran que los tumores de ovario que sobre-expresan el canal TRPV6 son detectados in vivo mediante agentes de aumento MRI tal como SPIO-SorC27, después de administración a los ratones. La masa del tumor con xenoinjerto con alto contenido de TRPV6, es distinguida claramente del tejido de fondo, mediante señales de resonancia magnética fuertemente aumentadas y generación de imagen.

EJEMPLO 12: Uso de Péptidos de Enlace TRPV6 Conjugados para Radio-Moléculas que Contienen 18F Los compuestos que comprenden péptidos de enlace TRPV6 etiquetados en forma covalente con radio-moléculas que contienen 18F dirigen dichas moléculas a tumores, células o tejidos que expresan TRPV6 que permiten la detección utilizando escaneo PET (Tomografía de Emisión de Positrones) y detección de estos tumores, células o tejidos (Cheng y asociados. J. Nucí. Med. 48:987-994, 2007). SorC27 conjugado con una radio-molécula que contiene 8F se incuba con células SKOV-3 y células HEK293. Posteriormente se generan las imágenes de las células utilizando escaneo PET.

Resultados El 18F-SorC27 muestra claramente la identificación de las células SKOV-3 con alto contenido de TRPV6 en comparación con células negativas-TRP V6 (HEK293).

EJEMPLO 13: Uso de Péptidos de Enlace TRPV6 Conjugados para Radio-Moléculas que Contienen 12SI Los compuestos que comprenden péptidos de enlace TRPV6 etiquetados en forma covalente con radio-moléculas que contienen 125l dirigen dichas moléculas a tumores, células o tejidos que expresan TRPV6 y permiten la detección utilizando detección radiométrica de estos tumores, células o tejidos (Bolton y asociados. Biochem. J., 133, 529-539, 1973). SorC27 conjugado con una radio-molécula que contiene 125l se incuba con células SKOV-3 y células HEK293. Posteriormente se generaron las imágenes de las células utilizando escaneo PET. Resultados El péptido-125! muestra claramente la identificación de las células TRPV6 con alto contenido de TRPV6 en comparación con células negativas-TRPV6 (HEK293).

EJEMPLO 14: Detección de mARN TRPV6 en Microvesículas Aisladas de Muestras de Sangre, Otros Fluidos Corporales o Excreta El mARN TRPV6 se detecta en microvesículas aisladas de muestras de sangre, otros fluidos corporales o excreta de pacientes con cánceres con alto contenido de TRPV6 (por ejemplo, tumores de ovario). La fracción de sangre que contiene las microvesículas se trasladaron de tumores a través de un proceso endocítico y se aislan de una muestra obtenida de un sujeto. Posteriormente el ARN es extractado de estas microvesículas, con el análisis subsecuente mediante técnicas a base de PCR.

Resultados Q-RT-PCR muestra la presencia de mARN TRPV6 en exceso en muestras de sangre de pacientes con cáncer en comparación con personas con un cáncer con alto contenido de TRPV6. La detección de cantidades relativas de expresión TRPV6 por consiguiente es útil para diagnosticar cánceres con alto contenido de TRPV6, tal como cáncer de ovario.

EJEMPLO 15: Detección de Proteína TRPV6 en Microvesículas Aisladas de Fluidos Corporales o Excreta La proteína TRPV6 se detecta en microvesículas aisladas de fluidos corporales tales como muestras de sangre, linfa o excreta de pacientes con cánceres con alto contenido de TRPV6 (por ejemplo, tumores de ovario). La fracción de la muestra que contiene las microvesículas trasladadas tumores a través de un proceso endocítico, se aisla. Posteriormente la proteína se extracta de estas microvesículas con el análisis subsecuente mediante manchado Western y técnicas a base de anticuerpos para detectar la proteína TRPV6. Como alternativa, las microvesículas aisladas pueden ser tratadas ya sea con anticuerpos anti-TRPV6 o péptidos de enlace TRPV6 y detectarse.

Resultados El manchado Western muestra la presencia de proteína TRPV6 en exceso en muestras de sangre de pacientes con cáncer en comparación con personas sin un cáncer con alto contenido de TRPV6 tal como cáncer de ovario. Las microvesículas completas muestran TRPV6 mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo para TRPV6 y utilizando péptidos de enlace TRPV6 etiquetados en forma adecuada.

EJEMPLO 16: Uso In Vivo de Péptidos de Enlace TRPV6 Conjugados Para Taxanos Queda claro a partir de los estudios de bio-distribución establecidos en el Ejemplo 1, que los compuestos que comprenden péptidos de enlace TRPV6 son útiles para suministrar el fluoróforo adherido de la clase de cianidina (cy5.5) a tejidos, y a células que expresan TRPV6 (ver figura 6 a 9). Los compuestos que comprenden los péptidos de enlace TRPV6 aquí descritos por consiguiente pueden ser utilizados para suministrar otras moléculas a células o tejidos que expresan TRPV6.

Los compuestos se preparan mediante adhesión covalente de fármacos de oncología, tal como taxanos a los péptidos de enlace TRPV6 con el objeto de utilizar la función de dirección-TRPV6 de los péptidos, para suministrar el fármaco directamente a una célula de cáncer o tumor con alto contenido de TRPV6. La química para adherir dichos fármacos a compuestos es conocida en la técnica (ver por ejemplo la Publicación de Peng Li y asociados, Biopolymers 87: 225-230, 2007).

El paclitaxel se adhiere a través de una molécula espadadora de cuatro carbonos al péptido SorC27 en una amina primaria o grupo tiol libre. El taxano conjugado-SorC27 posteriormente se administra a ratones xenoinjertados con un tumor con alto contenido de TRPV6. A los ratones de control se les administra solución salina.

Resultados Los experimentos in vivo en ratones muestran que un compuesto que comprende un péptido de enlace TRPV6 conjugado para paclitaxel, da como resultado el suministro adecuado de paclitaxel al sitio de tumor, la regresión del tumor y la muerte de células de cáncer, cuando se compara con ratones de control a los que se les administró solución salina. EJEMPLO 17: Suministro de Fármacos Anti-Virales Conjugados para Péptidos de Enlace TRPV6 Los fármacos anti-virales o anti-retrovirales son adheridos fácilmente en forma covalente a péptidos de enlace TRPV6 para el tratamiento de depósitos de HIV. Un depósito primario de HIV en humanos, son los nodos linfáticos mesentéricos (Cumont y asociados. Cell Death and Differentiation, 14, 1747-1758, 2007; Estaquier y Hurtrel. Medical Science (Paris) 24(12): 1055-1060, 2008). Los compuestos que comprenden los péptidos de enlace TRPV6 que llevan una etiqueta fluorescente se acumulan en los nodos linfáticos mesentéricos tal como se muestra a través de la presencia de fluorescencia en los nodos después de inyección i.v. del péptido etiquetado (ver figura 1).

Los anti-virales o anti-retrovirales se adhieren en forma covalente a los péptidos de enlace TRPV6 aquí descritos. Un compuesto que comprende un conjugado anti-viral SorC27, se administra posteriormente a ratones después del protocolo establecido en el Ejemplo 1.

Resultados Los resultados muestran que el conjugado anti-viral se detecta en el tejido de nodo linfático. La actividad anti-viral se obtiene, bloqueando la reproducción de HIV y de esta forma tratando HIV.

EJEMPLO 18: Péptidos de Enlace TRPV6 Conjugados a Anti-M i c robianos La adhesión covalente de fármacos anti-microbianos a los péptidos de enlace TRPV6, es útil para el tratamiento de depósitos de infección bacteriana. Los compuestos que comprenden el péptido de enlace TRPV6 conjugado a una etiqueta fluorescente se acumulan en los nodos linfáticos, tal como se indica mediante la presencia de fluorescencia en estos nodos después de inyección iv del péptido etiquetado (ver figura 1). En forma similar, los anti-microbianos son adheridos en forma opcionalmente covalente a los péptidos de enlace TRPV6 a través de métodos conocidos en la técnica, y utilizados para dirigir nodos linfáticos.

Resultados Los resultados muestran que los fármacos son detectados en tejido de nodo linfático aislado de ratones tratados con los conjugados de enlace TRPV6 anti-microbiano y exterminarán los microbios.

EJEMPLO 19: Péptidos de Enlace TRPV6 Conjugados a Complejos de Boro Los compuestos que comprenden el complejo de boro adherido en forma covalente al péptido de enlace TRPV6, son útiles para terapia de cáncer. Los péptidos de enlace TRPV6 dirigen y contactan las células y tumores con alto contenido de TRPV6, originando la concentración de los complejos de boro en los mismos (cada uno con múltiples átomos de boro, por ejemplo un complejo de 12 boro closo-boro). La irradiación con neurones térmicos da como resultado la captura de neutrones mediante boro-10 átomos y la transferencia de alfa-partículas de alta energía al tejido que extermina las células de tumor. Este aspecto de la presente invención proporciona grandes cantidades de agrupaciones de boro que son dirigidas a tumores. El valor de umbral ha sido manifestado como de aproximadamente 20 µg B/g tumor (Barth y asociados. Clinical Cáncer Research, 11 (11) 3987-4002, 2005). La química para adherir los compuestos de boro a los complejos de proteína, está bien establecida (Guan y asociados. Proc. Nati. Acad. Sci., 95 13206-13210, 1998).

El boro conjugado para los péptidos de enlace TRPV6 se administra a ratones con xenoinjerto con un tumor con alto contenido de TRPV6. El tumor se irradia posteriormente con neutrones térmicos.

Resultados La concentración de boro se incrementa en gran parte en tumores con alto contenido de TRPV6, tal como tumores de ovario. La irradiación de tumor con neutrones térmicos extermina las células de tumor. Los compuestos de péptido-boro son útiles para exterminar células de tumor.

EJEMPLO 20: Péptidos de Enlace TRPV6 Conjugado para Epítopes La adhesión covalente de epítopes conocidos y/o reconocidos de anticuerpos globales para los péptidos de enlace TRPV6, reclutan estos anticuerpos preexistentes para tumores que expresan TRPV6 y células de cáncer. Este complejo (anticuerpo-epítope-péptído de enlace TRPV6) da como resultado la detección y destrucción de células que expresan TRPV6 mediante células inmune, tal como se muestra en experimentos de xenoinjerto en donde los tumores (por ejemplo, ovario) tuvieron rangos de crecimiento más lentos.

EJEMPLO 21: Péptidos de Enlace TRPV6 Conjugados para Antígenos o Epítopes La adhesión covalente de un antígeno o epítope novedoso a los péptidos de enlace TRPV6 y la administración del compuesto a los ratones, dirige el complejo de epítope/péptido de enlace TRPV6 a los tumores que contienen TRPV6. La administración subsecuente de un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra el epítope específico, da como resultado cualquier tipo de anticuerpo que se adhiere a la célula, tejido o tumor con alto contenido de TRPV6. El reclutamiento subsecuente de células inmune (por ejemplo, células T exterminadoras) da como resultado la muerte de estas células dirigidas por péptidos y la contracción de los'tumores. EJEMPLO 22: Péptidos de Enlace TRPV6 Conjugados Para Inmunoactivadores La adhesión covalente de los péptidos de enlace TRPV6 y una molécula que es reconocida y enlazada por receptores en células del sistema inmune, particularmente células T exterminadoras, dirige dichas células a tumores y células de cáncer con alto contenido de TRPV6. El reclutamiento de dichas células como células exterminadoras, destruye la célula de cáncer o tumor. Los experimentos indican que el péptido de enlace TRPV6 dirige el canal TRPV6, en tanto que la molécula de "restricción" está adherida al otro extremo de los péptidos de enlace TRPV6, recluían la célula inmune; la administración de este producto origina la contracción de los tumores (por ejemplo, tumores de ovario xenoinjertados) .

EJEMPLO 23: Péptidos de Enlace TRPV6 Conjugado para Nano-Estructuras Metálicas La adhesión covalente de nano-estructuras metálicas (por ejemplo, nano-partículas de oro) a los péptidos de enlace TRPV6, dirige las nano-partículas de metal u otras construcciones (esferas, varillas, etc.) a través de la función de enlace TRPV6 de los péptidos, a células de cáncer y tumores. Debido a las propiedades únicas, por ejemplo, de las nano-partículas de oro, la irradiación con radiofrecuencias o radiación infrarroja, origina que las partículas se calienten.

En forma subsecuente al calentamiento de las células de cáncer o tumor, se origina la muerte de las células o tumor. La química para adherir nano-partículas metálicas a moléculas, tales como péptidos, está bien establecida. Los experimentos indican que la dirección de la nano-conjugado de oro, a tumores xenoinjertados con alto contenido de TRPV6 (por ejemplo, tumores de ovario), con irradiación subsecuente origina la contracción de la masa del tumor.

EJEMPLO 24: Uso de Anticuerpos TRPV6 para Detectar y Graduar Cáncer Las muestras que comprenden secciones de tejido de 146 biopsias independientes en 4 micro-formaciones de tejido (TMA) (OV483, OV802, T112, BCN721 obtenido de US Biomax, Inc. Rockville, MD 20850, USA), se probaron con respecto a manchado inmunohistoquímico de TRPV6 utilizando un anticuerpo TRPV6, anticuerpo secundario y detección colorimétrica utilizando peroxidasa de rábano (HRP). Las muestras incluyeron dieciocho diferentes tipos de cáncer de ovario, que representan los tipos más importantes de cánceres de ovario, así como 21 muestras de tejidos de ovario normal. Muchas de las muestras representaron cánceres que fueron graduados previamente. La figura 17 muestra la calibración y graduación representativa de muestras TMA en una escala de seis puntos de (-) a ( + + + + ) utilizada para evaluar la intensidad de manchado TRPV6. Tal como se muestra en la tabla 3, cada una de las 146 muestras fue clasificada de acuerdo con esta escala de seis puntos.

La figura 18, muestra que un porcentaje mucho más pequeño de muestras de tejido de ovario normales, tuvieron una intensidad de manchado TRPV6 con calificación de = 1+, en comparación con muestras de tejido de adenocarcinoma papilar seroso con cáncer grado I, grado II o grado III. Por ejemplo, el 100% de las muestras de tejido de adenocarcinoma papilar serosa, tuvieron una intensidad de manchado con calificación de = 1, en comparación con únicamente aproximadamente 24% de tejidos de ovario normales. Por consiguiente, la detección de TRPV6, tal como mediante manchado de anticuerpo es útil con el objeto de anticipar o diagnosticar la probabilidad de cáncer en una muestra. Además, la detección de TRPV6 es útil para identificar muestras con cáncer grado I (etapa temprana) en comparación con muestras de tejido de ovario normal.

La figura 19, muestra ejemplos de la detección inmunohistoquímica de TRPV6 utilizando anticuerpos TRPV6 en muestras de micro-formación de tejido de ovario normal, así como muestras de carcinoma papilar seroso Grados I, II y III. La figura 19 muestra y observa la tendencia del manchado incrementado de TRPV6 en muestras con mayores Grados de cáncer.

Los datos de generación de etapas de cáncer, también estuvieron disponibles para una cantidad de muestras de formación de tejido. Los cánceres tuvieron etapas de acuerdo con el sistema de Tumor, Nodo, Metástasis (TNM), tal como se sabe en la técnica. La intensidad del manchado inmunohistoquímico TRPV6 para cada muestra evaluada en una escala de cinco puntos de (-) a ( + + + + ) utilizando anticuerpo TRPV6, anticuerpo secundario y detección colorimétrica utilizando peroxidasa de rábano (HRP) se proporciona en la tabla 4.

Tal como se muestra en la tabla 4, únicamente el 23.8% (5/21) de las muestras de tejido de ovario normal tuvieron una calificación de intensidad de manchado TRPV6 mayor o igual a + 1. En contraste, el 95.7% (44/46) de las muestras con cáncer etapa I a IV tuvieron una calificación de intensidad TRPV6 mayor o igual a +1. Los cánceres de etapa temprana (etapa I y etapa II) fueron detectados fácilmente con 92.9% (26/28) de cánceres de etapa temprana que tienen una calificación de intensidad de manchado TRPV6 mayor o igual a +1. La detección de TRPV6, tal como mediante métodos inmunohistoquímicos, por consiguiente se puede utilizar para detectar cáncer, y en particular cánceres de etapa temprana.

Tabla 3: Manchado TRPV6 de carcinoma ovario y formación de tejido normal en 146 muestras.

Tabla 4: Carcinoma de ovario y formaciones de tejido anormal agrupadas mediante etapa de cáncer. Número total de casos = 67; número total de muestras de tumor = 46.

EJEMPLO 25: Co-Localización de TRPV6 y Sorc27 Etiquetada en Forma Fluorescente en Adenocarcinoma Papilar Seroso Grado II Para probar la eficacia del péptido Sorc27 etiquetado para detectar su enlace a TRPV6 objetivo, se aplicaron protocolos inmunohistoquímicos y de enlace SorC27-cy5.5 estándar a microformaciones de tejido de un número de secciones de tumor de cáncer de ovario. La detección del canal TRPV6 a través de ambos métodos, fue observada a través de diferentes muestras de microformacion de cáncer de ovario.

Resultados La figura 20 muestra la detección de anticuerpo TRPV6 y la detección fluorescente de una muestra de microformacion de tejido de adenocarcinoma papilar seroso grado II manchado con anticuerpos para TRPV6, así como SorC27 etiquetado en forma fluorescente con cy5.5 (SorC27-cy5.5) . El uso de péptidos de enlace TRPV6 etiquetados en forma fluorescente, corresponde por consiguiente a la detección inmunohistoquímica estándar de los canales de ión TRPV6 y péptidos de enlace TRPV6 que son útiles para detectar en forma confiable TRPV6 o células o tejidos que expresan TRPV6.

EJEMPLO 26: Localización de SorC27 para Tumores de Cáncer Xenoinjertados In Vivo Los ratones xenoinjertados con tumores de ovario con alto contenido de TRPV6 (células SKOV-3) y próstata (células DU145) fueron inyectados (en forma ¡ntraperitoneal) con el péptido de enlace TRPV6 etiquetado en forma fluorescente SorC27-cy5.5. SorC27 se etiquetó con la sonda casi infrarroja Cy5.5 en el tiol de cisteína simple utilizando una reacción activada por maleimida Cy5.5. Los péptidos etiquetados fueron purificados con una combinación de cromatografía de exclusión por tamaño HPLC. Cy5.5 fluoresce en la región infrarroja después de la excitación con una láser de exploración. El láser de baja energía tiene la capacidad de penetrar al animal en aproximadamente 1 cm, y por lo tanto, mediante escaneo, se puede cuantificar en tres dimensiones la presencia de los péptidos etiquetados. Los péptidos etiquetados Cy5.5 fueron inyectados en forma intraperitoneal en ratones CD1 desprotegidos en 100 ug por animal, y se generaron imágenes en vivo de los animales utilizando un sistema de generación de imagen óptica, Optix eXplorer (GE Healthcare Systems) en diferentes puntos de tiempo (30 minutos, 90 minutos, 4 h).

Resu Itados Los tumores de ovario y próstata que sobre-expresan el canal TRPV6 se detectan claramente in vivo durante al menos 24 horas después de la inyección. Las masas de tumor con xenoinjerto con alto contenido de TRPV6 fueron distinguidas claramente del tejido de fondo como una fluorescencia fuerte en el infrarrojo. La figura 21A muestra la localización dependiente del tiempo de SorC27-cy5.5 en tumor de ovario, en tanto que la figura 21 B muestra la localización dependiente del tiempo de SorC27-cy5.5 en tumor de próstata. Los ríñones también fueron señalados en estas dos imágenes. La naturaleza 3D del dispositivo de escaneo, permite la diferenciación clara entre los tumores y los tejidos de riñon visibles aislando una rebanada de 2 mm del animal. Así también, una "rebanada" a través del tumor (la rebanada-Z) permite una observación clara de la región central fluorescente de los tumores.

Ejemplo 27: RT-PCR Cuantitativo de m ARN TRPV6 en Tejidos de Cáncer RT-PCR cuantitativo para mARN TRPV6 se llevó a cabo en las muestras de biopsias de cáncer de ovario, próstata y seno, así como muestras de control recolectadas en forma correspondiente de 15 individuos saludables. Se probaron 18 biopsias de tumor de ovario, 4 biopsias de tumor de próstata y 3 biopsias de tumor de seno. Se utilizaron 3 diferentes conjuntos de cebador RT-PCR (A, B y C) para probar las muestras de próstata. Los resultados se estandarizaron contra los niveles de expresión del gen de mantenimiento, transferasa de fosforribosilo de hipoxantina (HPRT) y se expresaron como una proporción de la señal estandarizada de las muestras de tumor a las señales estandarizadas de una muestra recolectada de 15 tejidos saludables.

Resultados La figura 22, muestra los resultados de la cuantif icación Q-RT-PCR del mARN TRPV6 extractado de biopsia de cáncer de ovario (A), próstata (B) y seno (C) humano, en comparación con tejidos saludables. Las tablas 5 a 7 también proporcionan los resultados Q-RT-PCR cuantitativos de cada una de las biopsias de muestra en forma relativa a controles normales. Las biopsias de tumor mostraron un incremento significativo en los niveles de expresión del mARN TRPV6. Los incrementos en la expresión de mARN TRPV6 en forma relativa de los tejidos de control se observaron en cada muestra de cáncer probada, excepto una muestra de cáncer de ovario (LTL290). Las muestras de cáncer de ovario mostraron un incremento promedio de 39 veces en la expresión del mARN TRPV6 en comparación con controles saludables, en tanto que las muestras de cáncer de próstata y muestras de cáncer de seno exhibieron 8.7 veces y 13 veces de incremento, respectivamente. Los incrementos significativos observados en la transcripción de mARN TRPV6 en tejidos de cáncer, proporciona un herramienta útil de diagnóstico o pronóstico para identificar cáncer, incluyendo cánceres de ovario, seno y/o próstata.

Tabla 5: Resultados de RT-PCR cuantitativo de mARN TRPV6 para biopsias de cáncer de ovario S.D. = desviación estándar; n = número de muestras.

Tabla 6: Resultados RT-PCR Cuantitativo de mARN TRPV6 para biopsias de cáncer de próstata. Promedio y media tomados para todos los conjuntos de cebadores en cada muestra.

TABLA 7: Resultados RT-PCR cuantitativos de mARN TRPV6 para biopsias de cáncer de seno.

EJEMPLO 28: Inyección In Vivo y Generación de Imagen MRI de Conjugados de Péptido de Enlace TRPV6 (SPIO-SorC27) Conjugación de SorC27 a nano-gránulos SPIO Los gránulos SPIO (Óxido de Hierro Súper Paramagnético) funcionalizados con aproximadamente 120 grupos de maleimida por gránulo (Producto No. 77-96-201 de Micromod Partikeltechnologie GmbH, Alemania) se hicieron reaccionar con un exceso molar de 5 veces de Sor-C27 amortiguado (1mM, 10x PBS, pH 7.2) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los gránulos fueron separados de la mezcla de reacción mediante centrifugación y suspendidos en un volumen de PBS estéril de Dulbecco para inyección en los ratones desprotegidos CD-1 que contienen tumor. El número de péptidos SOR-C27 por gránulo se determinó mediante análisis 1H RMN cuantitativo del sobrenadante para determinar el número de moléculas de péptido reactivadas. En promedio, se conjugaron 75 moléculas de SOR-C27 para cada SPIO. La conjugación del péptido al SPIO se confirmó mediante LC-MS después de digestión de tripsina del conjugado SPIO-péptido. El conjugado SPIO-SorC27 posteriormente se inyectó en forma intraperitoneal (i.p.) en tumores de ovario derivados de SKOV-3 xenoinjertados con ratones desprotegidos CD-1 antes de la generación de imagen.

Captura de imagen MRI Se adquirieron imágenes MRI en una 3T Varían Direct Drive Consolé utilizando una bobina de gradiente 305/210 mm OD/ID Magnex y una bobina RF de ratón de cuadratura de diámetro de 25 mm de Doty Inc. Las imágenes se adquirieron utilizando una secuencia de pulsación seleccionada en forma específica para optimizar la sensibilidad de contraste para nanopartículas de hierro-óxido. El hierro-óxido parece obscuro contraste negativo) para estos tipos de adquisiciones. Las adquisiciones utilizaron una secuencia de pulsación de precesión libre de estado constante balanceado 3D (b-SSFP) con un TR/TE de 8/4 ms y una resolución de imagen de 150 mieras (dimensión de pixel 150 mieras en las 3 direcciones). Resultados La figura 23 muestra imágenes MRI y la localización del agente de aumento MRI (SPIO-SorC27) para tumores de ovario derivados de SKOV-3 xenoinjertados en ratones desprotegidos CD-1. Los paneles de control superior (A) muestran la administración de los gránulos de control SPIO, sin SorC27 conjugado. Los gránulos de control SPIO fueron despejados del tumor en 24 horas posteriores a la inyección. El panel de nivel inferior (B) muestran que el compuesto SPIO-SorC27 etiquetad la corteza del tumor 24 horas después de la inyección. La flecha blanca sólida mostrada en las imágenes de la izquierda indica la posición del tumor en el xenoinjerto. La flecha punteada en el panel inferior derecho, indica la señal MRI aumentada obscurecida de la construcción SPIO-SorC27 enlazada a la corteza del tumor. No se observa acumulación correspondiente de las nanopartículas de hierro en el panel del control superior derecho. Los paneles del lado derecho muestran la generación de imagen MRI antes de la inyección i.p., en tanto que los del lado derecho muestran la generación de imagen MRI 24 horas después de la administración del reactivo de control o de diagnóstico. Los péptidos enlazados TRPV6 conjugados tales como conjugados SorC27, por consiguiente tienen la capacidad de dirigir en forma efectiva los sitios de tumor in vivo.

EJEMPLO 29: RT-PCR de Sangre de Sujetos con Cáncer con Etapa Establecida Las muestras de sangre tomadas de sujetos con cáncer de próstata, seno u ovario (etapas I a IV) se probaron para expresión mARN TRPV6 utilizando RT-PCR. Las muestras de control de la sangre tomada de un hombre saludable (próstata) o mujer saludable (seno y ovario) también fueron probadas. Los productos RT-PCR se cargaron en geles de agarosa y se separaron utilizando electroforesis. Posteriormente la densidad de banda integrada fue medida en los geles de agarosa para los amplicones del mARN TRPV6 (-320 pb) para cada muestra y control.

Resultados La figura 24 muestra que la expresión del mARN TRPV6 en muestras de sangre tomadas de pacientes con cáncer, fue significativamente mayor en comparación con muestras tomadas de controles saludables normales. La figura 24A muestra los sujetos con cáncer de próstata etapa I, II, III o IV tuvieron hasta 6 veces más expresión de TRPV6 en sangre. Un incremento significativo en la expresión TRPV6, también se observan muestras que representan diferentes etapas de cáncer, en comparación con muestras normales. La figura 24B muestra que los sujetos con cáncer de seno, exhiben un incremento significativo en la expresión de TRPV6 en sangre. La figura 24C muestra que los sujetos con cáncer de ovario también exhiben un incremento en la expresión TRPV6 en comparación con muestras de control de mujeres saludables. Las señales integradas representadas en la figura 24 fueron divididas por un factor ya sea de 100,000 (24A & 24B) o 10,000 (24C). Los análisis de los niveles de expresión de mARN TRPV6 en sangre, por consiguiente es útil para identificar sujetos con cáncer, incluyendo la detección temprana de cáncer de próstata, seno y ovario de etapa I.

EJEMPLO 30. mARN TRPV6 en Muestras de Plasma de Sujetos con Cáncer de Ovario Etapa I o Etapa II El ARN total fue extractado de muestras de plasma de mujeres saludables (10) y de mujeres con cáncer de ovario Etapa I (3) o Etapa II (3) utilizando el método TRI Reagent® LS (Sigma Aldrich). Después de la preparación de bibliotecas de cADN (iScript, BioRad) de una cantidad igual del ARN extractado de cada muestra, las muestras fueron sometidas a PCR estándar. Se analizaron las reacciones PCR utilizando geles de agarosa E-Gel® EX 1% y se corrieron en la unidad de electroforesis de gel E-Gel® iBase. Utilizando el programa 7 para geles E-Gel® EX 1 a 2% durante 10 minutos. Se generaron imágenes de los amplicones mRNA TRPV6 (cADN) y se cuantificaron con un generador de imágenes Alpha Innotech FluorChem® FC2, utilizando el positrón #1 de filtro (filtro verde) y luz UV (302 nm) utilizando Auto Expose. Todas las muestras fueron analizadas por triplicado y los datos se compararon utilizando la prueba t del Estudiante y el límite de confiabilidad del 95%.

Resultados Tal como se muestra en la figura 25, el plasma tomado de sujetos con cáncer de ovario etapa I o II, tuvieron una expresión significativamente mayor de mARN TRPV6 (p < 0.0001 OVI; p = 0.0475 OVII) en comparación con muestras de controles saludables.

EJEMPLO 31: Análisis de Niveles de Proteína TRPV6 en Sujetos con Cáncer de Ovario Etapa I y II Se obtuvieron muestras de plasma de mujeres saludables y mujeres diagnosticadas con cáncer de ovario etapa I o II. La proteína fue aislada de las muestras de plasma siguiendo el método de TRI Reagent® LS (Sigma Aldrich). Se prepararon lisados a partir de los pelets de proteína de plasma del procedimiento TRI Reagent® LS, calentando en una solución de 1% en PBS y 15 mM ditiotrietol (DTT) en un baño de agua hirviendo. Los extractos de proteína fueron cuantif icados midiendo la absorbancia en 280 nm de cada Usado en el espectrofotómetro Varían Cary 50 UV. La cantidad de proteína en ug/uL, fue extrapolada a partir de una curva estándar de proteína de albúmina de suero de bovino. Los extractos de proteína fueron electrof orados en depósitos de 1.5 mm de gel de NuPage® Novex 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) en 145V durante 55 minutos. Los geles fueron transferidos durante 10 minutos en una iBIot® Transfer Stack, PVDF regular (Invitrogen) utilizando el sistema de transferencia Invitrogen iBIot. Se llevó a cabo el bloqueo PVDF, incubación de anticuerpo y lavado utilizando el sistema de detección de proteína SNAP i.d. (Millipore). Las membranas PVDF posteriormente fueron bloqueadas durante 30 segundos con amortiguador de bloqueo avanzado 0.5% ECL (Fisher). Los PVDF fueron incubados en una dilución 1/30 de anticuerpo primario TRPV6 (H-90) (Santa Cruz) durante 10 minutos y se lavaron 3 veces con 30 mL de TBS-T. Los PVDF posteriormente fueron incubados en una dilución 1/1500 de anticuerpo secundario HRP IgG anti-conejo de cabra (Santa Cruz) durante 10 minutos y se lavaron 3 veces con 30 mL de TBS-T. Las bandas TRPV6 fueron detectadas con 15 mi de Luminol durante 3 minutos. Se generaron imágenes de los geles y se cuantificó la densidad de banda con un generador de imagen Alpha Innotech FluroChem durante 10 minutos. Todas las muestras se analizaron por triplicado y los datos se compararon utilizando las prueba t del Estudiante y el límite de confiabilidad del 95%.

Resultados Tal como se muestra en las figuras 26A, los niveles de proteína TRPV6 fueron significativamente mayores en muestras de sangre tomadas de sujetos con cáncer de ovario etapa I (p = 0.0001) o etapa II (p = 0.0270) en comparación con muestras tomadas de controles saludables. La figura 26B muestra que el cáncer de ovario etapa I o etapa II considerado junto (cáncer de etapa temprana) también exhibe niveles incrementados de proteína TRPV6 (p = 0.0006) en comparación con controles saludables.

Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a lo que actualmente se considera como los ejemplos preferidos, quedará entendido que la presente invención no se limita a los ejemplos descritos. Por el contrario, la presente invención pretende cubrir diversas modificaciones y ajustes equivalentes incluidos dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia, hasta el mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual, fuera indicada en forma específica e individual como incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

REFERENCIAS: Aalders J. G., Thomas G. 2007. Cáncer endometrial -abordando nuevamente la importancia de los nodos linfáticos pélvicos y para-aórticos. (Endometrial cancer-revisiting the importance of pelvic and para aortic lymph nodes). Gynecol. Oncol. 104(1): 222-231. Review Agnes, R.S., Lee, Y.S., Davis, P., Ma, S.W., Badghisi, H., Porreca, F., Lai, J., Hruby, VJ. 2006. Relaciones de estructura-actividad de péptidos bifuncionales con base en farmacoforos de traslape y receptores opioides y de colescitoquinina. (Structure-activity relationships of bifunctional peptides based on overlapping farmacophores and opioid and cholescytokinin receptors. Journal of Medicinal Chemistry, 49: 2868-2875.

Barth, R.F., Coderre, J.A., Graca, M., Vicente, H., Blue, T.E. 2005. Terapia de cáncer de captura de neutrón de boro: estado actual y prospectos futuros. (Boron neutrón capture therapy of cáncer: current status and future prospects). Clinical Cáncer Research, 11: 3987-4002.

Bolton, A. E. y Hunter, W. M. 1973. Etiquetado de proteínas para radioactividades específicas de alto nivel mediante conjugación a un agente de acilación que contiene 1 5l (The labelin of proteins to high specific radioactivities by conjugation a to 125l-containing acylating agent). Biochem. J., 133: 529-539.

Cheng. Z., Zhang, l_. , Graves, E., Xiong, Z., Dandekar, . , Chen, X. Gambhir S. S. 2007. PET de animal pequeño de expresión de receptor de malanocortin 1 utilizando un análogo de hormona que estimula a-melanocito etiquetado-18F. (Small-animal PET of malanocortin 1 receptor expression using a 18F-labeled a-melanocyte stimulating hormone analog. J. Nucí. Med. 48: 987-994.

Cumont, M. C, Monceaux, V., Viollet, L., Lay, S., Parker, R., Hurtrel, B. Estaquier, J. 2007. TFG-b en órganos linfoides intestinales contribuye a la muerte de células T CD8 efectoras armadas y está asociado con la ausencia de contención de virus en macado Rhesus infectado con el virus de inmunodef ¡ciencia de simio. (TFG-b in intestinal lymphoid organs contributes to the death of armed effector CD8 T cells and is associated with the absence of virus containment in rhesus macaques infected with the simian immunodef iciency virus). Cell Death and Differentiation, 14: 1747-1758. den Dekker, E., Hoenderop, J.G.J., Nilius, B., Bindels, RJ. M. 2003. Canales de calicó epiteliales, TRPV5 & TRPV6: de la identificación a la regulación. (The epithelial calcium cahnnels, TRPV5 & TRPV6: from Identification towards regulation). Cell Calcium, 33: 497-507.

Estaquier, J. Hurtrel, B. 2008. Nodos linfáticos mensentéricos, un santuario para la presistencia de HIV. ( esenteric lymph nodes, a sanctuary for the persistence of HIV). Medical Science (París) 24(12): 1055-1060.

Guan, L., Wims, LA, Kane, R.R., Smuckler, M. B. , Morrison, S.L. Hawthorne, M. F. 1998. I nmunoconjugados homogéneos para la terapia de captura de neutrón de boro: Diseño, síntesis y caracterización preliminar. (Homogeneous immunoconjugates for boron neutrón-capture therapy: Desing, synthesis, and preliminary characterization) . Proc. Nati. Acad. Scí., 95: 13206-13210.

Lu, P., Boros, S., Chang, Q., Bindels, R.J., Hoenderop, J. G. 2008. El cloto beta-glucoronidasa activa en forma exclusiva los canales Ca2+ epiteliales TRPV5 y TRPV6. (The beta-glucuronidase klotho exclusively activates the epithelial Ca2 + channels TRPV5 and TRPV6). Nefrol. Dial. Transplant, 23: 3397-3402.

Lyshchik, A., Higashi, T., Asato, R., Tanaka, S., Ito, J., Hiraoka, M., Insana, M. F., Brill, A.B., Saga, T., Togashi, K. 2007. Metástasis de nodo linfático cervical: diagnóstico en experiencia inicial-sonoelastograf ía. (Cervical lymph node metastases: diagnosis at sonoelastography-initial experience). Radiology. 243(1): 258-267.

Ma, J., Uu, L, Tang, L., Zong, J., Lin, A., Lu, T., Cui, N., Cui, C, Li, L. 2007. Metástasis de nodo linfático retrofaríngeo en valor y pronóstico de carcinomas nasofaríngeo y categorías de generación de etapa. (Retrofaryngeal lymph node metástasis in nasopharyngeal carcinoma: prognostic valué and staging categories). Clin. Cáncer Res. 13(5): 1445-1452.

Mujoomdar, A., Austin, J. H., Malhotra, R., Powell, CA, Pearson, G. D., Shiau, M. C, Raftopoulos, H. 2007. Anticipadores clínicos de enfermedad metastática hacia el cerebro de carcinoma de pulmón de célula no pequeña: tamaño de tumor primario, tipo de célula y metástasis de nodo linfático. (Clinical predictors of metastatic disease to the brain from non-small cell lung carcinoma: primary tumor size, cell type, and lymph node metastases). Radiology. 242(3): 882-888.

Peng, J., Chen, X., Berger, U.V., Weremowicz, S., Morton, CC, Vassilev, P.M., Brown, E. M . , Hediger, M.A. 2000. Proteína de transporte de calicó humano CaT1. (Human Calcium Transport Protein CaT1. Biochim. Biophys). Res. Comm. 278: 326-332. [Nota: CaT1 = TRPV6] Peng, L., Jiang, S, Pero, S. C, Olingino, L. Krag, D. N. , ichejda, CJ. , Roller, P.P. 2007. Diseño y síntesis de paclitaxel conjugado con un péptido de reconocimiento-ErB2, EC-1. (Design and synthesis of paclitaxel conjugated with an ErbB2-Recognizing peptide, EC-1). Biopolymers, 87: 225-230.

Veness, M.J., Porceddu, S., Palme, C. E., Morgan, GJ. 2007. Carcinoma de célula escamosa cutánea de cabeza y cuello metastática hacia nodos linfáticos de paratiroide y cervical. (Cutaneous head and neck squamous cell carcinoma metastatic to parotid and cervical lymph nodes). Head Neck. 29(7): 621-631. Review.

Vernooij, F., Sie-Go, D. M . , Heintz, A.P. 2007. Recurrencia de nodo linfático después de carcinoma vulvar etapa IA: dos casos y una revisión breve de la literatura. (Lymph node recurrence following stage IA vulvar carcinoma: two cases and a short overview of literature. Int. J. Gynecol. Cáncer. 17(2): 517-520. Review.

Wind, J., Lagarde, S.M., Ten Kate, F.J., Ubbink, D.T., Bemelman, W.A., van Lanschot, JJ. 2007. Una revisión sistemática con respecto al significado de la implicación de nodo linfático extracapsular en malignidades gastrointestinales. (A systematic review on the significance of extracapsular lymph node involvement in gastrointestinal malignancies) . Eur. J. Surg. Oncol. 33(4): 401-408. Review.

Yamamoto, T., Nair, P., Vagner, J., Largent-Milnes, T., Davis, P., Ma, S.W., Navratilova, E., Moye, S., Tumati, S., Lai, J., Yamamura, H. I., Vanderah, T.W., Porreca, F., Hruby, VJ. 2008. Estudio de relación de estructura-actividad de método sintético de combinación de péptidos bif uncionales modificados por C-terminal que son agonistas de receptor opioide delt/mu y antagonistas de receptor de neurokinin 1. (A structure-activity relationship study of combinatorial synthetic approach of C-terminal modified bifunctional peptides that are delt/mu opioid receptor agonists and neurokinin 1 receptor antagonists. J. of Med. Chem. 51(5): 1369-1376.

Zhuang, L., Peng, J-B., Tou, L., Takanaga, H., Adam, R. . , Hediger, MA, Freeman, M. R. 2002. Canal de ión selectivo de calcio, CaT1, se Localiza en forma Apical en Epitelio de Tracto Gastrointestinal y se Expresa en forma Aberrante en Malignidades Humanas. (Calcium-Selective Ion Channel, CaT1, Is Apically Localized in Gastrointestinal Tract Epithelia and Is Aberrantly Expressed in Human Malignancies) . Laboratory Investigation. 82(12): 1755-1764.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que comprende un Péptido de Enlace Vaniloide Potencial de Receptor Temporal 6 (TRPV6) conjugado a una biomolécula, en donde el péptido de enlace TRPV6 comprende toda o una parte de un péptido que comprende EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR (SEC ID NO:1).

2. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de enlace TRPV6 comprende de 9 a 27 aminoácidos de SEC ID NO: 1.

3. El compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el péptido de enlace TRPV6 comprende una parte contigua de la secuencia C-terminal de SEC ID NO:1.

4. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque el péptido de enlace TRPV6 comprende al menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia C-terminal de SEC ID NO:1

5. El compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado porque el péptido de enlace TRPV6 tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de aminoácido HPSKVDLPR.

6. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de enlace TRPV6 comprende la secuencia de aminoácido HPSKVDLPR.

7. El compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado porque el péptido de enlace TRPV6 tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos KEFLHPSKVDLPR.

8. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende la secuencia de aminoácido KEFLHPSKVDLPR.

9. El compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado porque el péptido de enlace TRPV6 tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de aminoácido EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR.

10. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende la secuencia de aminoácido EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR.

11. El compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizado porque la biomolécula comprende una etiqueta detectable.

12. El compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizado porque la biomolécula comprende un agente terapéutico.

13. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque el agente terapéutico es un agente anticáncer.

14. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, y un transportador farmacéuticamente aceptable.

15. Un método para detectar proteína TRPV6 en una muestra, en donde el método comprende: a) contactar la muestra con el compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11; b) detectar la biomolécula conjugada para el péptido de enlace TRPV6, para detectar de esta forma la proteína TRPV6.

16. El método tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la biomolécula comprende un fluoróforo, y el paso de detectar la biomolécula comprende detectar el fluoróforo.

17. El método tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la muestra es un fluido corporal.

18. El método tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el fluido corporal es sangre.

19. El método tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la biomolécula se detecta in vivo.

20. Un método para identificar cáncer en una muestra procedente de un sujeto, en donde el método comprende: a) detectar el mARN o proteína TRPV6 en la muestra; b) comparar la cantidad de mARN o proteína TRPV6 en la muestra, con una cantidad de mARN o proteína TRPV6 en una muestra de control, en donde la cantidad incrementada de mARN o proteína TRPV6 en la muestra, en comparación con el control, es indicativa de cáncer.

21. El método tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque el paso de detectar la proteína TRPV6 comprende contactar la muestra con el compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11.

22. El método tal como se describe en la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque la muestra es un fluido corporal.

23. El método tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque el fluido corporal es sangre.

24. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 20 a la 23, caracterizado porque el cáncer es cáncer de etapa I o cáncer de etapa II.

25. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 20 a la 24, caracterizado porque el cáncer es cáncer de ovario, cáncer de seno o cáncer de próstata.

26. Un método para identificar un tumor de cáncer en un sujeto, en donde el método comprende: a) administrar al sujeto un compuesto que comprende un péptido de enlace TRPV6 o un anticuerpo para TRPV6; b) detector el péptido de enlace TRPV6 o anticuerpo para TRPV6, en el sujeto, detectando de esta forma TRPV6; c) identificar regiones del sujeto con niveles incrementados de TRPV6 relativos a un nivel de control, en donde los niveles incrementados de TRPV6 son indicativos de un tumor de cáncer.

27. El método tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto comprende el compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 11.

28. El método tal como se describe en la reivindicación 26 ó 27, caracterizado porque el tumor de cáncer es tumor de cáncer de ovario, tumor de cáncer de seno o tumor de cáncer de próstata.

29. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 28, caracterizado porque el compuesto que comprende un péptido de enlace TRPV6 o anticuerpo para TRPV6, comprende un agente de contraste de generación de imagen de resonancia magnética, y el paso de detectar el péptido de enlace TRPV6 o anticuerpo para TRPV6, comprende generación de imagen de resonancia magnética (MRI).

30. El método tal como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el agente de contraste de generación de imagen de resonancia magnética es un óxido de hierro superparamagnético (SPIO)

31. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 28, caracterizado porque el compuesto que comprende el péptido de enlace TRPV6 o anticuerpo para TRPV6, comprende un fluoróforo y el paso para detectar el péptido de enlace TRPV6 o anticuerpo para TRPV6, comprende detectar un fluoróforo.

32. Un método para suministrar una biomolécula a células que expresan TRPV6, en donde el método comprende contactar la célula con el compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13.

33. El método tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque la biomolécula comprende un agente terapéutico.

34. El método tal como se describe en la reivindicación 33, caracterizado porque el agente terapéutico comprende un agente anti-cáncer.

35. El método tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque la biomolécula comprende una etiqueta detectable.

36. El método tal como se describe en la reivindicación 35, caracterizado porque la etiqueta detectable es un fluoróforo o un agente de contraste de generación de imagen de resonancia magnética.

37. El método tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el paso de contactar la célula, ocurre in vivo.