CN103760352A - 一种用于tafi含量体外检测的试剂盒及其体外检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测凝血酶激活的纤溶抑制物（thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor，简称TAFI）含量的新方法，特别是TAFI含量的体外检测方法。试剂盒由TAFI快速检测试纸、样本稀释液组成，其中TAFI快速检测试纸由PVC板条、样品垫、金垫、NC膜和吸水纸组成；样本稀释液为磷酸盐缓冲液（pH7.0）。所述NC膜由T线和C线组成。酸盐缓冲液配置方法为：取磷酸二氢钾0.68g加0.1mol/L NaOH溶液29.1ml，用水稀释至100ml。所述试剂盒示踪标志物为胶体金。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测凝血酶激活的纤溶抑制物（thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor，简称TAFI）含量的新方法，特别是TAFI含量的体外检测方法。
背景技术
众所周知，血栓性疾病是一类严重影响健康的疾病，尤其是心脑血管栓塞性疾病已成为我国人口死亡的首位原因。由于血栓性疾病的临床表现千差万别，诊断和治疗往往非常复杂，因此，早期发现、早期治疗尤为重要。目前，血栓性疾病的检查方法主要有心电图、超声心动图、胸部X射线、血压监测、头颅X射线、脑CT扫描、脑MRI检查、DSA、MRA、经颅多普勒超声检查等。射线类检查会对人体产生一定程度的电离辐射，组织血流灌注的功能性成像检查方法较多，这些检查设备通常比较昂贵，增加了成本，有的还需特殊装备，成像时间较长，无法短期获得结果。在医学检验中，尚缺乏一种简单、快捷、准确的用于临床预测心脑血管疾病等发生可能性的检测方法，不利于对疾病的早期发现，早期治疗。
据相关文献报导，TAFI具有被凝血酶激活后下调纤溶活性的功能，是一种存在于血浆中的含金属Zn的羧肽酶前体，又被称为血浆羧肽酶原B、血浆羧肽酶原U、血浆羧肽酶原R。TAFI前体由肝脏合成，是一条包含423个氨基酸的单链糖蛋白，在循环至血液中的过程中，切掉N端22个氨基酸的信号肽，形成401个氨基酸的56kDa的TAFI；TAFI也存在于血小板内，血小板激活时释放至血液。凝血酶、胰蛋白酶、纤溶酶等蛋白水解酶可以作用于TAFI的Arg92，将其切割成20kDa的激活肽和具有羧肽酶活性的36kDa的TAFIa。TAFIa具有切除部分降解的纤维蛋白C端Arg或Lys的能力，使纤溶蛋白酶原不能被激活，因而具有下调纤溶***的功能，但其构象具有高度不稳定性。
TAFI于1988年被首次发现，活化后具有内在不稳定性，通常在 37℃条件下孵育2h失去活性，并且能特异性地分解底物上精氨酸。后经多位科技工作者对其cDNA进行分离以及测定，并利用纤溶酶原-琼脂糖柱层析的方法从血浆中分离、提纯其酶原蛋白pro-pCPB，进一步分析发现TAFI通过凝血酶激活后具有羧肽酶活性，发挥纤溶抑制作用。
TAFI与心脑血管疾病有一定关系。动脉粥样硬化（atherosclerosis，简称AS）是缺血性心脑血管疾病（如心绞痛、心肌梗死、脑卒中等）共同的病理基础，也是导致血管内血栓形成的主要原因。近几年的研究表明，AS的发生发展与炎症、凝血-纤溶调节***密切相关。目前研究表明，TAFI通过降低纤溶活性可促进静脉血栓的形成，血浆高TAFI水平能增加静脉血栓事件。
目前，用来检测TAFI水平的方法主要有两类，一类是通过测定酶活力的方法间接测定TAFI含量，即利用凝血酶和凝血酶调节蛋白激活TAFI，测定TAFIa的酶活力；另一类是免疫学方法，包括酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和火箭免疫电泳。其中，夹心ELISA法检测TAFI抗原是目前相对成熟的检测方法，检测灵敏度高，特异性强，准确性好，检测方法安全易行。2005年出现了两种针对TAFI的特异性单克隆抗体，成功运用ELISA方法检测TAFI、TAFIa和失活的TAFI。但这些方法因自身存在一定的缺陷，都没有成为国际公认的TAFI参照标准法。
发明内容
本发明的目的是提供一种TAFI含量的体外检测方法，它解决了现有技术存在的设备昂贵，检测时间较长等缺陷，与其它检测方法相比，具有操作简便、快捷、成本低廉，诊断敏感，检出限低等优点，作为用于临床预测心脑血管疾病的辅助诊断，可显著提高疾病的检出率和准确率，有利于疾病的早期发现，早期治疗；减少被检者不必要的痛苦和医疗费用支出，提高被检者的生存质量。
其具体技术方案为：
一种用于TAFI含量体外检测的试剂盒，由TAFI快速检测试纸、样本稀释液组成，其中TAFI快速检测试纸由PVC板条、样品垫、金垫、NC膜和吸水纸组成；样本稀释液为磷酸盐缓冲液（PH7.0）。
所述NC膜由T线和C线组成。
酸盐缓冲液配置方法为：取磷酸二氢钾0.68g加0.1mol/L NaOH溶液29.1ml,用水稀释至100ml。
所述试剂盒示踪标志物为胶体金。
TAFI快速检测试纸的制备方法为：
a.金垫的制备
1）取1ml胶体金加0-6ｕl的0.2M K2CO3，混合后再加入10-20ug浓度为3.68mg/ml的4E7抗体，得到体积为2.7-5.4ｕl的4E7抗体,混匀静置5-20min，加5-20ｕl BSA、PEG或者Casein-Na封闭，再次混匀静置5-200min（200分钟那么久吗请确认是否为20min），离心5-10min（9000r/min），弃上清，沉淀用30-100ｕl复溶液复溶；2）取1ml胶体金，加0-6ｕl的0.2M K2CO3，混合后再加入15-25ug浓度为10mg/ml的兔IgG，得到体积为1.5-2.5ｕl兔IgG,混匀静置10min，加5-20ｕl20%的BSA、PEG或者Casein-Na溶液，混匀静置5-20min，离心5-10min（9000r/min），弃上清，沉淀用50ｕl复溶液复溶；
3）喷金：将4E7抗体和兔IgG各复溶的50ｕl两者1:1混合至100ｕl，混合后的样本通过加压的方式，以雾状均匀喷在玻璃纤维素膜上，45℃烘干0.5h-2h，密封干燥保存即为金垫,。
b.NC膜的制备
包被工艺：将3B1抗体用PBS稀释至0.3-0.8mg/ml，羊抗兔用PBS稀释至1.5mg/ml分别固定在NC膜上T线和C线位置上，包被后室温晾干后，密封干燥保存待用；
c.安装
将样本垫、金垫、PVC板、固定好抗体的NC膜、吸水纸组装成试纸 条即可，所述样本垫采用玻璃纤维素膜。
试纸制作完成后直接装入卡壳中，卡壳上对应试纸条的样品垫处设置一个加样孔。
复溶液为Tris0-0.5%；pvp400-1%；BSA0-1%；PEG200000-0.5%；10%蔗糖0-5%；TWEEN200-0.8%；10%叠氮钠2/万，余量为水。
所述试剂盒检测的血清或血浆样本中标志物的浓度范围为5-40ug/ml.样本稀释400-600倍使用。样本值过高时增加稀释倍数使用，稀释后的样本使用量为60-80ul。
所述试剂盒检测结果以T/C比值为测试值，即T线检测值和C线检测值之比为最终测试值。所述快速检测试纸，检测时间为5-20min。
步骤一采集人个体生物样品立即于30分钟内，4℃条件下离心取上清或样本静止后的上清作为待检样品，置于冰盒1小时内使用或-20℃保存备用；
步骤二取样本，用样本稀释液进行稀释，可采用一步稀释或两步稀释均可，稀释倍数为400-600倍，稀释后将样本加到相应加样孔内，10min后将样本放入检测仪器中，即可得出检测最终结果。
标记抗体是针对重组人TAFI抗原所制备的鼠抗人单克隆抗体，所述鼠抗人单克隆抗体包含3B1和4E7，所述3B1为特异性结合TAFI和失活的TAFI，所述4E7仅与TAFI结合。
试纸条是由金垫、包被抗体的NC膜、吸水纸、样品垫、PVC板组成。
金垫是4E7与带负电荷的20-40nm的胶体金结合后的偶联物混合，在室温条件下反应10～15分钟后，使用10%BSA、10%PEG二者1:1的混合混合封闭后10-20分钟后，离心去上清，使用金蛋白偶联物复溶液对离心后的沉淀进行复溶，复溶后喷至玻璃纤维素膜上烘干。
包被抗体的NC膜是将3B1单克隆抗体经样本稀释液稀释至0.3-0.8mg/ml后固定在NC膜上相应位置。
样本稀释液成分为10Mm PBS PH=7.4、0-1%SDS,0.5-2%吐温 20、0-1%PVP、0-2mg/ml EDTA.2Na，0-1%PEG20000，0-1%酪蛋白。
试纸条在使用过程中无需定标，样本稀释后直接加样使用，测量后由检测仪中标准曲线直接运算出最终检测结果。
体外检测试剂盒的内容物包括：TAFI快速检测试纸条，用于样本的检测；TAFI样本稀释液，用于待检样本的稀释；使用说明，用于产品使用的指导。
TAFI含量的体外检测方法的应用：是用于检测人体生物样品中的血液、血清、血浆、尿液、粘液、粪便、脑脊液、胸腔积液、腹水、唾液、组织或细胞。
TAFI含量的体外检测方法的应用：是将对人个体样品中TAFI含量的测定，根据TAFI与相关疾病的关系，应用于辅助心脑血管疾病、急性早幼粒细胞白血病、内源性凝血***缺陷疾病、炎症等的与TAFI含量相关联疾病的诊断。
本发明具有的优点及积极效果是：由于本发明所采用的体外检测试剂盒的内容物中包括针对TAFI的特异性单克隆抗体和胶体金标记测定所需试剂，与新型胶体金免疫检测方法相结合，用于检测人体生物样品的TAFI含量的体外检测，开辟了TAFI新的体外诊断学方法，所以它解决了现有技术存在的操作繁琐，检测时间较长等缺陷。将这种体外诊断学方法用于临床预测心脑血管疾病的可能性，其操作简便、快捷、成本低廉，诊断敏感，检出限低。样品中的TAFI抗原与标记了胶体金的特异抗体进行免疫学反应，通过胶体金颜色变化的放大作用，根据其显色强度，显色强度与抗原浓度呈正比关系，从而达到定量测定抗原含量的目的。将TAFI检测和胶体金技术相结合可以明显提高检测的灵敏度和特异性，这种体外诊断学方法优于现有技术中采用的其它普通方法。因此，本发明的方法可应用于大量样品中TAFI含量的体外测定，根据TAFI与相关疾病的关系，作为辅助诊断，提高相关疾病的检出率和准确率，同时检测时间很短，达到了早期发现，早期治疗的目的；减少被检者不必要的痛苦和医疗费用支出，提高被检者的生存质量。
本发明所用的体外检测试剂盒与人纤溶抑制因子/凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）酶联免疫分析试剂盒进行比较实验。实验材料为 已确诊的心脑梗死患者血浆60例，使用TAFI酶联免疫分析试剂盒和本发明所用的TAFI快速检测剂盒同时进行酶联免疫测定，本发明所用的TAFI快速检测试剂盒与TAFI酶联免疫分析试剂盒测定的阳性率分别为41.67%和30%，同时，本发明检测TAFI用快速检测试剂盒，检测时间仅为10min，节约大量的时间，该结果显示，本发明方法对TAFI抗原的检测特异性更高，更准确，速度更快。
附图说明
图1为本发明TAFI快速定量检测产品标准曲线；
图2为TAFI快速定量检测示意图。
具体实施方式
采用仪器如下：
三维点膜喷金仪（上海金标生物科技有限HM3030）。
冰盒的温度取决于冰盒原来放置的环境，从-20℃拿出来的就是-20℃，从-80℃冰箱里拿出来的就是-80℃，但是只能短时间保存，本发明这里对冰盒温度没有要求，-20℃就可以达到要求，只是用于短时间保存而已。
实施例一
本发明是采用体外检测试剂盒的内容物中的针对TAFI的特异性单克隆抗体和胶体金法测定所需试剂，与现有的胶体金法检测试剂相结合，用于检测人体生物样品的TAFI含量的体外检测。该TAFI含量的体外检测试剂盒组成包括：TAFI快速检测试纸、样本稀释液，及使用说明。本发明所采用的TAFI含量的体外检测试剂盒的内容物的制备方法如下：
1、胶体金的制备
本发明使用的胶体金，采用柠檬酸钠和氯金酸制备，首先将100ml4/万氯金酸溶液加入微量胶体金保护剂，再用电炉加热至沸腾，加入525ul10%柠檬酸三钠溶液，继续加热10min后既得胶体金溶液，计算（以氯金酸的使用量为准，保证最终制备体积重反应前氯金酸的使用量为4/万，即反应前使用4/万氯金酸溶液为100ml，反应后也是100ml）理论制备胶体金溶液的体积，定容后，利用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计对其进行全波长扫描，确定其峰值，本发明所使用 的胶体金溶液全波长扫描，其波峰在515-530nm之间。
2、单克隆抗体和金标抗体的制备
单克隆抗体和金标抗体是针对重组人TAFI抗原所制备的鼠抗人单克隆抗体，鼠抗人单克隆抗体包含3B1和4E7。
杂交瘤制备：以纯化的人血浆TAFI为免疫原，按常规方法免疫BALB/c小鼠；取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；对杂交瘤细胞进行筛选，阳性孔经3次有限稀释法克隆，最终获得2株持续且稳定分泌抗人TAFI单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3B1和4E7；
抗体鉴定：按照罗氏公司抗体亚类试剂盒说明书测定这两种单克隆抗体的类型均为IgG1，κ；以模拟血浆作为对照，免疫印迹和ELISA分析显示，3B1和4E7这两种单克隆抗体均与人源TAFI抗原特异性结合，其中3B1可以特异性结合TAFI和失活的TAFI，如图1所示，3B1能够特异性识别血浆中的TAFI。图2单克隆抗体4E7与TAFI特异性结合ELISA曲线。以15μg/ml4E7包被酶标板，以TAFI、TAFI和4E7混合物、TAFI和小鼠IgG混合物分别作为抗原，3B1作为酶联抗体，进行ELISA反应。从曲线图可以看出，游离4E7竞争性抑制TAFI与固相4E7结合，说明4E7仅与TAFI特异性结合。
抗体制备：杂交瘤细胞体外培养法。
抗体纯化：中空纤维滤柱（美国通用公司）浓缩杂交瘤培养上清，蛋白A-琼脂糖亲和层析柱（美国通用公司）分离纯化浓缩液中的单克隆抗体。
抗体效价：经ELISA法测定纯化后的3B1和4E7单克隆抗体，效价分别105和106。
3、试纸条的制备
（1）每1ml胶体金使用2μl的0.2M K2CO3混匀后，再加入20μg4E7I抗体，反应10min后，加入20%的BSA（20%PEG或20%Casein均可）等进行封闭，封闭时间为10min，离心纯化，离心时间为7min，转速为9000r/min,离心后去上清，沉淀使用含TRIS0.36%、Casein-Na0.6%、PEG200000.1%、BSA0.2%、TWEEN200.6%、PVP400.5%、蔗糖2%，叠氮钠0.5‰的胶体金复溶液进行复溶，复溶 体积为50ul.
（2）取1ml胶体金，加6ｕl的0.2M K2CO3，混合后再加入25ug浓度为10mg/ml的兔IgG，得到体积为2.5ｕl兔IgG,混匀静置10min，加10ｕl BSA封闭，混匀静置10min，离心7min（9000r），弃上清，沉淀使用（1）中复溶液复溶至50ｕl；
（3）将（1）和（2）最终所得的50ul溶液混合后，使用三维点膜喷金仪（上海金标生物科技有限HM3030）加压喷至玻璃纤维素膜上，烘干1h后使用。
（4）将3B1抗体使用PH=7.4的PBS稀释至0.5mg/ml，及羊抗兔1.5mg/ml分别使用三维点膜喷金仪（上海金标生物科技有限HM3030）固定在NC膜（NC膜已经贴在PVC板相应位置）上T线和C线位置上，室温晾干后使用。
（5）然后将吸水纸贴在PVC板上方预留位置，吸水纸压在NC膜上端1mm处，再将金垫粘贴在NC膜的下侧，压在NC膜上，与NC膜重叠1mm，再将玻璃纤维素膜压在金垫上，重叠1mm。粘贴后使用微电脑自动斩切机，将其切成4mm的试纸条，最后将试纸条装在卡壳中，和干燥剂、塑料吸管一起装进6.5*12cm的铝箔袋中，封口后既得最终胶体金产品。
TAFI标准曲线的制定：
从德国Merck公司购买人血浆纯化的TAFI，相对分子质量60000，作为标化浓度的TAFI。利用人混合血浆与标化浓度的TAFI进行比对，稀释后获得含预期浓度TAFI的血浆，作为实验用标准品。该方法制备TAFI标准品无需纯化，操作简单，成本低廉，适合大批量制备。具体操作步骤如下：
以标化TAFI作为标准品，倍比稀释做标准曲线，ELISA方法测定人混合血浆浓度。根据测定结果，利用该血浆及100mM pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液、100mM壳聚糖溶液将购买的TAFI抗原稀释并充分混匀，制成终浓度为含TAFI（0、10、20、30、40μg/ml）、乙二胺四乙酸二钠5mM、壳聚糖20mM的溶液，取各浓度标准品溶 液100μl分装至灭菌过的冻存管底部，液体或冷冻干燥后4℃保存，标准曲线制定，将样不同梯度的样本分别使用样本稀释液稀释400倍后，分别加到TAFI快速检测试纸条上，10min后将试纸条***检测仪（使用北京华慧达的Kreader系列的读数仪或者德国QIAGEN的LF）中，根据检测结果定制标准曲线。标准曲线由产品生产后直接在厂家定标后使用，每批产品一个标准曲线，曲线为直线拟合方式。
具体应用例
应用例一：
现以人血浆为例，用本发明方法对60例确诊为心脑梗死的患者血浆样品及300例健康血浆样品进行TAFI含量测定。具体操作步骤如下：
步骤一采集人个体生物样品立即于30分钟内，4℃条件下离心取上清或样本静止后的上清作为待检样品，置于冰盒1小时内使用或-20℃保存备用；
步骤二取样本做稀释，可采用一步稀释或两步稀释均可，稀释倍数为400倍，稀释后将样本加到相应加样孔内，10min后将样本放入检测仪器中，即可得出检测最终结果；
检测结果见下表
经TAFI检验，心脑梗死组血浆TAFI含量与健康组TAFI含量的P<0.01（P=0.0031），两组数据具有显著差异。以健康组含量平均值与2倍标准偏差的和为参考上限，心脑梗死的检出率可以达到41.67%。因此该方法作为辅助诊断，对心脑血管疾病的预测具有意义。
应用例二：
现以人血浆为例，用本发明方法对200例确诊为心脑血管疾病的患者血浆样品及30例健康血浆样品进行TAFI含量测定。操作步骤同实施例一。经T检验，心脑血管疾病组血浆TAFI含量与健康组TAFI含量的P<0.01（P=0.0086），两组数据具有显著差异。以健康组含量平均值与2倍标准偏差的和为参考上限，心脑血管疾病的检出率可以达到23.4%。因此该方法作为辅助诊断，对心脑血管疾病的预测具有意义。
应用例三：
本发明方法还可以测定人尿液中的TAFI含量。采集人晨尿，于30分钟内，4℃条件下，1500rpm离心5分钟，取上清作为待检样品。后续步骤同实施例一。
Claims (9)
1.一种用于TAFI含量体外检测的试剂盒，其特征在于：由TAFI快速检测试纸、样本稀释液组成，其中TAFI快速检测试纸由PVC板条、样品垫、金垫、NC膜和吸水纸组成；样本稀释液为磷酸盐缓冲液（PH6.8-7.4）。
2.按权利要求1所述用于TAFI含量体外检测的试剂盒，其特征在于：所述NC膜在检测线T线位置和质控线C线位置固定两种蛋白原料。
3.按权利要求1所述用于TAFI含量体外检测的试剂盒，其特征在于：样本稀释液由0-0.68%磷酸二氢钾、0-0.4%NaOH、0-1%Casein-Na、0-1%TWEEN20、0-1%PVP40、0-1%PEG20000、0-2%EDTA、0-0.5%SDS和余量为水组成。
4.按权利要求1所述用于TAFI含量体外检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒示踪标志物为胶体金。
5.一种按权利要求1所述用于TAFI含量体外检测的试剂盒的制备方法，其特征在于：TAFI快速检测试纸的制备方法为：
a.金垫的制备
1）取1ml胶体金加0-6ｕl的0.2M K2CO3，混合后再加入10-20ug浓度为3.68mg/ml的4E7抗体，得到体积为2.7-5.4ｕl的4E7抗体,混匀静置5-20min，加5-20ｕl BSA、PEG或者Casein-Na封闭，再次混匀静置5-20min，离心5-10min（9000r/min），弃上清，沉淀用30-100ｕl复溶液复溶；
2）取1ml胶体金，加0-6ｕl的0.2M K2CO3，混合后再加入15-25ug浓度为10mg/ml的兔IgG，得到体积为1.5-2.5ｕl兔IgG,混匀静置10min，加5-20ｕl20%的BSA、PEG或者Casein-Na溶液，混匀静置5-20min，离心5-10min（9000r/min），弃上清，沉淀用50ｕl复溶液复溶；
3）喷金：将4E7抗体和兔IgG各复溶的50ｕl两者1:1混合至100ｕl，混合后的样本通过加压的方式，以雾状均匀喷在玻璃纤维素膜上，45℃烘干0.5h-2h，密封干燥保存即为金垫。
b.NC膜的制备
包被工艺：将3B1抗体用PBS稀释至0.3-0.8mg/ml，羊抗兔用PBS稀释至0.5-1.5mg/ml分别固定在NC膜上T线和C线位置上，包被后室温晾干后，密封干燥保存待用；
c.安装
将样本垫、金垫、PVC板、固定好抗体的NC膜、吸水纸组装成试纸条即可，所述样本垫采用玻璃纤维素膜。
6.按权利要求4所述用于TAFI含量体外检测的试剂盒，其特征在于：试纸制作完成后直接装入卡壳中，卡壳上对应试纸条的样品垫处设置一个加样孔。
7.按权利要求4所述用于TAFI含量体外检测的试剂盒，其特征在于：复溶液为Tris0-0.5%；pvp400-1%；BSA0-1%；PEG200000-0.5%；10%蔗糖0-5%；TWEEN200-0.8%；10%叠氮钠2/万，余量为水。
8.按权利要求4所述用于TAFI含量体外检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒检测的血清或血浆样本中标志物的浓度范围为5-40ug/ml.样本稀释400-600倍使用。
所述试剂盒检测结果以T/C比值为测试值，即T线检测值和C线检测值之比为最终测试值。
9.一种按权利要求1所述试剂盒用于TAFI含量体外检测的方法：
步骤一 采集个体生物样品立即于30分钟内，4℃条件下离心取上清或样本静止后的上清作为待检样品，置于冰盒1小时内使用或-20℃保存备用；
步骤二 取样本，用样本稀释液进行稀释，可采用一步稀释或两步稀释均可，稀释倍数为400-600倍，稀释后将样本加到相应加样孔内，10min后将样本放入检测仪器中，即可得出检测最终结果。
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