CN115109125A - 一种非洲猪瘟病毒k205r蛋白特异性b细胞抗原表位多肽及其应用 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒k205r蛋白特异性b细胞抗原表位多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位多肽及其应用，属于分子免疫学技术领域。为了提供一种具有免疫保护功能或具有血清学诊断价值的非洲猪瘟病毒蛋白多肽抗原。本发明公开的抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明ASFV K205R蛋白特异性B细胞抗原表位合成多肽、合成表位多肽偶联抗原以及抗原表位融合表达蛋白作为抗原可用于特异性地检测机体免疫或感染后产生的抗ASFV K205R蛋白抗体。可用于ASFV感染诊断，疫苗免疫效果评价以及作为疫苗组份诱导免疫猪产生特异性抗体。

Description

一种非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位多肽及其 应用
技术领域
本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细 胞抗原表位多肽及其应用。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)感染引起的一种急性、 热性、高度致死性的猪传染病。ASFV主要感染各品种的家猪，家猪感染后症状一般表现为 高烧、严重抑郁、厌食、皮肤发绀、全身出血性病变、呼吸障碍和神经症状等，病程时间短， 病死率高，最急性和急性型感染死亡率高达100％。针对该病目前还没有有效的上市疫苗， 为了促进该病防控技术研究，迫切需要开展该病原重要蛋白抗原免疫学功能研究。针对该病 目前没有有效的上市疫苗亦无特效治疗药物。为了促进该病防控技术研究，迫切需要开展该 病病原重要抗原蛋白免疫学功能研究，筛选鉴定具有免疫保护功能或具有血清学诊断价值的 病毒蛋白抗原。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种具有免疫保护功能或具有血清学诊断价值的非洲猪瘟病 毒蛋白多肽抗原。
本发明提供一种非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列 为SEQ ID NO.1所示。
进一步地限定，在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或/和N端进行化学修。
进一步地限定，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端进行化学修饰为羧基化或 酰胺化；所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的N端进行化学修饰为氨基化或乙酰化。
进一步地限定，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列与偶联蛋白KLH、BSA或OVA连接；SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列利用半胱氨酸形成环状肽段；SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端和C端进行反应形成肽键获得环状肽。
本发明提供一种编码上述非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位多肽的基因。
本发明提供一种重组载体，所述重组载体携带上述的编码基因。
本发明提供一种重组微生物细胞，携带上述的基因或者表达上述的抗原表位多肽。
进一步地限定，所述微生物细胞为原核细胞或者真核细胞。
本发明提供上述的抗原表位多肽、上述的编码基因、上述的重组载体或上述的重组微生 物细胞在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒或者抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白抗体的试剂盒中的 应用。
本发明提供上述的抗原表位多肽、上述的编码基因、上述的重组载体或上述的重组微生 物细胞在制备预防或治疗非洲猪瘟疫疾病的疫苗中的应用。
有益效果：1.将本发明的非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位多肽或多肽 与载体蛋白偶联物作为抗原能够检测非洲猪瘟病毒ASFV抗体或抗非洲猪瘟病毒ASFV多肽 抗体。
2.本发明的非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位多肽具有更强的特异性， 可减少检测结果的假阳性率。
3.本发明的非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位或其连接物作为抗原，抗 原纯度更高，可克服基因工程表达抗原纯化中菌体杂蛋白的残留所致的非特异性反应。
4.本发明的非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位或其连接物作为抗原检测 非洲猪瘟病毒ASFV抗体或抗非洲猪瘟病毒多肽抗体。所生产的抗原可以仪器自动化生产， 质量易均一，检测结果更稳定。
5.本发明的非洲猪瘟病毒K205R蛋白抗原表位多肽，与载体蛋白偶联或与其他抗原蛋白 进行融合表达后作为疫苗抗原，对猪进行免疫可以诱导免疫猪产生非洲猪瘟病毒多肽抗体。
附图说明
图1为表达与纯化非洲猪瘟病毒(ASFV)K205R蛋白的电泳分析。
图2为K205R短肽融合表达蛋白的电泳分析结果。M是蛋白质分子量标准；1～13是MBP-K05R-1至MBP-K205R-13短肽融合蛋白；14是空载体表达MBP蛋白。
图3为抗原表位肽融合蛋白表达与纯化电泳分析结果。M是蛋白质分子量标准；1是未诱导 菌体蛋白；2是诱导后全菌蛋白；3是诱导后可溶性蛋白；4是亲和层析纯化的表位肽融合蛋 白。
具体实施方式
pK205R-6、pK205R-8和pK205R-10单克隆抗体记载在刘靖.非洲猪瘟病毒CD2v、p30和pK205R蛋白的表达纯化与p30、pK205R蛋白单克隆抗体的制备[D].中国农业科学院,2021.
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的， 决不限制本发明的范围。
实施例1.非洲猪瘟病毒(ASFV)K205R蛋白的真核表达与纯化
参考ASFV中国分离株Pig/HLJ/18株K205R基因序列(GenBank氨基酸的序列号：QBH90536.1，GenBank基因的序列号MK333180.1)编码蛋白序列，将基因序列进行密码子 优化，优化基因序列如SEQ ID NO.2所示，密码子优化基因序列命名为opti-ASFV-K205R， 在基因序列的3’端引入6×His标签编码序列。opti-ASFV-K205R基因由生物公司进行合成后克隆到真核表达载体pCAGneo((Hua et al.,2014.Generation and characterization ofa new mammalian cell line continuously expressing virus-like particles ofJapanese encephalitis virus for a subunit vaccine candidate.DOI:10.1186/1472-6750-14-62))的SacI与XhoI酶切位点之间， 构建了重组表达质粒pCAG-opti-K205R。将重组质粒pCAG-opti-K205R转染BHK-21细胞， 转染细胞用含G418培养基进行选择培养后获得稳定表达细胞株BASFV-K205R。将稳定表 达细胞株进行扩大培养后收获细胞培养上清液，细胞表达止清液用Ni-NTA树脂进行亲和层 析纯化，纯化的K205R蛋白用SDS-PAGE进行电泳分析表明得到了纯化的K205R蛋白(图 1)。
实施例2.K205R蛋白单克隆抗体的复制与制备
利用实施例1获得的表达纯化的重组蛋白K205R作为免疫原，免疫6周龄BALB/c小鼠，采用脾脏淋巴细胞杂交瘤技术进行融合，经有限稀释法克隆后获得3株分泌特异性针对ASFV K205R抗体的杂交瘤细胞，分别命名为pK205R-6、pK205R-8和pK205R-10。三株 单克隆抗体经亚型鉴定均为IgG1/κ型。三株单克隆抗体经Western blot检测表明均可特异地 与ASFV K205R蛋白反应，间接免疫荧光试验亦表明三株单克隆抗体均能够识别细胞表达的ASFV K205R蛋白。同时也表明该三株单抗所识别的抗原表位是位于K205R蛋白表面的线 性抗原表位，可以进一步鉴定其抗原表位序列。
实施例3.抗原表位的筛选与鉴定
采用部分重叠多肽融合表达系列ASFV K205R蛋白抗原多肽片段并进行间接ELISA筛 选单克隆抗体识别抗原表位。根据ASFV K205R蛋白氨基酸序列，设计一系列多肽，这些多 肽相互重叠，且覆盖ASFV K205R蛋白全长。根据每一条多肽氨基酸序列(重叠多肽序列)， 设计合成一对DNA链，将DNA链***表达载体pMAL-c5X与MBP蛋白进行融合表达，融 合表达的短肽融合蛋白用SDS-PAGE电泳分析表明都得到了表达(图2)。融合表达的系列 重组蛋白与ASFV K205R特异性单克隆抗体进行反应性分析，鉴定其线性抗原表位。具体流 程如下：
设计多肽序列→合成编码多肽序列的DNA链→多肽融合表达载体构建→诱导表达→表 达融合蛋白包被ELISA板→与单克隆抗体免疫反应性检测→分析ASFV K205R蛋白特异性 抗原表位。重叠多肽序列以及ELISA检测结果见表1。
表1重叠多肽融合蛋白与ASFV K205R特异性单克隆抗体ELISA反应检测结果
Figure BDA0003662722350000041
注:包被抗原为多肽与MBP融合表达蛋白，多肽序列分别如表中所示多肽序列。OD值为三个重复孔 平均OD值。
以上实验表明三株单克隆抗体所识别的线性抗原表位主要集中在121-180位氨基酸残基 之间，且三株单抗所识别的表位不同。单抗pK205R-6识别的抗原表位位于151-180位氨基 酸残基之间；单抗pK205R-8识别的抗原表位位于136-165与151-180的重叠区；而单抗pK205R-10识别的抗原表位位于121-150与136-165的重叠区。进一步对各单所识别的区域 分别进行N端与C端的删除突变后，再与MBP进行融合表达。所表达的系列融合蛋白再与单抗进行ELISA反应检测以精确定位抗原表位。将删除突变多肽序列与MBP蛋白进行融合表达，再分别与单克隆抗体进行ELISA反应。单克隆抗体pK205R-6与突变多肽融合蛋白 反应的结果如表2所示，结果表明单克隆抗体所识别的抗原表位核心序列为157FLTPEIQAILDEQF170。单克隆抗体pK205R-8与突变多肽融合蛋白反应的结果如表3所 示，结果表明单克隆抗体7A8所识别的抗原表位核心序列为154REKFL158。单克隆抗体 pK205R-10与截短突变多肽融合蛋白反应的结果如表4所示，结果表明单克隆抗体7H10所 识别的抗原表位核心序列为138-NAMFFTRSEWA-148，但136位P与137位N氨基酸残基 对表位也有一定贡献，删除这两个氨基酸残基后，单抗结合反应有所下降。综合上述试验结 果可以得出K205R蛋白136-PTNAMFFTRSEWASSNTFREKFLTPEIQAILDEQF-170多肽为 K205R蛋白抗原表位集中区域，包含3个独立抗原表位，该抗原表位优势区具有作为诊断抗 原以及诱导机体产生免疫抗体的应用潜力。
表2截短的表位肽融合蛋白与ASFV K205R特异性单克隆抗体pK205R-6 ELISA反应结果
Figure BDA0003662722350000051
注:包被抗原为多肽与MBP融合表达蛋白，多肽序列分别如表中所示多肽序列。OD值为三个重复孔 平均OD值。
表3截短的表位肽融合蛋白与ASFV K205R特异性单克隆抗体pK205R-8 ELISA反应结果
Figure BDA0003662722350000061
注:包被抗原为多肽与MBP融合表达蛋白，多肽序列分别如表中所示多肽序列。OD值为三个重复孔 平均OD值。
表4截短的表位肽融合蛋白与ASFV K205R特异性单克隆抗体pK205R-10 ELISA反应结果
Figure BDA0003662722350000062
注:包被抗原为多肽与MBP融合表达蛋白，多肽序列分别如表中所示多肽序列。OD值为三个重复孔 平均OD值。
实施例4.非洲猪瘟病毒ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位多肽的合成
1.根据实施例3抗原表位筛选与鉴定结果，将K205R特异性B细胞抗原表位的氨基酸 序列136-PTNAMFFTRSEWASSNTFREKFLTPEIQAILDEQF-170，应用固相多肽合成技术， 采用自动多肽合成仪或人工多肽合成方法。固相树脂采用Fmoc保护的氨基酸Wang树脂或 其它树脂，树脂经DMF溶涨、piperidine胶Fmoc保护后，根据氨基酸序列顺序，加入Fmoc 保护的氨基酸，在HBTU存在情况下进行酰化反应。酰化反应完成后经过洗涤，再加入第二 位的Fmoc-氨基酸进行酰化反应，并洗涤。如此循环，从多肽序列C末端起始向N末端，按 照顺序合成完整的多肽链。合成完成后，根据组成肽链氨基酸不同选取适当试剂用TFA法 裂解肽链与树脂的连接并用冷***沉淀TFA多肽，经脱盐纯化、LC－MS和HPLC分析鉴 定后备用。在整个合成过程中，每个氨基酸酰化反应后可以应用Kaiser法或TMBS法测试 反应的完成情况。为了便于使表位多肽和载体蛋白连接，在合成多肽时可以在多肽序列的N 末端加一个半胱氨酸。根据以上所述的固相多肽合成技术，合成了SEQ NO.1所示的抗原表 位多肽。
2.编码K205R蛋白抗原表位多肽的基因序列如SEQ ID NO.4所示，将SEQ ID NO.4所 示的序列***到pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K 系列中的任意一种获得重组载体，利用重组载体表达获得SEQ NO.1所示的抗原表位多肽。
实施例5.非洲猪瘟病毒ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位多肽的化学修饰产物
按照实施例4的方法合成的多肽片段(SEQ NO.1)，在多肽片段的N末端进行自然氨基修饰，C末端进行自然羧基修饰。
N末端乙酰化修饰方法：按照实施例4中的多肽合成至最后一个Fmoc保护氨基酸偶联 结束，并进行N末端Fmoc保护基团的去除，然后进行以下操作。取150μl乙酸酐和20μLEIPEA溶于4.8ml DMF中，充分混合并在冰浴中冷却。然后将以上混合液加入多肽合成反 应管中反应5min。再依次用5ml DMF和二氯甲烷(DCM)洗2次，每次5min。氮气吹干 后按照常规方法进行侧链保护基团的去除、裂解、纯化和鉴定。
C末端酰胺化修饰方法：C末端酰胺化的多肽合成时应选用树脂为Rink树脂。执行合 成程序时应对树脂用DMF溶涨20min，然后从C末端第一位氨基酸开始执行合成程序，同前过Fmoc-wang树脂合成方法。
利用上述的方法获得在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端进行化修饰为羧基化或 酰胺化的产物；
在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端进行化学修饰为氨基化或乙酰化的产物。
在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端进行化学修饰为氨基化或乙酰化，C端进行 化修饰为羧基化或酰胺化的产物。
获得修饰后的产物可以增加抗原的稳定性，作为检测抗非洲猪瘟ASFV K205R蛋白抗体 的应用中检测结果比只用SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列未修饰多肽稳定。修饰后的产物制 成疫苗后的治疗和预防非洲猪瘟的效果的与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列制成疫苗的效 果持平的。
实施例6.非洲猪瘟ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位多肽与载体蛋白KLH和BSA的偶联产物
载体蛋白KLH或BSA4mg溶于0.5ml含5mM EDTA的PBS(pH7.2)缓冲液中，加入 1.0mg连接剂Sulfo-SMCC，充分溶解后在室温孵育60min或37℃孵育30min。应用Sephadex G-25柱或透析方法脱盐纯化Sulfo-SMCC处理的载体蛋白，并用BCA法测定蛋白含量后备 用。
称取实施例4所合成的表位多肽4mg，加入0.5ml重蒸馏水溶解多肽，然后将溶解后的 多肽与Sulfo-SMCC处理的载体蛋白混合，4℃孵育2小时或反应过夜，分装备用，获得SEQNO.1所示的抗原表位多肽与载体蛋白KLH偶联的融合蛋白、SEQ NO.1所示的抗原表位多 肽与载体蛋白BSA偶联的融合蛋白。
将SEQ NO.1所示的抗原表位多肽与载体蛋白OVA连接，获得融合蛋白。
上述三种融合蛋白作为抗原制成疫苗后具有比SEQ NO.1所示的抗原表位多肽具有更强 的诱导抗体产生效果。作为检测抗非洲猪瘟ASFV K205R蛋白抗体的应用中检测结果比只用 SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列稳定性和准确度相当。
实施例7.非洲猪瘟病毒ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位氧化实现自身的连接获得的 产物
1.含半胱氨酸的多肽可以通过巯基的氧化反应形成自身连接。在SEQ NO.1所示的氨酸 序列的N端加入半胱氨酸，一般情况下应用DMSO介导的氧化反应实现连接，根据多肽的 酸碱性，氧化反应可以在微酸或微碱性条件下进行，得到环状肽段。
微酸性环境下的氧化反应：用适当浓度的醋酸溶解多肽，使多肽的浓度在0.5-1.5mM范 围内，醋酸的终浓度不超过5％，用(NH4)2CO3调整多肽溶液的pH为6.0左右，加入10-20％ 的DMSO，25℃反应5-25h，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后，用1％TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽。
微碱性环境下的氧化反应：用0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.5，溶解多肽至终浓度1.0mM， 加入浓度DMSO至终浓度1％，25℃反应过夜，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。 然后用1％TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽，获得SEQ NO.1所示的抗原表位多肽形成的环状肽段。
2.将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端和C端进行自连接，形成肽键获得环状肽 段。
步骤1和步骤2获得的环状肽段均可以增加抗原的稳定性的，作为检测抗非洲猪瘟ASFV K205R蛋白抗体的引用中检测结果比只用SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列线性多肽要稳定。 作为检测抗非洲猪瘟ASFV K205R蛋白抗体的应用中检测结果比只用SEQ ID NO.1所示的 氨基酸序列稳定性和准确度持平。
实施例8.非洲猪瘟病毒ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位多肽及多肽偶联蛋白抗原间 接ELISA检测猪抗ASFV抗体
用ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位合成抗原表位多肽(SEQ NO.1)以及实施例6获得的表位多肽(SEQ NO.1)与载体蛋白(KLH)的连接物为包被抗原，包被96孔聚苯乙烯酶 标板。用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度为4μg/ml，按100μl/孔加入酶标板中， 4℃包被过夜。然后用PBST(含0.05％Tween 20的PBS液)洗涤酶标板3次，300μl/孔； 用含1％BSA的PBST封闭酶标板，200μl/孔，37℃封闭2h，封闭后用洗液PBST洗板3次， 立即用于检测或－20℃存放备用。
抗体检测操作程序：加入待检测猪血清(定性检测血清100倍稀释，抗体效价检测血清 进行倍比稀释，同时设立阳性血清对照与阴性血清对照以及不加血清的空白对照)100μl/孔， 37℃孵育1h，PBST洗液洗涤3次，每次3分钟；加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，100μl/ 孔，37℃孵育1h，PBST洗液洗涤4次，每次3分钟；加入TMB显色液，100μl/孔，室温孵 育10分钟观察显色反应；充分显色后，加入2M硫酸，100μl/孔，终止显色反应；用酶标仪 测量450nm波长的吸光值(OD450)；判定结果。
判定结果时：空白对照及阴性血清孔吸光值小于或等于0.2，阳性血清对照孔吸光值大 于0.4时结果有效；计算P/N值＝(检测孔OD值－空白对照孔OD值)/(阴性血清OD值－空白对照孔OD值)，P/N值等于或大于2时为阳性；以反应阳性血清的最大稀释倍数为该样品血清的抗体效价。
选取已知的ASFV抗体阳性猪血清以及阴性猪血清各30份，分别以K205R表位合成肽 与合成肽偶联蛋白KLH为包被抗原进行间接ELISA检测，以检测抗原的检测效果。
试验结果见表5，表6与表7。
表5合成表位多肽SEQ ID NO.1检测猪血清结果
Figure BDA0003662722350000101
注：包被抗原为抗原表位SEQ ID NO.1合成肽，4μg/ml。该阳性血清效价为800。
表6表位多肽SEQ ID NO.1偶联KLH抗原检测猪血清结果
Figure BDA0003662722350000102
注：包被抗原为抗原表位SEQ ID NO.1合成肽,5μg/ml。该阳性血清效价为800。
表7多肽及多肽偶联物为抗原检测猪血清结果
Figure BDA0003662722350000103
注：多肽抗原为SEQ ID NO.1，多肽偶联蛋白抗原为SEQ NO.1与载体蛋白(KLH)的连接物。
实施例9.非洲猪瘟病毒ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测猪抗ASFV抗体
ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位多肽(SEQ ID NO.1)或表位多肽与载体的连接物(实 施例6获得的表位多肽(SEQ NO.1)与载体蛋白BSA的连接物)为包被抗原，以BSA为对照抗原。在硝酸纤维素膜上定点包被抗原，2μg/点，37℃固定30min，PBST洗涤6次，2％BSA中4℃封闭过夜，PBST洗涤6次后即可用于抗体检测。
检测抗体时，将待检测血清样品用样品稀释液(含1％BSA的PBST)适当稀释后与抗原包被膜于37℃孵育30min，PBST洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，37℃ 孵育1h，PBST洗液洗涤6次；加入AEC或DAB底物显色，室温避光孵育10min观察颜色 反应。
结果判定时，以包被抗原点呈现棕红色颜色反应，对照抗原点不出现颜色反应者为阳性。
实施例10.非洲猪瘟病毒ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位多肽用于乳胶凝集试验检测 ASFV抗体：
表位多肽乳胶诊断抗原的制备：将根据实施例4的方法合成的K205R蛋白抗原表位多 肽(SEQ ID NO.1)对商品化羧化聚苯乙烯乳胶进行致敏，建立ASFV抗体乳胶凝集检测方法。具体步骤为：用0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤商品化羧化乳胶3次，离心，弃上清；用0.02mol/L pH4.5磷酸缓冲液重悬，洗3次，离心弃上清；用2％碳化二亚胺(EDC)溶 液重悬，室温作用3～4h，离心弃上清；用0.01mol/L pH8.4硼酸缓冲液重悬，洗3次；离心， 重悬，加入K205R蛋白抗原表位多肽，室温下缓慢摇动作用4h；用0.1mol/L乙醇胺封闭30min 后悬浮于贮存液中。
抗体检测：用移液器吸取20μL致敏的乳胶试剂滴于玻片上，然后吸取等量的待检血清 与玻片上的乳胶试剂混合，并用枪头搅拌均匀，轻轻摇动卡片，使其充分结合，5～10min后 判定结果。同时用生理盐水设为阴性对照。
结果判定：
“++++”表示：全部胶乳凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；判定为ASFV抗 体强阳性。
“+++”表示：大部分胶乳凝集，颗粒明显，液体稍混浊；判定为ASFV抗体阳性。
“++”表示：约50％胶乳凝集，但颗粒较细，液体较混浊；判定为ASFV抗体阳性。
“+”表示：有少许凝集，液体呈混浊；判定为ASFV抗体弱阳性。
“－”表示：液滴呈原有的均匀乳状而不凝集；判定为ASFV抗体阴性。
用抗原表位多肽致敏的乳胶试剂对已知的5份ASFV抗体阳性猪血清与5份ASFV抗体 阴性猪血清进行检测，结果如表8所示，阳性血清均发生凝集，阴性血清均不凝集。
表8乳胶凝集试验法检测猪血清非洲猪瘟抗体结果
Figure BDA0003662722350000111
实施例11.非洲猪瘟病毒ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位肽与ASFV CD2v蛋白(QBH90546.1)融合表达
ASFV CD2v蛋白记载在文章王曼,沈宇清.非洲猪瘟病毒结构蛋白CD2v的功能研究进 展[J].中国免疫学杂志,2021,37(22):5.
将编码SEQ ID NO.1所示抗原表位肽的基因序列与编码ASFV CD2v蛋白基因进行连 接，将K205R抗原表位肽融合在CD2v羧基端，融合基因序列如SEQ ID NO.3所示，融合 基因命名为CD2v-EPK205R，将CD2v-EPK205R基因克隆到表达质粒pMAL-c5X的NotI与BamHI 酶切位点之间，构建成表达质粒pMAL-CD2v-EPK205R。表达质粒经序列测定验证后，转化表 达菌ER2523感受态细胞，挑取单菌落进行扩大培养后用0.3mmol/L IPTG在30℃下诱导表 达4h。诱导表达菌体经离心，洗涤后进行超声波裂解后，12000rpm离心10min后取上清进 行表达纯化。融合表达蛋白MBP-CD2v-EPK205R用淀粉柱进行亲和层析纯化。表达与纯化的 融合蛋白MBP-CD2v-EPK205R经SDS-PAGE分析，如图3所示，融合蛋白以可溶解蛋白形式 表达，经亲和层析获得了纯化的融合蛋白，可以作为检测或免疫抗原进行抗体检测或动物免 疫。
实施例12.非洲猪瘟病毒ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位肽融合CD2v蛋白免疫猪
将实施例11所表达、纯化的抗原表位融合蛋白MBP-CD2v-EPK205R作为抗原蛋白，与油 佐剂乳化后对实验动物猪进行免疫试验。具体步骤为：将纯化的MBP-CD2v-EPK205R抗原表位融合蛋白用PBS稀释至200μg/mL，与MONTANIDE ISA 61 VG油佐剂按重量比为1：1 进行混合、乳化制成疫苗。
将6头30～40日龄非洲猪瘟抗原与抗体均为阴性的健康仔猪随机分为两组，3头/组。第 一组为免疫组，每头颈部肌肉注射疫苗1ml进行免疫，首次免疫28日后以相同剂量与免疫 方式进行加强免疫一次；第二组为对照组，与第一组免疫的相同时间注射生理盐水对照。试 验猪分别于免疫前，免疫后28日，免疫后42日采血分离血清，用间接ELISA法检测K205R 蛋白抗原表位特异性抗体。以实施例4合成的抗原表位多肽为包被抗原，用间接ELISA法 检测试验猪抗体；用K205R蛋白抗原表位多肽检测试验猪抗体方法如实施例8所示。结果 如表9所示，疫苗免疫组猪于免疫后产生了抗原表位肽特异性抗体，加强免疫后抗体效价明 显升高，而未免疫对照猪则无特异性抗体产生。
表9抗原表位肽融合蛋白免疫试验猪抗体检测结果
Figure BDA0003662722350000121
实施例13.非洲猪瘟病毒ASFV K205R蛋白B细胞抗原表位肽免疫猪获得疫苗
SEQ ID NO.1所示抗原表位肽用PBS稀释至200μg/mL，与MONTANIDE ISA 61 VG油佐剂按重量比为1：1进行混合、乳化制成疫苗。
将6头30～40日龄非洲猪瘟抗原与抗体均为阴性的健康仔猪随机分为两组，3头/组。第 一组为免疫组，每头颈部肌肉注射疫苗1ml进行免疫，首次免疫28日后以相同剂量与免疫 方式进行加强免疫一次；第二组为对照组，与第一组免疫的相同时间注射生理盐水对照。试 验猪分别于免疫前，免疫后28日，免疫后42日采血分离血清，用间接ELISA法检测K205R 蛋白抗原表位特异性抗体。以实施例4合成的抗原表位多肽为包被抗原，用间接ELISA法 检测试验猪抗体；用K205R蛋白抗原表位多肽检测试验猪抗体方法如实施例8所示。结果 如表10所示，疫苗免疫组猪于免疫后产生了抗原表位肽特异性抗体，加强免疫后抗体效价 明显升高，而未免疫对照猪则无特异性抗体产生。
表10抗原表位多肽免疫试验猪抗体检测结果
Figure BDA0003662722350000131
SEQ ID NO.1(非洲猪瘟病毒K205R蛋白抗原表位多肽氨基酸序列) PTNAMFFTRSEWASSNTFREKFLTPEIQAILDEQF
SEQ ID NO.2(密码子优化的编码ASFV K205R蛋白的基因序列)
atggtggagccccgcgagcagttcttccaggacctgctgtccgccgtggaccagcagatggacaccgtgaagaacgacatcaaggacatca tgaaggagaagacctccttcatggtgtccttcgagaacttcatcgagcgctacgacaccatggagaagaacatccaggacctgcagaacaagt acgaggagatggccgccaacctgatgaccgtgatgaccgacaccaagatccagctgggcgccatcatcgcccagctggagatcctgatgat caacggcacccccctgcccgccaagaagaccaccatcaaggaggccatgcccctgccctcctccaacaccaacaacgagcagacctcccc ccccgcctccggcaagacctccgagacccccaagaagaaccccaccaacgccatgttcttcacccgctccgagtgggcctcctccaacacct tccgcgagaagttcctgacccccgagatccaggccatcctggacgagcagttcgccaacaagaccggcatcgagcgcctgcacgccgagg gcctgtacatgtggcgcacccagttctccgacgagcagaagaagatggtgaaggagatgatgaagaag
SEQ ID NO.3(编码抗原表位肽融合蛋白CD2v-EPK205R的基因序列)
attgattattgggttagttttaataaaacaataattttagatagtaatattactaatgataataatgatataaatggagtatcatggaatttttttaataattc ttttaatacactagctacatgtggaaaagcaggtaacttttgtgaatgttctaattatagtacatcaatatataatataacaaataattgtagcttaacta tttttcctcataatgatgtatttgatacaacatatcaagtagtatggaatcaaataattaattatacaataaaattattaacacctgctactcccccaaat atcacatataattgtactaattttttaataacatgtaaaaaaaataatggaacaaacactaatatatatttaaatataaatgatacttttgttaaatatacta atgaaagtatacttgaatataactggaataatagtaacattaacaattttacagctacatgtataattaataatacaattagtacatctaatgaaacaa cacttataaattgtacttatttaacattgtcatctaactatttttatactttttttaaattatatcccacgaatgcgatgttcttcacgcgtagcgaatgggc atcctcgaatacttttcgagaaaagtttttaacaccagaaattcaagccatattggatgagcagttt
SEQ ID NO.4(编码K205R蛋白抗原表位多肽的基因)
cccacgaatgcgatgttcttcacgcgtagcgaatgggcatcctcgaatacttttcgagaaaagtttttaacaccagaaattcaagccatattggat gagcagttt
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 一种非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位多肽及其应用
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser Asn
1 5 10 15
Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu Asp
20 25 30
Glu Gln Phe
35
<210> 2
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atggtggagc cccgcgagca gttcttccag gacctgctgt ccgccgtgga ccagcagatg 60
gacaccgtga agaacgacat caaggacatc atgaaggaga agacctcctt catggtgtcc 120
ttcgagaact tcatcgagcg ctacgacacc atggagaaga acatccagga cctgcagaac 180
aagtacgagg agatggccgc caacctgatg accgtgatga ccgacaccaa gatccagctg 240
ggcgccatca tcgcccagct ggagatcctg atgatcaacg gcacccccct gcccgccaag 300
aagaccacca tcaaggaggc catgcccctg ccctcctcca acaccaacaa cgagcagacc 360
tccccccccg cctccggcaa gacctccgag acccccaaga agaaccccac caacgccatg 420
ttcttcaccc gctccgagtg ggcctcctcc aacaccttcc gcgagaagtt cctgaccccc 480
gagatccagg ccatcctgga cgagcagttc gccaacaaga ccggcatcga gcgcctgcac 540
gccgagggcc tgtacatgtg gcgcacccag ttctccgacg agcagaagaa gatggtgaag 600
gagatgatga agaag 615
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
attgattatt gggttagttt taataaaaca ataattttag atagtaatat tactaatgat 60
aataatgata taaatggagt atcatggaat ttttttaata attcttttaa tacactagct 120
acatgtggaa aagcaggtaa cttttgtgaa tgttctaatt atagtacatc aatatataat 180
ataacaaata attgtagctt aactattttt cctcataatg atgtatttga tacaacatat 240
caagtagtat ggaatcaaat aattaattat acaataaaat tattaacacc tgctactccc 300
ccaaatatca catataattg tactaatttt ttaataacat gtaaaaaaaa taatggaaca 360
aacactaata tatatttaaa tataaatgat acttttgtta aatatactaa tgaaagtata 420
cttgaatata actggaataa tagtaacatt aacaatttta cagctacatg tataattaat 480
aatacaatta gtacatctaa tgaaacaaca cttataaatt gtacttattt aacattgtca 540
tctaactatt tttatacttt ttttaaatta tatcccacga atgcgatgtt cttcacgcgt 600
agcgaatggg catcctcgaa tacttttcga gaaaagtttt taacaccaga aattcaagcc 660
atattggatg agcagttt 678
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cccacgaatg cgatgttctt cacgcgtagc gaatgggcat cctcgaatac ttttcgagaa 60
aagtttttaa caccagaaat tcaagccata ttggatgagc agttt 105
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 5
Met Val Glu Pro Arg Glu Gln Phe Phe Gln Asp Leu Leu Ser Ala Val
1 5 10 15
Asp Gln Gln Met Asp Thr Val Lys Asn Asp Ile Lys Asp Ile
20 25 30
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 6
Val Asp Gln Gln Met Asp Thr Val Lys Asn Asp Ile Lys Asp Ile Met
1 5 10 15
Lys Glu Lys Thr Ser Phe Met Val Ser Phe Glu Asn Phe Ile
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Met Lys Glu Lys Thr Ser Phe Met Val Ser Phe Glu Asn Phe Ile Glu
1 5 10 15
Arg Tyr Asp Thr Met Glu Lys Asn Ile Gln Asp Leu Gln Asn
20 25 30
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 8
Glu Arg Tyr Asp Thr Met Glu Lys Asn Ile Gln Asp Leu Gln Asn Lys
1 5 10 15
Tyr Glu Glu Met Ala Ala Asn Leu Met Thr Val Met Thr Asp
20 25 30
<210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Lys Tyr Glu Glu Met Ala Ala Asn Leu Met Thr Val Met Thr Asp Thr
1 5 10 15
Lys Ile Gln Leu Gly Ala Ile Ile Ala Gln Leu Glu Ile Leu
20 25 30
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 10
Thr Lys Ile Gln Leu Gly Ala Ile Ile Ala Gln Leu Glu Ile Leu Met
1 5 10 15
Ile Asn Gly Thr Pro Leu Pro Ala Lys Lys Thr Thr Ile Lys
20 25 30
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
Met Ile Asn Gly Thr Pro Leu Pro Ala Lys Lys Thr Thr Ile Lys Glu
1 5 10 15
Ala Met Pro Leu Pro Ser Ser Asn Thr Asn Asn Glu Gln Thr
20 25 30
<210> 12
<211> 30
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 12
Glu Ala Met Pro Leu Pro Ser Ser Asn Thr Asn Asn Glu Gln Thr Ser
1 5 10 15
Pro Pro Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Thr Pro Lys Lys Asn
20 25 30
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
Ser Pro Pro Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Thr Pro Lys Lys Asn Pro
1 5 10 15
Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser
20 25 30
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser Asn
1 5 10 15
Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile
20 25 30
<210> 15
<211> 30
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 15
Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu
1 5 10 15
Asp Glu Gln Phe Ala Asn Lys Thr Gly Ile Glu Arg Leu His
20 25 30
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 16
Leu Asp Glu Gln Phe Ala Asn Lys Thr Gly Ile Glu Arg Leu His Ala
1 5 10 15
Glu Gly Leu Tyr Met Trp Arg Thr Gln Phe Ser Asp Glu Gln
20 25 30
<210> 17
<211> 25
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 17
Ala Glu Gly Leu Tyr Met Trp Arg Thr Gln Phe Ser Asp Glu Gln Lys
1 5 10 15
Lys Met Val Lys Glu Met Met Lys Lys
20 25
<210> 18
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 18
Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu
1 5 10 15
Asp Glu Gln Phe Ala Asn Lys Thr Gly Ile Glu Arg
20 25
<210> 19
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 19
Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu
1 5 10 15
Asp Glu Gln Phe Ala Asn Lys Thr Gly Ile
20 25
<210> 20
<211> 24
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 20
Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu
1 5 10 15
Asp Glu Gln Phe Ala Asn Lys Thr
20
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<212> PRT
<213> 人工合成
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Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu
1 5 10 15
Asp Glu Gln Phe Ala Asn
20
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 22
Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu
1 5 10 15
Asp Glu Gln Phe
20
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 23
Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Phe Ala Asn Lys Thr Gly Ile Glu Arg Leu His
20 25
<210> 24
<211> 26
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 24
Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu Asp Glu Gln Phe
1 5 10 15
Ala Asn Lys Thr Gly Ile Glu Arg Leu His
20 25
<210> 25
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工合成
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Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu Asp Glu Gln Phe Ala Asn
1 5 10 15
Lys Thr Gly Ile Glu Arg Leu His
20
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<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 26
Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu Asp Glu Gln Phe Ala Asn Lys Thr
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Gly Ile Glu Arg Leu His
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工合成
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Glu Ile Gln Ala Ile Leu Asp Glu Gln Phe Ala Asn Lys Thr Gly Ile
1 5 10 15
Glu Arg Leu His
20
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<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 28
Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工合成
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Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln
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<212> PRT
<213> African Swine fever virus
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Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile
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<213> 人工合成
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<212> PRT
<213> African Swine fever virus
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Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro
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<212> PRT
<213> 人工合成
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<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 34
Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu
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<212> PRT
<213> 人工合成
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<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 36
Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile
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<211> 13
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<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 38
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 39
Glu Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 40
Lys Phe Leu Thr Pro Glu Ile Gln Ala Ile
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<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 41
Lys Asn Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala
1 5 10 15
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 42
Lys Asn Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu
1 5 10
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 43
Lys Asn Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 44
Lys Asn Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe
1 5
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 45
Asn Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 46
Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser
1 5 10 15
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 47
Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser
1 5 10
<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 48
Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 49
Ala Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser
1 5 10
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> African Swine fever virus
<400> 50
Met Phe Phe Thr Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser
1 5 10

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的抗原表位多肽，其特征在于，在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或/和N端进行化学修。
3.根据权利要求2所述的抗原表位多肽，其特征在于，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端进行化学修饰为羧基化或酰胺化；所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端进行化学修饰为氨基化或乙酰化。
4.根据权利要求1所述的抗原表位多肽，其特征在于，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列与偶联蛋白KLH、BSA或OVA连接；SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列利用半胱氨酸形成环状肽段；SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端和C端进行反应形成肽键获得环状肽。
5.编码权利要求1所述非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性B细胞抗原表位多肽的基因。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求2所述的编码基因。
7.一种重组微生物细胞，其特征在于，携带权利要求2所述的基因或者表达权利要求1所述的抗原表位多肽。
8.根据权利要求7所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核细胞或者真核细胞。
9.权利要求1-4任意一项所述的抗原表位多肽、权利要求5所述的编码基因、权利要求6所述的重组载体或权利要求7或8所述的重组微生物细胞在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒或者抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白抗体的试剂盒中的应用。
10.权利要求1-4任意一项所述的抗原表位多肽、权利要求5所述的编码基因、权利要求6所述的重组载体或权利要求7或8所述的重组微生物细胞在制备预防或治疗非洲猪瘟疫疾病的疫苗中的应用。
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