CN103756954A

CN103756954A - 一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂、诱导培养基及方法

Info

Publication number: CN103756954A
Application number: CN201410027180.2A
Authority: CN
Inventors: 张炳强; 王秀芹; 孙全伟; 宋大鹏; 孙玉萍
Original assignee: QINGDAO ZHONGTIAN STEM CELL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: Qingdao Ruisike Biological Technology Co. Ltd.
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2014-04-30

Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞的诱导剂、诱导培养基及方法。一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂，由以下组分组成：大株红景天注射液、烟酰胺、牛磺酸和GLP-1。含有上述诱导剂的诱导培养基，每1000ml所述诱导培养基中含有大株红景天注射液20～40g、烟酰胺0.97～1.47g、牛磺酸0.25～0.50g、GLP-1 26.84～40.27mg，余量为人间充质干细胞无血清培养基，混匀过滤除菌即可。本发明的将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂、诱导培养基及方法，应用中药大株红景天注射液诱导脂肪间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞，各成分均安全无毒性，本发明的方法步骤少、时间短，诱导效率高。

Description

一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂、诱导培养基及方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞的诱导剂、诱导培养基及方法。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种以糖脂代谢紊乱为主要特征的内分泌代谢性疾病。根据世界卫生组织和国际糖尿病联盟公布的预测，到2030年，全球糖尿病患者将达3.7亿。目前我国DM患者已超过4500万，仅次于印度居第二位。尽管其病因不同，但都表现为胰岛细胞数量及功能的缺陷，最终都需要使用胰岛素进行治疗。尽管由于胰岛素的应用，尤其是近年来在胰岛素剂型以及给药途径等方面均取得了一些进展，但实践证明外源性胰岛素并不能像人体自身分泌胰岛素那样完美地控制血糖并恒定维持血糖正常。细胞替代疗法是治疗糖尿病的重要方法，是一种更接近生理方式的有效方法，可实现对血糖进行持续监测和精细调节。近些年，经肝门静脉植入胰岛细胞治疗糖尿病也获得了一些疗效，但胰岛细胞移植面临着两个难题：供体来源不足及严重的免疫排斥反应。

干细胞作为一种具有自我更新及多向分化的细胞，在一定条件下可分化为具有功能性的胰岛细胞，因此可作为胰岛细胞的全新来源。目前由干细胞分化获得胰岛细胞有三种途径：1、胚胎干细胞分化；2、胰岛干细胞或胰岛前体细胞分化；3、成体干细胞分化。由于胚胎干细胞具有伦理争议，且很难获得胰岛干细胞，而成体干细胞来源广泛，无伦理争议，可作为胰岛细胞的来源。

脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪间充质干细胞，简称脂肪干细胞。其生物学性质与骨髓间充质干细胞相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景，因此脂肪间充质干细胞已成为继骨髓间充质干细胞后干细胞领域另一个备受关注的热点。

目前的干细胞诱导方式主要有体外诱导、基因修饰、蛋白转导与组织微环境诱导，其中体外诱导是采用不同刺激因子组合，将干细胞诱导分化为目的细胞。各实验室诱导分化条件各异，诱导分化机制尚不明确，诱导分化效率低，胰岛分泌能力仅为正常胰岛1%左右，且诱导过程复杂，诱导时间长，所得细胞数量少，功能低。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂。该诱导剂成分安全无毒，诱导成功率高。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂，由以下组分组成：大株红景天注射液、烟酰胺、牛磺酸和GLP-1。

所述诱导剂各组分的质量浓度配比为：大株红景天注射液20～40 g/L、烟酰胺0.97～1.47g/L、牛磺酸0.25～0.50 g/L，GLP-1 26.84～40.27mg/L。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述诱导剂的诱导培养基，所述诱导培养基通过以下方法制备而成：每1000ml所述诱导培养基中含有大株红景天注射液20～40 g、烟酰胺0.97～1.47g、牛磺酸0.25～0.50 g、GLP-1 26.84～40.27mg，余量为人间充质干细胞无血清培养基，混匀过滤除菌即可。

本发明的另一个目的是提供一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，该方法包括以下步骤：

1、脂肪间充质干细胞的制备：将脂肪组织消化后，进行原代细胞培养、传代培养；

2、脂肪间充质干细胞的鉴定：取P3代脂肪间充质干细胞，流式检测细胞表面标记；

3、诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛细胞：传3代的脂肪间充质干细胞，0.125%～0.01％Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度1×10⁴/cm²，接种于事先放置有经多聚赖氨酸处理的消毒盖玻片的24孔板内，制备细胞爬片。待细胞达接近80%融合，生长旺盛时用诱导剂进行诱导分化；

4、诱导后胰岛细胞鉴定：（1）双硫腙染色反应；（2）化学发光免疫分析法检测胰岛素水平；（3）ELISA试剂盒检测诱导获得的胰岛样细胞是否具有胰岛素分泌功能；（4）葡萄糖刺激实验；（5）动物模型体内移植实验。

近年来，中药研究不断取得进展，大株红景天注射液是由大株红景天经微波协助提取分离、精制、膜过滤制成的中药新药注射液。大株红景天注射液含有红景天苷（Salidroside）、酪醇（Tyrosol）、红景天芬（Rosavin）、红景天任（Rozarin）、红景天素（Rosin）、多糖，具有抗缺氧、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤作用，可保护细胞膜，促进细胞生长，改变细胞外衣的性质等，是非常值得研究和开发的中药。

烟酰胺是维生素B3的一种形式，是一种ADP-核糖合成酶抑制剂，通过其主要代谢产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）参与广泛的生命活动，包括营养代谢、信号转导、维持基因组的完整等，烟酰胺能诱导人类胚胎胰岛内分泌细胞的分化和成熟。

牛磺酸是一种含硫的非蛋白氨基酸，在体内以游离状态存在，不参与体内蛋白的生物合成。可与胰岛素受体结合，促进细胞摄取和利用葡萄糖，加速糖酵解，降低血糖浓度。

GLP-1(胰高血糖素样肽1)可以刺激胰岛细胞增殖、分化，抑制胰岛细胞凋亡；而且可以促进胰岛素基因转录，促进细胞分泌胰岛素。

本发明的将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂、诱导培养基及方法，应用中药大株红景天注射液诱导脂肪间充质干细胞分化为胰岛分泌细胞，具有以下优势：

1、无需基因转染，故无基因改变和癌症风险；

2、诱导步骤少：当前文献报道的方法以两步法或者三步法为主，采用本发明的诱导剂、诱导培养基及方法仅需要一步；

3、诱导时间短：当前文献一般诱导需要10天以上，采用本发明的诱导剂、诱导培养基及方法仅需要7天；

4、采用本发明的诱导剂、诱导培养基及方法将脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞诱导分化效率高；

5、本发明的诱导剂，各成分均安全无毒性，且发挥中医药特色；

6、自体脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞后，自体移植后无排斥，无伦理问题，安全性高，具有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1是脂肪间充质干细胞，p3，200×；

图2是双硫腙染色反应示诱导组双硫腙染色后呈红色。

具体实施方式

实施例1 本实施例的将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂，由以下质量浓度配比的组分组成：大株红景天注射液20 g/L、烟酰胺1.2g/L、牛磺酸0.50 g/L，GLP-1 30.5mg/L。

含有上述诱导剂的诱导培养基的组成配比为：每1000ml所述诱导培养基中大株红景天注射液20 g、烟酰胺1.2 g、牛磺酸0.5 g，GLP-1 30.5 mg，余量为人间充质干细胞无血清培养基，上述各成分混匀后过滤除菌即可制成本发明的诱导剂培养基。

本发明的诱导剂及诱导培养基各成分均为市售产品：人间充质干细胞无血清培养基，LONZA，00190632；大株红景天注射液，通化玉圣药业；烟酰胺，Sigma, N0636；牛磺酸，Sigma, T8691；GLP-1(胰高血糖素样肽1)，Sigma, scp0153。

实施例2 本实施例是将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，包括下列步骤：

一、脂肪间充质干细胞制备：

1、接收脂肪组织，用75%的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁。

2、分装脂肪组织，每一个T175 培养瓶分装脂肪组织为50ml。10ml移液管，去吸头，于脂肪采集瓶先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。

3、洗涤脂肪组织，除去血细胞。向T175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5 分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。

4、胶原酶I消化：加入等量新配制的预热（提前半小时于37℃的气浴摇床预热）的胶原酶I溶液（0.1%胶原酶I配制方法：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml 未加任何因子的培养基中，用之前37℃预热），封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5~10秒，置于振动气浴锅中，37℃，200rpm，消化60分钟，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5~10秒，直到看起来较为平滑。

5、分离基质血管组分（SVF）：将消化后的组织用无菌40目滤网分装到50ml的心管中，室温400g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。

6、净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。注意：在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g，10分钟离心。离心完毕，小心吸去上清液，不能直接倒掉。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的出去油。10ml培养基悬浮细胞，然后将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次室温300g，10分钟离心。

7、细胞种植：离心后加20ml培养基充分混匀。基于组织块法：根据培养瓶的面积进行细胞种植。按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶。进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞。

8、原代细胞培养：平置培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2%。培养基：人间充质干细胞无血清培养基（LONZA，00190632）。

9、换液：原代培养第24小时，进行全量换液。此后每隔3天全量换液，放置二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养。

10、原代细胞收获：7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70%～80%时，消化收获。

11、原代细胞收获：在培养瓶中加入消化酶（消化酶为0.125%Trypsin～0.01％ EDTA溶液，使用前室温（20～25℃）放置15～25min，每75 cm²加入2ml消化酶溶液），消化时间为1.5～2.5min，加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落,移入50ml离心管中，原培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射-液冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，移液管吹打悬浮后，100目无菌滤网过滤，过滤液收集到50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤。

12、原代细胞传代：观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数。计数后1000rpm，10min二次离心。去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm²，即（3.75~4.5）×10⁵个cells/T75，按照4.5×10⁵个cells/T75进行传代。在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息。将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱。条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2%。培养至细胞融合达85%～90%。

二、脂肪间充质干细胞的鉴定

取P3代脂肪间充质干细胞，流式检测细胞表面标记，流式结果见表1。

表1流式检测细胞表面标记

其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD49d表达大于95%，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2%，证明为该细胞为脂肪间充质干细胞。

三、诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛细胞：传3代的脂肪间充质干细胞，0.125%～0.01％Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度1×10⁴/cm²，接种于事先放置有经多聚赖氨酸处理的消毒盖玻片的24孔板内，制备细胞爬片。待细胞达接近80%融合，生长旺盛时再进行诱导分化，分组见表2。

表2诱导分组

四、诱导后胰岛细胞鉴定

1、双硫腙染色反应

分别取以上三组诱导7天后获得的胰岛样细胞，移出原培养基，PBS洗2次，各加入2ml PBS和50ul双硫腙工作液，37℃孵育10min, 移出染色液，PBS洗涤两次，观察细胞着色情况并拍照。结果如图所示，两个诱导组双硫腙染色后呈红色（如图1所示），为阳性反应，对照组为阴性。

2、化学发光免疫分析法检测胰岛素水平

分别取以上三组诱导7天后细胞培养上清，检测胰岛素含量，诱导组2的细胞分泌胰岛素浓度为408mU/L，远高于诱导组1的细胞分泌胰岛素浓度226.0mU/L，而空白对照组检测胰岛素浓度为零，说明本发明的诱导剂及诱导培养基可以显著提高诱导效率。

3、ELISA试剂盒检测用本发明诱导剂及诱导培养基诱导获得的胰岛样细胞是否具有胰岛细胞功能

这一检测过程直接按照Mercodia公司所提供的“C-peptide ELISA assays”标准过程操作。最终结果检测出C-肽，说明本发明的诱导剂及诱导培养基诱导的胰岛细胞能够分泌胰岛素。

4、葡萄糖刺激实验

挑取100个本发明诱导剂诱导分化7天的胰岛细胞团（50~150um）至1.5ml离心管中，用PBS清洗2遍，加入1ml无糖DMEM预培养3~6h，然后以300ul含有5.6mmol/L葡萄糖、16.7mmol/L葡萄糖的DMEM依次培养2h，收集上清液，用ELISA法检测上清中不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量，对照组细胞上清中几乎检测不到胰岛素，而经诱导的胰岛细胞团在5.6mmol/L葡萄糖刺激下有少量分泌，经16.7mmol/L葡萄糖孵育2h后，胰岛素分泌量明显升高（P<0.001），约为低糖条件下的2倍，由此结果可知，诱导后胰岛细胞团对葡萄糖刺激敏感，其胰岛素的分泌受外环境的调控。

5、体内移植实验

首先制作糖尿病大鼠模型。取成年Wistar大鼠，雌雄不限，体重约180~200g。按照70mg/kg剂量给每只大鼠腹腔注射链脲霉素。链脲霉素粉剂用0.1M柠檬酸缓冲液（PH=4.5）配成液体使用，现配现用。当大鼠血糖升高（≥16.7mmol/L）且稳定一周，表明糖尿病模型已经建成。无菌条件下，向糖尿病大鼠肾包囊下或者肝门脉小分支注入500个本发明的诱导剂诱导得到的胰岛样细胞团（50~150um）。术后，定期观测血糖情况。结果：糖尿病大鼠在植入细胞5天后血糖平均下降6.2mmol/L。表明采用本发明的诱导剂及诱导培养基得到的胰岛细胞团具有显著的降血糖作用。

Claims

1.一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂，其特征在于：由以下组分组成：大株红景天注射液、烟酰胺、牛磺酸和GLP-1。

2.根据权利要求1所述的将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂，其特征在于：各组分的质量浓度配比为：大株红景天注射液20～40 g/L、烟酰胺0.97～1.47g/L、牛磺酸0.25～0.50 g/L，GLP-1 26.84～40.27mg/L。

3.一种含有如权利要求1或2所述的诱导剂的诱导培养基，其特征在于：所述诱导培养基通过以下方法制备而成：每1000ml所述诱导培养基中含有大株红景天注射液20～40 g、烟酰胺0.97～1.47g、牛磺酸0.25～0.50 g、GLP-1 26.84～40.27mg，余量为人间充质干细胞无血清培养基，混匀过滤除菌即可。

4.一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，该方法包括以下步骤：

（1）、脂肪间充质干细胞的制备：将脂肪组织消化后，进行原代细胞培养、传代培养；

（2）、脂肪间充质干细胞的鉴定：取P3代脂肪间充质干细胞，流式检测细胞表面标记；

（3）、诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛细胞：传3代的脂肪间充质干细胞，0.125%～0.01％Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度1×10⁴/cm²，接种于事先放置有经多聚赖氨酸处理的消毒盖玻片的24孔板内，制备细胞爬片；待细胞达接近80%融合，生长旺盛时用诱导剂进行诱导分化；

（4）、诱导后胰岛细胞鉴定。

5.根据权利要求4所述的将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：步骤（4）所述的诱导后胰岛细胞鉴定方法为：双硫腙染色反应。

6.根据权利要求4所述的将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：步骤（4）所述的诱导后胰岛细胞鉴定方法为：化学发光免疫分析法检测胰岛素水平。

7.根据权利要求4所述的将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：步骤（4）所述的诱导后胰岛细胞鉴定方法为：采用ELISA试剂盒检测诱导获得的胰岛样细胞是否具有胰岛素分泌功能。

8.根据权利要求4所述的将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：步骤（4）所述的诱导后胰岛细胞鉴定方法为：葡萄糖刺激实验。

9.根据权利要求4所述的将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：步骤（4）所述的诱导后胰岛细胞鉴定方法为：动物模型体内移植实验。