发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种检测方便快捷、反应条件温和、检测灵敏度高的脂肽定量检测的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种脂肽定量检测的方法,其特征在于,包括以下步骤:1)待检样品分离获得脂肽;2)脂肽与荧光标记物反应得到荧光标记的脂肽;3)荧光标记的脂肽利用高效液相色谱检测;4)由色谱峰面积计算脂肽含量。
步骤1)待检样品分离获得脂肽是在待检样品中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,然后***萃取,萃取液除去***获得脂肽。
步骤2)所述的荧光标记物为4-溴甲基-7-甲氧基香豆素。
所述的待检样品中脂肽浓度在0.1ppm~1ppm、1ppm~100ppm和100ppm~600ppm时,4-溴甲基-7-甲氧基香豆素的加入量分别为0.1mg、1mg和2mg。
所述的荧光标记物与脂肽反应在有机溶剂中进行,所述有机溶剂选自乙腈、丙酮或四氯化碳中的一种。
所述的有机溶剂为乙腈。
所述的荧光标记物与脂肽反应在催化剂下进行,催化剂选自Na2CO3、吡啶或三乙胺中的一种。
所述的催化剂为三乙胺,三乙胺加入量为100μL。
所述的荧光标记物与脂肽反应体系总体积采用所述的有机溶剂定容至1mL。
所述的荧光标记物与脂肽反应的温度为40℃~80℃,反应时间为10min~30min。
所述的荧光标记物与脂肽反应的温度为60℃,反应时间为20min。
本发明采用荧光标记脂肽,利用高效液相色谱分离及荧光检测器检测。现有技术采用高效液相色谱直接检测发酵液样品的脂肽(未荧光标记),结果见图1(紫外检测(a)和荧光检测(b)),可见,由于样品中脂肽的含量太低,不能被紫外检测器和荧光检测器检测到,现有技术无法检测该样品。本发明技术针对同一发酵液样品,采用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素荧光标记脂肽,标记后采用高效液相色谱检测,结果见图2(紫外检测(a)和荧光检测(b)),由图2可见,使用荧光标记后,带有荧光基团的脂肽采用荧光检测器检测,响应值很高;而采用紫外检测器检测,响应值很低,可见,本发明技术采用荧光标记脂肽后结合荧光检测能大大降低了脂肽检出限。同时,由于灵敏度大大提高,荧光的色谱图还可识别脂肽分子中脂肪链长度分别为13个碳、14个碳和15个碳的脂肽同系物(见图2)。
与现有技术相比,本发明采用荧光标记脂肽,利用高效液相色谱分离及荧光检测器检测的方法具有方法简便快捷,反应条件温和,检出限低的特点,检出限可以达到0.1ppm,大大提高了检测灵敏度。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
在实验室仪器条件下(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),测定脂肽含量与脂肽在高效液相色谱上对应的峰面积具有如下关系:
其中,M为脂肽摩尔分子质量,计算脂肽的某个同系物的含量时,M取该同系物的分子量,脂肽的总含量等于脂肽的同系物含量之和;为方便,计算样品中脂肽总含量时,M可取值1000,峰面积按同系物的峰面积之和计算。
峰面积单位:μV·s
实施例1
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加乙腈定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC结果见图2,HPLC荧光检测器检测得脂肪链长度为13个碳的脂肽同系物的峰面积为11022255μV·s,该脂肽同系物的分子量为1007.68,按公式(1)计算该脂肽同系物的浓度为107mg/L,脂肪链长度为14个碳的脂肽同系物的峰面积为12374905μV·s,该脂肽同系物的分子量为1021.68,按公式(1)计算该脂肽同系物的浓度为122mg/L,脂肪链长度为15个碳的脂肽同系物的峰面积为30895805μV·s,该脂肽同系物的分子量为1035.68,按公式(1)计算该脂肽同系物的浓度为308mg/L。脂肽的总含量等于三种脂肽同系物含量之和,为107+122+308=537mg/L。
实施例2
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加乙腈定容至1mL,40℃反应30min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为53682755μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为516mg/L。
实施例3
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加乙腈定容至1mL,80℃反应10min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为52746305μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为507mg/L。
实施例4
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和1mgNaC03,加乙腈定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为51913905μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为499mg/L。
实施例5
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL吡啶,加乙腈定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为52434155μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为504mg/L。
实施例6
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加丙酮定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛滓RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为53058455μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为510mg/L。
实施例7
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加四氯化碳定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为52434189μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为504mg/L。
实施例8
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加乙腈定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为53297531μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为519mg/L。
实施例9
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加乙腈定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为52434209μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为505mg/L。
实施例10
10mL微生物发酵液中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到粗提的脂肽,向粗提脂肽中加2mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加乙腈定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为53058477μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为511mg/L。
实施例11
10mL脂肽注入体系1(含化学表面活性剂、聚合物等)中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到样品中粗提的脂肽,向粗提脂肽中加1mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加乙腈定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为481991μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为4.7mg/L。
实施例12
10mL脂肽注入体系2(含化学表面活性剂、聚合物等)中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到样品中粗提的脂肽,向粗提脂肽中加1mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加乙腈定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为565233μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为5.5mg/L。
实施例13
10mL某油田微生物驱试验区油井产出液(含原油、无机离子等)中加6M盐酸调节溶液pH=2.0,***萃取3次,吹干***得到样品中粗提的脂肽,向粗提脂肽中加0.1mg4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和100μL三乙胺,加乙腈定容至1mL,60℃反应20min,冷却后进行HPLC分析(高效液相色谱:WUFENG-LC100;荧光检测器:岛津RF-20A),HPLC荧光检测器检测得峰面积为27296μV·s,按公式(1)计算脂肽的总量为0.33mg/L。