CN103748224B

CN103748224B - 一个棉花蛋白激酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103748224B
Application number: CN201280004530.2A
Authority: CN
Inventors: 崔洪志; 梁丽; 王建胜; 何云蔚
Original assignee: Biocentury Seed Industry Co Ltd
Current assignee: Biocentury Seed Industry Co Ltd
Priority date: 2012-08-13
Filing date: 2012-08-13
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2032-08-13
Also published as: CN103748224A; WO2014026311A1

Abstract

本发明涉及一个来源于棉花的蛋白激酶GPK1及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

一个棉花蛋白激酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及蛋白激酶及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的棉花蛋白激酶GPK1及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。

技术背景

非生物胁迫，如干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等能够对植物的生长发育造成严重的危害，对作物产量造成极大损失，其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计，世界干早、半干早地区占陆地面积的34％；我国干早、半干旱地区约占国土面积的52％，年受早面积达20～270万公顷，全国灌溉区每年缺水约30亿立方米，因缺水而少收粮食350～40亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。

由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状，现有可利用的种质资源匮乏，采用常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大，培育出真正的耐胁迫品种就尤为困难。近年来，随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分子生物学技术的迅猛发展，抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平，促进了植物抗逆基因工程的发展。当植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应，来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为3类：(1)参与信号级联放大***和转录控制的基因及产物；(2)直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；(3)与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。近年来，通过转基因技术提高植物对胁迫耐受能力的研究，以及对胁迫具有耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导***也有了更进一步的了解(LiuQ.1998.Two transcrip tion facto rs，DREB1and DREB2，withan EREBP/AP2DNA bindingdomain，separate two cellular signal transductionpathways in drought-and lowtemperature-responsive gene exp ression，respectively，in A rabidopsis.PlantCell，10：1391-1406；KAN GJY.2002.A rabid op sis basicleucine zipper p ro teinsthat mediate stress2responsive abscisic acid signaling。PlantCell，14：343-357；ABE H.2003.A rabid op sis AtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)function as transcriptional activato rs in abscisic acid signaling.Plant Cell，15：63-78.)。

但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究占多数，但抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络***的机理还有待进一步研究。

发明内容

本发明人利用SSH与RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个蛋白激酶(本文命名为GPK1)的编码基因的DNA序列。并发现将其导入转基因植株后，可明显改善转基因植株的耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个蛋白激酶GPK1的编码基因，其序列为SEQID NO：1。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图2所示的rd29A-GhGPK1-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的核苷酸序列或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述的核苷酸序列或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。

本发明第七方面提供发明第一方面所述的基因编码的氨基酸序列，如SEQID NO：1所示。

附图说明

图1是GhGPK1的植物表达载体(rd29A-GhGPK1-2300)的构建流程。

图2是GhGPK1的植物表达载体(rd29A-GhGPK1-2300)的质粒图。

图3是GhGPK1T1代转基因烟草植株(图中，T1R1；右，T1R3)和作为对照的非转基因烟草植株(图左，CK)的耐旱模拟实验结果。

图4是转基因T1代烟草植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验证结果。

具体实施方式

下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1、干旱胁迫下棉花SSH文库构建：

具体方法为：

利用Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶子的mRNA作为样本(tester)，以未处理的棉花幼苗的叶子的mRNA作为对照(driver)。具体步骤简述如下：

(1)供试材料：

冀棉14(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-30270)播种到灭过菌的蛭石上，在25℃、光周期16h/8h条件下培养，每周浇1/2MS培养基(9.39mM KNO3，0.625mM KH2PO4，10.3mM NH4NO3，0.75mM MgSO4，1.5mM CaCl2，50μM KI，100μM H3BO3，100μM MnSO4，30μM ZnSO4，1μM Na2MoO4，0.1μM CoCl2，100μM Na2EDTA，100μM FeSO4)一次。当苗株高达25-30cm时用于实验。

(2)材料处理：

将供试幼苗分为2组，每组4盆，每盆1株。第一组为对照组，在25℃、光照培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组，25℃、光照培养，停止浇灌，处理10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。

(3)总RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶子0.5g，用植物RNA提取试剂盒(invitrogen)提取棉花的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA纯化试剂盒(purification of polyA+RNA fromtotal RNA)分离mRNA。

(4)抑制消减杂交：

为了增加获得表达序列标签(Expressed sequence tag，EST)(unigene)的有效性，避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区。本实验室用RsaI，HaeIII分别对双链cDNA(按照消减试剂盒中记载的方案，由mRNA逆转录获得)进行消化，做两组抑制差减，其他步骤及方法按Clontech公司的PCR-select^TMcDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制消减杂交，最后合并两组两组正向消减杂交cDNA片段的第二次PCR产物。

(5)cDNA消减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

正向消减杂交cDNA片段的第二次PCR产物(QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自Qiagen)与pGEM-T Easy(购自Promega试剂盒)载体连接，依照pGEM-TEasy试剂盒的程序，具体步骤如下：用200μl PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交cDNA片段的第二次PCR产物3μl，T4连接酶缓冲液5μl，pGEM-T Easy载体1μl，T4DNA连接酶1μl，于4℃连接过夜。取10μL连接反应产物，加入到100μL感受态大肠杆菌JMI09(购自TAKARA)中，冰浴30min、热休克60s、冰浴2min，另加250μL LB培养液(1％Tryptone购自OXOID，0.5％YeastExtract购自OXOID，1％NaCl购自国药)置37℃水浴中，以225r/min振荡培养30min，取200μL菌液种植于含50μg/mL氨苄青霉素的LB(同上)/X-gal/IPTG(X-gal/IPTG购自TAKARA)培养板上，37℃培育18h。计数培养板中直径＞1mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取360个白色菌落(编号：Gh-D001至Gh-D360)。将所有白色克隆挑于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的96孔细胞培养板(CORNING)中，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，于-80℃保存备用。以巢式PCR引物Primer1和Primer2R(Clontech公司的PCR-selectTM cDNASubtraction Kit试剂盒自带)进行菌液PCR扩增，得到292个阳性克隆，对所有阳性克隆在送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序

(6)差异克隆的cDNA测序分析：

将DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的cDNA后，共得到180个EST(unigene)。经BlastN发现其中102条unigene在GenBank中有同源序列(蛋白同源性50％以上)，33条EST功能未知或者为假定蛋白，另有45条未获得同源匹配，推测可能是处于3’、5’末端非翻译区的较短序列。

实施例2棉花蛋白激酶类编码基因GhGPK1的克隆

克隆子Gh-D193去掉冗余DNA后，序列为SEQ ID No：3，序列分析表明该序列的编码的氨基酸序列属于促***原活化蛋白激酶，本文将克隆子Gh-D193编码的全长基因命名为GhGPK1，对应的蛋白命名为GPK1。

SEQ ID No：3

1 ACACTAAACA ACTTTTGTTG GGACTGGAAT ATCTTCACAA AAATAGAATC GTGCATAGAG

61 ACATCAAGGG AGCAAACATT CTTGTGGATA ACAAGGGTTG TATCAAACTT GCAGACTTTG

121 GTGCATCCAA AAAAGTTGTC GAGTTGGCTA CAATAAATGG AGCCAAGTCA ATGAAGGGAA

181 CTCCTTATTG GATGGCTCCT GAAGTTATTC TCCAAACTGG GCATAGCTTC TCTGCCGATA

241 TTTGGAGTGT TGGCTGT

GhGPK1全长基因的克隆

根据已经获得的Gh-D193基因片段，设计两条特异性引物，作为3’RACE的5’端特异性引物。

GhGPK1 GSP1：SEQ ID NO：4：

ACTTTTGTTGGGACTGGAAT AT

GhGPK1 GSP2：SEQ ID NO：5：

CAAAAATAGAATCGTGCATAGAG

实验步骤按试剂盒说明书操作(3’RACE System for Rapid AmplificationofcDNA Ends试剂盒购自invitrogen公司)

用SEQ ID NO：4与3’端引物AUAP(试剂盒自带)，以mRNA逆转录的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。具体步骤如下：Ex Taq购自TAKARA，50μl PCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl mRNA反转录的cDNA，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ IDNO：4和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。

所得的PCR产物用双馏水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：5与3’端引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μl PCR反应体系：5μl10×Ex Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：5和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。第二次PCR产物回收片段约为1600bp条带(Gel Extraction Kit购自OMEGA)连接于pGEM-T EasyVector，转化到大肠杆菌JM109(具体方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQ ID NO：5与3’端引物AUAP进行菌液PCR扩增，得到3个阳性克隆，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序测序，获得该基因的cDNA的3’端。

根据已经获得的GhGPK1基因片段，设计三条特异性引物，作为5’RACE的3’端特异性引物。

GhGPK1 GSP3：SEQ ID NO：6：

TATCGGCAGAGAAGCTATGC

GhGPK1 GSP4：SEQ ID NO：7：

GAATAACTTCAGGAGCCATCC

GhGPK1 GSP5：SEQ ID NO：8：

TTCCCTTCATTGACTTGGCTCC

实验步骤按试剂盒说明书操作(5’RACE System for Rapid AmplificationofcDNA Ends试剂盒购自invitrogen公司)。

用SEQ ID NO：7与5’通用引物AAP(试剂盒自带)，以mRNA逆转录的cDNA(反转录引物SEQ ID NO：6)为模板进行第一轮PCR扩增，具体步骤如下：Ex Taq购自TAKARA，50μl PCR反应体系：5μl10×Ex Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl mRNA反转录的cDNA，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：7和AAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：8与3’端引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μl PCR反应体系：5μl10×Ex Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：8和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。第二次PCR产物回收片段约为800bp条带(Gel Extraction Kit购自OMEGA)连接于pGEM-T EasyVector，转化到JM109(具体方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQ ID NO：8与3’端引物AUAP进行菌液PCR扩增(反应体系及反应条件同上)，得到4个阳性克隆，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序测序，获得该基因的cDNA的5’端。

所得的5’RACE产物克隆测序后，与3’RACE产物测序结果拼接。获得GhGPK1全长cDNA序列SEQ ID NO：19。

SEQ ID NO：19：

1 ACCTCCAAAT CTTTAAGCAA ACGGATCTGA AGAAAGAAGA TTTTTGTACT CTAAATGCAG

61 GAGCTTGTTG GATCGGTTCG CCGGTCCTTT GTCTTTAGGT CTTCAACCTC CAGCGACGAT

121 GCCGGTGGAG GACTTGGAGG CTTTGTTGAG AAGATCGGCG CCAGCATTCG CAGATCGCGA

181 ATCGGCTTGT TCGCTAAGCC ACCTGCTCCA CCCGCTCTTC CTTCTGTTAA GAAAAGGGAC

241 GCTACGATCC GGTGGCGGAA GGGCGAGTTG ATTGGTTGTG GCGCCTTTGG TCGGGTTTAC

301 ATGGGGATGA ATCTTGACTC CGGCGAGTTA CTAGCTGTTA AACAGGTTTT GATAGCGGCA

361 AATGCTTCAA AGGAGAAAAC ACAGGCTCAT ATTAGAGAGC TCGAAGAAGA AGTGAAGCTT

421 CTACAGAATC TGTCACATCC AAACATTGTT AGATATTTGG GCACCGCAAG AGAGGACGAT

481 TCGTTGAATA TTCTATTGGA GTTTGTACCA GGTGGATCCA TTTCCTCACT TTTGGGGAAG

541 TTTGGATCTT TCCCCGAATC TGTTATAAGA ATGTACACTA AACAACTTTT GTTGGGACTG

601 GAATATCTTC ACAAAAATAG AATCGTGCAT AGAGACATCA AGGGAGCAAA CATTCTTGTG

661 GATAACAAGG GTTGTATCAA ACTTGCAGAC TTTGGTGCAT CCAAAAAAGT TGTCGAGTTG

721 GCTACAATAA ATGGAGCCAA GTCAATGAAG GGAACTCCTT ATTGGATGGC TCCTGAAGTT

781 ATTCTCCAAA CTGGGCATAG CTTCTCTGCC GATATTTGGA GTGTTGGCTG TACTGTGATT

841 GAGATGGCTA CTGGAAAGCC CCCTTGGAGC CAACAGTATC AGGAGGTTGC TGCTCTCTTT

901 CATATTGGGA CAACTAAATC TCATCCACCC ATCCCTGAGC ATCTCTCCCC TGAGGCTAAA

961 GACCTTTTGT TAAAATGCCT ACAGAAGGAA CCAGGACTGA GACCTAGTGC ATCAGACTTG

1021 CTTCAGCACC CTTTTGTCAC TGGGGACTAT CAGGAACCTC ATGCGGTGCT TCGTAGATCA

1081 ATTAGGGAAC CTGAAAATCT GGAGATGGCA TCTGGGGTGA ACCTGAGAAG CTCAATAAAT

1141 TCGGAGATCA GGTCAACCTG CACGGGTTTA AAGGACGTTT GTGAAATGGG TAGTGTGAGT

1201 TGCTCTACAG CATTTCTTGG GAAATTCTCA GAACCAGGAG CCTATTGGAG GGGAAGCAAT

1261 TGTGACAATA GCATGTGTGA GATAGATGAC AAAGATGATC TAGAATTTAA TTATTCTGTA

1321 AAGTTCTCCT CTGTTTTATC ATCTGCTGAC TTGAATAAAA GTTTCAATCC CATGTGTGAA

1381 CCCACTGAAG ACTGGCCACC CAAATTAGAT CAAAGTTCTG AGCTAAGCCG AAGTGGAGTA

1441 AACTTGTCTT TGGATGAAAC AATGGAAGCT GCTAGCACTC CTGGAATGTC TGGTAAGGAG

1501 GAGAATGGCT TCACTTTTCT CTGCGGACCT CCAACAGGTG ATGATGATGA AGAAGTTACA

1561 GAGTCAAAAA TTAGAGCCTT CCTGGATGAA AAGGCTCTGG AACTGAAGAA GCTGCAATCT

1621 CCTCTGTATG AACAGTTCTA CAACACATTG AATGGTAGTC TTCCACCTTC TGTTGGAACT

1681 GCAAATGGTG AAAATATTTT GAGCTTACCT CCTAAAAGTA GGTCACCTAA GTGGCTGCCT

1741 AGCAGAAGAC TCTCAGCAGT TGCTGATGCT GCCAACATGG TTAGCTCAAA GAGTCGTATG

1801 AATCATTTGT CAAATACTGC AGTTGTTCAT GACCGGACTT TACAAGAAAT TCAGCCACCG

1861 TCTGTTGAGG AATGGAAAGG GCAGGATATA ATTAGTCCGA GCATGAGCTT TTCTGAGAGA

1921 CAAAGGAGAT GGAAGGAAGA GCTTGACCAA GAGCTTGAGA GAAAGCGAGA GATGCTGCGG

1981 AAGACATCAT CTCCAAAGGA TAAGTTTCTA TTTGGACAAA GAGAACAAAT ACGGTCTCCA

2041 TTTCCTGGCA AGTAAATGTA GTATCCAACT TTACCTCTTT TGATGTTCCA TTGGGACTGT

2101 TCATTTCTGT ATTCTATTTT TGGTGAGAAT GGTGCCCAAT AATGTTACTC GGGCTTTATT

2161 TATGAGTGTC AGATACGAAT ATGTATTTGA TATGAGTATA TTTAATTTTT TTTCTTTTTT

2221 TTTTTTGCTT GTATAAAGTT CTTTCATATT TGTGGAAGAT ATTTGGGAGA GCCAAAAAAA

2281 AAAAAAAAAA AAA

根据GhGPK1全长cDNA序列设计一对引物如下：

GhGPKF：SEQ ID NO：9：

ATGCAGGAGCTTGTTGGATCGG

GhGPKR：SEQ ID NO：10：

TTACTTGCCA GGAAATGGAG ACCG

通过SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10来克隆GhGPK1全长。

采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的cDNA为模板进行PCR反应。50μlPCR反应体系：10μl5×PS Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。

PCR扩增产物加A尾：PCR产物加2.5倍的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，用21μl双蒸水溶解。加入2.5μl10×Ex Buffer，0.5μl5mM的dATP，2.5μl10×ExTaq。反应条件：70℃反应30分钟。将得到约1900bp的DNA片段回收(Omega回收试剂盒)，连接至pGEM T-easy载体上，转化JM109(方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQID NO：9与SEQ ID NO：10进行菌液PCR扩增(反应体系及反应条件同上)，得到4个阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，序列为SEQ ID NO：2。

GPK1蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO：1

1 MQELVGSVRR SFVFRSSTSS

21 DDAGGGLGGF VEKIGASIRR

41 SRIGLFAKPP APPALPSVKK

61 RDATIRWRKG ELIGCGAFGR

81 VYMGMNLDSG ELLAVKQVLI

101 AANASKEKTQ AHIRELEEEV

121 KLLQNLSHPN IVRYLGTARE

141 DDSLNILLEF VPGGSISSLL

161 GKFGSFPESV IRMYTKQLLL

181 GLEYLHKNRI VHRDIKGANI

201 LVDNKGCIKL ADFGASKKVV

221 ELATINGAKS MKGTPYWMAP

241 EVILQTGHSF SADIWSVGCT

261 VIEMATGKPP WSQQYQEVAA

281 LFHIGTTKSH PPIPEHLSPE

301 AKDLLLKCLQ KEPGLRPSAS

321 DLLQHPFVTG DYQEPHAVLR

341 RSIREPENLE MASGVNLRSS

361 INSEIRSTCT GLKDVCEMGS

381 VSCSTAFLGK FSEPGAYWRG

401 SNCDNSMCEI DDKDDLEFNY

421 SVKFSSVLSS ADLNKSFNPM

441 CEPTEDWPPK LDQSSELSRS

461 GVNLSLDETM EAASTPGMSG

481 KEENGFTFLC GPPTGDDDEE

501 VTESKIRAFL DEKALELKKL

521 QSPLYEQFYN TLNGSLPPSV

541 GTANGENILS LPPKSRSPKW

561 LPSRRLSAVA DAANMVSSKS

581 RMNHLSNTAV VHDRTLQEIQ

601 PPSVEEWKGQ DIISPSMSFS

621 ERQRRWKEEL DQELERKREM

641 LRKTSSPKDK FLFGQREQIR

661 SPFPGK＊

GhGPK1编码基因的核苷酸序列：SEQ ID NO：2

1 ATGCAGGAGC TTGTTGGATC GGTTCGCCGG TCCTTTGTCT TTAGGTCTTC AACCTCCAGC

61 GACGATGCCG GTGGAGGACT TGGAGGCTTT GTTGAGAAGA TCGGCGCCAG CATTCGCAGA

121 TCGCGAATCG GCTTGTTCGC TAAGCCACCT GCTCCACCCG CTCTTCCTTC TGTTAAGAAA

181 AGGGACGCTA CGATCCGGTG GCGGAAGGGC GAGTTGATTG GTTGTGGCGC CTTTGGTCGG

241 GTTTACATGG GGATGAATCT TGACTCCGGC GAGTTACTAG CTGTTAAACA GGTTTTGATA

301 GCGGCAAATG CTTCAAAGGA GAAAACACAG GCTCATATTA GAGAGCTCGA AGAAGAAGTG

361 AAGCTTCTAC AGAATCTGTC ACATCCAAAC ATTGTTAGAT ATTTGGGCAC CGCAAGAGAG

421 GACGATTCGT TGAATATTCT ATTGGAGTTT GTACCAGGTG GATCCATTTC CTCACTTTTG

481 GGGAAGTTTG GATCTTTCCC CGAATCTGTT ATAAGAATGT ACACTAAACA ACTTTTGTTG

541 GGACTGGAAT ATCTTCACAA AAATAGAATC GTGCATAGAG ACATCAAGGG AGCAAACATT

601 CTTGTGGATA ACAAGGGTTG TATCAAACTT GCAGACTTTG GTGCATCCAA AAAAGTTGTC

661 GAGTTGGCTA CAATAAATGG AGCCAAGTCA ATGAAGGGAA CTCCTTATTG GATGGCTCCT

721 GAAGTTATTC TCCAAACTGG GCATAGCTTC TCTGCCGATA TTTGGAGTGT TGGCTGTACT

781 GTGATTGAGA TGGCTACTGG AAAGCCCCCT TGGAGCCAAC AGTATCAGGA GGTTGCTGCT

841 CTCTTTCATA TTGGGACAAC TAAATCTCAT CCACCCATCC CTGAGCATCT CTCCCCTGAG

901 GCTAAAGACC TTTTGTTAAA ATGCCTACAG AAGGAACCAG GACTGAGACC TAGTGCATCA

961 GACTTGCTTC AGCACCCTTT TGTCACTGGG GACTATCAGG AACCTCATGC GGTGCTTCGT

1021 AGATCAATTA GGGAACCTGA AAATCTGGAG ATGGCATCTG GGGTGAACCT GAGAAGCTCA

1081 ATAAATTCGG AGATCAGGTC AACCTGCACG GGTTTAAAGG ACGTTTGTGA AATGGGTAGT

1141 GTGAGTTGCT CTACAGCATT TCTTGGGAAA TTCTCAGAAC CAGGAGCCTA TTGGAGGGGA

1201 AGCAATTGTG ACAATAGCAT GTGTGAGATA GATGACAAAG ATGATCTAGA ATTTAATTAT

1261 TCTGTAAAGT TCTCCTCTGT TTTATCATCT GCTGACTTGA ATAAAAGTTT CAATCCCATG

1321 TGTGAACCCA CTGAAGACTG GCCACCCAAA TTAGATCAAA GTTCTGAGCT AAGCCGAAGT

1381 GGAGTAAACT TGTCTTTGGA TGAAACAATG GAAGCTGCTA GCACTCCTGG AATGTCTGGT

1441 AAGGAGGAGA ATGGCTTCAC TTTTCTCTGC GGACCTCCAA CAGGTGATGA TGATGAAGAA

1501 GTTACAGAGT CAAAAATTAG AGCCTTCCTG GATGAAAAGG CTCTGGAACT GAAGAAGCTG

1561 CAATCTCCTC TGTATGAACA GTTCTACAAC ACATTGAATG GTAGTCTTCC ACCTTCTGTT

1621 GGAACTGCAA ATGGTGAAAA TATTTTGAGC TTACCTCCTA AAAGTAGGTC ACCTAAGTGG

1681 CTGCCTAGCA GAAGACTCTC AGCAGTTGCT GATGCTGCCA ACATGGTTAG CTCAAAGAGT

1741 CGTATGAATC ATTTGTCAAA TACTGCAGTT GTTCATGACC GGACTTTACA AGAAATTCAG

1801 CCACCGTCTG TTGAGGAATG GAAAGGGCAG GATATAATTA GTCCGAGCAT GAGCTTTTCT

1861 GAGAGACAAA GGAGATGGAA GGAAGAGCTT GACCAAGAGC TTGAGAGAAA GCGAGAGATG

1921 CTGCGGAAGA CATCATCTCC AAAGGATAAG TTTCTATTTG GACAAAGAGA ACAAATACGG

1981 TCTCCATTTC CTGGCAAGTA A

实施例3GhGPK1基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择诱导型启动子rd29A及Tnos作为GhGPK1基因的启动子和终止子。

用引物SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12以植物表达载体PBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl5×PS Buffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μl PBI121，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQID NO：11和SEQ IDNO：12各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过EcoRI、BglII酶切连接到pCAMBIA2300(promega，T4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-1。

SEQ ID NO：11：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT

SEQ ID NO：12：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14以PBI121为模板扩增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl5×PS Buffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlPBI121，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQID NO：13和SEQ ID NO：14各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过KpnI、EcoRI酶切连接到pCAMBIA2300-1(promegaT4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-2

SEQ ID NO：13：

AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO：14：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16以拟南芥(哥伦比亚型，购自www.arabidopsis.org)DNA为模板扩增拟南芥rd29A启动子(参考Zeng J.，etL.2002，Preparation of total DNA from“recalcit rant plant taxa”，ActaBot.Sin.，44(6)：694-697中的方法提取拟南芥DNA)。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl5×PS Buffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μl拟南芥DNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQID NO：15和SEQ ID NO：16各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过HindIII、SalI酶切连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3

SEQ ID NO：15：

ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA

SEQ ID NO：16：

TGAGTCGACTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG

SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18扩增GhGPK1(模板是实施例2所获得GhGPK1)，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μl GhGPK1-pGEM，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。通过KpnI、SalI酶切连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体rd29A-GhGPK1-2300。

SEQ ID NO：17：

TGAGGTACCATGCAGGAGCTTGTTGGATCGG

SEQ ID NO：18：

AAGGTCGACTTACTTGCCAGGAAATGGAGACCG

实施例4rd29A-GhGPK1-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌LBA4404(购自Biovector Science Lab，Inc)感受态制备：提前1-2天将农杆菌LBA4404在含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB固体培养基上划单斑接种，28℃培养1至2天。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB液体培养基中，28℃下摇动培养过夜(约12-16h)至OD600值为0.4，形成种子菌液。取5ml活化后的菌液(1∶20的比例)接种于100ml同样浓度抗生素的LB液体培养基中，28℃摇动培养2-2.5h至OD₆₀₀＝0.8。冰浴菌液10min，每隔3min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于4℃下4000g离心10min，弃上清液；加入一定量预冷10％甘油重悬浮菌体，4℃下4000g离心10min，收集沉淀；用10％甘油重复洗3-4次；加入适量冰浴预冷的10％甘油重新悬浮细菌沉淀，以40μl/管将其分装，于-70℃保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往40μl的感受态细胞中加入1μl的质粒，混匀后冰浴约10min。将感受态和DNA的混合物用枪转移到预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯(购自bio-rad)放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用0.1cm的电击杯的时候，MicroPulser(购自bio-rad)的程序设置为“Agr”，电击一次。立即取出电击杯，加入28℃预热的LB培养基。快速而轻柔的用枪将细胞打匀。将悬浮液转入1.5ml的离心管，28℃，225rpm培养1h。取100～200μl的菌液涂布与相应的抗性筛选培养基平板上(LB固体培养基，含50μg/ml利福平、50μg/ml链霉素、50μg/ml卡那霉素)，28℃培养。

实施例5利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用75％酒精浸泡烟草种子(国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号I5A00660)30s，用灭菌双蒸水洗两次。再用0.1％升汞浸泡8min，用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于MS(18.78mMKNO₃，1.25mM KH₂PO₄，20.6mM NH₄NO₃，1.5mM MgSO₄，3.0mM CaCl₂，50μM KI，100μM H₃BO₃，100μM MnSO₄，30μM ZnSO₄，1μM Na₂MoO₄，0.1μM CoCl₂，100μM Na₂EDTA，100μM FeSO₄，7.4g/L琼脂，蔗糖30g/L)上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体rd29A-GhGPK1-2300的农杆菌浸染叶盘10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养2天(MS培养基)。将叶片转到分化培养基(MS+1mg/L细胞***素(BA)+0.1mg/L萘乙酸(NAA)+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)上，光照条件下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取DNA(同实施例3中拟南芥DNA提取方法)，用SEQ IDNO：9：和SEQ ID NO：10(50μl PCR反应体系：5μl10×Ex Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min)，PCR鉴定，保存阳性植株进行编号T₀R1-T₀R20。

实施例6过表达GhGPK1转基因烟草T1的耐旱模拟实验及功能鉴定

灭过菌的蛭石用1/2MS培养基浸透。T₀R1-T₀R20及对照烟草种子分别播种在蛭石上，每盆播种15颗种子，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环，每5天浇一次1/2MS，培养25天之后，每盆保留大小较一致的4-5棵苗，做干旱实验，转基因烟草、对照烟草干旱14天(不浇水)，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环。T1代转基因植株(T0代转基因植株的种子长成的植株)的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而T₁R1、T₁R3、T₁R5、T₁R8、T₁R11、T₁R13、T₁R16七个株系共34棵烟草中有22棵能够正常生长，表现出明显的耐旱性(参见图3，以T₁R1、T₁R3为例，T₁R5、T₁R8、T₁R11、T₁R13、T₁R16的结果与T₁R1、T₁R3类似，在此未示出)。

实施例7在转录水平上验证GPK1蛋白表达

分别取对照烟草、不耐旱转基因烟草T1代植株、耐旱转基因烟草T1代植株(生长状况良好)干旱14天叶子0.05g，用植物RNA提取试剂盒(invitrogen)提取的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，计算各个RNA浓度。依照invitrogen反转录试剂盒SuperScript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录(2μg总RNA作为模板，反转录引物SEQ ID NO：10)。通过SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10扩增GhGPK1，检测GPK1蛋白相对表达情况。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：10μl5×PS Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，29个循环后，72℃延伸10min。产物电泳结果如图4所示：M为DNA Ladder Marker(DL2000，购自深圳瑞真生物技术有限公司)，1-5为对照烟草，6-18为耐旱转基因烟草T1代植株，19-24为不耐旱转基因烟草T1代植株。图中所示条带大小与GhGPK1-1基因的大小一致。结果表明对照烟草没有转录GhGPK1的mRNA，耐旱转基因烟草T1代植株对GhGPK1的转录较强，不耐旱转基因烟草T1代植株没有转录或转录很弱。

Claims

1.棉花的一个蛋白激酶编码基因，其序列为SEQ ID NO：2。

2.一种重组表达载体，其含有权利要求1所述基因的核苷酸序列并且所述核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。

3.权利要求2所述的载体，其为附图2所示的rd29A-GhGPK1-2300载体。

4.一种重组细胞，其含有权利要求1所述基因的核苷酸序列或者权利要求2或3所述的重组表达载体。

5.权利要求4的重组细胞，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

6.一种改善植物耐旱性的方法，包括：将权利要求1所述基因的核苷酸序列或者权利要求2或3所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达。

7.权利要求6的方法，其中所述植物是烟草。

8.一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求1所述基因的核苷酸序列或者权利要求2或3所述的重组表达载体的植物或植物组织。

9.权利要求8所述的方法，其中所述植物是烟草。

10.权利要求1所述的基因、权利要求2或3所述的重组表达载体或者权利要求4或5所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。

11.权利要求10所述的用途，其中所述植物是烟草。

12.权利要求1所述的基因编码的蛋白，如SEQ ID NO：1所示。